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PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA VEGETAL

EXTRACCIÓN DE CLOROPLASTOS Y MEDIDA DE LA REACCIÓN DE HILL EN


CLOROPLASTOS AISLADOS

1. INTRODUCCIÓN

En 1939, Robin Hill y col. encontraron que una suspensión de cloroplastos aislados puede
desprender O2 en presencia de luz, si se suministra un compuesto oxidado capaz de aceptar electrones
procedentes de la fotolisis del agua. De esta forma, el proceso de desprendimiento de O2 en la fotosíntesis
pudo ser separado del de la fijación de CO2.

En la hoja intacta, los principales aceptores naturales de electrones son la ferredoxina y el NADP,
pero se inactivan durante el proceso de aislamiento de los cloroplastos. “in vitro”, estos aceptores
naturales pueden sustituirse por el 2,6 diclorofenolindofenol (DCPIP). Este compuesto es azul en forma
oxidada (quinona) pero se decolora lentamente cuando se reduce (fenol). La reacción que tiene lugar es la
siguiente:

Luz
DCPIP+ (azul) + H2O DCPIP-H (azul pálido) + ½ O2
Cloroplastos
En esta práctica se medirá la fotosíntesis a través de la decoloración del DCPIP mediante un
espectrofotómetro.

2. MATERIAL
Hojas frescas de espinaca
Mortero y mano
Papel de filtro
Centrífuga y tubos
Papel de aluminio
Espectrofotómetro y cubeta
Parafilm
Gradilla con tubos de ensayo pyrex
Probeta de 50 ml
Erlenmeyer
Embudo
Varilla de vidrio
Pipetas de 2 ml (2) y de 1 ml (1)
Vaso de precipitados de 50 ml
Solución de sacarosa 0.5 M
Propilenglicol al 10%
DCPIP al 0.1%
Tampón fosfato 0.1 M pH 6.5 con ClK 0.08 M
Foco

3. METODOLOGÍA

Aislamiento de cloroplastos. Pesar 6 g de hojas de espinaca previamente desnerviadas y lavadas


dos veces con agua destilada fría. Cortar las hojas en pequeños trozos y macerar en un mortero (si es
posible con arena de cuarzo limpia) y 2 ml de sacarosa 0.5 M e ir completando paulatinamente hasta 10
ml con la misma solución .

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Filtrar el homogenado obtenido a través de papel de filtro y recogerlo sobre un tubo de centrífuga

Centrifugar el filtrado durante 10 min a 1000 r.p.m. Eliminar el precipitado y volver a centrifugar
el resto de sobrenadante durante 10 min a 2500 r.p.m. Desechar el sobrenadante y resuspender el
precipitado que contiene los cloroplastos aislados en 6 ml de propilenglicol al 10% agitando con una
varilla o un pincel.

Tomar 2 ml de esta suspensión de cloroplastos en un tubo de ensayo pyrex y llevarla a ebullición .


Enfriar con agua.

Reacción de Hill. Preparar 3 tubos de ensayo siguiendo el esquema que a continuación se expone.

Tubo 1 2 3

Solución tampón 9 ml 9 ml 9 ml

Suspensión cloroplastos hervidos 0.5 ml - -

Suspensión cloroplastos frescos 0.5 ml 0.5 ml

A continuación cubrir el tubo 2 con papel de aluminio con objeto de mantenerlo en oscuridad
Seleccionar en el espectrofotómetro la longitud de onda de 590 nm (es la longitud de onda a la que
absorbe el DCPIP)
*Colocar un recipiente con agua a 30 cm del foco luminoso aunque sin encender todavía éste.
Añadir rápidamente 0.1 ml de la solución de DCPIP al tubo 1. Agitar, poner una parte de la
solución en la cubeta de espectrofotómetro y medir la absorbancia a 590 nm.
Situar el tubo en el recipiente con agua y encender el foco. Mirar la hora, y a partir de este
momento, medir la absorbancia a los 3, 6 y 9 min. Apagar el foco.
Repetir desde * para los tubos 2 y 3. Apagar el foco
Anotar los resultados de absorbancia en el siguiente cuadro:

0 min 3 min 6 min 9 min

Tubo 1
cloroplastos hervidos
tubo destapado
Tubo 2
cloroplastos frescos
tubo tapado

Tubo 3
cloroplastos frescos
tubo destapado

Representa gráficamente los resultados

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