1. Defina y explique cómo se relacionan los siguientes conceptos.

Incluya, cuando
corresponda, el símbolo y ecuación que representa al concepto:

• Factor de separación

Define que tan selectiva es una columna para separar dos picos. La columna
puede ser selectiva a una separación, que se identifica por un valor alto de
este factor. El factor de selectividad α de una columna para dos especies A
y B se define como:

Donde KB es el coeficiente de distribución para la especie más fuertemente

retenida B, y KA es el coeficiente de distribución para la menos retenida, o
que eluye con más rapidez, la especie A. Según esta definición α siempre es
mayor que la unidad, porque B es el compuesto más retenido (de > tR).
Donde k’B y k’B son los factores de capacidad de B y de A, respectivamente.

• Resolución

Es el parámetro que expresa el grado de separación que se puede obtener

en un sistema cromatográfico para dos componentes dados. Relaciona la
capacidad separadora de un sistema cromatográfico para dos componentes.

Se define como:

1
 Donde Rs es la resolución, tRA y tRB son los tiempos de retención de los
componentes A y B, y aA y aB son las anchuras de los picos del
cromatograma de los anteriores componentes.

La resolución puede observarse directamente sobre el cromatograma de

picos. Se tendrá una buena resolución si los picos no se solapan, y está
perfectamente delimitado cada pico, sin que coincida el final de uno con el
principio del siguiente.

Eficiencia

Para definir la eficacia se utiliza el concepto de piso teórico, y se define éste

como la sección teórico-transversal en la cual se realiza el equilibrio de
partición durante el flujo de fase móvil. Cuanto mayor se el número de platos
teórico (N) mayor será la eficiencia de la columna.

El número de platos teóricos mide la capacidad de la columna para separar

los componentes, no la retención de los mismos. La eficiencia o el número
de platos se puede observar directamente a partir del cromatograma,
observando la agudeza de los picos.

Donde N es el número de platos teóricos, L es la longitud de la columna, H es

la altura de cada plato, t'R es el tiempo corregido de retención de un
componente y ai es la anchura del pico cromatográfico. Y:

2
 Si H tiene un valor pequeño, la distancia entre platos es menor y por tanto la
eficiencia será mayor. Por el contrario, si H es grande la columna es poco
eficiente para separar ese componente ya que sus moléculas estarán muy
difundidas.

La velocidad de la fase móvil influye en la eficiencia del sistema

cromatográfico, ya que si la velocidad es pequeña los componentes tendrán
más tiempo parta que se pueda realizar el equilibrio de reparto, por lo que el
número de platos será mayor y la altura de los platos menor.

• Factor de retención o factor de capacidad:

Es un parámetro que describe la velocidad de migración de los solutos

(analitos) en la columna. Para una especie A, el factor de capacidad k’ A se
define como:

Donde KA es el coeficiente de distribución de la especie A, VS es el volumen

de la fase estacionaria y VS es el volumen de la fase móvil. Cuando el factor
de capacidad para una especie es mucho menor que la unidad, la elución
tiene lugar tan rápidamente que es difícil determinar con exactitud los tiempos
de retención, estos son demasiado cortos. En cambio cuando el factor de
retención es del orden de 20 o 30 o tal vez mayor, los tiempos de retención
son excesivamente largos.

3
• Tiempo de retención (tR)

Tiempo transcurrido desde la introducción de la muestra hasta que el

componente alcanza el detector.

Tiempo de retención de un componente: El tiempo de retención (ti o tR) es

el tiempo transcurrido entre el instante en que se introduce la mezcla y el
instante en que se detecta la señal propia del componente en su máxima
intensidad. Los tiempos de retención no son reproducibles, ni siquiera en una
misma columna cromatografía.

Tiempo de retención corregido de un componente (t'i): Es el tiempo que

transcurre entre la aparición de la señal que corresponde a un componente
inerte y a la del componente considerado:

Tiempo de retención relativa (rip): Es la razón entre los tiempos de

retención corregidos del componente considerado, i, y de otro, p, que se toma
como patrón de referencia:

• Tiempo muerto (tM)

4
 Tiempo requerido para que una especie no retenida alcance el detector. Es
el tiempo de migración de la especie no retenida; es el tiempo necesario para
que, por término medio una molécula de la fase móvil pase a través de la
columna.

• Ancho de banda (sigma total)

Corresponde al intervalo de longitudes de onda comprendido entre los puntos

en donde la transmitancia (de la radiación emitida por la fuente y que llega a
la rendija de salida) alcanza la mitad de su máximo de transmisión o el
intervalo de 6 longitudes de onda que contiene el 75% de la energía radiante
que proviene del monocromador. La anchura de banda se puede expresar en
términos de la apertura o amplitud de las rendijas, S, y la dispersión lineal
recíproca del monocromador como:
𝑆𝐵𝑊 = 𝑆. 𝐷 − 1

• Cromatografía líquida en fase normal

Se basa en la hidrofilia y la lipofilia usando una fase estacionaria polar y una

fase móvil menos polar. Así, los compuestos hidrofóbicos eluye más
rápidamente que los hidrofílicos. La fase está constituida por una matriz de
sílica a la que se unen grupos silanol, amino y nitrilo que le confieren
polaridad relativa respecto a la fase móvil.

• Cromatografía líquida en fase reversa

También se basa en la hidrofilia y la lipofilia. La fase estacionaria consiste en

una matriz de sílica empacada que lleva unida covalentemente una cadena
alquílica de n-carbonos (por ejemplo, C-8 significa que se incorpora una

5
 cadena octil y C-18 una octadecil). La más hidrofóbica es, en este caso, la
fase estacionaria, eluyendo los compuestos hidrofílicos más rápidamente que
los hidrofóbicos, que interaccionan con la fase estacionaria. También hay
empaquetamientos poliméricos alternativos a la sílice que ofrecen similares
características con mayor resistencia dinámica y más amplio rango de
estabilidad de pH. Existen dos variantes de la cromatografía en fase reversa:

Supresión iónica, se utiliza modificando el pH de la fase móvil para ácidos y

bases débiles, de forma que el analito pasa a ser más lipófilo y se mejora la
separación porque se establece más interacción con la columna.

Formación de pares iónicos, se utiliza para compuestos que tienen grupos

funcionales biológicos que serán unidos a un contraión. El contraión
+
se asocia al analito y lo desplaza del par iónico normal (corrientemente Na
-
o Cl ) mejorando su hidrofobicidad. Para analitos catiónicos se utilizan grupos
alquil o aril sulfonatos y para analitos aniónicos aminas cuaternarias.

Gradiente de elución

Este tipo de elución se utiliza cuando se tiene una mezcla compleja de

componentes con polaridad diferente.
Los diferentes compuestos son eluidos modificando gradualmente la
composición de la fase móvil durante el transcurso de la cromatografía
(aumentando la fuerza iónica, modificando la polaridad, etc.). El resultado
sobre la elución es un acortamiento de los tiempos de retención, el factor de
retención disminuye conforme aumenta la variación de flujo del gradiente y el
compuesto eluye. Este gradiente puede llevarse a cabo de forma lineal o
escalonada o linealmente escalonada.
La predicción mediante ecuaciones que describan la separación de
componentes por elución en gradiente es muy compleja, por lo que se parte

6
 de las ecuaciones empleadas para la isocrática y se adaptan casi
empíricamente. La relación del cambio de la composición de la fase móvil
durante el transcurso de la elución en gradiente puede ser descrita por la
pendiente del gradiente como (∆∅/𝑡𝐺 ) dónde (G) simboliza la progresión del

gradiente:

Siendo (∅) el volumen de fase del modificador, (tG) el tiempo del gradiente,

(S) la pendiente del (ln k') frente a (∅) (o la relación lineal de fuerza del
solvente).

 Tiempo de retención: 𝒕𝑮 = 𝒕𝟎.𝒌̅. 𝐥𝐨𝐠(𝟐, 𝟑 .𝒌̅𝟎/𝒌̅)

 Factor de capacidad:

 Resolución: 𝑹 = [(𝟏/𝟒).(𝜶 − 𝟏)/(𝜶). 𝑵𝟏/𝟐].⌊𝒌̅/(𝟏 + 𝒌̅)⌋

En el caso de que converjan diferentes solutos, los valores de gradientes (G)

para los diferentes solutos no serán idénticos, ya que (G) es proporcional a
(S). Cuando la concentración de gradiente es lineal, el gradiente (G) es
constante durante toda la elución.

• Elución isocrática

Los compuestos eluyen usando una fase móvil de composición constante

durante toda la cromatografía. Todos los compuestos acaban migrando a
través de la columna hasta el final. Sin embargo, cada uno migra con una
velocidad diferente, resultando en una relación de elución más rápida o más
lenta. Este tipo de elución es bastante simple y barato, pero la resolución de
algunos compuestos es cuestionable y el eluido puede no ser obtenido en un
plazo de tiempo adecuado.

7
 La separación de los compuestos mediante elución isocrática puede
describirse utilizando las siguientes ecuaciones:

• Tiempo de retención: 𝒕𝑹 = 𝒕𝒐 . 𝒌̅´+ 𝒕𝒐

• Factor de capacidad: 𝒌̅´ = (𝒕𝑹 − 𝒕𝒐)/𝒕𝟎

• Resolución:

Efecto de la estructura de los compuestos (solutos) y de la composición de

la fase móvil sobre la retención y la resolución.

1. Dibuje estructuras de los siguientes compuestos utilizando las convenciones de

cuña/slash representando los ángulos de enlace adecuados:

Nombre Estructura Propiedades Formula

Compuesto molecular

Acetofenona Densidad:
1030 kg/m3;
C8H8O1
1,03 g/cm3
Punto de Fusión:
293,15 K (20 °C)
Punto de fusión:
475,15 K (202 °C)
Benzofenona Apariencia: Sólido
blanco C13H10O
Densidad:
1110 kg/m3;
1,11 g/cm3

Masa molar:
182.217 g/mol

8
Butilparabeno
Masa molar: C11H14O3
194.227
g/mol

Propiofenona Apariencia:
líquido incoloro a C9H10O
amarillo pálido

Densidad: 1,01
g·cm-3

Punto de Fusión:
18 °C

Masa molar: 134.18

g/mol

Etilparabeno Masa molar:

166,16 C9H10O3
g mol -1

Punto de fusión:
115-
118 ° C

Punto de
ebullición: 297-
298 ° C
Propilparabeno Apariencia: sólido
C10H12O3
Masa molar: 180,18
g mol -1

Densidad:
01:28 g cm -3 (25 °
C, sólido)
1.063 g cm -3 (102
°
C, líquido)

Punto de fusión:
369,2 K

9
 Ketoprofeno
Masa molecular:
254.28 g/mol C16H14O3

Punto de fusión: 94
-
97 ºC

3-nitrofenol
Masa molecular: C6H5NO3
139,11 g/mol

Punto de ebullición:
194 ° C / 70 mmHg
(Lit).

Punto de fusión: 93-

103 ° C

4-nitrofenol Apariencia: Pilares

incoloros o
amarillos C6H5NO3

Masa molar: 139,11

g mol -1

Punto de ebullición:
279 ° C (534 ° F;
552 K)

2. Sobre la base de sus estructuras:

a) Prediga el orden de elución de los compuestos, partiendo del menos al más

retenido en RPLC (Cromatografía líquida en fase reversa). Justifique su
respuesta.

¿Cuáles son los principales usos de cada uno de estos compuestos?

• Acetofenona

10
 Acetofenona comercial puede ser obtenido a partir de benceno con anhídrido
acético o cloruro de acetilo de Friedel-Crafts proceso. Se puede también
obtenerse por medio de una oxidación de etilbenceno ir, como un
subproducto decumeno o de acrilonitrilo.

Se utiliza como un catalizador de polimerización para la fabricación

deolefinas. Se utiliza como producto intermedio para los productos
farmacéuticos, agroquímicos y otros compuestos orgánicos.

También se ha utilizado como una droga para inducir el sueño. Se utiliza en

su gas lacrimógeno (sobre todo en la forma de acetofenona cloro) y la guerra.
Se utiliza como un disolvente de plásticos, resinas, éteres de celulosa y
ésteres. El dímero (dipnone) se utiliza como plastificante. Actophenone y sus
derivados, además de haber sustituido saturados alquilos, oxigenada grupos
alquilo, tioéter grupos, más los grupos aromáticos, alifáticos insaturados
cadenas laterales, y otros grupos funcionales, son los ingredientes de sabor
fragancia en jabones, detergentes, cosméticos y perfumes y como en los
alimentos, bebidas y tabaco.

• Benzofenona

Se puede utilizar como un iniciador de foto en aplicaciones de curado UV,

tales como tintas, imágenes, y barnices de acabado en la industria de la
impresión. Benzofenona evita que la luz ultravioleta de los olores nocivos y
los colores en los productos tales como perfumes y jabones. También se
puede añadir a los envases de plástico como un bloqueador de UV. Su uso
permite a los fabricantes para empaquetar el producto en vidrio transparente
o de plástico. Sin ella, sería necesario envases opacos u oscuros.

11
 En aplicaciones biológicas, benzofenonas se han utilizado ampliamente
como sondas fotofísicas para identificar y mapear las interacciones
péptidoproteína.

• Butilparabeno

El butilparabeno es un polvo cristalino inodoro y incoloro a temperatura

ambiente, muy utilizada como conservante en alimentación, medicina y
cosmética. Lo encontraréis muy a menudo; se utiliza muchísimo en muchos
productos del cuidado de la piel e incluso en medicinas tan comunes como el
ibuprofeno. Es el antifúngico más potente de entre los parabenos. De hecho,
su potencial microbiano es mayor que el del metilparabeno, el propilparabeno
o el etilparabeno. Es particularmente eficaz contra mohos y levaduras, y
menos contra bacterias.

• Propiofenona

Reactivos comunes, productos farmacéuticos, perfumes y la industria de

síntesis orgánica.

• Etilparabeno

Son utilizados como conservadores protegiendo a los productos de las

levaduras y los hongos. No obstante, no son muy efectivos contra las
bacterias. Su actividad es independiente de la acidez, y adicionalmente, son
poco solubles, lo que limita sus aplicaciones (antimicrobianos y ciertas
propiedades antioxidantes) en formas farmacéuticas liquidas como jarabes,
soluciones, suspensiones e inyectables. Son usados en una gran variedad
de alimentos y cosméticos.

12
• Propilparabeno

Usa como conservador para cosméticos (es el segundo producto de este tipo
más utilizado) y en combinación con metilparabeno se utiliza en
formulaciones farmacéuticas parentales. Para productos de cuidado para la
piel y comida. Tiene una toxicidad generalmente baja por ingestión. Puede
irritar los ojos, la piel, el tracto intestinal y el respiratorio con el contacto, la
ingestión y la inhalación, respectivamente. También es combustible.

• Ketoprofeno

Es un antiinflamatorio no esteroideo dotado de potente actividad analgésica,

muy eficaz en el tratamiento de enfermedades reumáticas, traumatológicas y
procesos inflamatorios en general. El principio activo ketoprofeno se utiliza
en el tratamiento de la artritis reumatoide, osteoartrosis, espondilitis
anquilosante y episodios agudos de gota.

• 3-nitrofenol
Usa principalmente para manufacturar tinturas, pigmentos, productos de
caucho y sustancias funguicidas.

• 4-nitrofenol

Es usado principalmente en la manufactura de medicamentos, fungicidas,

tinturas y para oscurecer el cuero. Es un producto de la degradación de
plaguicidas como el paratión y el fluoridifen. Puede producir enfermedades
de la sangre. Los fenómenos observados en personas por inhalación del 4‐
nitrofenol son sensación de quemazón, vértigo y debilidad. La inhalación en
altas concentraciones puede originar un aumento del metabolismo. También

13
 puede absorberse por la piel. En contacto con los ojos produce
enrojecimiento y dolor.

3. Ejecute el HPLC simulator (http://www.hplcsimulator.org/ ).

4. Configure el simulador así:

Compuesto Tiempo de factor de Ancho de banda

retención (tR) retención (k’) (sigma total)
Acetofenona 1,3431 1,5254 0,7528

Butilparabeno 7,494 13,0915 4,1375

Ketoprofeno 3,5642 5,702 1,9712

Benzofenona
6,6901 11,5799 3,6941

Propiofenona 2,4337 3,5762 1,3495

14
3-nitrofenol 1,3493 1,5371 0,7562
Etilparabeno 2,007 2,7739 1,1154

Propilparabeno 3,8315 6,2047 2,1185

4-nitrofenol 1,2619 1,3728 0,7088

Acetofenona

15
Benzofenona

Butilparabeno

Propiofenona

Etilparabeno

16
Propilparabeno

Ketoprofeno

3-nitrofenol

4-nitrofenol

17
 Cambie la composición de la fase móvil de metanol a acetonitrilo:

Compuesto Tiempo de factor de Ancho de banda

retención (tR) retención (k’) (sigma total)
Acetofenona 0,5208 0,8088 0,4055
Butilparabeno 2,0296 1,6112 0,7749

Ketoprofeno 1,0948 1,114 0,5442

Benzofenona 3,6878 2,493 1,1888

Propiofenona 1,3452 1,2472 0,6056

3-nitrofenol 0,4345 0,7629 0,385
Etilparabeno 0,4012 0,7452 0,3771

Propilparabeno 0,9498 1,0369 0,5089

4-nitrofenol 0,376 0,7317 0,3711

18
Acetofenona

Benzofenona

19
Butilparabeno

Propiofenona

Etilparabeno

20
Propilparabeno

Ketoprofeno

3-nitrofenol

21
4-nitrofenol

Explique por qué se da el cambio en los tiempos de retención y en la

separación de los compuestos cuando el metanol es sustituido por el
acetonitrilo. ¿En qué caso se obtiene una mejor separación?

El mecanismo de separación en cromatografía de fase reversa se basa en la

distribución del soluto entre la fase móvil y la estacionaria. La elución o el arrastre
del soluto mediante la fase móvil, se inicia con un eluyente de elevada polaridad
como es el caso de una solución acuosa; a esta fase móvil inicial se le denomina
fase A. Hay que tomar en cuenta que la polaridad de la fase móvil A debe ser
suficientemente baja como para disolver al soluto de carácter hidrofóbico y
suficientemente alta como para permitir que el soluto se una a la matriz hidrofóbica.

Para lograr la desorción secuencial de los solutos unidos a la matriz, se disminuye

la polaridad de la fase móvil. Esto se hace mediante la adición gradual de solventes
orgánicos a la fase móvil A como son el metanol o el acetonitrilo. La fase móvil final,
denominada fase B, es la que presenta menor polaridad y tiene el mayor poder de
elución. La fuerza del solvente está definida cuantitativamente por el parámetro εº.

22
¿Cuál es la importancia del agua en la composición de la fase móvil?

El agua es un compuesto de alta polaridad que se adsorberá fuertemente sobre la

superficie, evitando la adsorción de los solutos, por lo que estos no se retendrán. La
presencia de moléculas de agua en la fase móvil conduce a una desactivación de
la superficie de la fase estacionaria.

El agua es el disolvente menos fuerte para la elución de solutos en cromatografía

de la fase reversa, dando origen a tiempos de retención muy elevados.

g) Calcule la diferencia en los cambios de energía libre (ΔΔG) para la retención

de los solutos en las fases móviles MeOH/Agua, 50/50 y ACN/Agua, 50/50,
de acuerdo con:

h) ¿Cuáles solutos poseen las diferencias más grandes y más pequeñas en la

energía libre asociada a la retención comparando las fases móviles
MeOH/Agua (50/50) y ACN/Agua (50/50)? Explique la naturaleza de esos
cambios.

23
i) Con los hallazgos realizados hasta ahora, elabore una conclusión sobre el
efecto de la estructura de los solutos y la composición de la fase móvil
sobre la retención y la resolución.

Efecto del porcentaje del modificador en la composición de la fase móvil sobre

la retención y la resolución.

Revisando la información de la gráfica obtenemos los siguientes datos:

24
𝑡𝑅𝐴 = 1,185 𝑚𝑖𝑛

𝜎𝑇𝐴 = 0,5485 𝑠

𝑡𝑅𝐵 = 1,196 𝑚𝑖𝑛

𝜎𝑇𝐵 = 0,5490 𝑠

a) Calcule el tiempo muerto.

Usamos la siguiente ecuación:

𝑘′ ∗ 𝑡𝑚 = 𝑡𝑅 − 𝑡𝑚

𝑘′ ∗ 𝑡𝑚 + 𝑡𝑚 = 𝑡𝑅

(𝑘′ + 1) ∗ 𝑡𝑚 = 𝑡𝑅

𝑡𝑚𝐴 = 1,127 𝑚𝑖𝑛

𝑡𝑚𝐵 = 1,136 𝑚𝑖𝑛

25
b) Calcule la resolución, α, para los dos compuestos.

Calculamos la retención relativa o selectividad α mediante la siguiente ecuación:

𝛼 = 1,0345

Calculamos la resolución mediante la siguiente ecuación:

𝑅𝑠 = (2∆𝑡𝑅)/(𝑤𝐴 + 𝑤𝐵)

Dónde:

∆𝑡𝑅 = 𝑡𝑅𝐵 − 𝑡𝑅𝐴 = 1,196 𝑚𝑖𝑛 − 1,185 𝑚𝑖𝑛 = 0,011 𝑚𝑖𝑛 = 0,66 𝑠

𝑤𝐴 = 4𝜎𝑇𝐴 = 4 ∗ 0,5485 𝑠 = 2,194 𝑠

𝑤𝐵 = 4𝜎𝑇𝐵 = 4 ∗ 0,5490 = 2,196 𝑠

Sustituyendo los valores obtenidos calculamos 𝑅𝑠

𝑅𝑠 = (2 ∗ 0,66 𝑠)/(2,194 𝑠 + 2,196 𝑠)

𝑅𝑠 = 0,3

26
3. Cambie gradualmente el porcentaje de metanol en intervalos de 10%
iniciando en 95% y terminando en 5% (95%, 85%, 75%, …, 5%). ¡Para cada una
de las composiciones obtenidas!:

d) Registre el tiempo de retención, el factor de retención y el sigma total para

los dos compuestos. Adjunte una imagen del cromatograma obtenido.

Porcentaje de metanol (85%):

Porcentaje de metanol (75%):

27
Porcentaje de metanol (65%):

28
Porcentaje de metanol (55%):

29
Porcentaje de metanol (45%):

Porcentaje de metanol (35%):

30
Porcentaje de metanol (25%):

Porcentaje de metanol (15%):

31
Porcentaje de metanol (5%):

A continuación se presentan dos tablas donde se resumen el tiempo de retención,

el factor de retención y sigma total para los dos compuestos:

Acetofenona (Compuesto A)
Porcentaje Tiempo retención Factor de Sigma total
Metanol (min) retención (s)
(% V/V)
95 1,185 0,0516 0,5485
85 1,1802 0,1096 0,5654
75 1,3109 0,2325 0,6243
65 1,5885 0,4935 0,7571
55 2,1774 1,0472 1,0401
45 3,4272 2,2222 1,6380
35 6,0793 4,7157 2,8960

32
 25 11,7073 10,0070 5,5334
15 23,6504 21,2358 11,0663
5 48,9946 45,0642 22,7749

Etilparabeno (Compuesto B)
Porcentaje Tiempo retención Factor de Sigma total
Metanol (min) retención (s)
(% V/V)
95 1,196 0,0526 0,5490
85 1,1987 0,1270 0,5739
75 1,3897 0,3066 0,6601
65 1,8506 0,7399 0,8785
55 2,9628 1,7856 1,4101
45 5,6471 4,3094 2,6934
35 12,1254 10,4002 5,7717
25 27,7601 25,0997 13,1177
15 65,4928 60,5755 30,6429
5 156,5566 146,1926 72,7735

4. Con los hallazgos realizados en esta sección, elabore una conclusión sobre
el efecto del porcentaje del modificador en la composición de la fase móvil
sobre la retención y la resolución. Si fuera contratado en un laboratorio para
separar, por medio de cromatografía líquida, de una mezcla los compuestos
acetofenona y etilparabeno ¿cuál sería la mejor composición de fase móvil
a emplear? Justifique su respuesta.

33
Conclusiones

34
 Referencias Bibliográficas

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http://es.scribd.com/doc/123401090/Acetofenona

E-Centro. (2014). Benzofenona, Utiliza, Síntesis, La química orgánica. Recuperado de

http://centrodeartigo.com/articulos-utiles/article_100005.html

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http://rebeautys.com/2013/04/22/butilparabeno-borrador/

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http://pediamecum.es/wpcontent/farmacos/Ketoprofeno.pdf

Alcazares, J. (2009). Disminución del contenido en p-nitrofenol de disoluciones

acuosas mediante membranas líquidas en emulsión utilizando un mecanismode
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35