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2012
BIOTECNOLOGÍA
20/02/2012
Biotecnología
A. H. Scragg
BIBLIOGRAFIA
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Smith, J. E. (1985). Biotechnology Principles. Van Nostrand Reinhold, England.
2.1.- INTRODUCCION:
Todos los organismos vivientes, ya sean bacterias, levaduras, animales o vegetales,
comparten muchas características comunes. Todos los organismos con la posible excepción
de los virus, tienen una composición común que consisten en ácidos desoxirribonucleicos
(DNA), ácidos ribonucleicos (RNA) y proteínas.la molécula de DNA es la que
constitúyelos genes, los que a su vez contienen toda la información requerida para formar y
controlar el organismo. La información contenida en el DNA se transfiere al resto del
organismo para ejercer su función de la manera como la información almacenada en un
disco de computadora necesita ser leída. El flujo de información desde el DNA hacia el
resto de la célula esta mediada por moléculas de RNA, las cuales finalmente dirigen la
síntesis de proteínas que, como componentes estructurales o como enzimas, dirigen y
controlan muchas de las funciones del organismo. El proceso de transferir la información
genética del DNA a las moléculas de RNA se conoce como transcripción: la transferencia
de información desde la molécula de RNA a las proteínas se conoce como traducción.
Además de contener estos tres tipos de moléculas, los organismos realizan ciertas
reacciones químicas comunes conocidas colectivamente como metabolismo. Para crecer y
dividirse, se necesita un organismo para sintetizar sus propios constituyentes celulares a
partir de substancias químicas externas y, para lograr esto, a menudo organismos diferentes
tienen vías enzimáticas similares y una estructura celular básica.
La microbiología es el estudio de los organismos que son demasiado pequeños para verlos a
simple vista (menores de 0.1 mm) y que fueron descubiertos en el siglo XVII por Robert.
Traducción
Proteínas
Hook publica la micrographia, en la cual describe e ilustra la estructura celular del cerebro.
Leeuwenhoek mejora las lentes del microscopio y descubre diversas formas de vida
unicelular.
Wohler sintetiza la urea desmintiendo el punto de vista de que los compuestos orgánicos
solo pueden ser sintetizados por organismos vivos.
Pasteur propone que todos los procesos fermentativos son el resultado de actividad
microbiana y descubre los organismos anaerobios.
Roberto Koch y su grupo introducen las técnicas de cultivo puro, incluyendo la caja de petri
inventadas por Ricardo Petri.
Mientras tanto, en Inglaterra, Tyndall había confirmado que los organismos provenientes
del aire eran las causantes de las infecciones microbianas y que estas no se formaban por
generación espontanea. Alrededor de 1876, Roberto Koch fundo la microbiología medico,
quien mostro la causa bacteriana o etiología del ántrax. Esto fue confirmado después por
Pasteur de manera independiente. Estos experimentos no solo demostraron que las bacterias
eran la causa de ciertas enfermedades, sino que cada tipo producía una enfermedad
específica, es decir, que existe especificidad biológica. El trabajo de kosh estableció
muchos de los fundamentos de las técnicas de esterilidad que son la base de la
microbiología moderna. La inoculación de bacterias sobre un medio solido, de modo que
cada colonia formada que se hubiese originado de una bacteria individual, permitiéndose el
uso y estudio de cultivos puros. Al principio el medio se solidificaba mediante la adición de
gelatina, pero más tarde esta substituyo por agar, un extracto por polisacáridos obtenido de
algas marinas. El medio solido de coloco entonces e una caja de petri, inventada por el
italiano Petri y que ahora es de uso universal.
Plantas Animales
Musgos y hepáticas
Protistas
Hongos (levaduras)
Bacterias y virus
PROCARIOTAS EUCARIOTAS
ESTRUCTURAS GENETICAS
Membrana nuclear - +
DNA en organeros - +
ESTRUCTURAS
CITOPLASMATICAS
Naturaleza de los ribosomas 70s 80s
citoplasmáticos.
Ninguna 70s
Naturaleza de los ribosomas de los
- +
organelos.
- +
Mitocondrias
-5x10-15 g (1) 3x1012 o 0.5 x 10 12
CANTIDADES RELATIVAS DE DNA.
Estos grupos son los eucariotas y procariotas; la diferencia entre ellos depende
principalmente si los cromosomas (DNA) están contenidos en un núcleo bien definido. En
la tabla 2.3 se listan las principales diferencias entre los procariotas y los eucariotas en
términos de su estructura celular y de contenido de DNA. Los procariotas contienen un solo
cromosoma, en tanto que los eucariotas contienen muchos cromosomas, en tanto que los
eucariotas contienen muchos cromosomas en una estructura unida a una membrana. El
núcleo, en los eucariotas, el DNA contenido en los cromosomas esta unido a historias,
proteínas básicas ausentes en los procariotas. El DNA del núcleo en los eucariotas no es el
único DNA presente en la célula, puesto que otras estructuras unidas a membranas, los
mitocondrias y los cloroplastos, también contienen DNA, en estructuras rodeadas de
membrana, conocidas como organelos, no se encuentran en procariotas. Los organelos
también contienen a las estructuras capaces de sintetizar proteínas. Las cuales incluyen a
los ribosomas de los procariotas (70 s), en tanto que los ribosomas toplasmicos miden 80 s
(son unidades Svedberg). Los virus se incluyen con frecuencia en el grupo de los protistas.
Los virus fueron detectados en 1892 por Iwanowski, quien demostró que el virus del
mosaico de tabaco pasaba atreves de un filtro a prueba de bacterias y no podía ser cultivado
por la genética, pero dependen de las células huésped preexistentes para su reproducción.
En incapacidad para existir sin usar otras células, ha originado muchos argumentos cuanto
así los virus son o no organismos vivos. Los virus afectan vegetales, animales y bacterias.
2.4.- PROCARIOTAS
Los procariotas representas las células más pequeñas del reino protista, el cual consiste en
bacterias y algas verde- azules. El resto, algas, levaduras, hongos y protozoarios, son:
PROCARIOTAS
45-55% 25-55%
COMPOSICION 65-75%
Proteína(N x
6.25)(nitrógeno 5-12% 5-10%
15-25%
total)
Acido nucleído
10-50% 10-50%
(RNA y DNA) 5-30%
Carbohidratos y
li8pidos 1um=10-3
mm
Eucariotas. En la tabla 2.4. Se comparan los protistas, las bacterias, los mohos y las
levaduras, en cuanto a su forma, tamaño y composición. Las células bacterianas se
presentan como bastones, esferas, cadenas y espirales (figura 2.2), que en general son más
pequeñas que las levaduras y los mohos. Los tres grupos contienen organismos que pueden
formar esporas cuando las condiciones son desfavorables. La composición de las bacterias
nos muestra que contienen más proteínas y menos lípidos o carbohidratos que las levaduras
o los mohos.
Las diferentes formas de las bacterias se usan en las primeras etapas de la identificación,
pero debido a la falta de otras características, se usan las nutricionales para una
identificación más detallada. Según su fuente de energía, las bacterias y las algas verde-
azules se pueden clasificar en cuatro categorías:
Neisseria
Algas verde-azules mixobacterias Bacterias Eubacterias
El citoplasma bacteriano está encerrado por una pared celular rígida altamente
Grupo
- +
Fotoautotrofo -
+ - +
Fotoheterotrofos -
- - +
Quimioautotrofo -
+ + +
Quimiheterotrofos. +
+
Que la célula adquiera una forma esférica conocida como protoplasto cuando la membrana
celular tiene poca resistencia intrínseca. Si el protoplasma se coloca en un medio
hipertónico, una solución más diluida que el citoplasma, se provoca una rápita captación de
agua y, finalmente, la ruptura de la membrada.
detinción que divida a las bacterias en los grupos Gram-negativas. La composición general
de la pared de las Gram positiva y gran negativa se muestra en la figura 2.5. Las bacterias
Gram Positiva tienen una estructura básica de peptidoglucano unida a ácido teicoico, en
tanto que las bacterias gran negativas tienen una membrana fuera de la capa de
peptidoglunano que consiste en una bicapa de fosfolípidos con lipoplisacaridos y proteínas.
La difencia entre las bacterias gram negativa y gram positiva detectadas por la
tIntaciónGram, se puede correlacionar con otras características (tabla 2.7) como la
sensibilidad a la penicilina y a la digestión con lisozima. La penicilina es de muchos
antibióticos que se sabe inhiben la síntesis te peptidoglucano al unirse a la enzima
responsable del cruzamiento de las cadenas. Puesto que ninguna otra actividad biocinética
es afectada, el crecimiento de las células continua, pero son incapaces de producir paredes
celulares adecuadas y, por lo tanto, producen formas anormales y finalmente se lisan. Las
células humanas y animales no contienen peptidoglucano por lo que son afectadas. La
enzima lisozomaticas encontradas en la clara de huevo, las lágrimas y otras secreciones,
rompen el enlace entre las unidades de ácido N-acetilmuránico y N-acetilglucosamina
(figura 2.4).
N-acetilmuránico
N-acetilglucosamina lisozima
Figura 2.4
con agua
Sensibilidad a la penicilina + ±
Acidoteicoico + -
Ejemplo Bacillus
Escherichiacoli
(1nm = 10-6 mm)
Debajo de la pared celular bacteriana esta una membrana de unos 40-80 °A de espesor.
Alrededor del año 1990 se descubrió el primer indicio de que los lípidos, moléculas
orgánicas pequeñas insolubles en agua que incluyen a las grasas y aceites puedan ser un
constituyente de las membranas biológicas. En las décadas de los años cincuenta, J.D
Robertson propuso que la membranaconsistía en una capa externa de polisacáridos, una
capa interna de proteínas, entre estas, una bicapa de lípidos conocida como unidad de
membrana. La bicapa lípido consistía en fosfolípidos, moléculas de glicerol con extremo
hidrófilo ( el fosfato) y un extremo hidrofilico (tallo de ácidos grasos), arreglados como una
capa doble (figura 2.6).
Hidrofilico (fosfatos)
BICAPA
LIPIDICA
Hidrofo
bic
FIGURA 2.6
2.4.3 Flagelos
Figura 2.8
Cuando son vistos en el microscopio electrónico, pueden observarse otros apéndices sobre
la bacteria, que consiste en delgados flagelos filamentosos conocidos como fimbrias o pilis,
los cuales participan en la transferencia de material genético.
2.4.4 Esporas
El citoplasma de las bacterias contiene muy poca estructura separadas de uno o dos
agregados de material nuclear. Sin embrago, se puede hallar una estructura que solo está en
las bacterias Gram-negativa, la endoesporas. Cuando la condiciones son difíciles, o bien, en
alguna etapa de ¿l ciclo de desarrollo, las bacteria forman una espora refractiva a partir de
una invaginación de la membrana citoplasmáticas. La gruesa pared de las esporas les
confiere resistencia al calor i a la desecación (figura 2.9).
2.5 EUCARIOTAS
En los hongos, las levaduras y las algas. La celular está encerrada en una pared celular
rígida que consiste principalmente en polisacáridos, los cuales le confieren una forma fija y
la protegen del dalo mecánico y osmótico. La pared estabiliza la estructura celular y , en
cuanto a los procariotas, pueden usarse como una característica taxonomía. Las levaduras
pueden tener forma casi esférica u oblonga y se divide pro gemación o fisión ( figura 2.11) ,
en tanto que el crecimiento micelial se realiza por elongación, el cual puede incluir
ramificación.
Las eucariotas están limitadas por una membrana de estructura similar a las de los
procariotas. En cuanto a los eucariotas varían mucho en tamaño de las estructuras que
rodena la membrana dentro de la célula (tabla 2.8).
2.5.3 Núcleo
Las características mas sobresalientes de las células eucariotas es el núcleo, el cual contiene
el DNA de la celular y esta limitado por la membrana. Dentro del núcleo se pueden ver
áreas más densas, ricas en RNA, conocidas como nucléolos.
2.5.4 Mitocondrias
La célula eucariota contiene estas estructuras, las cuales, a menudo son grandes, cilíndricas,
encerradas por una membrana doble y contiene invaginaciones numerosas conocidas como
crestas. La mitocondrias es le sitios principal de generación de energía y contiene su propio
sistema sintetizado de proteínas y su propio DNA (figura 2.12)
2.5.5 Cloroplasto
El cloroplasto también es una estructura rodeada por una membrana y , al igual que las
mitocondrias. Contiene un sistema separado para la síntesis de pretinas y su propio
DNA. Como su nombre lo indica, los cloroplastos contiene el pigmento clorofila y en ellos
se lleva a cabo la fotosíntesis.
2.5.6 Otras estructuras membranosas
3.1 Introducción
Todas las células vivas, incluyendo los microorganismos, requieren ciertos nutrientes para
su crecimiento y desarrollo. Los nutrientes deben contener los elementos químicos que
constituyen los materiales y estructuras celulares, así como aquellos elementos que son
requeridos para el transporte a través de la membrana, la actividad enzimática y la
generación de la energía necesaria para los procesos biosintéticos.
El agua constituye el 80 y 90% del peso total. El resto de la célula se compone de carbono,
hidrogeno, oxigeno, nitrógeno, azufre y fosfato (en concentraciones mayores de 10-4M),
además de unos 18 elementos más que con frecuencia se presentan en cantidades mínimas.
La tabla 3.1 lista lo diez elementos principales encontrados en las células microbianas con
detalles sobre su origen y requerimiento de la célula.
La mayor parte de los elementos se presentan como sales en los medios naturales como el
suelo y el agua. Sin embargo, con frecuencia se necesita añadir fuentes solubles de estos
elementos a los medios de cultivo de laboratorio o industriales. Algunos microorganismos,
como por ejemplo Escherichia coli, pueden crecer en mezclas simples de estas sales junto
con una fuente de carbono y energía, mientras que otros, como Lactobacilli, necesitan otros
compuestos que no pueden sintetizar por sí mismo. Los constituyentes inorgánicos de
varios microorganismos se muestran en la tabla 3.3.
Los microorganismos muestran cierta diversidad en cuanto a los componentes que pueden
usar como fuentes de C, H, O, N y S. Así el azufre generalmente es tomado por las células
como sulfato y residuos de sulfuro para propósitos biosintéticos. Sin embargo, algunas
bacterias como Thiobacilli pueden crecer en compuestos con azufre reducidos como
sulfuro, azufre elemental o tiosulfato que las usan como donadores de electrones, en tanto
que los metanógenos crecen solamente en presencia de sulfuro de hidrogeno.
Los nutrientes requeridos por microorganismos no son para reacciones biosintéticas que
dan lugar al crecimiento celular, sino también funcionan como fuentes de energía para
“alimentar” los procesos biosintéticos metabólicos que demandan energía. Los
microorganismos se pueden clasificar por la naturaleza de las fuentes de carbono y energía
que pueden utilizar.
Los organismos que utilizan luz como fuente de energía se denominan fotótrofos, mientras
que aquellos que obtienen su energía de reacciones químicas se denominan quimiótrofos.
3.3.1 Fotótrofos:
Es común que los fotótrofos utilicen CO2 como fuente celular de carbono, en cuyo caso se
denominan fotoautótrofos. Durante el crecimiento, el CO” debe ser reducido al nivel de la
materia celular usando donadores de electrones que con frecuencia son inorgánicos, tales
como el hidrogeno molecular o compuestos de azufre reducidos. Cuando los organismos
crecen de esta manera se denominan fotolitótrofos (tabla 3.4).
Alternativamente, algunos fotótrofos (tabla3.4) pueden usar la luz como fuente de energía
para su crecimiento y fuentes de carbono orgánicas como succinato o acetato. En este caso,
el substrato orgánico aporta los electrones para las reacciones de reducción y el organismo
crece como fotoorganótrofo. El substrato orgánico aporta también carbono celular en lugar
de CO2. En consecuencia, los organismos crecen como heterótrofos.
3.3.2 Quimiótrofos:
Donde un substrato se reduce a expensas del otro. La mayoría de las levaduras, hongos y
organismos superiores utilizan donadores de electrones orgánicos (Xred) y O2 como aceptor
de electrones. Las bacterias, sin embargo, pueden usar NO3-, SO42- o CO32- como aceptor de
electrones en lo que se denomina respiración anaerobia, compuestos orgánicos
(fermentación anaerobia) u O2 (respiración). El donador de electrones, Xred, puede ser
orgánico o inorgánico (por ejemplo H2, H2S, Fe2+, NO2- o NH4+).
Los quimiolitótrofos también son quimioautotrofos, ya que generalmente usan CO2 como
fuente de carbono y no metabolizan un compuesto organico. Sin embargo, también puede
crecer en forma aeróbica como quimioorganótrofos (por ejemplo las bacterias que oxidan
hidrogeno y algunos thiobacilli), mientras que Nitrosomonas y Thiobacillus Thiooxidans
son quimiolitótrofos obligados.
La mayoría de las levaduras y las algas pueden sintetizar los componentes orgánicos
necesarios para su crecimiento a partir de la fuente de carbono. Muchas bacterias no pueden
hacer esto y necesitan la presencia de factores de crecimiento específicos en el medio,
además de una fuente de carbono y energía.
El requerimiento más común son las vitaminas, las cuales se necesitan en cantidades
extremadamente pequeñas como cofactores para varias enzimas. Así, Clostridium kluyveri
requiere un medio complementado con biotina y acido p-aminobenzoico. Ciertas bacterias lácticas
tienen necesidades muy estrictas de prácticamente todos sus aminoácidos, purinas, pirimidinas y
vitaminas. En consecuencia, estos organismos realmente pueden crecer en un medio en el que no
se conoce la concentración de uno de estos nutrientes necesarios para el crecimiento. El grado de
crecimiento esta relacionado directamente con la concentración del nutriente esencial. Esto
constituye la base del ensayo microbiológico.
En la tabla 3.6 se listan algunas vitaminas y compuestos relacionados que a menudo se necesitan
para el crecimiento.
Las células microbianas, como todos los sistemas vivos con excepción de los virus, se componen
de carbohidratos, grasas, lípidos y ácidos nucleicos. Estos materiales se forman a partir de las
unidades básicas de construcción o productos metabólicos primarios, a saber, monohidratos,
ácidos grasos, aminoácidos y nucleótidos (o nucleósidos) y, por otras reacciones metabólicas, se
convierten en los componentes estructurales principales de células, como paredes celulares,
membranas, enzimas, proteínas estructurales y DNA o RNA.
3.51 Carbohidratos
Son compuestos orgánicos con fórmula general (CH₂O)n, donde n>3. Existen dos formas
principales de carbohidratos, los monosacáridos y los polisacáridos. Los monosacáridos o azúcares
simples, son los carbohidratos más pequeños que contienen entre 3 y 9 átomos de carbono y son
las unidades de construcción de los polisacáridos. La D-glucosa (hace girar la luz polarizada en el
plano de la dirección +) es el monosacárido mas común. Se compone de 6 átomos de carbono y, al
igual que otros azúcares, es un derivado polihidroxialcohol (figura 3.1)
Aldolasas Cetosas
CHO CH 2OH
CH 2OH CH 2OH
D-gliceraldehído Dihidroxiacetona
HCOH C=O
H COH HCOH
HCOH HOC H
CH 2OH CH 2OH
D-ribosa D-ribulosa
Para muchos microorganismos la D-glucosa es el compuesto base que se metaboliza para formar
los demás componentes celulares. La mayoría de los microrganismos (particularmente las
levaduras), pueden crecer en glucosa, la cual se transporta a través de la membrana hacia la célula
de difusión pasiva, transporte activo o translocación de grupo. Cuando hay polisacáridos en el
medio, es común que sean hidrolizados a unidades de glucosa por enzimas extracelulares
(invertasas, celulasas, amilasas, aminoglucosidasas) antes de ser transportados hacia la célula.
Los monosacáridos se clasifican como aldosas o cetosas (figura 3.1). Así, la glucosa es una
aldohexosa (aldo=azúcar aldehído; hexosa=6 átomos de carbono). Hay dos formas de glucosa (y
otros azucares) llamadas formas D- y L- (figura 3.2 (a)),
CHO CH2OH
H C OH HO C H
HO C H H C CH3
H C OH HO C H
H C OH HO C H
CH2OH CH 2OH
D-glucosa L-glucosa
α-D-glucosa β-D-glucosa
que son imágenes especulares entre si. Los azucares de origen natural por lo general son de la
forma D-. La D-glucosa se presenta principalmente como una estructura de anillo, denominada la
forma piranosa (figura 3.2 (b)), en la que α- y β- representan la posición del grupo –OH del átomo
de carbono 1.
La unión de otros grupos químicos a la estructura básica, da lugar a una variedad de derivados de
azúcar que incluye alcoholes (glicerol, sorbitol, etc.), ácidos (acido glucónico, acido glucorónico),
fosfatos (glucosa-1-fosfato, glucosa-6-fosfato), desoxiazúcares (desoxirribosa, figura 3.3) y
aminoazúcares (glucosamina, galactosamina, acido N-acetilmurámico). Estos son componentes
importantes comunes de la estructura de la célula microbiana.
HOCH HOCH H
O H O
H H H H
OH H OH
H
OH OH OH H
D-ribosa D-desoxirribosa
Bajo la influencia de enzimas, los monosacáridos se pueden condensar entre si para formar
polisacáridos. El grupo –OH sujeto al átomo de carbono en la posición 1 de la molécula de
glucosa, es relativamente reactivo y se puede condensar con el grupo –OH en la posición 4 ó 6 de
otro azúcar par producir un disacárido con un enlace α- (o β-) 1,4 glucosídico (figura 3.4)
Si las unidades de glucosa se polimerizan aun más mediante la formación de enlaces α-1, 4-
glucosídicos se obtiene un polímero de cadena recta con un peso molecular de hasta 500.000,
denominado amilosa (un componente del almidón: figura 3.5). La amilopectina (el componente
principal del almidón) se compone de unidades de α-D-glucosa unidas por enlaces α-1, 6-
glucosídicos. La molécula completa de almidón (un polisacárido común de almacenamiento) es
una combinación de amilosa y amilopectina (figura 3.5).
Un polisacárido estructural importante es la celulosa, la cual contiene más del 50% del carbono
orgánico total de la biosfera. La madera contiene aproximadamente 50% de celulosa, en tanto que
el algodón es casi celulosa pura. Se compone de unidades de D-glucosa unidas por enlaces β-1, 4
(figura 3.6) y es el componente principal de las células
Figura 3.6 Estructura de la celulosa.
Las paredes celulares bacterianas están formadas de un péptido polisacárido complejo llamado
peptidoglicano o mureína (figura 2.7). Esteconsiste en cadenas paralelas de polisacárido
compuestas de un disacárido de N-acetil-D-glucosamina y acido N-acetilmurámico unidos por
enlaces β-1, 4-glucosidicos. En el grupo hidroxilo del acido láctico unido al ácido murámico, se
encuentra una cadena lateral de tetrapéptido compuesta de L-alanina, D-alanina, acido D-
glutámico y acido diaminopimélico o L-lisina (figura 3.7. La D-alanina terminal de la cadena
péptida lateral de un polisacárido
Figura 3.7 Componente peptidoglicano de las paredes celulares bacterianas.
puede unirse con la cadena peptídica de otra cadena de polisacárido, ya sea directamente o a través
de otra cadena polipetídica corta (en Staphylococcus aureus, esta cadena de polipéptido se
compone de 5 unidades de glicina).
Por lo tanto, el peptidoglicano consiste en cadenas de polisacáridos paralelas con muchas uniones
entre las cadena que le confiere fuerza y rigidez a al pared celular.
La enzima lisozima hidroliza los enlaces β-1, 4 del peptidoglicano para producir disacáridos de N-
acetil-D-glucosamina y acido N-acetilmurámico a los cuales están unidos los péptidos (figura 3.7).
Este es uno de los métodos usados para obtener protoplastos de bacterias gram +.
Los lípidos son compuestos orgánicos insoluble en agua localizados en todas las células vivientes,
pero son solubles en solventes no polares como el benceno y el éter.
Tienen cuatro funciones principales: 1)como componentes estructurales de las membranas: 2)
como materiales de almacenamiento intracelular cuya oxidación produce energía para el
crecimiento; 3) como fuente de combustible (energía) transportable; 4) como componente
protector de paredes celulares de las bacterias, las hojas de las plantas y la piel de los vertebrados.
Las grasas y lípidos se componen de ácidos grasos de los cuales se han aislado más de 70 tipos
diferentes. Los ácidos grasos se componen de una cadena larga de hidrocarburo con un grupo de
carboxilo terminal con la forma general mostrada en la figura3.8, donde n esta, por lo general,
entre 12 y 20. La cadena de hidrocarburo puede
O
H3C (CH 2)n C
OH
ser saturada (sin enlaces dobles) o insaturada (uno o mas enlaces dobles). Los ácidos grasos
difieren principalmente en la longitud de la cadena y en el número y en la posición de los dobles
enlaces. Algunos de los ácidos grasos más importantes y comunes se muestran en la tabla 3.7.
Casi todos los ácidos grasos naturales tienen un numero par de átomos de carbono y se llaman
saturados si no tienen dobles en laces. Los ácidos grasos insaturados presentan uno o más dobles
enlaces (tabla 3.7). Si bien las plantas y animales superiores tienen predominantemente ácidos
grasos insaturados de 14 a 22 átomos de carbono; los microorganismos, y en particular las
bacterias tienen tipos más simples de 12 a 18 átomos de carbono y ácidos grasos insaturados C₁₆ o
C₁₈. En las bacterias no se han encontrado ácidos grasos con más de un enlace doble.
Los ácidos grasos solo se encuentran en pequeñas cantidades en forma libre. Se localizan en
materiales estructurales y de almacenamiento como esteres de glicerol (glicéridos o acilgliceroles)
o como fosfoésteres de glicerol (fosfoglicéridos o fosfolípidos).
Los glicéridos son la forma de almacenaje principal de grasas en los microorganismos, plantas y
animales.
Hay tres clases de glicéridos, dependiendo del número de ácidos grasos (o grupos acilo)
esterificados en la molécula de glicerol (figura 3.9):
1-monoacilglicerol (monoglicérido);
1, 2-diacilglicerol (diacilglicérido);
1, 2, 3-triacilglicerol (triglicérido).
Los más comunes en la naturaleza son los triacilgliceroles. La clase de triacilglicerol depende del
tipo y posición de los ácidos grasos esterificados en relación con el glicerol, por ejemplo,
triesteroilglicerol.
Los fosfoglicéridos se encuentran casi exclusivamente en las membranas celulares, siendo escaso
en grasas de almacenamiento. Son similares en estructura a los glicéridos excepto que uno de los
grupos alcoholes primarios del glicerol esta fosforilado mas que esterificado con un acido graso.
Así, el componente básico de los fosfolípidos es el glicerol-1-fosfato o el glicerol-3-fosfato, al
cual están unidos dos ácidos grasos.
Los fosfoglicéridos (figura 3.10) poseen una cabeza polar (hidrofílica) y otras dos cabezas
hidrocarbonadas no polares (hidrofóbicas) y, por tanto, se denominan lípidos antipáticos. Así, en
solución acuosa, es fácil que formen micelas con las regiones polares de un grupo de
fosfoglicéridos en contacto con el agua, en tanto que las cadenas
Procesos químicos de la célula
3.5.3 Esteroides
3.5.4 Proteínas
Las proteínas son las moléculas orgánicas mas abundantes de las células vivas,
comprendiendo entre el 30% y el 70% del peso seco total de las células. Son componentes
celulares muy importantes puesto que son copiados de la información genética de la célula
y, posteriormente, dirigen la maquinaria metabólica de ella.
El peso molecular de las proteínas varía desde 5000 hasta más de 40 millones. Sin
embargo, ciertas cadenas peptídicas, como las que se asocian con el peptidoglucano,
constan de pocos aminoácidos con pesos moleculares tan bajos como 240. Las proteínas y
péptidos se componen de α-aminoácidos, los cuales representan las unidades de
construcción de las proteínas. Existen 20 α-aminoácidos comunes (tabla 3.9) unidos entre si
mediante enlaces peptídicos (figura 3.13) para formar polímeros grandes, no ramificados o
cadenas polipetídicas. Los enlaces peptídicos se forman por una reacción de condensación
entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de un segundo aminoácido
(figura 3.13). El numero y secuencia de los residuos aminoácidos en una cadena
polipeptídica (proteína) determinan la función y la actividad catalítica (si existe). El peso
molecular promedio de un aminoácido es 138. Sin embargo, puesto que se pierde una
molécula de agua en la formación de un enlace peptídico, el peso molecular promedio de un
residuo de aminoácido en una proteína es de 120.
Así, las nucleoproteínas contienen acido nucleico; las lipoproteínas contienen lípido o
fosfolípido; las glicoproteínas contienen carbohidratos; las hemoproteínas contienen una
estructura de porfirina asociada con fierro; las flavoproteínas contienen grupos flavin y las
metaloproteínas contienen iones metálicos.
1) Fibrosas
2) Globulares
Las proteínas fibrosas son más fuertes físicamente y son insolubles en agua o soluciones
acuosas diluidas. Se componen de cadenas polipetídicas arregladas en paralelo a lo largo de
un solo eje para formar fibras grandes o laminas (figura 3.15).
Representan los componentes estructurales básicos del pelo (queratina), cuero, uñas,
colágeno y tendones de los animales superiores, así como de los flagelos, cilios y pilis de
los microorganismos.
Las proteínas globulares consisten en cadenas polipetídicas estrechamente empaquetadas
dobladas en formas esféricas o globulares (figura 3.15). Por lo general, son solubles en
solución acuosa y se difunden con rapidez. En consecuencia, son bastante móviles en el
citoplasma celular y, a menudo, tienen una función catalítica (enzimas). Por lo tanto, la
mayoría de las enzimas y proteínas de transporte son proteínas globulares.
Se observa que hay tres niveles diferentes de estructura proteínica, las cuales se pueden
resumir como sigue:
Componentes estructurales básicos de la célula
Las proteínas que tienen más de una cadena polipeptídica se denominan proteínas
multiméricas u oligométricas, y cada polipéptido se conoce como subunidad o protómero.
Procesos químicos de la célula
En general, la mayoría de las proteínas grandes tienen dos o más subunidades que pueden
o no poseer ningún enlace covalente entre ellas. Ejemplo de proteínas oligoméricas son
las enzimas, hexocinasa de las levaduras (4 subunidades), triptófano sintetasa (4
subunidades), lactato deshidrogenasa (4subunidades) y la sintetasa de ácidos grasos (21
subunidades), aunque la ribonucleasa y la lisozima poseen una sola subunidad. De
ordinario, las subunidades están asociadas estrechamente, aunque puede no haber enlaces
covalentes. En consecuencia, la proteína actúa como una sola molécula y, de hecho, casi
siempre se requieren todas las subunidades para el funcionamiento óptimo de la proteína.
En la tabla 3.10 se listan algunas de las proteínas que se encuentran más comúnmente en
la naturaleza y su función.
Una de las clases principales de proteínas son las enzimas, las cuales funcionan como
catalizadores biológicos. Esta clase de proteínas se considerara con más detalle en el
capítulo sobre “Cinética enzimática”.
Proteínas de almacenamiento
Ovoalbúmina Proteína de la clara de huevo
Lactoalbúmina (caseína) Proteína de la leche
Proteínas de transporte
Hemoglobina Transporta O2 en la sangre
Mioglobina Transporta O2 en el músculo
Albumina de suero Transporta ácidos grasos en la sangre
Proteínas contráctiles
Miosina Filamentos estacionarios en las miofibrillas
Actina Filamentos móviles en las miofibrillas
Dineína (flagelina) Cilios y flagelos
Proteínas protectoras
Anticuerpos Forman complejos con proteínas extrañas
trombina Componente del mecanismo de coagulación
de la sangre.
Toxinas
toxina de clostridiumbotulinum Causas de envenenamiento de alimentos por
bacterias
toxina diftérica Causa de la difteria
venenos de serpiente Enzimas que hidrolizan a fosfoglicéridos
Hormonas
Insulina Regula el metabolismo de la glucosa
Hormona de crecimiento Estimula el crecimiento óseo
Proteínas estructurales
Glicoproteínas Paredes y cubiertas celulares
Proteínas de la estructura de la Componente de las membranas
membrana
α – queratina Piel, plumas, uñas, pezuñas, etc.
esclerotina Exoesqueletos de insectos
proteínas de la cubierta viral Cubierta alrededor del cromosoma
colágeno Tejido conectivo fibroso (tendones, hueso,
cartílago)
Tabla 3.10 algunas proteínas comunes y su función.
Principal es actuar como cofactores o enzimas en reacciones de óxido reducción en el
interior de la célula.
cloroplastos, el cual es diferente del DNA nuclear. El DNA procariótico de ordinario está
unido a un pliegue o invaginación de la membrana celular llamado mesosoma en la región
nuclear (los procariotas no poseen un núcleo verdadero). No hay proteínas asociadas con
DNA. Los procariotas también pueden tener material extracrosomal denominado plasmidos
o episomas, de los cuales se tratará en capítulos posteriores sobre biología molecular.
Dentro de la célula el RNA (ácido ribonucleico) existe en tres formas, a saber: RNA
mensajero (mRNA), RNA de transferencia (tRNA) y RNA ribosomal (rRNA). Todas
consisten en una cadena
individual de polirribonucleótido compuesta en cuatro ribonucleótidos principales (aunque
el tRNA contiene además algunos ribonucleótidos inusuales que incluyen a los ácidos
pseudouridílico y ribotimidílico). En los procariotas todos los RNAs se encuentran en el
citoplasma, en tanto que en los eucariotas el rRNA se localiza en el citoplasma (en los
ribosomas) y el mRNA y el tRNA se encuentran en el núcleo, mitocondrias, cloroplastos y
citoplasma.
Los tRNAs son moléculas pequeñas (23000 – 30000 de peso molecular) que actúan como
portadores de aminoácidos específicos. Durante la síntesis de proteínas, cada uno de los 20
aminoácidos más comunes tiene al menos un tRNA específico que lo conduce hasta el
mRNA que se encuentra unido al ribosoma. Una vez allí, el tRNA transfiere el aminoácido
correspondiente a la cadena polipeptídica en crecimiento.
El rRNA constituye hasta el 65% del peso de los ribosomas y se divide en tres tipos, a
saber: rRNA 23S, 16S y 5S, dependiendo de su capacidad para sedimentar en la
centrifugación. Durante la síntesis de proteínas, el mRNA se une al ribosoma, y un tRNA se
adhiere al mRNA y transfiere su aminoácido a la cadena polipeptídica en crecimiento; el
ribosoma se mueve entonces a lo largo
Jones, C. W. (1984) Bacterial respiration and photosynthesis. In: Cole, J. A. and Knowles,
C. J. (eds.). Aspects of microbiology, series N°. 11. Van NostrandRheinhold, London.
BIOLOGÍA MOLECULAR
4.1.1. Introducción
La molécula de DNA tiene polaridad porque los nucleótidos están unidos por su residuo
fosfato, cada uno de los cuales une el átomo de carbono 3´de una molécula de
desoxirribosa, con el átomo de carbono 5´de la siguiente molécula de desoxirribosa. Lo
anterior de un enlace fosfodiéster 3´-5´y, por convención, las secuencias de DNA se
escriben con el radical fosforil libre a la izquierda. Las secuencias del lado 5´de un
nucleótido a menudo se denominan “cuesta arriba” y las del lado 3´se denominan “cuesta
abajo”. Además de las bases comunes descritas anteriormente, pueden surgir algunas bases
raras mediante la adición de grupos metil e hidroxi, como la base hidroximetilcitosina que
reemplaza a la citosina en algunos bacteriófagos.
4.1.3. Generalmente el DNA es una hélice doble
Los primeros experimentos químicos demostraron que la adenina y la timina, así como la
guanina y la citosina, se presentan en cantidades equimolares en el DNA. Con esta
información y con datos obtenidos por cristalografía de rayos X, Watson y Crick pudieron
proponer su modelo tridimensional para la estructura del DNA. Concluyeron que la cadena
de polinucleótidos es una doble hélice, el diámetro de la cadena es de 2nm, la cadena
cambia de dirección cada 3-4nm, la distancia entre bases es de 0.34nm y la hélice se
compone de dos cadenas de polinucleótidos.(figura 4.1 y 4.2).
El esqueleto de las dos cadenas que se enrollan entre sí están formadas por grupos azúcar-
fosfato de polaridad opuesta. Las bases están dispuestas en ángulos rectos con respecto al
esqueleto hacia el centro de la molécula, lo que permite la unión de la guanina con la
citosina y de la adenina con la timina mediante enlace hidrógeno. El hecho de que las bases
se unan sólo en estas combinaciones es una característica del DNA.
Las moléculas deDNA sólo se pueden analizar con ayuda de un microscopio electrónico y
se ha encontrado que aparecen de diversas formas en diferentes organismos. El DNA de los
procariotas es de forma circular y se dice que estos organismos tienen un solo cromosoma.
El contenido de DNA en estas bacterias es bajo como en las células de Escherichia coli
(3.8X 103 pares de kilobases). Los eucariotas tienen complejidad genética mayor y grandes
cantidades de DNA. Las moléculas de DNA lineal tienen la forma de los cromosomas que
están ubicados en el núcleo. Los eucariotas inferiores, como los hongos, tienen poca
cantidad de DNA. Por ejemplo, la levadura Saccharomyces cerevisiae tiene 34 pequeños
cromosomas con aproximadamente 14 X 103pares de kilobases por célula. La cantidad de
DNA tiende a aumentar en los organismos más complejos, por ejemplo, las células del
hombre contienen 5.6 X 106 pares de kilobases, pero, en particular, las plantas y los
anfibios parecen tener mucho más DNA. La rana tiene 45 X 106 pares.
Los cromosomas de los eucariotas tienen estructuras características determinadas por las
proteínas (histonas) asociadas al DNA. Tanto las moléculas de DNA circular como las de
los cromosomas lineales, se enrollan varias veces sobre sí mismas, lo cual reduce la
longitud de la estructura, misma que es estabilizada por las proteínas asociadas. En las
células humanas el DNA se extenderá hasta 230nm de longitud, pero en el núcleo está
empaquetado en un organelo cuyo diámetro es de aproximadamente 5 X 10 -3nm.
El empaquetamiento del DNA de los cromosomas eucarióticos está asociado con muchas
proteínas, siendo las más estudiadas las histonas las cuales son responsables de la estructura
de la cromatina (fibras de nucleoproteínas) y en el transcurso de la evolución se han
conservado en gran medida.
Figura 4.1. Asociación de bases de dos cadenas de DNA( Tomado de Watson, J.D..Tooze.
J. y Kurtz.D.T.(1983).
Cuando una célula se divide en dos, cada una de las hijas contiene el complemento total de
información genética (excepto en las divisiones que originan óvulos y espermatozoides). El
DNA debe replicarse en forma precisa; lo cual se logra mediante la separación de las dos
cadenas, seguidas por la asociación de los nucleótidos de las hebras sencillas con las bases
complementarias mediante puentes de hidrogeno ( figura 4.2).
Esto significa la asociación de la guanina con la citosina y la de la cadena sencilla, los
primeros se unen entre sí. La síntesis del DNA nuevo la realizan las enzimas conocidas
como DNA polimerasas. El DNA se sintetiza en forma continua sobre una cadena del DNA
(cadena 3´- 5´) conocida como cadena principal, empero, la cadena 3´-5´está mal orientada
para la síntesis continua mediante la enzima DNA polimerasa. En esta cadena de DNA, la
síntesis ocurre en fragmentos de aproximadamente 100 nucleótidos, llamados fragmentos
de Okasaki (figura 4.3).
La replicación del DNA significa, por lo tanto, la asociación de una cadena original con una
nueva y se dice es semiconservativa. Hay otras enzimas que participan en la síntesis de
DNA. Entre éstas están el ácido ribonucleico (RNA), polimerasas y nucleasas, ya que las
moléculas de acido ribonucleico actúan como iniciadoras de la replicación del DNA, y la
DNA ligasa que sirve para unir entre sí fragmentos de Okasaki adyacentes. Hay otras
enzimas encargadas de relajar el enrollamiento del DNA para permitir la replicación en las
horquillas de replicación. El proceso de tal actividad es más complicado en los eucariotas
debido a la estructura cromosómica más compleja.
En E. coli, la replicación del DNA comienza en un sitio específico del cromosoma llamado
Ori C. Este es un tramo de 440 pares de bases (pb) cuya función normal da por resultado la
replicación del DNA lejos de este origen en ambas direcciones. El análisis de otros sitios de
iniciación de replicación de DNA procariótico han revelado regiones conservadas repetidas
de 12 pb con zonas espaciadoras de 16 pb. Probablemente éstas permiten la unión de las
proteínas al DNA en las secuencias conservadas y la iniciación de la replicación del DNA.
Aunque la replicación del DNA en los eucariotas se comprende menos, se han hecho
algunos adelantos mediante el uso de la levadura Saccharomyces cerevisiaecomo sistema
modelo. A partir de este organismo se han aislado secuencias que permiten replicar
pequeñas moléculas circulares de DNA llamadas plásmidos. Las secuencias se denominan
Autonomously Replicating Sequences, ARS, (Secuencias de replicación autónoma), es
posible que funcionen de forma similar a Ori C.
Figura 4.2. Mediante la replicación semiconservativa del DNA se generan hélices hijas
idénticas dobles. ( Tomado de Watson, J.D..Tooze. J. y Kurtz.D.T.(1983).
Figura 4.3. Síntesis continua y discontinua de dos hebras de DNA durante la replicación.
El RNA mensajero que transfiere la información genética es transcrito del DNA mediante
una enzima RNA polimerasa dependiente del DNA. Para que esto ocurra las cadenas de
DNA deben separarse sólo una cadena, se usa como molde con las bases de RNA unidas
por puentes de hidrógeno con el DNA. La RNA polimerasa dependiente del DNA, cataliza
la formación de enlaces fosfodiéster entre las unidades nucleotídicas que parten del extremo
5´del DNA (figura 4.4). E.coliposee sólo una de estas polimerasas, pero los eucariotas tiene
por lo menos cuatro clases, que posiblemente reconocen secuencias distintas de unión o
iniciación.
La RNA polimerasa de E. coli, que ha sido objeto de estudios detallados, es un tetrámero
(cuatro subunidades). Se necesita un polipéptido adicional denominado sigma para la
iniciación exacta; algunas veces, se requiere de un factor, rho, para terminar la
transcripción.
Figura 4.4. Una cadena de RNA se sintetiza ( transcribe) sobre una región local de hebra
sencilla de DNA.( Tomado de Watson, J.D..Tooze. J. y Kurtz.D.T.(1983).
El RNA mensajero (mRNA) es sólo uno de varios tipos de moléculas de RNA que se
encuentran en la célula. El tamaño del RNA varía entre procariotas y eucariotas. En los
primeros, a menudo se codifican varios mensajes en una sola molécula de m RNA, pero en
los eucariotas los transcritos primarios, los m RNA, a menudo son mucho más grandes que
el m RNA maduro final, el cual es el resultado del proceso del m RNA. Una característica
importante del m RNA es que no sólo contiene información para proteínas específicas, sino
también otras secuencias laterales que intervienen en el mecanismo de la síntesis de
proteínas.
El código en si se determina por una secuencia de tres nucleótidos (un triplete) para cada
aminoácido. Como esto produce 64 combinaciones posibles y hay 20 aminoácidos,
entonces algunos aminoácidos son codificados por más de un triplete. El triplete que da la
clave a un aminoácido, como en el m RNA, se conoce como codón. Las posibles
combinaciones del código genético se muestran en la tabla 4.1 para los codones de los 20
aminoácidos presentes en las proteínas. Además, se usan tres codones como señales de
detención durante la traducción, los cuales se denominan codones sin sentido.
Codones indicados en la tabla 4.1 muestran que las dos primeras bases tienen el efecto
mayor al especificar un aminoácido particular, pero que la tercera base puede variar a
menudo sin afectar al sentido del codón. Por ejemplo, tanto el codón UUU como el UUC,
conducen a la incorporación del aminoácido fenilalanina.
El codón AUG para la metionina casi siempre se usa como codón de iniciación para que el
primer aminoácido sea incorporado en un polipéptido con una sucesión de tripletes que
especifica a los aminoácidos hasta que se llegue a un codón sin sentido y se termina la
traducción.
La fase final de la traducción ocurre cuando se llega a un codón sin sentido y no hay tRNA
correspondiente. Luego, el polipéptido es hidrolisado lejos del ultimo tRNA; se disocia el
mRNA y las subunidades ribosomales. En la práctica es común encontrar varios ribosomas
espaciados en una molecula de mRNA separados por unas 80-100 bases. Esas estructuras se
denominan polisomas.
4.5 MUTACIÓN
Una vez que se ha descrito el material hereditario, su código y su traducción, es más fácil
entender la naturaleza de las mutaciones. Estas se originan debido a perturbaciones en el
código genético y ocasionan cambios en la regulación o funcionamiento de las proteínas.
Por ejemplo, diferentes sistemas celulares inician mecanismos de reparación de DNA, que
mantiene al DNA, si este se daña. Son útiles dos conceptos acerca del origen de las
mutaciones, que son,: que las mutaciones pueden surgir por mala replicación de DNA, es
decir, por errores en la replicación del DNA, o bien, por una mala reparación, es decir, por
errores durante la reparación del DNA dañado.
Parece ser que la replicación del DNA es mas discriminatoria en los eucariontes, como
también la reparación del daño del DNA inducido por agentes mutagénicos. Por lo tanto
existe una tendencia de fagos a procariotas y a eucariotas inferiores hacia la presencia de
reparación errónea como fuente de mutación.
4.5.1 Mutaciones cromosómicas
La nucleasa S1 digiere únicamente DNA o RNA de una sola hebra. El mapeo con la
mucleasa S1 es una herramienta muy útil para ubicar el sito de transcripción en el DNA.
Mediante la hibridación de una RNA transcriptasa a DNA de una sola hebra, se produce un
hibrido resistente a la digestión por la nucleasa S1. Así, es posible desnaturalizar el híbrido
DNA-RNA y analizar y separar el DNA.
En forma rutinaria, las moléculas de DNA se analizan mediante electroforesis en gel. El gel
es una red compleja de moléculas poliméricas y distancia que el DNA migra a
Biología molecular
cada 256 pares de bases. Por lo tanto, es probable ya que un gen típico de procariotas tiene
de 1 a 2 pares de kilobases (1000 bases), que por lo menos algunas endonucleasas de
restricción que reconocen 6 pares de bases, no corten tal secuencia. En los eucariotas los
genes pueden ser más grandes y contener secuencias interpuestas llamadas intrones, que
pueden causar complicaciones.
Ingeniería genética
El RNA crudo se pasa a través de una columna que contiene secuencias de poli U o poli T
unidas a un soporte sólido, que une a las secuencias de polo A del mRNA. Así, la
transcriptasa reversa puede usarse para sintetizar una molécula de DNA de una sola hebra
la cual se puede convertir posteriormente a una hebra doble mediante una DNA polimerasa
(figura 4.9). El cDNA se puede incorporar en vectores para su amplificación y análisis.
En ciertos casos los anticuerpos monoclonales se pueden usar para aislar un mRNA solo a
partir de los componentes celulares. Los anticuerpos monoclonales se obtienen, se inyectan
a un ratón o a un conejo con la proteína para la que se requiere el cDNA. El animal se
sacrifica posteriormente para obtener las células del bazo, las cuales se fusionan con células
de mieloma. Las células denominadas hibridomas producen un anticuerpo muy específico
para la proteína blanco (figura 4.10). El anticuerpo se utiliza entonces para precipitar
mRNA para la proteína de interés mientras se produce en el ribosoma.
Biología molecular
Así, el mRNA se separa del anticuerpo como ya se describió y se obtiene una copia de
cDNA. Puesto que los genes de los eucariotas superiores a menudo contienen secuencias
interpuestas no codificadoras llamadas intrones, la producción de cDNA es crítica en la
representación de secuencias codificadoras cuando es necesaria la expresión en los
organismos inferiores. Lo anterior evita los problemas asociados con el reconocimiento y
proceso de secuencias no codificadoras.
La nucleasa S1 dirige únicamente DNA O RNA de una sola hebra.El mapeo con la
nucleasa S1 es una herramienta muy útil para ubicar el sitio de transcripción en el DNA.
Mediante la hibridación de una RNA transcripatasa a DNA de una sola hebra, se produce
un hibrido resistente a la digestión por la nucleasa S1. Así, es posible desnaturalizar el
hibrido DNA-RNA y analizar y separar el DNA.
En forma rutinaria, las moléculas de DNA se analizan mediante electroforesis en gel.El gel
es una red compleja de moléculas poliméricas y la distancia que le DNA migran a
través del gel refleja su tamaño, el cual se puede estimar usando fragmento de DNA
marcador como referencia. La agarosa se usa en le análisis de moléculas de varios cientos
hasta 20 000 pares de bases, en tanto que la poliacrilamida se usa para fragmentos de DNA
mas pequeños. El DNA se observa usando luz UV después de teñirlo con bromuro de etidio
(figura 4.11).
La secuencia de bases del DNA se puede determinar usando uno de dos métodos. En uno
de ellos, creado por Maxam y Gilbert, se necesita el rompimiento de la hebra en bases
específicas, como lo que seobtienemoléculas de tamaño característico. El segundo método,
mas requiere la síntesis de DNA en presencia de los nucleótidos, pero con la adición de un
nucleótido análogo que irrumpe la síntesis (un trifosfato de disoxinucleósido). Ambos
métodos utilizan una cantidad limitante de DNA o reactivo de terminación, por lo que la
frecuencia d estos eventos es aleatoria y ocurre ne cada sitio disponible en el DNA. Las
moléculas de tamaño diferente son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida y
se observan mediante auto radiografía del DNA marcado radiactivamente.