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1. OBJETO
Esta norma específica los métodos horizontales para el recuento de estafilococos
coagulasa positiva en productos destinado al consumo humano o para la
alimentación de animales, mediante el recuento de colonias obtenidas en medio
sólido medio Baird-Parker o medio plasma de conejo fibrinógeno como medio
alternativo véase el anexo B (Informativo)] después de incubación aeróbica a 36 °C
± 2 ºC.
2- REFERENCIAS NORMATIVAS
Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la
aplicación de este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica
únicamente la edición citada. Para referencias no fechadas, se aplica la última
edición del documento normativo referenciado (incluida cualquier corrección).
NTC 4002. Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Requisitos
generales para el examen microbiológico (ISO 7218).
NTC 4491-1, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales, preparación
de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los
análisis microbiólogos. Parte 1: Reglas generales para la preparación de la
suspensión inicial y de diluciones decimales (ISO 6887-1).
NTC 4491-2. Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación
de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los
análisis microbiológicos. Parte 2. Reglas específicas para la preparación de carne y
productos cárnicos (ISO 6887-2).
NTC 4491-3, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación
demuestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los
análisis microbiológicos. Parte 3. Reglas específicas para preparación de muestras
de pescado y productos de la pesca (ISO 6887-31).
NTC 4491-4. Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación
de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los
análisis microbiológicos. Parte 4.Reglas específicas para la preparación de
productos diferentes de leche, productos lácteos, carne, productos cárnicos,
pescado y productos de la pesca (ISO 68874).
3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES
Para los propósitos de esta norma se aplican los siguientes términos y definiciones:
5.3.1.2 Preparación
- Se disuelven los componentes de la base completa deshidratada en agua
hasta ebullición.
- Se ajusta el pH de tal forma que después de la esterilización sea de 7.2 ±
0,2 a 25°C.
5.3.2.1.2 Preparación
- Se disuelve el telurito de potasio en el agua calentando lentamente hasta
disolución completa.
- El sólido debe ser soluble. Si se presenta material blanco insoluble, se
descarta el reactivo,
- Se esteriliza por filtración usando membranas con tamaño de poro de 0,22
µn.
- La solución puede ser almacenada como máximo por un mes a 3°C ± 0,2
°C.
- Se descarta la solución si se forma un precipitado blanco.
5.3.2.2 Emulsión de yema de huevo (concentración aproximada del 20% o de
acuerdo con las instrucciones del fabricante).
Se usan huevos de gallina con las cáscaras intactas que tengan menos de siete
días. Se lavan los huevos con un cepillo en detergente líquido. Se enjuagan con
agua corriente, luego se desinfectan sumergiéndolos en etanol al 95 % (V/V)
durante 30 s o etanol al 70 % durante 1 h y se secan. Empleando procedimientos
asépticos, se rompe cada huevo y se separa la yema de la clara. Se colocan las
yemas en una probeta estéril para su medición y se añaden 4 partes por volumen
de agua estéril y/o solución salina al 0.85 %. Se transfiere asépticamente a un
matraz estéril y se mezcla vigorosamente.
Se calienta la mezcla por 2 h en un baño de maría a 45 °C. Luego se deja por 18 h
a 24 h a una temperatura a 3°C± 2°C para permitir que se forme un precipitado.
Se retira asépticamente el sobrenadante. La solución debe ser en lo posible utilizada
en su totalidad.
Se adiciona, bajo condiciones asépticas, la yema de huevo. Se mezcla bien después
de cada adición mediante rotación para minimizar la formación de espuma.
Servir inmediatamente en las cajas de petri.
5.3.2.3 Solución de Sulfamezatina (sulfametazina, sulfadimidina)
5.3.2.3.1 Composición
Sulfamezatina 0.2 g
Solución de hidróxido de sodio (NaOH)- 0,1 MOL/L 10ml
Agua destilada o des ionizada 90 ml
5.3.2.3.2 Preparación
- Se disuelve la sulfametazina en la solución de hidróxido de sodio.
- Se completa hasta 100 ml con agua.
- Se esteriliza por filtración usando membranas con un tamaño de poro de 0.22
µm.
- La solución puede ser almacenada como máximo por un mes a 3°C± 2°C.
5.3.3 Medio completo
5.3.3.1 Composición
Medio base (Véase el numeral 5.3.1) 100ml
Solución de telurito de potasio (Véase el numeral 5.3.2.1 ) 1,0ml
Emulsión de yema de huevo (Véase el numeral 5.3.2.2) 5,0ml
Solución de Sulfametazina 2,5ml
5.3.3.2 Preparación
- Se funde el medio, luego, se enfría a 45°C± 2°C, mediante el baño maría.
- Se adiciona, bajo condiciones asépticas, las otras dos soluciones (si se
sospecha que especies de Proteus están en la muestra de ensayo) la
solución de sulfametazina (Véase numeral 5.3.2.3). siendo previamente
calentadas en el baño de maría a 45°C± 1°C.
- se mezcla bien después de cada adición.
5.3.4 Preparación de las cajas
Se coloca la cantidad apropiada de medio completo (véase el numeral 5.3.3) en
cajas de Petri estériles para obtener un agar de 4 mm, de espesor
aproximadamente, y se permite la solidificación.
Las cajas pueden ser almacenadas, de 24 h hasta 72 h a 3 °C± 2°C.
5.4.2 Preparación
- Se disuelven los componentes de la base completa deshidratada en agua
por ebullición.
- Si es necesario, se ajusta el pH de tal forma que después de la esterilización
sea de 7.4 ± 2 a 25 °C.
- Se transfiere el medio en cantidades de 5 ml a tubos de ensayo o frascos
(Véase el numeral 8.5) de capacidad apropiada
- Se esteriliza el medio por 15 min a 121 °C.
= _____x +_____x
En donde
Ac = es el número de colonias típicas sometidas a la prueba coagulasa
(Véase el numeral 9.5)
-
65 + 51 + 3 + 7
𝑁= = 57 272
(0.22 x 10 − 2)
∑
=
𝑥2
En donde
∑
=
2
en donde
∑a = es la suma de colonias identificadas de estafilococos coagulasa-
positiva (Véase el numeral 10.1.1) en las cajas seleccionadas;
11. PRESICION
11.1 GENERALIDADES
La precisión de los métodos cuantitativos puede expresarse en términos de
repetitividad y reproducibilidad, según se define en Ia norma ISO 5725-2. Sin
embargo, el método de cálculo utilizado en Ia noema ISO 5725-2, basado en la
media, no siempre resulta apropiado para los análisis microbiológicos, que no
siempre muestran una distribución normal (Gaussiana).Por consiguiente, se ha
seguido la norma ISO 16140, que se ha desarrollado especialmente para los
métodos microbiológicos y que utiliza estimadores robustos para calcular la
repetibilidad y la reproducibilidad. Estas estadísticas presentan la ventaja de ser
menos sensibles a los valores extremos, permitiendo por lo tanto conservar los
datos discrepantes de los análisis estadísticos.
Por tanto estos estimadores se utilizan en esta parte de la NTC 4779 (ISO 6888)
11.2 REPETIBILIDAD
11.2.1 Limite de repetibilidad
La diferencia absoluta entre los resultados (transformados a log10) de dos análisis
individuales (número de estafilococos coagulasa-positiva por gramo o por mililitro),
o Ia proporción entre el mayor y el menor de los dos resultados del análisis en escala
normal, obtenidos utilizando el mismo método sobre idéntico material de análisis por
el mismo analista, utilizando los mismos aparatos dentro del intervalo de tiempo lo
más corto posible, no sobrepasará el límite de repetibilidad (r) en más del 5% de los
casos.
11.3 REPRODUCIBILIDAD
ANEXO A
(Informativo)
RESULTADO DE UN ESTUDIO NTERLABORATORIOS
Tabla A.1. Resultados del análisis de datos obtenidos con muestras de queso
Límite de repetibilidad (r), en forma de diferencia en escala de 10gw 0,50 0,17 0,33
(en log1o UFC/g)
Tabla A.2. Resultados del análisis de datos obtenidos con muestras de carne
Límite de repetibilidad (r), en forma de diferencia en escala de 10gw 0,25 0,25 0,22
(en log1o UFC/g)
Desviación estándar de la reproducibilidad, sr (en log10 UFC/g) 0,11 0,10 0,11
materiales de referencia
Muestra/Nivel de contaminación (capsula que contiene unas 5
000 UFC
Número de laboratorios que proporcionaron resultados 23
ANEXO B
(Informativo)
MEDIO DE CULTIVO ALTERNO
B.2.2.2.2 Preparación
Bajo condiciones asépticas, se disuelve el fibrinógeno bovino en el agua justo
antes de su uso.
B.2.2.3 Solución de plasma de conejo e inhibidor de tripsina
B.2.2.3.1 Composición
Plasma de conejo con EDTA para coagulasa 30 ml
Inhibidor de tripsina 30 mg
B.2.2.3.2 Preparación
Operando bajo condiciones asépticas, disolver los componentes en el agua justo
antes de su uso.
B.2.3 Medio completo
B.2.3.1 Composición
Medio base 90 ml
solución de telurito de potasio 0,25ml
solución fibrinógeno bovino 7,5 ml
Solución de plasma de conejo e inhibidor de tripsina 2,5 ml
B.2.3.2 Preparación
Fundir el medio, luego enfriarlo a 48 °C ± 1 °C en un baño de maría (véase el
numeral 6.4).
Se adiciona, bajo condiciones asépticas, las tres soluciones previamente calentadas
en un baño de maría a 48°C ± 1°C. Se mezcla bien después de cada adición
mediante rotación para minimizar La formación de espuma.
Se usa el medio completo inmediatamente después de su preparación, con el fin de
evitar cualquier precipitación del plasma.
ADVERTENCIA Si se consigue comercialmente solución de plasma de fibrinógeno
bovino/plasma de conejo, se deben seguir con mucho cuidado las indicaciones del
fabricante para la preparación de esta solución y del medio completo (en particular
la temperatura del medio base) de lo contrario, el medio puede perder
completamente su actividad.
B.3 PREPARACIÓN DE LAS CAJAS
Véase el numeral 5.3.4.
B.4 INOCULACIÓN E INCUBACIÓN CUANDO SE EMPLEA MEDIO PLASMA
DE CONEJO FIBRINÓGENO VÉASE NUMERAL B.2
B.4.1 Se transfiere por medio de una pipeta estéril (véase el numeral 6.8), 1 ml de
la muestra de ensayo si es líquida, o 1 ml de la suspensión en el caso de otros
productos, a cada una de las dos cajas (véase el numeral 6.6). Se toman otras dos
cajas de Petri estériles y se transfiere 1 ml de la primera dilución decimal a cada
una de las cajas.
Se repiten estas operaciones con diluciones decimales sucesivas usando una
pipeta estéril para cada dilución decimal.
B.4.2 En cada caja de Petri (véase el numeral 9.3.1), se vierte inmediatamente
medio completo recién preparado (véase el numeral 5.6.3) (no guardar en forma
líquida) hasta una profundidad de 3 mm aproximadamente.
Se mezcla cuidadosamente el inóculo con el medio de cultivo y se deja solidificar
colocando las cajas de Petri en una superficie horizontal fría.
B.4.3 Después de una completa solidificación, se invierten las cajas preparadas
colocándolas en la incubadora (véase el numeral 6.2) a 35 °C± 2 °C por 18 h a 24
h. Si es necesario, se re incuba por 18h a 24 h.
B.5 SELECCIÓN DE LAS CAJAS E INTERPRETACIÓN CUANDO SE EMPLEA
MEDIO PLASMA DE CONEJO FIBRINÓGENO VÉASE EL NUMERAL 5.6
Después de un periodo de incubación suficiente (véase el numeral 9.3.3), los
estafilococos forman pequeñas colonias negras o grises o aún blancas rodeadas de
un halo de precipitación, indicando la coagulación. Las colonias de Proteus pueden
mostrar, al inicio de la incubación, una apariencia similar a las colonias de
estafilococos coagulasa-positiva. Sin embargo, después de 24 h a 48 h de
incubación, pueden tener una apariencia de un cultivo extendido, más o menos
pardo, que las permiten diferenciar de los estafilococos.
Se cuentan las colonias típicas de cada placa.
Debido a que el agar plasma de conejo fibrinógeno está basado en una reacción
de coagulasa, no es necesario confirmar esta actividad.
__________________________________________________________________
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4779 (Primera actualización)
__________________________________________________________________
ANEXO C
(Informativo)
CUADRO COMPARATIVO RESPECTO DE LAS MODIFICACIONES
REALIZADAS A LA NTC 4779 (Primera actualización) Y LA NTC 4491:2000
Se incluyeron las
2. REFERENCIAS 2. REFERENCIAS referencias normativas
NORMATIVAS NORMATIVAS para la preparación de las
muestras para ensayo,
NTC 4491-1, NTC 4491:1998, suspensiones iniciales y
Microbiología de Microbiología de diluciones decimales que
alimentos y de alimentos alimentos y de alimentos reemplazaron la NTC
para animales. para animales. 4491, que han sido
Preparación de muestras Preparación de muestras adoptadas por el comité
para ensayo, para ensayo, técnico.
suspensiones iniciales y suspensiones iniciales y
diluciones decimales diluciones decimales
para los análisis para los análisis
microbiológicos. Parte 1: microbiológicos. Parte 1:
Reglas generales para la Reglas generales para la
preparación de la preparación de la
suspensión inicial y de suspensión inicial y de
diluciones decimales. diluciones decimales.
(ISO 6887-1). (ISO/DIS 6887).
NTC 4491-3,
Microbiología de
alimentos y de alimentos
para animales.
Preparación de muestras
para ensayo,
suspensiones iniciales y
diluciones decimales
para los análisis
microbiológicos. Parte 3:
RegIas específicas para
preparación de muestras
de pescado y productos
de la pesca. (ISO 6887-
3).
NTC 4491-4,
Microbiología de
alimentos y de alimentos
para animales.
Preparación de muestras
para ensayo,
suspensiones iniciales y
diluciones decimales
para los análisis
microbiológicos. Parte 4:
RegIas específicas para
la preparación de
productos deferentes de
leche, productos lácteos,
carne, productos
cárnicos, pescado y
productos de la pesca.
(ISO 6887-4).
NTC 4092, Microbiología
de alimentos y de
alimentos para animales.
Requisitos generales
para el examen
microbiológico. (ISO
7218).
NOTA La determinación
de S. aureus puede
realizarse también por
los siguientes métodos:
siembra en membranas
hidrofóbicas. PCR u otro
método búsqueda.
Servir inmediatamente
en las cajas de Petri.