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Cite este artículo como: Kambiz Varmira, Ghobad Mohammadi, Majid Mahmoudi, Reza Khodarahmi,
Khodabakhsh Rashidi, Mehdi Hedayati, Hector C. Goicoechea y Ali R. Jalalvand, la fabricación de
una novela biosensor electroquímico enzimática para la determinación de la tirosina en algunas
muestras de alimentos,
Talanta, https://doi.org/10.1016/j.talanta.2018.02.053
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La fabricación de una novela biosensor electroquímico enzimático para
determinación de la tirosina en algunas muestras de alimentos
kambiz Varmira un, Ghobad Mohammadi segundo, Majid Mahmoudi un, Reza Khodarahmi do, Khodabakhsh Rashidi un, Mehdi Hedayati re, Hector C.
Goicoechea mi, Ali R. Jalalvand un*
un Centro de Investigación de aceites y grasas (FREPC), Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), la Universidad de Kermanshah de Ciencias Médicas,
Kermanshah, Irán
segundo Departamento de Farmacia, Facultad de Farmacia, Universidad de Kermanshah de Ciencias Médicas, Kermanshah, Irán
do Biología Médica Centro de Investigación de la Universidad de Ciencias Médicas de Kermanshah, Kermanshah, Irán
re Celular y Molecular del Centro de Investigación de Endocrinología, Instituto de Investigación de Ciencias endocrinos, Universidad Shahid Beheshti de
En este trabajo, la fabricación de una novela y biosensor electroquímico ultrasensible basa en la inmovilización de
metilimidazolio bis (trifluorometilsulfonil) imida / grafeno múltiples paredes nanotubos de carbono-IL / vidrioso
electrodo de carbono para la determinación de L-tirosina en algunos alimentos con alto contenido de tirosina incluyendo queso, huevo y yogur
Fue reportado. La inmovilización de la tirosina hidroxilasa sobre la superficie del biosensor se realizó por
emplear la afinidad y selectividad de proteínas catalíticamente activos hacia sus moléculas diana y de aquí, el
tirosina hidroxilasa cataliza selectivamente la conversión de tirosina a la levodopa que puede ser oxidado a
potenciales menores que la tirosina. Las modificaciones se caracterizaron por impedancia electroquímica
espectroscopia, la voltametría cíclica, la energía dispersiva de espectroscopia de rayos X y microscopía electrónica de barrido.
En condiciones óptimas, el biosensor detecta la tirosina en intervalos de concentración de 0,01 × 10- 9 a 8,0 × 10- 9 mol
L- 1 y 8,0 × 10 9 a 160,0 × 10- 9 mol L- 1 con un límite de detección de 0,009 × 10- 9 mol L- 1. El biosensor pudo
a la determinación selectiva de la tirosina, incluso en presencia de interferentes comunes, por lo tanto, el biosensor era
altamente selectivo. El biosensor también mostró una buena estabilidad operacional, las propiedades antiincrustantes, la sensibilidad,
repetibilidad y reproducibilidad.
Gráficamente abstracto
1
palabras clave: tirosina; tirosina hidroxilasa; levodopa; biosensor; Los alimentos ricos en tirosina.
1. Introducción
L-tirosina (Tyr) es uno de los aminoácidos que es necesario para el mantenimiento del equilibrio nutricional. los
contenido de Tyr en el cuerpo se correlaciona con el estado de salud de la persona [1,2]. Tyr es un precursor de la tiroxina,
sistemas nerviosos [3]. Tyr se puede hacer en el cuerpo de una persona que recibe suficientes cantidades de fenilalanina.
Las personas que padecen fenilcetonuria suelen tomar suplementos de tirosina, ya que no pueden consumir
fenilalanina. Algunos estudios revelaron que los alimentos ricos Tyr tales como queso, cordero, soja, carne de cerdo, pescado, carne de res,
pollo, nueces, semillas, huevos, productos lácteos, frijoles y granos enteros puede mejorar la memoria de las personas bajo estrés [1,2].
Algunas enfermedades como el hipocondrio, la depresión y otras enfermedades psicológicas pueden ser observados en el
ausencia de Tyr [4,5]. Por lo tanto, debido a la importancia nutricional de Tyr, métodos analíticos son eficientes
2
necesaria para su determinación en muestras de alimentos. Muchos métodos analíticos tales como quimioluminiscencia,
electroforesis han sido reportados para la determinación de Tyr [6-10]. Sin embargo, la mayoría de estos métodos son
limitado por algunas desventajas tales como el coste, el tiempo de la preparación de análisis y la muestra. electroquímica
métodos proporcionan una forma simple, de bajo costo y rápida para analizar biológicamente y ecológicamente importante
sustancias. Desafortunadamente, los aminoácidos tienen una respuesta electroquímica pobres en electrodos sólidos, por lo tanto,
se emplean modificaciones químicas para mejorar su respuesta electroquímica. El inconveniente más importante
de estos electrodos modificados químicamente se somete a la rápida ensuciamiento superficie. Este problema podría resolverse
mediante la inmovilización de una enzima apropiada en la superficie del electrodo [11]. biosensores enzimáticos son los más
El grafeno (Gr) es una monocapa de SP 2 carbonos enlazados con electrónica específica, mecánica y térmica
características que se utilizan en diferentes campos de investigación [12]. Gr ha recibido una gran cantidad de aplicaciones en las
propiedades. Por otra parte, los nanotubos de carbono (CNT) se enrollan hojas de grafeno que también exhiben buena
propiedades mecánicas, eléctricas y electrocatalíticas [12]. En los últimos años, muchos proyectos se han centrado
sobre las aplicaciones de los CNT a la fabricación de sensores electroquímicos y biosensores [13]. La incorporación de Gr
con nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNT) produce un material híbrido con excelente electrocatalítica
propiedades [12]. Los líquidos iónicos (ILS) son otros materiales importantes con propiedades únicas, tales como alta iónica
conductividad, amplia ventana electroquímica y buena estabilidad térmica con una gran cantidad de sensores de aplicaciones y
biosensores, en baterías de litio, células solares y condensadores. Además, los nanomateriales-IL carbono composites
debido a las interacciones-¸ ¸ o catión-π tener aplicaciones potenciales en la fabricación de sensores electroquímicos y
biosensor [14]. Chitosan (Ch) es un biopolímero natural que tiene excelentes propiedades tales como la biocompatibilidad,
no toxicidad, película de capacidad, buena permeabilidad al agua y alta resistencia mecánica [15-17] de conformación. Ch es capaz de
la acumulación de iones metálicos por varios mecanismos tales como la atracción electrostática, quelación y el intercambio de iones.
Se ha demostrado por los otros investigadores que la combinación de Ch con líquidos iónicos puede mejorar las propiedades de Ch [18].
3
Los grupos amina de Ch pueden interactuar con las nanopartículas (NP), el bloqueo de la agregación de nanopartículas
síntesis de NPs metálicos donde la densidad, tamaño, forma y composición de los NPs de aleación pueden ser controlados por
parámetros instrumentales [19-22]. Aleación PN se han utilizado con frecuencia en campos de detección y bio-sensores [19-
22]. Debido a la interacción entre los componentes en NPs de aleación, que muestran mejores propiedades tales como alta catalítica
actividad y selectividad y una mejor resistencia a la desactivación en comparación con NPs monometálicos. tirosina
hidroxilasa (TyrH) cataliza una reacción en la que Tyr se hidroxila en la posición meta para obtener L-3,4-
En este trabajo, vamos a fabricar una novela y ultrasensible biosensor basado en la inmovilización Tyr
de TyrH Onto paladio-platino (PDPT) bimetálicos nanopartículas de aleación (NPs) / líquido quitosano iónico (Ch-
IL) / grafeno múltiples paredes nanotubos iónicos de carbono líquido (GR-MWCNTs-IL) / electrodo de carbono vítreo (GCE) para
determinación de Tyr en algunas muestras de alimentos altos Tyr. Representación esquemática de los pasos de fabricación de la
Tyr biosensor se muestra en el Esquema 2. La inmovilización de TyrH sobre la superficie del biosensor se realiza por
y luego, se aplicará a algunos alimentos con alto contenido de tirosina, como el queso, huevo y yogur para la determinación de
Tyr. Por último, los resultados de la metodología electroanalytical desarrollado en este estudio serán comparados con
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con detección de fluorescencia como método de referencia para validar
su rendimiento.
2. Experimental
2.1. Productos químicos y soluciones
Tyr, TyrH, Ch, 1-etil-3-metilimidazolio bis (trifluorometilsulfonil) imida (IL), ferrocianuro de potasio,
ferriccyanide potasio, paladio (II) cloruro (PdCl 2), ácido hexacloroplatínico (H 2 PtCl 6),
dimetilformamida (DMF), glutaraldehído (GA), NaBH 4, de cloruro ferroso tetrahidratado, ácido acético, sodio
monobásico de fosfato (NaH 2 correos 4), fosfato dibásico de sodio (Na 2 HPO 4), ácido fosfórico (H 3 correos 4) y sodio
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hidróxido de (NaOH) fueron adquiridos de Sigma. Gr fue adquirido de PubChem. Los MWCNTs eran
preparado a partir de líquido iónico Technologies. Los otros productos químicos utilizados en este estudio fueron adquiridos de regularidad
fuentes y utilizado según lo recibido. Todas las soluciones utilizadas en este trabajo se prepararon en agua desionizada doblemente destilada
agua (DDW).
NaH 2 correos 4, y Na 2 HPO 4 se utilizaron para preparar una solución tamponada con fosfato (PBS, 0,05 mol L- 1) y
1% NaBH 4 y 1% de cloruro ferroso tetrahidratado se añadieron a la misma y, posteriormente, H 3 correos 4 y NaOH eran
utilizado para ajustar su pH a 2,0. La solución de la sonda redox, [Fe (CN) 6] 3- / 4-, con una concentración de 0,05 M era
preparado en el 0,1 KCl y se utiliza para la caracterización electroquímica de las modificaciones. Una solución madre de
Tyr (0,1 mol L- 1) se preparó de la PBS (0,05 mol L- 1, pH 2,0) y se mantuvo en un refrigerador que se utilizó para
preparar Tyr soluciones de trabajo mediante la aplicación de diluciones apropiadas. Se preparó una solución madre de Ch (0,2%)
en ácido acético ((v / v) 1,0%) por ultrasonicación durante 30,0 min. Una mezcla de Ch-IL se preparó añadiendo 1,0 l
IL en 1,0 ml de CH $ (0,2%). Para preparar GR-MWCNTs-il, 1,0 mg Gr, 1.0 MWCNTs mg y 5,0 l IL Se
añadido a 3,0 ml de DMF y a ultrasonidos durante 1,0 horas. Una solución GA 0,25% se preparó diluyendo su
solución original. Una solución que contiene 2,5 × 10- 3 mol L- 1 H 2 PtCl 6, 2,5 × 10- 3 mol L- 1 PdCl 2, y 0,1 mol L- 1 KCl
se preparó de la DDW. TyrH se disolvió en el PBS (0,05 mol L- 1, pH 2,0) y se mantuvo a -23,0 ° DO.
Todos los datos electroquímicos obtenidos a partir de experimentos de voltametría y EIS se registraron por un Autolab
PGSTAT302N-alto rendimiento controlado por el software NOVA 2.1.2. Los análisis cromatográficos de bienes
muestras se realizaron mediante un cromatógrafo de líquidos Shimadzu controlada por la cromatografía de Claridad
software que estaba equipado con el sistema de LC-10ADvp disolvente de suministro, SIL-10ADvp automuestreador, CTO-
horno 10ASvp columna, detector de fluorescencia RF-10Axl y controlador del sistema SLC-10Avp. Las imágenes de SEM
fueron capturados por un microscopio electrónico de barrido KYKY-EM 3200. Los análisis elementales se realizaron por una
Hitachi S-4800-EDS integrado. Una centrífuga Sigma se utilizó para la centrifugación de las soluciones. A Jenway-3345
pH-metro equipado con un electrodo de vidrio combinado se aplicó a los ajustes de pH. Todo el grabado
datos electroquímica fue transferido en el MATLAB (versión 7.14, MathWorks, Inc.) para entorno
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correcciones de línea de base por asimétrica regresión de mínimos cuadrados splines (AsLSSR). Los cálculos sobre la base de
elíptica región de la articulación de confianza (EJCR) también se realizaron en el entorno de MATLAB. Todos los cálculos
La CME era bien pulido sobre una almohadilla sedoso lixiviado por una suspensión de alúmina y luego, se aclara con DDW y
a ultrasonidos en etanol durante 20,0 min y se secó a temperatura ambiente. 10,0 l de solución GR-MWCNTs-IL era
caer sobre la superficie del GCE limpiado y de izquierda a ser secado a temperatura ambiente. A continuación, 5,0 l de Ch-IL
se dejó caer sobre la superficie del GR-MWCNTs-IL / GCE para preparar los Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE y se secó
bajo una corriente de aire caliente proporcionado por un secador de pelo. Para la síntesis electroquímica de PDPT NPs de aleación bimetálica,
la Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE se utilizó como electrodo de trabajo en una celda electroquímica que contiene 10 ml
de una solución que consiste en 2,5 x 10- 3 mol L- 1 H 2 PtCl 6, 2,5 × 10- 3 mol L- 1 PdCl 2 y 0,1 mol L- 1 KCl, donde
Ag / AgCl y el alambre de Pt se actuaron como electrodo de referencia y contra, respectivamente. deposición electroquímica
de PDPT NPs de aleación bimetálica se realizó mediante voltametría cíclica (CV) con un potencial de barrido (scan
velocidad = 0,025) de 0 a -0,5 V durante 5,0 ciclos. A continuación, los NPs PDPT / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE se sumergió
en la solución de GA 0,25% durante 1,0 h. Finalmente, 5,0 l de solución de TyrH se dejó caer sobre la superficie de la
PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE y se dejó secar a temperatura ambiente y se mantuvo en un refrigerador
Tres muestras reales, incluyendo el yogur, el queso y el huevo se compraron de un supermercado local, Kermanshah,
Corrí. Las cantidades exactas de cada muestra, huevo (50,0 g), yogur (20,0 g) y queso (10,0 g) se incubaron con
ácido clorhídrico (L- 2,25 mol 1, 30,0 ml) a 100,0 ° C durante 2,0 horas y estas muestras se centrifugaron durante
15.0 min a 4500,0 rpm y los sobrenadantes se filtraron. Luego, 10,0 ml de cada filtrado se trató con el
PBS (0,05 mol L- 1, pH 2,0, 10 ml) para el ensayo de muestra adicional. Por último, se determinó la concentración Tyr
3. Resultados y discusión
6
3.1. Paso a paso caracterizaciones de las modificaciones
3.1.1. caracterizaciones electroquímicos
espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) es un método electroquímico eficaz que podría ser utilizado para
el seguimiento de las modificaciones aplicadas a la GCE desnudo. El diagrama de Nyquist de la EIS tiene una porción de semicírculo en
altas frecuencias que se relaciona con el proceso limitada de transferencia de electrones y una parte lineal que es
de transferencia de electrones ( R Connecticut) en la superficie del electrodo que es capaz de describir las propiedades de la interfaz de la
superficie del electrodo. Por lo tanto, de acuerdo con la información descrita anteriormente, se utilizó el método EIS para supervisar la
modificaciones aplicadas a la GCE desnudo. Las mediciones de EIS se realizaron en una celda electroquímica
que contiene la solución de sonda redox donde un GCE desnudo o modificado actuó como electrodo de trabajo, alambre de Pt como
contraelectrodo y Ag / AgCl como electrodo de referencia. los R Connecticut valores de las curvas de EIS se calcularon mediante ajuste
y el comando de simulación proporcionada por el software NOVA. Los diagramas de Nyquist de la CME desnudo (curva a), Gr-
MWCNTs-IL / GCE (curva b), Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE (curva c), PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE
(Curva d) y TyrH / PDPT NPs / Ch-IL / Gr-MWCNTs-IL / GCE (curva e) están mostrando en la Fig. 1A. Después de montar la
curva de EIS del GCE desnudo, su R Connecticut valor se calculó que era 977 Ω. Después de modificar la CME desnudo con Gr-
MWCNTs-IL, su R Connecticut valor se redujo ( 38 Ω) que confirmó esta capa mejorada la velocidad de transferencia de electrones
en la superficie del electrodo. La presencia de Ch-IL sobre la superficie del electrodo aumenta la R Connecticut valor ( 368 Ω) cual
manifiesta que el Ch obstaculizado la transferencia de electrones en la superficie del electrodo en cierta medida. Después
electrodeposición de PDPT NPs sobre la superficie de Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE, la R Connecticut valor fue fuertemente
disminuido (14 Ω), que sugiere una aceleración significativa para la reacción de la sonda redox en el electrod e superficie por
apertura una gran cantidad de nuevas vías de conducción para facilitar la transferencia de electrones entre la superficie de electrodo y
solución de electrolito. Finalmente, la inmovilización de la TyrH sobre los NPs PDPT / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE
superficie aumentó la R Connecticut valor ( 40 Ω) que mostró que la TyrH fue capaz de obstaculizar el electrón interfacial
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El CV es también una técnica muy útil que nos puede ayudar a controlar las etapas de modificación.
Por lo tanto, los CV de los GCE desnudos o modificados se registraron en solución de sonda redox y están mostrando en
Fig. 1B. La CME desnudo mostró un CV bien definido (curva a), que estaba muy mejorado (corrientes de pico de mayor tamaño
y el pico inferior separación de potencial) después de la modificación con GR-MWCNTs-IL (curva b) manifiesta más grande
área de superficie electroactivo y la transferencia de electrones más rápido para GR-MWCNTs-IL / GCE. Después de dejar la Ch-IL en
la superficie / GCE GR-MWCNTs-IL, una respuesta CV más pobre con corrientes de pico más cortos se registró (curva c)
que confirmó que la Ch obstaculizado la transferencia de carga en la superficie del electrodo en cierta medida. Por
electrodeposición de NPs sobre la superficie / GCE Ch-IL / GR-MWCNTs-IL, separación de potencial pico fue
disminuido, mientras que corrientes de pico se incrementó (curva d), que confirmó la excelente función de los NPs en la expansión
el área de superficie electroactivo y la fijación de la tasa de transferencia de electrones. Después de la inmovilización de la TyrH en
la PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL superficie / GCE, las corrientes de pico se redujeron y la separación del pico se
aumento (curva e) que confirmó que las moléculas de enzima fueron capaces de bloquear la interfaz en cierta medida
Para una caracterización adicional de las etapas de modificación, también hemos utilizado diferencial de impulsos
voltametría (DPV) experimentos en solución de sonda redox y los resultados se muestran en la Fig. 1C. Toda la DPV
se corrigieron línea de base con la ayuda de AsLSSR y entonces, fueron representados. Como puede verse, después de
modificación de la CME desnudo (curva a) con GR-MWCNTs-IL (curva b), su pico potencial actual y pico
fueron aumento y disminución, respectivamente. La presencia de Ch-IL en la superficie del electrodo como la capa siguiente
causado menor intensidad de pico y pico de potencial más alto como puede ser claramente observado en la curva c. estas observaciones
confirmó que la presencia de Ch-IL en la superficie del electrodo dificulta la transferencia de electrones en el electrodo
superficie en cierta medida. Electrodeposición de PDPT NPs en la superficie del electrodo causó un electrón más fácil
transferir a la superficie del electrodo (curva d). Inmovilización de la TyrH sobre la PDPT NPs / Ch-IL / Gr-MWCNTs-
IL / GCE superficie mostró que las moléculas de enzima fueron capaces de bloquear la interfaz en cierta medida y
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La Fig. 1D muestra los CV registrados por TyrH / NPs PDPT / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE sumerge en
la solución de la sonda redox a diferentes velocidades de barrido (0,05-0,8 V / s). Como se puede ver, los picos anódicos están cambiando
hacia potenciales más grandes mientras que los picos catódicos están cambiando en la dirección inversa mediante el aumento de la tasa de
potenciales de escaneado. Las corrientes de pico redox son proporcionales a la tasa de los potenciales de exploración (Fig. 1E), que
La Fig. 2 muestra las imágenes SEM capturadas de las etapas de modificación aplicadas a la GCE desnudo para fabricar el
biosensor. La Fig. 2A muestra la imagen SEM de GR-MWCNTs-IL / GCE que confirma que las hojas de Gr y
MWCNTs se han unido a la superficie de la CME. Ch-IL forma una capa en la superficie de Gr-MWCNTs-
IL / GCE como se puede observar en la Fig. 2B. La Fig. 2C muestra que la superficie de Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE tiene
sido decoradas por NPs que también confirma la successfulness de la deposición electroquímica de NPs. Finalmente,
La Fig. 2D confirma la formación de una capa sobre la superficie del PDPT NPs / CH-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE por el
inmovilización de TyrH.
los resultados se pueden observar en la Fig. 2E. se observaron picos de firma para Pd y Pt y los porcentajes en peso de
Pd y Pt fueron 48,9% y 51,1%, respectivamente, que estaban en buen acuerdo con la relación molar de metal
precursores.
Fig. 3A muestra los CV registrados por GCE desnudo (curva a), MWCNTs-IL / GCE (curva b), GR-MWCNTs-IL / GCE
(Curva c), Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE (curva d), PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE (curva e) y
TyrH / PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE (curva f) como electrodo de trabajo se sumerge en una solución Tyr con
un nivel de concentración de 100 × 10- 6 mol L- 1 frente a Ag / AgCl y Pt alambre como referencia y el electrodo contador,
respectivamente. Como puede verse, todos los electrodos modificados tienen picos de corriente más grandes y potenciales máximas más bajas en
la comparación con la CME desnudo y el mejor rendimiento se ha observado para TyrH / PDPT PN / Ch-IL / Gr-
MWCNTs-IL / GCE que su corriente es de unos 205 μA y su potencial es 0,83 V. La corriente de pico de
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TyrH / PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE es 7,5 veces mayor que la de la CME desnudo (27.1 μA) y es
pico de potencial de oxidación (0,83 V) se ha desplazado aproximadamente 140 mV hacia potencial menos positivo en comparación con
GCE desnudo (0,97 V). Cuando la oxidación de Tyr en TyrH / PDPT NPs / CH-IL / GR-MWCNTs-IL / CME y PDPT NPs / CH-
IL / GR-MWCNTs-IL / GCE se compara, no es una mejora evidente en TyrH NPs / PDPT / Ch-IL / Gr-
MWCNTs-IL / GCE que demuestra que la PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL puede proporcionar una
microambiente biocompatible para TyrH y proporciona vías necesarias para su transferencia directa de electrones.
La Fig. 3B muestra las respuestas de la CME desnudo (curva a), MWCNTs-IL / GCE (curva b), GR-MWCNTs-IL / GCE
(Curva c), Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE (curva d), PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE (curva e) y
TyrH / NPs PDPT / Ch-IL / Gr-MWCNTs-IL / GCE (curva f) en presencia de L-DOPA. Mediante la comparación de la Fig. 3A y
B se puede observar claramente que se ha producido la oxidación de L-DOPA a potenciales más altos que Tyr. TyrH / PDPT
NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE tenía diferentes respuestas a L-DOPA y Tyr que pueden estar relacionados con el
respuesta enzimática selectiva de TyrH a Tyr. Por lo tanto, como resultado, se puede concluir que el biosensor tiene una
respuesta selectiva a Tyr lo que confirma que la presencia de la enzima a la superficie del electrodo puede ayudar a
la selectividad de la biosensor.
La oxidación de Tyr se ve afectada por el pH de la solución, ya que exhibe diversas formas protonadas en diferentes pH
[23]. Al tomar en cuenta que para los propósitos electroanalíticas ambas corrientes máximas y estables son necesarios,
hemos estudiado los efectos del pH sobre la respuesta del biosensor. Los CV de TyrH / PDPT NPs / Ch-IL / Gr-
MWCNTs-IL / GCE inmerso en el PBSS (0,05 mol L- 1) con diferentes pH que varían desde 2,0 hasta 12,0 eran
grabado y se muestra en la Fig. 4A. Como puede verse en la Fig. 4A, los CV se cambiaron a potenciales menos positivos
con el aumento de pH y los resultados muestran que la corriente máxima se observó a pH 2 (Fig. 4B), por lo tanto, pH
2 fue seleccionado como pH óptimo para los próximos estudios. Como puede verse, los potenciales pico se desplazan negativamente con
el aumento del pH de la PBS con una pendiente de -0,0558 V pH- 1 ( Fig. 4C), que sugiere que el electrodo obedece a la
comportamiento Nernst que implica protón y electrón en proporción 1: 1 (véase el Esquema 3). Este mecanismo es en
10
3.4. La investigación de los efectos de factores de ciclo
Los CV de TyrH / PDPT NPs / CH-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE sumergido en una solución Tyr preparado en el PBS
(0,05 mol L- 1, pH 2) a diferentes velocidades de barrido comprendidas entre 0,05 y 0,75 V / s fueron registrados (Fig. 5A) para investigar
la dependencia de las corrientes en la tasa de los potenciales de exploración. La regresión de los valores de corriente de pico en la gammagrafía
valores de tasa produjeron una dependencia lineal que confirmó que la oxidación de Tyr en la superficie de la
Desde DPV tiene una sensibilidad mucho más alta que CV, que fue elegido como la técnica analítica para la determinación
de Tyr. En condiciones optimizadas: paso potencial 0.025 V, amplitud de modulación 0.025 V, tiempo de modulación
0,05 s, el tiempo de intervalo de 0,5 s y la velocidad de barrido 0,05 V / s, la relación entre las respuestas DPV y concentraciones
de muestras Tyr sintéticos se investigó (Fig. 6). Los valores de corriente pico (de yo PAG) se retrocedido en el
valores de concentración de muestras Tyr ( do Tyr) y los resultados confirmaron que había dos relaciones lineales
Entre yo PAG y do Tyr más de dos intervalos de concentración de 0,01 × 10- 9 a 8,0 × 10- 9 mol L- 1 y 8,0 × 10 9 a
160.0 × 10 9 mol L- 1 como puede verse en el recuadro de la Fig. 6. Las linealidades observadas en la respuesta biosensor durante
cambios de concentración muestran que el biosensor podría ser posiblemente aplicada al análisis de muestras reales
hacia determinación Tyr. El límite de detección (LOD) del biosensor desarrollado se calculó de acuerdo
a las recomendaciones de la IUPAC (3 S segundo/ b, donde S segundo es la desviación estándar (n = 8) de los espacios en blanco, y segundo es la pendiente
de la curva de calibración) a un nivel de concentración de 0,009 × 10- 9 mol L- 1 y la sensibilidad de los países desarrollados
biosensor se calculó que era 0.086 μA ( 10- 9 mol L- 1) -1 lo que confirma una alta sensibilidad hacia Tyr
Los resultados obtenidos por el biosensor fabricado en este estudio se compararon con los de lo informado por la
trabajos previos publicados en la literatura y los resultados se presentan en la Tabla 1. Como se puede observar, la propuesta de
biosensor mostró mejores resultados en la mayoría de los sensores reportados hasta el momento.
11
Para evaluar la selectividad del biosensor Tyr construido, la influencia de varios agentes interferentes tales como
urea, sacarosa, galactosa, ácido bórico, ácido oxálico, L-lisina, L-asparagina, glicina, fenilalanina, N-acetil-L-
cisteína, glutatión, L-cisteína, ácido ascórbico, Mg 2+, California 2+, Na +, K + y lactasa en la determinación de
50 × 10- 6 mol L- 1 Tyr en las condiciones experimentales óptimas se investigó. El límite de tolerancia fue
calculado como la concentración máxima del agente de interferencia que causó una aproximadamente ± 5% con respecto
error en la determinación de la concentración de Tyr. Registro de las respuestas de la DPV TyrH / PDPT PN / Ch-IL / Gr-
MWCNTs-IL / GCE hacia determinación Try en presencia de los agentes que interfieren confirmó que la
concentración acatado de agentes que interfieren fue de 0,1 mol L- 1 para el Mg 2+, California 2+, Na + y K +; 0,01 mol L- 1 de L-
lisina, L-asparagina, glicina, fenilalanina, N-acetil-L-cisteína, ácido ascórbico y L-cisteína y 0,001 mol
L- 1 para la urea, sacarosa, lactosa, galactosa, ácido bórico, ácido oxálico y glutatión. Los resultados se muestran en la Tabla
2. Como puede verse, los resultados confirmaron que la TyrH / PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE puede ser
La estabilidad es una característica muy importante de un biosensor, por lo tanto, para verificar la estabilidad de la TyrH / PDPT
NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE, las respuestas DPV del biosensor hacia determinación Tyr en una solución de
que contiene 10 × 10- 9 mol L- 1 Tyr se registraron semanalmente durante seis semanas y los resultados se muestran en la Fig. 7.
Después de seis semanas, el biosensor propuesto retuvo 94,1% de su respuesta inicial. Comprobaciones adicionales hacia
examinar la estabilidad del biosensor demostró que su estabilidad también se ve afectada por el tiempo de inmersión en
la solución, por lo tanto, este parámetro también se examinó y los resultados mostraron que la estabilidad de la
biosensor se ve muy afectada por un largo tiempo de inmersión en la solución y el biosensor doesn ' t muestran una
buena estabilidad mediante la inmersión en la solución de células durante más de 3,0 h. Por lo tanto, nuestra recomendación para abordar
este desafío es eliminar el biosensor de la solución celular durante los descansos entre los experimentos.
Repetibilidad del biosensor propuesta también fue investigado por la aplicación durante diez veces durante un día para
determinar Tyr en una solución que contiene 10 × 10- 9 mol L- 1 Tyr y una desviación estándar relativa satisfecho (RSD) de
12
2,05% se encontró que confirmó una buena repetibilidad para el biosensor. La reproducibilidad del biosensor
También se examinó mediante el registro de las respuestas DPV de diez biosensores individuales inmersos en una solución de
que contiene 10 × 10- 9 mol L- 1 Tyr y un buen valor de RSD de 2,5% se obtuvo que confirmó una buena
reproducibilidad para el biosensor. La información antes mencionada, confirmó que la respuesta biosensor
Generalmente, después de desarrollar un nuevo método de análisis y validación de su rendimiento para el análisis de
muestras sintéticas, su rendimiento se compara con un método de referencia para verificar su capacidad para el análisis
de muestras reales. A continuación, el método analítico de nuevo desarrollo podría ser sugerido como un método fiable para
los análisis de rutina. Con respecto a este importante paso, también hemos aplicado el análisis por HPLC del yogur, queso y
huevo como muestras reales hacia la determinación Tyr y sus resultados se presentan en la Tabla 3. Como puede verse, el buen
recuperaciones confirman que hubo un acuerdo aceptable entre sus resultados y los obtenidos por el
biosensor fabricado en este estudio. Para hacer una comparación gráfica entre la exactitud y la precisión de la
HPLC y el biosensor propuesto, hemos utilizado la prueba EJCR [41,42]. En este paso, muestra de yogur como una de
muestras reales se eligió y se trataron con 10 × 10 9, 2 × 10- 9, 100 × 10- 9, 5 × 10- 9, 34 × 10- 9, 68 × 10- 9 y 44 × 10- 9
mol L- 1 Tyr y se analizaron por HPLC y el biosensor. Posteriormente, la regresión de del predicho
concentraciones por el biosensor y / o HPLC propuesto de las concentraciones nominales (concentraciones enriquecida)
fue realizado por mínimos cuadrados ordinarios, Fig. 8A y B. A continuación, se utilizó la prueba EJCR para comparar la
calculado valores de intersección y de pendiente con sus valores teóricos esperados (intersección = 0, pendiente = 1), que es
también llamado “ lugar ideal ”. Por lo tanto, si las elipses obtenidos como las salidas de la EJCR incluyen una base ideal,
las concentraciones previstas y nominales no son significativamente diferentes. El tamaño de elipses es proporcional a
la precisión del método, tamaños más pequeños confirmar precisiones superiores [41,42]. Los resultados de la prueba son EJCR
que muestra en la Fig. 8C. Como se puede ver la cabina, elipses de ambos métodos contienen el punto ideal que confirmar que ambos
ellos son exactos, pero, la elipse de HPLC es más pequeño que el del biosensor propuesto que confirma que
el método de referencia tiene una mejor precisión que el biosensor propuesto. De acuerdo con los resultados obtenidos anteriormente,
13
la precisión de la HPLC era mejor que el biosensor propuesto, pero, HPLC adolece de algunos problemas tales
como el costo, el tiempo y la necesidad de un operador experto y estos inconvenientes nos ha obligado a tomar una decisión para preferir
el biosensor propuesto.
4. Conclusiones
Tyr es uno de los aminoácidos que es necesario para el mantenimiento del equilibrio nutricional y su nivel en el
corporal se correlaciona con el estado de salud de la persona, por lo tanto, en este trabajo, los biosensores enzimáticos de Tyr en
algunos alimentos con alto contenido de tirosina incluyendo queso, huevo y yogur se informó de acuerdo con la fabricación de una novela y
biosensor electroquímico ultrasensible basado en inmovilización de TyrH en PDPT NPs / Ch-IL / Gr-MWCNTs-
IL / GCE. Electro-oxidación de Tyr en TyrH / / / Ch-IL PDPT NPs GR-MWCNTs-IL / GCE fue obviamente mejorada
que demostró que el NPS PDPT / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL proporciona un microambiente biocompatible
para TyrH y las vías necesarias para la transferencia directa de electrones. El biosensor podría fabricarse fácilmente qué
mostró una alta sensibilidad, selectividad, tiempo de respuesta rápido y una buena reproducibilidad y repetibilidad hacia Tyr
determinación en ambas muestras sintéticas y reales. Validación del método desarrollado mediante la comparación de sus resultados
con los obtenidos por HPLC con detección de fluorescencia confirmó que el método es fiable y precisa.
El biosensor fabricado en este estudio podría ser aplicada para una amplia gama de aplicaciones en análisis de rutina de
Tyr.
Expresiones de gratitud
Ayudas económicas de este proyecto por el Consejo de Investigación de la Universidad de Ciencias Médicas de Kermanshah están
agradece.
Conflicto de intereses
14
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19
Figura 1. ( A), (B) y C) EIS espectros, CV y DPVs de (a) GCE desnudo, (b) GR-MWCNTs-IL / GCE, (c) Ch-IL / Gr-
MWCNTs-IL / CME, (d) PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / CME y (e) TyrH / NPs PDPT / Ch-IL / Gr-MWCNTs-
IL / GCE en la solución de la sonda redox, respectivamente. Inserción de (A) muestra el circuito usado para adaptarse a las curvas de EIS
dónde R s: resistencia de la solución, R Connecticut: resistencia a la transferencia de electrones, do dl: doble capacitancia capa, Z w: Warburg
impedancia, (D) los CV de TyrH / NPs PDPT / CH-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE sumerge en la sonda redox
solución a diferentes velocidades de barrido (0,05-0,8 V) y la variación (E) de corrientes de pico frente a velocidades de exploración obtenidos a partir de
sumergiendo TyrH / PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE en la solución de la sonda redox.
Figura 2. La imagen SEM de (A) GR-MWCNTs-IL / GCE, (B) Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE, (C) PDPT NPs / CH-
IL / GR-MWCNTs-IL / CME y (D) TyrH / PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE. (D) picos firma obtenida
Fig. 3. ( UN) CVs registrados por (a) GCE desnudo, (b) MWCNTs-IL / GCE, (c) GR-MWCNTs-IL / GCE, (d) Ch-IL / Gr-
MWCNTs-IL / GCE, (e) PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / CME y (f) TyrH NPs / PDPT / Ch-IL / Gr-MWCNTs-
IL / GCE como electrodo de trabajo se sumerge en una solución Tyr con un nivel de concentración de 100 × 10- 6 mol L- 1
preparado en el PBS (0,05 mol L- 1, pH 2) frente a Ag / AgCl y el alambre de Pt como electrodos de referencia y de venta libre,
respectivamente, velocidad de barrido de 0,05 V / s y (B) como (A) pero en presencia de 100 × 10- 6 mol L- 1 L-DOPA.
Fig. 4. ( A) CV de TyrH / NPs PDPT / CH-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE sumergido en una solución Tyr (100 × 10- 6 mol
L- 1) preparado en el PBS (0,05 mol L- 1) a diferentes pH, velocidad de barrido de 0,05 V / s, (B) de variación de las corrientes de pico
de CVs registrados a diferentes pH en comparación con el pH y (C) la variación de los potenciales de pico frente pH.
20
Fig. 5. ( A) CV de TyrH / NPs PDPT / CH-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE sumergido en una solución Tyr (25 × 10 6 mol L-
1) preparado en el PBS (0,05 mol L- 1, pH 2) a diferentes velocidades de barrido que van 0.05-0.75 V / s y B) la variación de (
Fig. 6. las respuestas obtenidas en DPV TyrH / PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE después de la adición sucesiva de
Tyr en PBS (0,05 mol L- 1, pH 2). Recuadro: regresión de los valores de corriente pico en las concentraciones de Tyr con dos
rangos lineales de 0,01 × 10- 9- 8,0 × 10- 9 mol L- 1 y 8,0 × 10 9- 160.0 × 10 9 mol L- 1.
Fig. 7. Estabilidad de las respuestas DPV del TyrH / PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE a Tyr en una solución de
Fig. 8. ( A) Parcelas para la regresión de las concentraciones predichas en los nominales por (A) el biosensor propuesto y
(B) HPLC. (C) regiones de junta elípticas (a nivel de confianza del 95%) en relación con las predicciones de la propuesta
biosensor (elipse azul) y HPLC (elipse roja), el punto oscuro se refiere al punto ideal.
Esquema 2. Representación esquemática de los pasos de fabricación del biosensor Tyr propuesto en este estudio.
Tabla 1. Comparación de la biosensor propuesto con otros métodos informados para la determinación de Tyr.
LOD (mol L-
1)
Electrodo Linear Rang (mol L- 1) Árbitro.
21
β- discos compactos do electrodo de oro modificado 3,6 × 10 -5 a 2,4 × 10 -4 1,2 × 10 -5 [36]
EuHCF re electrodo de grafito modificado 10 × 10 -6 a 6 x 10 -4 8,0 × 10 -6 [37]
CME / SWCNT 5,0 × 10 -6 a 2,0 × 10 -5, 2,7 × 10 -5 a 2,6 × 10 -4 9,0 × 10 -8 [38]
Au NPs / poli (trisamina) / GCE 3,9 × 10 -6 a 61,8 × 10 -6 0,9 × 10 -6 [39]
fMWCNT-Au- HP β- CD / CME 2,2 × 10 -4 a 8,7 × 10 -4 3,0 × 10 -4 [40]
TyrH / PDPT NPs / Ch-IL / GR-MWCNTs-IL / GCE 0,01 × 10- 9- 8 × 10- 9 y 8 × 10 9- 160 × 10- 9 0,009 × 10 9 Este trabajo
un polímero impreso molecularmente.
do ciclodextrina
Tabla 2 Efecto de las especies interferentes potenciales en la determinación de Tyr a nivel de 50 × 10 6 mol L- 1.
especies La concentración de especies que interfieren (mol L- 1) Encontrado Tyr (mol L- 1) error relativo en la determinación de Tyr (%) Recuperación de Tyr (%)
interferentes
Tabla 2. Determinación de Tyr en muestras reales usando el biosensor propuesto y HPLC como método de referencia.
Muestra Método Detectado (mol L- 1) Añadido (mol L- 1) Encontrado (mol L- 1) Recuperación (%)
22
Reflejos
ü El biosensor fue capaz de determinación sensible de Tyr en rangos lineales de ancho de concentración.
ü El rendimiento del biosensor en muestras reales fue comparable con el método de referencia.
23
Figura 1
Figura 1.
Figura 2
Figura 2.
figura 3
Fig. 3.
Figura 4
Fig. 4.
Figura 5
Fig. 5.
Figura 6
Fig. 6.
Figura 7
Fig. 7.
Figura 8
Fig. 8.
Esquema 1
Esquema 1.
esquema 2
Esquema 2.
esquema 3
Esquema 3.