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Seminarios
Seminario 15 - Reacciones rédox - 2017
Seminario 16 - Biología Molecular - 2017
Seminario 17 - Presentación Cadena de transporte de
electrones. Fosforilación oxidativa - 2017
Seminario 18 - Integración del metabolismo en
condiciones fisiológicas - 2017
Seminario 18 - presentación Integración del metabolismo
en condiciones fisiológicas - 2017
Seminario 19 - Cuestionario de integración metabólica en
condiciones fisiológicas y patológicas - 2017
Seminario 20 - RIA - 2017
Trabajos Prácticos
TP 15 - Sangre. Orina. ELISA - 2017
TP 16 - No hay clase con este nombre
TP 17 - Curvas de consumo de oxígeno. Casos clínicos -
2017
TP 18 - No hay clase con este nombre
TP 19 - Metabolismo de la fenilalanina. Cuestionario de
productos especializados de aminoácidos - 2017
TP 20 - Catabolismo del hemo. Ictericias - 2017
TP de laboratorio 2 - Glucemia-Orina-ELISA - 2017
Teóricos
Teórico 13 Dra Rosenstein - Metabolismo de
aminoácidos - 2017
Teórico 14 Dra González - Síntesis del grupo
Hemo. Patologías asociadas - 2017
Teórico 15 Dr Coirini - Especies Reactivas del
Oxígeno - 2017
Teórico 16 Dra Cornejo - Bioquímica Clínica -
2017
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA HUMANA
MATERIA QUÍMICA BIOLÓGICA - CICLO LECTIVO 2017
SEMINARIO 15
Reacciones Rédox
Cuestionario - Problemas
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA HUMANA
MATERIA QUÍMICA BIOLÓGICA - CICLO LECTIVO 2017
CONCEPTOS BÁSICOS
Ejemplo:
Fe0+ Cu2+ Fe2+ + Cu0
Cada hemirreacción está formada por una especie reducida (dador de electrones) y
su especie oxidada (aceptor de electrones conjugado) que en conjunto constituyen un par
rédox conjugado.
Siguiendo con el ejemplo,
Fe2+/Fe0 constituye un par rédox, siendo Fe0 la especie reducida (dador de
electrones) y Fe2+ la especie oxidada (aceptor de electrones).
donde:
E: potencial de reducción real (en volt)
E0´: potencial de reducción estándar (en volt)
R: constante de los gases (1.987 cal / °K . mol)
T: Temperatura en °K (273+°C)
n: número de electrones intercambiados
F: Constante de Faraday (23062 cal/ v . mol)
(Especie Oxidada): concentración de la especie oxidada
(Especie Reducida): concentración de la especie reducida
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Se puede calcular la diferencia de potencial real o estándar ('E o 'E°’) de una
reacción rédox según
E = E hemirreacción - E hemirreacción
Reducción Oxidación
Los datos de E°' se encuentran tabulados y para las hemirreacciones del ejemplo
son
E°'Cu2+/Cu0 = + 0,337 v
E°'Fe2+/Fe0 = - 0,44 v
G0´= -R.T.ln(Keq)
En el ejemplo,
G°’ = -n F 'E°’
= - 2 23062 cal/v (+ 0,777v) = - 35838 cal = - 35,838 kcal
En el ejemplo,
El par Cu2+/Cu0 se reduce espontáneamente y su E°' (+ 0,337 v) es mayor que el
del par Fe2+/Fe0 (- 0,44 v).
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Si el par Fe2+/Fe0 se enfrentara con el par Zn2+/Zn0 cuyo E°' es - 0,76 v, en
condiciones estándar se reduciría el Fe2+ a Fe0 y el Zn0 se oxidaría a Zn2+.
Aclaración
¿Cómo me doy cuenta cuál es la especie oxidada y cuál es la especie reducida?
Estos casos son muy simples. Por ejemplo:
NAD+/NADH + H+ E0´NAD+/NADH + H+
FAD /FADH2 E0´FAD /FADH2
Fe3+/Fe2+ E0´Fe3+/Fe2+
Hay otros casos en los cuales generalmente necesitamos tener la fórmula escrita.
Observe y analice la estructura de los siguientes pares y determine los grupos funcionales
involucrados en la reacción rédox.
piruvato/lactato E0´piruvato/lactato
piruvato lactato
fumarato/succinato E0´fumarato/succinato
fumarato succinato
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oxaloacetato/malato E0´oxaloacetato/malato
oxaloacetato malato
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CUESTIONARIO - PROBLEMAS
1.- Observe las siguientes hemirreacciones e indique cuál de las dos sustancias está más
oxidada en cada hemirreacción:
CH3-(CH2)14-COOH CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)7-COOH
Ácido palmítico ácido palmitoleico
Cu+ Cu++ + e-
3-
a) ¿Qué es el potencial de reducción estándar?
b) ¿Cómo se establece la escala de potenciales de reducción?
c) ¿Cuál es el potencial de reducción de referencia?
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7- Calcular la Keq de la siguiente reacción a 25°C y pH 7
Xreducido + NAD+ Xoxidado + NADH + H+ E°’ = - 0,115 v
–4
a) 1,29x10
b) 1,29
c) 100
d) 8,9
10- Según los datos del ejercicio 9 y en condiciones estándar, conteste las siguientes
preguntas:
a) ¿Qué sustancias serán reducidas espontáneamente por el NADH?
b) ¿Qué sustancias podrán utilizarse para reducir espontáneamente al NAD+?
c) Justifique la siguiente afirmación: “En los sistemas biológicos, el oxígeno es el aceptor
final de electrones”
11- Utilizando los datos del ejercicio 9, indique en cuál de los siguientes casos se
producirá una reacción rédox en forma espontánea, en condiciones estándar:
a) piruvato + NAD+
b) lactato + NAD+
c) piruvato + NADH + H+
d) lactato + NADH + H+
12- Según los datos del problema 9, responda las siguientes preguntas, en todos los
casos en condiciones estándar y justifique desarrollando las ecuaciones.
a) Si se pone a reaccionar el par piruvato/lactato con el par NAD +/NADH + H+, ¿quién se
reduce y quién se oxida?
b) Si se pone a reaccionar el par O2/H2O con el par fumarato/succinato ¿quién se reduce
y quién se oxida?
c) Si se pone a reaccionar el par Cit boxidado/Cit breducido con el par O2/H2O ¿quién se reduce
y quién se oxida?
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13- Según los datos del problema 9, calcule la variación de energía libre estándar (Gº’)
que se produce al pasar un par de electrones desde el malato al citocromo b.
a) + 9,04 kcal/mol
b) – 9,04 kcal/mol
c) + 6,27 kcal/mol
d) – 4,52 kcal/mol
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17- Dados los siguientes potenciales de reducción estándar:
Eº’ oxaloacetato/malato = -0,166 v
Eº’ NAD+/NADH + H+ = -0,32 v
Calcule el G de la reacción espontánea a 37º C en los siguientes casos:
a) [OA] = 100 mM
[Mal] = 0,01 mM
[NADH + H+] = 200 mM
[NAD+] = 0,02 mM
b) [OA] = 0,01 mM
[Mal] = 100 mM
[NADH+ H+] = 0,02 mM
[NAD+] = 200 mM
Indique con qué situación metabólica se relaciona cada caso.
19- Utilizando los potenciales de reducción estándar indicados en el ejercicio anterior y las
siguientes concentraciones:
[piruvato] = 100 mM
+
[NAD ] = 0,10 mM
[lactato] = 150 mM
[NADH] = 0,05 mM
a) Calcule el E de la reacción a 37°C:
piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+
b) Indique si la reacción es o no espontánea en estas condiciones.
20- La reacción
piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+
Tiene un Gº’ = - 6226 cal/mol.
Calcule el Eº’ del par piruvato/lactato sabiendo que el Eº’ del NAD+/NADH es - 0,320 v.
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22- Teniendo en cuenta los valores de referencia, indique qué porcentaje de la energía
disponible de la oxidación del acetato se convierte en ATP, a través del ciclo de Krebs,
cadena respiratoria y fosforilación oxidativa.
Acetato + 2 O2 2 CO2 + 2 H2O G°’ = – 243 kcal/mol
+
NADH + H + ½ O2 +
NAD + H2O G°’ = – 53 kcal/mol
FADH2 + ½ O2 FAD + H2O G°’ = – 41 kcal/mol
GTP GDP + Pi G°’ = – 8kcal/mol
ATP ADP + Pi G°’ = – 8kcal/mol
a) 8%
b) 33%
c) 42%
d) 85%
24- En condiciones estándar, el potencial de reducción del par NAD +/NADH es igual a -
0,32 v. ¿Cuál debería ser el potencial de reducción de la sustancia X para producir una
diferencia de -1,35 kcal/mol en la variación de energía libre al reducirse en una reacción
rédox espontánea en condiciones estándar? F = 23060 cal/mol; n = 2.
a) + 0,08 v
b) - 0,29 v
c) + 0,12 v
d) - 0,05 v
25- En condiciones estándar, el potencial de reducción del par NAD +/NADH es igual a-
0,32 v. ¿Cuál debería ser el potencial de reducción de la sustancia X para producir una
diferencia de -2,52 kcal/mol en la variación de energía libre al reducirse en una reacción
rédox espontánea en condiciones estándar? F = 23060 cal/mol; n = 2.
a) +0,032 v
b) -0,155 v
c) +0,108 v
d) -0,265 v
26- Todas las reacciones rédox del ciclo de Krebs utilizan NAD + como aceptor de
electrones, excepto la oxidación del succinato a fumarato que utiliza FAD, de acuerdo a la
siguiente reacción:
Considerando las siguientes hemirreacciones
fumarato + 2 H+ + 2 e- succinato E°’ = 0,03 v
+ -
FAD + 2 H + 2 e FADH2 E°’ = 0,05 v
NAD+ H+ + 2 e- NADH E°’ = - 0,032 v
a) Indique cuál de los cofactores producirá un valor de G°’ negativo para la reacción.
b) ¿Cuál será la relación de concentraciones de productos / reactivos utilizando FAD que
dará un valor de G = 0, para la reacción a 37°C? repita los cálculos utilizando NAD+.
c) Suponga que la relación de NADH/NAD+ = 0,01 y de FADH2/FAD = 0,01, ¿cómo será la
relación fumarato/succinato para una reacción que utiliza FAD y para una reacción que
utiliza NAD+? ¿Por qué el FAD es un aceptor de electrones más adecuado para esta
reacción que el NAD+?
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27- La termogenina es una proteína natural de la membrana mitocondrial de ciertos
tejidos animales como el tejido adiposo pardo. Las células de este tipo de tejido adiposo
tienen una elevada concentración de mitocondrias, y su función específica es oxidar
ácidos grasos para producir preferentemente calor y no la síntesis de ATP. La
termogenina ubicada en la membrana mitocondrial interna provee un canal a través del
cual los protones pueden pasar libremente. Esta adaptación metabólica permite que el
animal regule su temperatura mediante la movilización de sus reservas lipídicas y se
puede explicar a partir del funcionamiento de la cadena respiratoria.
Responder y justificar:
a) ¿El proceso es aeróbico o anaeróbico?
b) ¿A cuántos complejos de la cadena respiratoria involucra?
c) ¿Se genera un gradiente transmembrana de protones acoplado al flujo de electrones?
d) ¿El flujo de electrones está activado o deprimido en este proceso?
e) ¿Se produce flujo de electrones a través de la subunidad Fo de la ATP sintetasa?
f) Por la acción que realiza la termogenina se dice que es un agente desacoplante de la
fosforilación oxidativa. ¿Qué entiende por efecto desacoplante?
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SEMINARIO 16
Biología Molecular:
Ingeniería genética y
sus aplicaciones en la medicina
Objetivos de aprendizaje
• Conocer y familiarizarse con los principios básicos de la biología molecular.
• Aprender fundamentos de las técnicas de rutina de biología molecular.
• Estudiar la secuenciación de ADN y su aplicación en el diagnóstico clínico.
• Comprender la técnica de PCR conceptualmente y aplicaciones de la misma.
• Conocer y comprender algunas aplicaciones médicas de la investigación de
genes, estudio de enfermedades hereditarias, huella genética, proteínas recombinantes,
animales transgénicos, terapia génica.
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LOS INSTRUMENTOS BÁSICOS DE LA INVESTIGACIÓN DE GENES
En las últimas décadas la tecnología de recombinación del ADN también conocida
como ingeniería genética, o más acertadamente recombinación genética in vitro, ha
revolucionado la biología. El campo de la salud es uno de los más beneficiados con el
desarrollo de esta tecnología. Las investigaciones que se realizan en esta área están
enfocadas al diagnóstico oportuno de enfermedades, así como su posible tratamiento a
través de la terapia con moléculas recombinantes e introducción de genes. Además, la
manipulación de genes proporcionará en el futuro una herramienta fundamental para la
eliminación de enfermedades mortales para el hombre. Por estas razones resulta útil que
el médico esté familiarizado con conceptos básicos sobre biología molecular, su
aplicación en la investigación biomédica, y en especial con sus posibles aplicaciones
clínicas, conceptos estos que aparecen cada vez con mayor frecuencia en toda la
literatura biomédica, tanto básica como clínica.
El rápido progreso de la biotecnología y, de hecho, su propia existencia, es el
resultado de utilizar unas pocas técnicas que se describen a continuación.
A- Enzimas de restricción
El descubrimiento de las enzimas de restricción ha permitido a los investigadores
manipular segmentos específicos de ADN, facilitando enormemente el estudio de esta
molécula de gran tamaño.
Las enzimas de restricción, o endonucleasas de restricción, reconocen secuencias
de bases específicas en el ADN doble hélice e hidrolizan las uniones fosfodiéster en
lugares concretos de ambas hebras del dúplex que contienen las secuencias reconocidas.
Las enzimas de restricción fueron obtenidas a partir de una gran variedad de procariontes.
Mediante su actividad de endonucleasa, en estos organismos las enzimas de restricción
eliminan ADN foráneo que pudiera ingresar. El ADN del propio microorganismo no se
destruye porque los sitios reconocidos por sus propias enzimas de restricción se
encuentran metilados.
Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas en el ADN de entre 4
a 8 pares de bases e hidrolizan un enlace fosfodiéster en cada hebra de la región
reconocida. Una característica notable de estos sitios de corte es que casi siempre son
palíndromos, o una repetición invertida, y los puntos de corte están dispuestos
simétricamente (figura 1).
Figura 1: Los puntos de corte están indicados por las flechas. El corte con BamHI (izquierda)
produce extremos simple cadena o “adhesivos” y el corte con AluI (derecha) produce extremos
doble cadena o “romos”. En cada hebra, la enzima hidroliza el enlace fosfodiéster en el lado 3’ del
eje de simetría.
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Se han purificado y caracterizado más de 100 enzimas de restricción. Se nombran
con una abreviatura de tres letras que se refiere al organismo hospedador, por ej. Eco de
Escherichia coli, Hin de Haemophilus influenzae, Hae de Haemophilus aegyptius, seguida
de una indicación de la cepa en cuestión y de un número romano (en el caso que se haya
identificado más de una enzima de restricción de la misma cepa). La reacción catalizada
por estas enzimas puede ocurrir en el centro mismo de la secuencia reconocida dejando
lo que se conoce como extremos “romos” con ADN doble cadena, o extremos “adhesivos”
si el corte ocurre en posiciones diferentes en una hebra y en la otra del ADN, dejando en
este caso una porción de hebra simple cadena. Las enzimas de restricción se utilizan para
hidrolizar las uniones fosfodiéster de moléculas de ADN y proporcionar fragmentos
específicos que se pueden analizar y manipular con más facilidad que la molécula
original. Además, la cantidad y la longitud de los fragmentos de ADN obtenidos luego del
tratamiento con una enzima de restricción dependerán de la frecuencia de la secuencia de
reconocimiento de dicha enzima ya que si su secuencia de reconocimiento se encuentra
muchas veces repetida en el ADN, se generarán muchos fragmentos de restricción de
diferentes tamaños. Es importante destacar que a medida que el sitio de restricción de
una enzima tenga mayor número de pares de bases, la frecuencia de corte será menor y
la longitud de los fragmentos será mayor, ya que es menos probable que se combinen
dichas pares de bases para formar la secuencia de reconocimiento y encontrarla en el
ADN.
Figura 2: Electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa, y tinción con Bromuro de etidio
de los fragmentos separados.
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del fragmento de interés. Luego que la sonda ha hibridado con el fragmento de interés,
debe lavarse la membrana para eliminar el exceso de sonda que no se hubiera unido
específicamente. La radioactividad puede ser detectada por exposición de la membrana a
una placa autorradiográfica (como la de rayos X). En la placa se observan
específicamente el o los fragmentos donde hibridó la sonda ya que la radiación emitida en
ese sitio vela la placa autorradiográfica (figura 3). Existen otras formas de detección de las
sondas que no son radioactivas, algunas se marcan con grupos químicos que luego se
observan por fluorescencia.
Figura 3: Un fragmento de ADN o una molécula de ARN que contiene una determinada secuencia
puede identificarse si se separan por electroforesis una mezcla de fragmentos, se transfieren a
nylon, y se hibridan con una sonda marcada con 32P (fósforo radioactivo), complementaria a la
secuencia que se busca. El fragmento que contiene la secuencia buscada se visualiza después
por autorradiografía. Figura modificada de Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT, et al. An Introduction
to Genetic Analysis. 7th edition. New York: W. H. Freeman; 2000. Using cloned DNA. Available
from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22040/.
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Cuadro comparativo de las técnicas de blotting
Tipo de blot Southern Northern Western
Analiza ADN ARN Proteínas
Procedimiento
1) Preparación de la Tratar con enzimas Nada Nada
muestra de restricción
C- Secuenciación de ADN
La secuenciación de ADN consiste en determinar el orden de los nucleótidos (A, C,
G y T) en una molécula de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética
heredable del núcleo celular, los plásmidos (bacterias), la mitocondria y cloroplastos (en
plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. Así pues,
determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los
procesos biológicos fundamentales, así como en campos aplicados, como el diagnóstico
de enfermedades hereditarias y la investigación forense. El desarrollo de la secuenciación
del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en
biología.
La mayoría de los métodos de secuenciación que se utilizan actualmente se basan
en el método originalmente desarrollado por Sanger en el año 1977. El principio clave
del método clásico de terminación de la cadena o método de Sanger es el uso de
dideoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la cadena de ADN. Estos
dideoxinucleótidos terminan la elongación de la cadena al carecer del grupo 3'-OH del
azúcar que se necesita para la formación del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos
durante la elongación de la cadena de ADN. En estas condiciones de elongación, se
generan moléculas de ADN simple cadena que difieren en longitud en apenas un
nucleótido y que pueden separarse unas de otras por electroforesis en gel de
poliacrilamida.
Este método requiere una hebra molde de ADN simple cadena, un cebador o
primer de ADN, una ADN polimerasa, dNTPs y los ddNTPs que terminan la elongación de
la cadena de ADN. La muestra de ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciación
separadas que contienen la ADN polimerasa, los cuatro deoxinucleótidos estándar (dATP,
dGTP, dCTP Y dTTP), uno de ellos marcado radioactivamente (no es relevante cuál de
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ellos, ya que solo se utiliza para evidenciar en pasos siguientes los fragmentos
generados). En cada mezcla de reacción se añade sólo uno de los cuatro ddNTPs
(ddATP, ddGTP, ddCTP, O ddTTP). La incorporación de un dideoxinucleótido en la
cadena naciente de ADN termina su extensión, lo que produce varios fragmentos de ADN
de longitud variable. Los fragmentos de ADN sintetizados, conteniendo la marca
radioactiva, son desnaturalizados por calor y separados por tamaño (con una resolución
de un solo nucleótido) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Cada una de las
cuatro reacciones de síntesis se corre en carriles individuales (denominados carril A, T, G
y C, de acuerdo al dideoxinucleótido añadido) y se visualizan las bandas de ADN
mediante autorradiografía. La secuencia del ADN se lee directamente a partir de la placa
autorradiográfica (figura 4): una banda oscura en un carril indica un fragmento de ADN
que es el resultado de una terminación de la cadena tras la incorporación de un ddNTP. El
nucleótido terminal puede ser identificado de acuerdo al ddNTP que se añadió en la
mezcla de reacción que dio lugar a esa banda.
Luego se desarrolló una técnica ligeramente modificada en la que no se usa
radioactividad sino fluorescencia: los ddNTPs terminadores de la cadena se marcan
fluorescentemente. Este método es conocido como secuenciación por terminador
fluorescente y utiliza cada uno de los cuatro ddNTPs que terminan la cadena marcado
con un fluoróforo de diferente color. La mayor ventaja de este método es que la
secuenciación se puede llevar a cabo en una sola reacción, en lugar de en cuatro
reacciones como en el método original. Además, a diferencia de la original que se
desarrollaba manualmente, esta técnica se desarrolla en equipos automatizados que
realizan una separación electroforética capilar y detectan la fluorescencia para determinar
la secuencia: una cámara detecta el color emitido por cada banda a medida que la
electroforesis avanza por lectores láser y envía los datos a un programa informático que
ensambla la secuencia (figura 4). Esta automatización de la lectura hace al método
atractivo por su gran capacidad y rapidez.
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El método de Sanger fue ampliamente usado para adquirir gran cantidad de
conocimientos en ciencias biológicas. Es de remarcar que fue el método utilizado para
obtener la secuencia del genoma humano completo.
Posteriormente, se desarrollaron los denominados métodos de “Next-generation
sequencing” (NGS) o de alto rendimiento. Estos hicieron la secuenciación genómica más
rápida y de menor costo, permitiendo una aplicación más extensiva de la técnica. Para la
secuenciación de genomas completos, estos métodos hacen primero una fragmentación y
amplificación de todo el ADN genómico. Luego la secuenciación de miles de fragmentos
individuales se procesa simultáneamente. Se utilizan herramientas bioinformáticas para
buscar secuencias superpuestas entre fragmentos y reconstruir la secuencia de todo el
genoma. Esta aproximación es apropiada para pequeños genomas que carecen de ADN
repetitivo. Hay más de una docena de plataformas de NGS, los más conocidos y
utilizados son los denominados Illumina (método fluorométrico, basado en el método de
Sanger descripto arriba) y el Ion Torrent (método potenciométrico). Utilizando estas
tecnologías actualmente es posible determinar la secuencia de varios genomas humanos
en solo unas pocas horas.
Actualmente se desarrollan métodos de secuenciación de ADN potencialmente aún
más rápidos. Algunas de estas tecnologías de tercera generación evitan la amplificación
previa y determinan la secuencia de moléculas únicas de ADN
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Características importantes de la técnica
No es necesario conocer toda la secuencia a amplificar, únicamente hay que
conocer las secuencias que flanquean el fragmento de ADN interés.
Por PCR se pueden amplificar fragmentos tan grandes como 10 kb.
No es necesario que los cebadores se ajusten perfectamente a las secuencias que
flanquean el fragmento a amplificar. El uso de cebadores derivados de un gen de
secuencia conocida hace posible la búsqueda de variaciones sobre el tema. Esta
característica es muy importante porque así se han descubierto por PCR familias de
genes y relaciones evolutivas entre organismos.
Aplicaciones
La PCR permite amplificar una secuencia que constituye menos de la millonésima
parte del ADN total de un organismo superior. Es una técnica sumamente sensible, se
puede amplificar y detectar una única molécula de ADN, aportando una información muy
valiosa en medicina. A continuación se describen algunos ejemplos.
♦ Detección de bacterias y virus: la PCR puede descubrir la presencia de bacterias
y virus en estadíos tempranos de la infección o en estado latente. En estos casos, los
individuos infectados no han desarrollado todavía respuesta inmune a dichos patógenos,
por lo cual no puede detectarse la infección determinando la presencia de los anticuerpos.
Entonces, se recurre a la detección del agente patógeno. Esta puede hacerse tanto por
métodos inmunológicos (detectando la presencia de proteínas características del agente),
técnica que está siendo reemplazada por la PCR. Como primers o cebadores se usan
secuencias cortas complementarias a una parte del genoma del agente infeccioso. Aún
unas pocas copias originales de una bacteria o virus en la muestra del paciente pueden
detectarse luego de la amplificación.
Se aplica, por ejemplo, en la detección de virus de hepatitis B (HBV) y C (HCV) y el
de inmunodeficiencia humano (HIV). La búsqueda de bacilos en muestras de tejido puede
ser muy lenta y laboriosa pero con la PCR se puede detectar la presencia de solo 10 de
estos microorganismos por cada millón de células humanas.
♦ Colaboración con la medicina forense en variados aspectos por ejemplo la
identificación de personas permitiendo el reconocimiento de cadáveres o parentescos
biológicos en casos de disputa de paternidad. Ver huella dactilar de ADN más adelante.
♦ Establecimiento de grupos tisulares precisos en transplantes, amplificando y
comparando secuencias de los HLA del donante y receptor para determinar
compatibilidades.
♦ Detección de organismos transgénicos, por ejemplo productos de agricultura
como soja o maíz, para su comercialización.
♦ Estudio de relaciones evolutivas entre los organismos ya que bajo ciertas
circunstancias el ADN puede mantenerse intacto durante miles de años o incluso más
tiempo.
G- Animales transgénicos
Los individuos que han sido genéticamente modificados ya sea por deleción o
reemplazo de genes se denominan organismos transgénicos y los genes extraños o
modificados que se agregan se denominan transgenes. Estas modificaciones se realizan
en plantas o animales de experimentación.
En los organismos superiores, animales o vegetales, la información genética se
transmite por mecanismos de reproducción sexual, es lo que se conoce como transmisión
genética vertical. Sin embargo, hace ya unos treinta años se lograron obtener los primeros
ratones transgénicos mediante transferencia génica por inyección directa de ADN extraño
en un cigoto obtenido por fecundación in vitro. Es decir, se trataba de una transmisión
genética horizontal, también llamada transgénesis. Dado que el cigoto se hace
transgénico inicialmente, el ADN extra pasa a las células germinales y luego es
transferido a la progenie derivada de estas células comportándose como un gen nuclear
regular.
Actualmente, la biotecnología hace uso de muchos conocimientos y herramientas
para lograr objetivos inicialmente impensados. Así, se logra que el transgen no se inserte
en el genoma de una célula en forma azarosa sino que reemplace el gen normal, técnica
denominada direccionamiento de genes.
Hay varias formas de lograr la alteración de un gen de interés. La más simple es
sacarlo del genoma. Aunque parezca contrario a la lógica, una de las mejores maneras de
verificar la función de un gen es observar los efectos en individuos que no lo tienen. Si
ambas copias del gen de interés son completamente inactivadas o removidas, se
consigue un animal denominado knock-out. Esta estrategia es válida particularmente si el
gen no es esencial, si su ausencia no es letal.
La habilidad de generar de animales transgénicos, especialmente animales knock-
out para un determinado gen, ha sido de gran utilidad para el estudio in vivo de la función
de genes y proteínas. También sirve para generar modelos animales de enfermedades
humanas (por ejemplo, ratones knock-out) para el estudio de la enfermedad propiamente
dicha o de su progresión y para evaluar estrategias terapéuticas, de una manera que no
sería posible en seres humanos.
Al igual que ocurre en plantas, los animales son manipulados genéticamente
también para mejorar la calidad del animal mismo, introduciéndole nuevos rasgos
genéticos y así otorgándole características no existentes naturalmente como la protección
contra enfermedades. Esta aplicación se da especialmente en especies de interés
comercial o agrícola-ganadero (vacas, cerdos, ovejas, caballos). En el área médica, los
animales transgénicos son utilizados en la producción de proteínas recombinantes
(granjas farmacéuticas). En estas granjas farmacéuticas se crían ovejas, cabras, vacas o
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cerdos transgénicos que producen en su leche proteínas terapéuticas humanas.
Ejemplos: obtención de α-1-antitripsina, proteína C, factor VIII de coagulación,
antitrombina III, etc.
A partir del núcleo de una célula de un animal es posible generar un animal
idéntico, denominado clon. El primer mamífero se clonó en 1996 (oveja Dolly), luego la
técnica se aplicó a cerdos y caballos. En Argentina, en el año 2002, el laboratorio Biosidus
clonó una vaca a la que llamó Pampa. Pampa también se clonó, y en el proceso, al ADN
de este animal se le agregó el gen humano que codifica para la somatotropina u hormona
de crecimiento de modo que el gen se expresa únicamente en la glándula mamaria,
generando una vaca transgénica, llamada Pampa Mansa. La leche de este animal
contiene hormona de crecimiento humana, vital para tratar a las personas que padecen
retrasos del crecimiento por deficiencias en la cantidad o actividad de esta proteína. En
2012, el Grupo de Biotecnología de la Reproducción del INTA Balcarce consiguió la
producción de leche con características de la leche materna humana en una vaca clonada
doblemente transgénica. Esta es la vaca Rosita ISA, productora de leche que contiene
lactoferrina y lisozima de origen humano.
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Detección de polimorfismos
Los polimorfismos son variaciones en las secuencias de ADN, que ocurren con
significativa frecuencia en la población. En el genoma humano pueden encontrarse
millones de diferentes polimorfismos, que involucran mutaciones puntuales, la sustitución
de una base por otra pero también pueden ser deleciones e inserciones. Las variaciones
tienen diferentes consecuencias fenotípicas: contribuyen a nuestras características
individuales, producen una alteración funcional (enfermedad congénita o genética
heredable) o aumentan la susceptibilidad a ciertas enfermedades. Cuando un
polimorfismo llega a una frecuencia de más del 1% en la población general se considera
estable. El alelo de la anemia falciforme es un ejemplo de mutación puntual que es
estable en la población humana.
Algunos polimorfismos, que ocurren dentro de la región codificante de genes y
otros que se encuentran en regiones no codificantes estrechamente relacionadas a
genes, están involucrados en la etiología (causa) de enfermedades heredables. Estas
variaciones en el genoma sirven como base para el uso de técnicas de ADN
recombinante en el diagnóstico de enfermedades.
El análisis de ADN hace posible examinar variaciones en la secuencia de ADN
entre individuos y entre especies. Se pueden realizar estos estudios a dos niveles:
estudiando la variación en sitios reconocidos por enzimas de restricción (por RFLP,
técnica que está en desuso actualmente) y en un nivel más preciso, secuenciando el ADN
para analizar la variación del ADN base por base. La secuenciación es el método de
elección en la actualidad para analizar regiones del ADN, zonas de genes, regiones no
codificantes, etc.
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Detección de polimorfismos que contienen regiones altamente variables,
causados por repetición de secuencias de ADN
El ADN humano contiene algunas secuencias que están repetidas en tándem un
número variable de veces en ciertos loci dispersos en el genoma. Esas regiones se
llaman regiones hipervariables porque contienen un número variable de repeticiones en
tándem (variable number of tandem repeats, VNTRs) o bien microsatélites de ADN y
contienen repeticiones en tándem de menor tamaño (short tandem repeats, STRs). Estas
regiones son polimórficas ya que la secuencia varía en el número de copias de la unidad
que se repite. El análisis de los VNTR es aplicable cuando se pueden obtener muestras
de ADN en buenas condiciones y en cantidad abundante.
Los VNTRs en humanos son secuencias de 1-5 kb que consisten en un número
variable de unidades repetitivas de 15 a más de 100 pb de longitud en el genoma de
diferentes individuos. Cuando el ADN completo es tratado con enzimas de restricción que
reconocen sitios que flanquean la región VNTR (no afectando dentro de los VNTRs) se
obtienen fragmentos que contienen esos loci, los cuales difieren en tamaño de un
individuo a otro dependiendo del número de repeticiones que estén presentes. Los
fragmentos de diferentes tamaños pueden ser separados por electroforesis en gel
mediante la técnica de Southern blot. Las sondas usadas para identificar esos fragmentos
de restricción se unen a la secuencia que está repetida o a una secuencia cercana a ésta.
Se comparan los patrones generados por muestras de ADN de origen conocido y
desconocido. La coincidencia entre los patrones indica con alta probabilidad que las
muestras provienen de la misma fuente.
Una de las primeras sondas que detectaron los VNTR humanos fue obtenida en
1985 a partir de una cuádruple repetición de una secuencia de 33 pb encontrada dentro
del primer intrón del gen de la mioglobina (figura 6). Una vez que los VNTRs se clonaron y
secuenciaron se encontró que la razón de la hibridación de la sonda a los VNTRs era una
secuencia central (core) de 13 pb común a todas las repeticiones y a la sonda. Las
secuencias flanqueantes a ese core, no eran necesariamente similares.
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Figura 6: Obtención de una huella dactilar de ADN, utilizando una sonda para VNTR:
Panel a). La sonda utilizada reconoce una secuencia interna de 13 pb presente en los VNTR (se
marcan en negrita en la secuencia de 33 pb).
Panel b): En este diagrama se observa tres pares de cromosomas somáticos homólogos
conteniendo VNTRs (I, II, III) para cada uno de los tres individuos (A, B, C). El tamaño de los
fragmentos depende del número de repeticiones que ellos contengan.
Se realiza un Southern blot utilizando la sonda indicada en a) y se visualizan los fragmentos de
restricción producidos a partir del material genómico de los individuos.
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Diagnóstico de enfermedades hereditarias aplicando técnicas de
secuenciación
Varias enfermedades hereditarias se pueden diagnosticar por secuenciación.
Se detalla la aplicación de la técnica para la poliposis adenomatosa familiar (PAF).
Esta es una enfermedad autosómica dominante, que se caracteriza clásicamente por el
desarrollo de cientos a miles de adenomas en el colon y el recto durante la segunda
década de la vida. La PAF tiene una incidencia de 1/8300 nacimientos, y se manifiesta por
igual entre ambos sexos. Casi todos los pacientes desarrollan cáncer colorrectal si no se
identifican y son tratados en una etapa temprana. La enfermedad es causada por
mutaciones en el gen APC, un gen supresor tumoral localizado en el cromosoma 5q21.
Este gen produce un ARNm de 8,9 kb dividido en 15 exones y genera una proteína de
2843 aminoácidos. La proteína APC tiene múltiples dominios que median tanto la
oligomerización como la unión a una variedad de proteínas intracelulares, las cuales
tienen importantes roles en la adhesión celular, la transducción de señales, y la activación
de la transcripción.
Otras características de las mutaciones del gen APC son:
1) pueden ocurrir en varias localizaciones dentro del gen APC.
2) dos de las más comunes son en los codones 1061 y 1309, se describe un nuevo
sitio con alta probabilidad de mutaciones en la ubicación 1465.
3) las mutaciones patogénicas resultan en un codón stop prematuro por alguno de
estos mecanismos: sustitución, deleción o inserción de nucleótido.
Hoy en día, una serie de pruebas genéticas están disponibles para analizar las
mutaciones en el gen APC. El método más utilizado actualmente es la secuenciación
directa del gen. Cuando se identifica una mutación específica causante de la enfermedad,
se debe realizar la prueba genética a todos los parientes de primer grado. Miembros de la
familia con un resultado negativo para la mutación detectada en el paciente no necesitan
más investigación y su seguimiento es el mismo de la población en general.
Farmacogenética
Es la ciencia que estudia las variaciones heredadas en los genes que dictan la
respuesta a fármacos. Explora cómo se pueden utilizar estas variaciones para predecir si
un paciente tendrá una buena, mala o ninguna respuesta a una determinada droga. ¿Hay
una diferencia entre farmacogenética y farmacogenómica? Farmacogenómica se refiere al
estudio general de diversos genes que determinan comportamiento a una droga. La
farmacogenética refiere al estudio de las diferencias heredadas (variaciones) en el
metabolismo y respuesta a una droga. La distinción entre los dos términos se considera
arbitraria y actualmente los dos términos se utilizan alternativamente. Para entender mejor
la importancia de esta nueva rama de la ciencia les describiremos un ejemplo.
Lucía es una niña de siete años que padece leucemia. Su doctor quiere comenzar
la quimioterapia cuanto antes. El purinethol es un quimioterápico común cuya
denominación genérica es 6-mercaptopurina. Su mecanismo de acción involucra su
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incorporación a las células cancerosas en activa división que conlleva la muerte celular.
Esta droga fue utilizada por primera vez hace 30 años. Mientras que la mayoría de los
pacientes fueron beneficiados por el uso de esta droga, los doctores sabían que el
tratamiento producía un riesgo muy importante y los efectos secundarios eran a veces
fatales en ciertos pacientes. Se estudió entonces el metabolismo de la droga
encontrándose que la enzima tiopurina metiltransferasa (TPMT) es responsable de
metabolizarla e inactivarla. Encontraron que en la población variaban los niveles de la
actividad enzimática de TPMT. Dado que se trata de una sustancia tóxica es importante
que permanezca en el cuerpo solamente por una cantidad de tiempo limitada y que afecte
principalmente a las células cancerosas y no a las células normales. Por lo tanto, antes de
prescribir la droga, es crítico conocer si el paciente tiene actividad de TPMT para hacer
inactivo con eficacia el Purinethol. Aproximadamente el 89% de los niños posee TPMT
normal y se les puede administrar una dosis completa de la droga, sin sufrir efectos
secundarios relevantes. Aproximadamente el 11% de los niños posee TPMT con actividad
disminuída y se beneficiarán de una dosis mucho más baja. El 0,33% de niños tienen la
variante de menor actividad, y la sustancia tóxica puede persistir en el cuerpo de estos
niños durante mucho más tiempo por lo que sufrirán efectos secundarios severos o fatales
si se les administra cualquier dosis de Purinethol. Saber qué variante genética de TPMT
posee el paciente influenciará el tratamiento enormemente.
Para determinar la dosificación de Purinethol que Lucía necesitará se debe realizar
una prueba de diagnóstico basada en el estudio de secuencias del ADN para determinar
qué variante de TPMT tiene Lucia.
Consejo genético
Una forma de prevenir enfermedades es evitando el pasaje de genes defectuosos
a la progenie. Con la verificación de la presencia de genes defectuosos en un individuo,
particularmente en familias que se conoce que lo portan, los consejeros genéticos pueden
informar sobre los riesgos y opciones.
Se han desarrollado análisis de screening basados en técnicas de recombinación
del ADN para muchas enfermedades hereditarias. Estos análisis pueden realizarse en
individuos adultos miembros de una familia donde una enfermedad es frecuente, en los
padres antes de la concepción, durante la gestación o luego del nacimiento. En ciertas
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enfermedades, el diagnóstico precoz permite instaurar el tratamiento en etapas tempranas
post-nacimiento o aún en útero.
Producción de Proteínas Terapéuticas
Una contribución muy importante de la ingeniería genética a la medicina es haber
desarrollado la habilidad de producir cualquier proteína en cantidades casi ilimitadas,
siempre que se conozca el gen que codifica dicha proteína. Con el desarrollo de métodos
que permiten la transferencia de genes específicos de una célula a otra, y la inducción de
la expresión de los mismos en el nuevo hospedador, la industria farmacéutica ha
adquirido una gran potencialidad. Algunas compañías farmacéuticas ya producen
polipéptidos humanos por bacterias o levaduras. Un ejemplo de estos polipéptidos
producidos son hormonas como la insulina, hormona del crecimiento, glucagon, interferón,
factores de la coagulación, factor VIII, etc. Estos productos se encuentran comúnmente en
venta en las farmacias y son producidos por técnicas de biotecnología.
3.- ¿Con qué técnica pueden separarse e identificarse proteínas particulares dentro
de una mezcla?
4.- ¿Qué es el ADNc? ¿Cuál es la enzima que se utiliza para obtenerlo? ¿De
dónde se obtiene esta enzima?
5.- ¿Por qué es importante la secuencia de bases del primer o cebador utilizado en
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)?
6.- ¿Cuáles son los reactivos necesarios para hacer una PCR?
7.- ¿Cómo se analizan los VNTRs del genoma de una persona? ¿Y los STRs? ¿En
qué se asemejan y en qué se diferencian ambas estrategias de análisis de huellas
dactilares de ADN?
10.- ¿Por qué las vacunas obtenidas por técnicas de recombinación de ADN son
más seguras que las que se fabricaban antiguamente?
EJERCITACION
1) La hemofilia A es una enfermedad hereditaria ligada al sexo y causada por la
falta de actividad del factor VIII de la coagulación. El gen que codifica para el factor VIII se
encuentra en el cromosoma X.
Una paciente con historial familiar de hemofilia A concurre a la consulta de un
médico genetista para averiguar si es portadora de la enfermedad. La paciente refiere que
posee un hermano y un tío materno afectados, y una hermana y hermano sanos. El
médico ordena la obtención de sangre venosa de su madre, padre, hermanos y su tío. A
partir del ADN extraído de las muestras se realiza un análisis de dos VNTRs localizados
en intrones 13 y 22 del gen factor VIII por PCR. A continuación, se muestran los geles de
agarosa teñidos con bromuro de etidio obtenidos y el árbol genealógico.
P = paciente
= mujer símbolo vacío = sano
= varón símbolo lleno = enfermo
= no se conoce el sexo
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VNTR intrón 13
VNTR intrón 22
P
P
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3) Usted está trabajando en el Plan Nacional de Investigación en Diabetes y
necesita clonar el gen de la acetil-CoA Carboxilasa con el objetivo de estudiar la
regulación de dicho gen por insulina en diferentes condiciones metabólicas.
a) ¿A qué vía metabólica corresponde esta enzima?
b) ¿Qué técnica utilizaría para estudiar la expresión de este gen?
c) Explique brevemente el fundamento de la técnica que eligió.
d) En un plan de detección de enfermedades genéticas, descubre que existe un
porcentaje de individuos que posee una mutación del gen de la acetil-CoA Carboxilasa,
que genera un nuevo sitio de restricción para EcoRI. Utilizando una sonda marcada
radioactivamente como se indica en la figura, ¿cuál le parece que sería la calle de la
autorradiografía correspondiente a la muestra de un individuo normal, cuál de un portador
y cuál de un individuo enfermo? Justifique.
I------------------ 2 Kb -------------------------I
1,5 Kb 0,5 Kb
I-----------------------------------I--------------I
Eco RI Eco RI Eco RI
(generado
por la mutación)
Sonda
1 2 3
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4) Dos bebés del mismo sexo (B1 y B2) nacieron el mismo día en el mismo
hospital. Debido a que se sospechó que los mismos fueron accidentalmente cambiados
en la nursery del hospital, se obtuvieron las huellas genéticas de ADN. A partir de
muestras de sangre de los padres y de los bebés, se extrajo el ADN y se amplificó por
PCR. El ADN luego fue tratado con la enzima de restricción BanI y se separaron los
fragmentos obtenidos por electroforesis en gel de agarosa. Para revelar los fragmentos
se usó una sonda radioactiva que se une a una secuencia dentro de los fragmentos BanI
que exhiben polimorfismos. Los resultados de un Southern blot son los mostrados más
abajo. Basados únicamente en este test, ¿quiénes son, con mayor probabilidad, los
padres del bebé B1 y quiénes los del bebé B2?
(MA es una de las madres y PA es su marido y MB es otra de las madres y PB su
marido).
MA PA B1 B2 MB PB
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A B C D
Peso molecular
Southern blot
5 kb
4 kb
1 kb
A B C D
Northern blot 3 kb
A B C D
20 kDa
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Bibliografía recomendada
LEHNINGER: PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA
(6ª ED.) (EN PAPEL)
ISBN 9788428216036
DAVID L. NELSON; MICHAEL M. COX , OMEGA, 2014
CADENA DE TRANSPORTE DE BIOQUIMICA
ELECTRONES Y (7ª ED.) (EN PAPEL)
ISBN 9788429176025
FOSFORILACIÓN OXIDATIVA LUBERT STRYER , REVERTE, 2013
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 1 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 2
Lípidos
Lípidos Polisacáridos
polisacáridos Proteínas
proteínas En los sistemas biológicos podemos hablar de cuatro
modalidades de transferencia de electrones:
Acetil -CoA Como átomos de hidrógeno (H+ + e-) (reacciones en las que
interviene FAD o FMN)
NADH + AH2 ⇔ A + 2 e- + 2 H+
Ciclo
Ciclo
FADH 2 Fase 2
de Krebs Como hidruro ( :H- ) (deshidrogenasas ligadas a NAD+)
EQUIVALENTES DE REDUCCIÓN
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 3 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 4
1
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Características generales de las mitocondrias
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 5 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 6
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 7 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 8
2
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NADH Nicotinamida adenina dinucleótido Complejo I:
NADH deshidrogenasa ó NADH:ubiquinona óxido reductasa
Sustrato reducido + NAD+ ⇔ Sustrato oxidado + NADH + H+
Deshidrogenasa
Niacina:
vitamina B3
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 9 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 10
Complejo I:
NADH deshidrogenasa ó NADH:ubiquinona óxido reductasa
Riboflavina: vitamina B2
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 11 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 12
3
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Complejo I:
Proteínas con Fe-S NADH deshidrogenasa ó NADH:ubiquinona óxido reductasa
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 13 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 14
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 15 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 16
4
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Citocromos COMPLEJO IV ó
citocromo oxidasa
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Succinato-CoQ reductasa
Acil CoA
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5
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(-)
malonato
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6
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ATP sintasa
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 27 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 28
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El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 29 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 30
10/4= 2,5
6/4= 1,5
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 31 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 32
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Disponibilidad de [ADP]
Disponibilidad de NADH
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 33 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 34
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 35 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 36
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Sistema de monooxigenasas del citocromo p450 mitocondrial
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 37 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 38
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SEMINARIO 18
Integración Metabólica
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Nuestro organismo debe satisfacer diversos requerimientos metabólicos
esenciales: sintetizar todos los componentes que las células necesitan, proteger nuestro
medio interno de toxinas y adaptarse a las condiciones cambiantes del medio externo.
Para cumplir con estos requisitos, transformamos los componentes de la dieta mediante el
metabolismo oxidativo, el almacenamiento y movilización de moléculas combustibles, las
vías biosintéticas y la detoxificación o eliminación de los compuestos residuales de las
diferentes vías metabólicas.
El organismo debe mantener un balance entre las necesidades de las células y la
disponibilidad de los combustibles, lo que se denomina homeostasis metabólica. La
disponibilidad constante de combustibles en la sangre se denomina homeostasis
calórica, mediante la cual el nivel sanguíneo de combustibles (en equivalentes de ATP)
no disminuye por debajo de ciertos límites, independientemente de si el individuo se
encuentra en un estado de buena nutrición o ayuno. El mantenimiento de la homeostasis
metabólica se logra mediante la integración de tres factores principales:
1) La concentración de nutrientes en la sangre, que afecta la velocidad con la
cual éstos son utilizados y almacenados en los diferentes tejidos,
2) los niveles de hormonas en sangre (primeros mensajeros), que transmiten
información a tejidos específicos sobre el estado del organismo y el aporte o demanda de
nutrientes,
3) el sistema nervioso central que, por medio de señales neurales, controla el
metabolismo directamente o a través de la liberación de hormonas.
Los nutrientes que utiliza nuestro organismo son los carbohidratos, los lípidos y las
proteínas, aproximadamente en las siguientes cantidades:
Una persona normal que lleva una vida sedentaria consume diariamente alrededor
de 200 g de glúcidos, 70 g de proteína y 60 g de lípidos, lo que le permite afrontar un
requerimiento energético de 1600-2400 kcal. Como se observa en la tabla anterior, desde
el punto de vista energético, el principal combustible metabólico son los ácidos
grasos.
Cuando se estudia la variación en los niveles de nutrientes en las diferentes etapas
que van desde la saciedad hasta el ayuno se observa que mientras que la cetonemia y la
concentración de ácidos grasos en sangre puede variar entre 1 y 2 órdenes de magnitud,
la concentración de glucosa se mantiene dentro de límites muy ajustados.
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Otros mecanismos de regulación
Los zimógenos representan un conjunto de enzimas que se activan luego de sufrir
la hidrólisis de un péptido. Esta modificación covalente es irreversible. Generalmente, este
mecanismo impide que la acción de estas enzimas, mayoritariamente enzimas
proteolíticas, se manifieste en localizaciones “inconvenientes” para la célula o el
organismo (enzimas digestivas), o permite que se desencadene un proceso en el
momento apropiado (coagulación).
Especialización celular
Aun cuando todas las células del organismo están dotadas de la información
completa correspondiente al genoma, la diferenciación que conduce a la formación de los
distintos tejidos y órganos es el resultado de la expresión diferencial de la información
genética. Es decir, cada grupo de células especializadas puede expresar diferentes genes
y por lo tanto presentar diferentes actividades enzimáticas.
Mecanismos múltiples
La superposición de diversos mecanismos de regulación en un paso metabólico no
constituye una redundancia estéril. Cada mecanismo tiene sus particularidades, entre
ellas, la velocidad con que se desencadena y con la que se establece, y la duración de su
efecto. Cuando operan varios mecanismos a la vez, la regulación de la vía es más
sensible a cambios metabólicos de diversa índole. Por otra parte, cuando alguno de los
dispositivos de control no funciona correctamente, por anormalidades del individuo o del
ambiente, las consecuencias se atenúan por la existencia de otros mecanismos de
control. Por ello, en la diversidad se encuentra gran parte de la eficiencia y eficacia de los
mecanismos de regulación metabólica, y por consiguiente, no cabe plantearse cuál de
ellos es más importante o desempeña un papel más relevante en el control del
metabolismo.
Insulina
La insulina es una hormona anabólica porque promueve el almacenamiento de
nutrientes. En particular, la insulina promueve
a) el almacenamiento de glucosa como glucógeno en hígado y músculo
b) la conversión de glucosa en TAG en hígado y su almacenamiento en el
tejido adiposo
c) el transporte de aminoácidos y la síntesis de proteínas en músculo
d) la síntesis de proteínas en el hígado (por ej. la albúmina)
e) el transporte de glucosa al músculo y al tejido adiposo La insulina también
inhibe la movilización de los combustibles.
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¿Qué efectos tiene el glucagon? Como ya dijimos, el glucagon favorece la
movilización de combustibles:
1) estimula la liberación de glucosa a partir del glucógeno hepático
2) estimula la gluconeogénesis hepática a partir de lactato, glicerol y
aminoácidos
3) moviliza los ácidos grasos de los TAG del tejido adiposo como fuente
alternativa de combustible.
Otras hormonas cuyos efectos son opuestos a los efectos de la insulina son la
adrenalina, la noradrenalina y el cortisol. Sólo la insulina y el glucagon se liberan como
respuesta directa al cambio de combustibles en la sangre. La liberación de las otras
hormonas es mediada por señales neurales.
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¿Qué ocurre luego de una ingesta con los distintos tipos de nutrientes que la
componen?
Los productos finales de la digestión de los alimentos son los monosacáridos, los
ácidos grasos y los aminoácidos que por diferentes rutas llegan a la circulación
sanguínea.
En esta situación, la hormona predominante es la insulina, que favorece la entrada
de glucosa a las células, particularmente a los miocitos y adipocitos. Sumado a la mayor
utilización de glucosa en los hepatocitos, la consecuencia es una disminución de la
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glucemia. Dos horas después de la ingesta la glucemia vuelve a los niveles del ayuno, 70
a 110 mg% (aprox. 5 mM).
En un individuo normal, aproximadamente el 50% de la glucosa ingerida se
metaboliza por glucólisis, el 10% se acumula como glucógeno y el 30 - 40% se convierte
en lípidos. En términos generales, en ausencia de insulina, la glucólisis, la glucogénesis y
la lipogénesis disminuyen. Sólo el 5% de la glucosa ingerida se transforma en lípidos en
un diabético deficiente en insulina.
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Estimulación de la glucogenolisis
El glucagon se une a receptores 7TMS
ubicados en la membrana plasmática y
asociados a la proteína Gs. La activación de la
adenilato ciclasa produce un incremento en los
niveles de AMPc y la activación de la proteína
quinasa A. Como consecuencia, la glucógeno
sintasa es fosforilada e inactivada y la síntesis
de glucógeno disminuye. Al mismo tiempo, se
estimula la degradación de glucógeno por un
mecanismo en dos pasos: 1) la PKA fosforila y
activa a la fosforilasa quinasa. 2) Esta enzima,
a su vez, fosforila y activa a la glucógeno
fosforilasa. La fosforilasa cataliza la
glucogenolisis, produciendo glucosa-1-fosfato,
que se convierte en glucosa-6-fosfato. La
desfosforilación de la glucosa-6-fosfato por la
glucosa-6-fosfatasa produce glucosa libre, que
se libera a la sangre.
Estimulación de la gluconeogénesis
Alrededor de 4 horas luego de una comida, el hígado produce glucosa que libera a
la sangre no sólo por glucogenolisis, sino también por gluconeogénesis. Los cambios
hormonales activan la liberación de precursores para la gluconeogénesis desde los tejidos
periféricos, específicamente lactato, aminoácidos y glicerol. Por diversos mecanismos se
promueve la conversión de los precursores gluconeogénicos a glucosa y se evita la
producción de ciclos fútiles. En particular, en el hígado, durante el ayuno se inactivan las
enzimas glucolíticas, piruvato quinasa, fosfofructoquinasa 1 (FFQ1) y glucoquinasa
promoviendo el flujo de carbonos por la vía gluconeogénica. Estos mecanismos operan en
los tres pasos en los que difieren la glucólisis y la gluconeogénesis:
1. Conversión de piruvato a fosfoenolpiruvato (PEP). El piruvato (derivado de
lactato y alanina) se convierte por la vía gluconeogenética a PEP. Este no se reconvierte
a piruvato (ciclo fútil) porque el glucagon promueve la fosforilación e inhibición de la
piruvato quinasa. El PEP se transforma en fructosa 1,6 difosfato (reversión de las
reacciones de la glucólisis).
2. Conversión de fructosa 1,6 bifosfato en fructosa 6 fosfato. Dados los bajos
niveles del regulador alostérico fructosa 2,6 bifosfato, la enzima glicolítica FFQ1 es
relativamente inactiva. Por lo tanto, la fructosa-6-fosfato no se convierte en fructosa-1,6-
bifosfato y se evita así un segundo ciclo fútil. La fructosa-6-fosfato se convierte en
glucosa-6-fosfato.
3. Conversión de glucosa-6-fosfato en glucosa por la glucosa-6-fosfatasa. Dado
que la glucoquinasa tiene un alto S0.5 (Km) para la glucosa y las concentraciones de
glucosa son relativamente bajas en el hepatocito durante el ayuno, la glucosa se libera a
la sangre. Por lo tanto, el tercer ciclo fútil potencial no ocurre.
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El músculo también puede liberar los cetoácidos de aminoácidos ramificados que
pueden ser transformados en el hígado en glucosa o cuerpos cetónicos (dependiendo de
su condición de aminoácidos cetogénicos o glucogénicos). A partir del cetoácido de la
valina se puede sintetizar glucosa, a partir de cetoácido de la leucina se puede sintetizar
cuerpos cetónicos y ambos tipos de compuestos se pueden sintetizar a partir del
cetoácido de isoleucina. Gran parte de la glutamina liberada por el músculo es convertida
en alanina en el epitelio intestinal. En el intestino, la glutamina puede ser parcialmente
oxidada para producir energía y en parte el esqueleto carbonado y el grupo amino se
liberan a la sangre como alanina y amonio. Esta vía probablemente involucra la formación
de oxaloacetato a partir de glutamina por el TCA y la conversión a PEP y a piruvato que
se transamina a alanina.
La síntesis de glucosa en el hígado durante el ayuno está muy relacionada con la
síntesis de urea. La mayoría de los aminoácidos ceden su grupo amino por
transaminación con α-cetoglutarato formando glutamato y un nuevo cetoácido que puede
utilizarse para la gluconeogénesis (para un aminoácido glucogénico). El glutamato (por
desaminación oxidativa catalizada por la glutamato deshidrogenasa) provee el amonio
para la síntesis de urea. Una fuente adicional de amonio es la mucosa intestinal que
convierte glutamina en alanina y amonio. Es importante considerar que cuanto mayor sea
la actividad gluconeogénica, mayor será la producción de urea.
Estimulación de la lipólisis
Los cambios hormonales (baja relación insulina/glucagon) que ocurren durante el
ayuno estimulan la degradación de TAG del tejido adiposo. Consecuentemente, se liberan
a la circulación ácidos grasos y glicerol. Los ácidos grasos (AG) son utilizados como
combustible preferentemente a la glucosa por muchos tejidos. En el corazón y el músculo,
la oxidación de los AG inhibe la glucólisis. En el cerebro, los AG no se oxidan porque no
atraviesan la barrera hematoencefálica. La -oxidación de ácidos grasos en el hígado,
permite generar el ATP necesario para la gluconeogénesis y la síntesis de acetil-CoA. En
este caso, sin embargo, la mayor parte del acetil-CoA no entra al TAC, sino que se
convierte en cuerpos cetónicos (CC, acetoacetato y -hidroxibutirato), que se transportan
a la sangre y sirven como combustible adicional para los tejidos extrahepáticos. Esto
ocurre porque en esas condiciones los niveles de oxaloacetato hepáticos son muy bajos
dado que el oxaloacetato se utiliza para la síntesis de glucosa. Como en el caso de los
AG, los CC son utilizados preferentemente a la glucosa en muchos tejidos. Pueden
atravesar la barrera hematoencefálica y cuando la cetonemia es suficientemente alta, los
CC son un combustible alternativo para el cerebro (Aclaración: esto ocurre cuando se
está en un estado de inanición: es decir con más de 3 a 5 días de ayuno) aunque son
incapaces de reemplazar completamente la necesidad de glucosa del cerebro. Los CC
también inhiben la proteólisis del músculo esquelético y por lo tanto disminuyen la
destrucción muscular durante el ayuno. Mientras la cetonemia esté elevada se necesitará
menos glucosa, menos aminoácidos gluconeogénicos y menor necesidad de usar
proteínas musculares. La glucemia tiende a disminuir en el ayuno por lo que se reduce la
secreción de insulina y se favorece la de glucagon. Además, el ayuno reduce la formación
de triiodotironina, la forma activa de la hormona tiroidea a partir de tiroxina lo que puede
reducir el requerimiento basal de energía hasta un 25%.
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Con la actividad muscular, los cambios en las concentraciones de ATP y ADP son
relativamente pequeños. Sin embargo, a través de la adenilato quinasa, los niveles de
AMP aumentan marcadamente durante el ejercicio (como vemos en el ejemplo, hay 4
veces de aumento en los niveles de AMP en el ejercicio respecto del reposo). De esta
forma, los niveles de AMP representan una señal intracelular muy importante en la
regulación del metabolismo muscular (por ej. recordar que es activador de la movilización
de glucógeno).
Hígado
El hígado esta “estratégicamente” ubicado entre la circulación general y el tracto
digestivo. Como ya se mencionó, una de las funciones centrales del hígado es mantener
la glucemia dentro de límites estrictos. Sin embargo, en el hígado se produce también un
sinnúmero de reacciones que permiten monitorear, reciclar, modificar y distribuir todos los
metabolitos absorbidos en el tracto digestivo. El hígado recibe todos los nutrientes que
entran a la sangre proveniente del tracto digestivo por la circulación enterohepática a
través del sistema porta. Esto le permite cumplir con algunas de sus funciones específicas
(como por ejemplo la síntesis de las proteínas de la coagulación) y metabolizar y eliminar
compuestos tóxicos ingeridos (por ej. alcohol) o productos metabólicos tóxicos (como el
amoníaco). Además del aporte sanguíneo de la vena porta, el hígado recibe a través de la
arteria hepática, sangre rica en oxígeno y en metabolitos provenientes de tejidos
periféricos, que fueron secretados a la circulación (por ej. glucosa, aminoácidos, ciertas
proteínas complejo hierro-transferrina, LDL remanentes, quilomicrones remanentes y
también metabolitos de desecho producidos en el metabolismo de distintos tejidos). Por
otro lado, el hígado cumple una importante función secretora de moléculas sintetizadas
localmente (por ej. VLDL y proteínas séricas). La secreción de VLDL no sólo distribuye el
exceso de calorías hacia el tejido adiposo para su almacenamiento, sino también
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fosfolípidos y colesterol hacia otros tejidos. Además, el hígado puede convertir
aminoácidos en glucosa, ácidos grasos y cuerpos cetónicos.
Músculo esquelético
El músculo esquelético representa casi la mitad del peso corporal. A pesar de usar
una gran parte de la glucosa que consumimos diariamente, el músculo no realiza
gluconeogénesis, no puede desfosforilar a la glucosa 6-P y por lo tanto no puede generar
glucosa libre y contribuir al mantenimiento de la glucemia. El músculo carece de
receptores para glucagon y, por lo tanto, no responde a las variaciones en los niveles
sanguíneos de esta hormona. Las grandes reservas de glucógeno muscular no pueden
ser movilizadas para mantener la glucemia, pero son importantes para el metabolismo
energético local, a través de la activación del sistema adrenérgico. Si se realiza
metabolismo anaeróbico, se incrementa la formación de lactato que puede ser
transportado a otros tejidos. El corazón usa grandes cantidades de lactato producido por
otros tejidos. A diferencia del hígado, el músculo esquelético carece de actividad de ácido
grasa sintetasa y por lo tanto no puede sintetizar ácidos grasos ni triglicéridos. Sin
embargo, el paso inicial en la síntesis de ácidos grasos (la síntesis de malonil-CoA) está
activo y sujeto al control de la AMP quinasa. Como ya mencionamos, el malonil-CoA
regula el transporte de ácidos grasos en la membrana mitocondrial interna y por lo tanto la
velocidad de oxidación de ácidos grasos en el músculo esquelético.
Corazón
El metabolismo del músculo cardíaco difiere del metabolismo del músculo
esquelético en diferentes aspectos. El metabolismo cardíaco en condiciones normales es
completamente aeróbico, mientras que el músculo esquelético puede funcionar
anaeróbicamente por períodos cortos. El corazón no contiene reservas apreciables de
combustibles metabólicos, ya sea glucógeno o lípidos, aunque contiene una pequeña
cantidad de fosfocreatina. Por lo tanto, el aporte de oxígeno y nutrientes debe ser
continuo. El corazón puede utilizar ácidos grasos, cuerpos cetónicos, glucosa y lactato.
Luego de una ingesta, predomina la utilización de lactato y glucosa, pero en el ayuno o
durante el ejercicio predomina la de ácidos grasos. Recién en condiciones extremas,
como carreras de 100 m o cuando la irrigación disminuye (como en la ateroesclerosis o
infarto de miocardio) puede realizar glucólisis anaeróbica.
Cerebro
El cerebro debe generar grandes cantidades de ATP para mantener el potencial de
membrana, lo que resulta esencial para la transmisión de los impulsos nerviosos. En
condiciones normales, el cerebro sólo usa glucosa como combustible, oxidándola a través
de la glucólisis aeróbica. No utiliza ácidos grasos, pues éstos no atraviesan la barrera
hematoencefálica. De hecho, el 60% del total de glucosa consumida por el organismo es
utilizado por el cerebro. El metabolismo del cerebro es totalmente aeróbico, consume el
20% del total del oxígeno consumido por el organismo. No posee reservas apreciables de
glucógeno u otros combustibles, por lo que requiere del aporte constante de oxígeno y
glucosa que atraviesan la barrera hematoencefálica con facilidad. Después de 5-10 días
de ayuno, el cerebro comienza a utilizar cuerpos cetónicos además de glucosa,
reduciendo notoriamente el consumo de glucosa.
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¿Por qué los cuerpos cetónicos reemplazan sólo parcialmente los requerimientos
de glucosa del cerebro? Las células gliales se alinean con los vasos sanguíneos que
irrigan el cerebro y forman una barrera que los ácidos grasos no pueden cruzar. Las
células gliales captan glucosa y la metabolizan por glucólisis anaeróbica a lactato, que es
exportado hacia las regiones más internas del cerebro. Allí, el lactato sirve como sustrato
para el metabolismo aeróbico. Por lo tanto, las células de la glía parecen ser parcialmente
dependientes del metabolismo anaeróbico y los cuerpos cetónicos no son sustratos de
esta vía metabólica. Esto bien puede explicar la dependencia del SNC por glucosa,
además de los cuerpos cetónicos, aun en estado de inanición.
Tejido adiposo
La función principal del tejido adiposo es almacenar combustibles lipídicos en forma
de TAG. Como ya se ha descripto, el transporte de glucosa a los adipocitos es un
mecanismo que depende de insulina. Los ácidos grasos se sintetizan a partir del acetil-
CoA que proviene del piruvato y de NADPH (procedente de la vía de las pentosas). El
glicerol 3 fosfato necesario para la síntesis de TAG proviene de la reducción de un
intermediario de la glucólisis, la dihidroxiacetona fosfato, ya que los adipocitos carecen de
la capacidad de fosforilar al glicerol, por no expresar la enzima glicerol quinasa. Por lo
tanto, la síntesis de TAG depende absolutamente de glucosa. La glucosa funciona como
sensor del metabolismo del tejido, cuando sus niveles son adecuados, se produce
glicerol-3-fosfato para la síntesis de TAG y cuando los niveles son bajos, los ácidos
grasos sintetizados se liberan de los adipocitos y son utilizados por otros tejidos.
Eritrocitos
El eritrocito es una célula especializada en el transporte de oxígeno, dióxido de
carbono y protones. La falta de mitocondrias le impide un metabolismo aeróbico,
reduciendo sus posibilidades de obtención de energía a la glucólisis anaeróbica con
formación de lactato, que pasa a sangre y puede utilizarse como combustible por tejidos
como el corazón o como precursor gluconeogenético por el hígado. La reducción del
piruvato a lactato es fundamental para reoxidar el NADH y permitir que la glucólisis siga
ocurriendo. Los requerimientos energéticos del eritrocito se basan en el mantenimiento de
su forma bicóncava (que asegura un transporte adecuado de gases e impide la remoción
por las células del sistema retículo endotelial) y de su ambiente iónico interno. Además de
la glucólisis anaeróbica, el eritrocito utiliza la glucosa para obtener NADPH por la vía de
las pentosas. El NADPH se utiliza para evitar la oxidación del hierro de la hemoglobina,
que en esa forma no podría transportar el oxígeno. Además, el NADPH es necesario para
mantener elevados los niveles de glutatión reducido que se emplea como defensa contra
los radicales libres del oxígeno. Finalmente, la glucosa también es utilizada en el glóbulo
rojo en una derivación de la vía glucolítica para sintetizar 2,3-difosfoglicerato (2,3 DPG) a
partir de 1,3-difosfoglicerato, cuya función es disminuir la afinidad de la hemoglobina por
el oxígeno, permitiendo una mayor liberación de oxígeno en los tejidos.
Insulina
En términos generales la insulina promueve:
1) la captación de sustratos por determinadas células
2) el almacenamiento de combustibles como glucógeno y lípidos
3) la biosíntesis de macromoléculas como ácidos nucleicos y proteínas.
Más en detalle, la insulina produce:
- Aumento de la permeabilidad a la glucosa en músculo y tejido adiposo,
por exposición del transportador GLUT4 en las membranas plasmáticas.
- Activación de la glucólisis y de la vía de las pentosas en el hígado y
tejido adiposo por inducción de las enzimas clave (fosfofructoquinasa y glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa, respectivamente), lo que permite la generación de energía y de
precursores para la síntesis de AG (NADPH y acetil-CoA) y de TAG (glicerol-3-fosfato,
proveniente de la reducción de la dihidroxiacetona fosfato).
- Activación de la síntesis de ácidos grasos y triacilglicéridos en hígado
y tejido adiposo, al aumentar el aporte de precursores y por inducción de la enzima
acetil-CoA carboxilasa. De esta manera se favorece la formación de la lipoproteína VLDL
en el hígado, que por sangre llega a los tejidos periféricos donde es sustrato de la
lipoproteín-lipasa, enzima cuya síntesis también se induce por insulina.
- Inhibición de la gluconeogénesis en hígado al disminuir las actividades
de fructosa- 1,6difosfatasa y de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa. Este efecto se debe en
parte al aumento de los niveles de fructosa-2,6-difosfato.
- Aumento de la síntesis e inhibición de la degradación de glucógeno en
hígado y músculo. A nivel hepático, se ha descripto recientemente una proteína quinasa
B, que se activa por fosforilación desencadenada por insulina. La proteína quinasa B
fosforila a una enzima denominada glucógeno sintasa quinasa (GSK), inactivándola. De
esta forma, no fosforila a la glucógeno sintasa y ésta se mantiene activa, con la
consecuente síntesis de glucógeno. Tanto en el hígado como en el músculo, la activación
de fosfodiesterasas disminuye los niveles de AMPc inactivándose por lo tanto la proteína
quinasa A. Además, la insulina activa fosfatasas con lo cual disminuye el grado de
fosforilación de la fosforilasa quinasa y de la glucógeno fosforilasa inactivando ambas
enzimas. En consecuencia disminuye la glucogenólisis. La desfosforilación de enzimas
también contribuye a mantener la glucógeno sintasa en estado activo.
- Efecto antilipolítico debido a la disminución en los niveles de AMPc
intracelular por activación de fosfodiesterasas. También contribuye la activación de
fosfatasas. En consecuencia, se inactiva la lipasa hormono sensible y se reduce la
hidrólisis de TAG en tejido adiposo.
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- Aumento de la captación de aminoácidos en músculo, con incremento
de la síntesis de proteína muscular.
Glucagon
El principal órgano blanco del glucagon es el hígado, donde interactúa con
receptores específicos acoplados a la adenilato ciclasa. Su mecanismo de acción
involucra el incremento en los niveles de AMPc. Consecuentemente se activan la
glucogenólisis (glucógeno fosforilasa fosforilada y, por lo tanto, activa) y se inhibe la
glucogenogénesis (glucógeno sintetasa fosforilada y por lo tanto, inactiva). Además, por
fosforilación de la FFQ2 disminuye su actividad de quinasa y aumenta su actividad de
fosfatasa, con lo que se hidroliza la fructosa-2,6-difosfato, se inhibe la glucólisis y se
activa la gluconeogénesis. El glucagon también inhibe a la piruvato quinasa hepática
causando una acumulación de PEP y una disminución en los niveles de piruvato. La
acumulación de PEP promueve la gluconeogénesis, mientras que la inhibición de la
piruvato quinasa disminuye la actividad de la vía glucolítica.
Varias enzimas se inducen cuando los niveles de glucagon son elevados,
fundamentalmente las que catalizan los pasos claves de la gluconeogénesis, la glucosa-6-
fosfatasa, la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y la fructosa-1,6-difosfatasa.
El glucagon también aumenta los niveles de AMPc en el tejido adiposo, donde
promueve la movilización de los depósitos de TAG por activación de la lipólisis (activa la
lipasa hormono sensible). Asimismo, al aumentar el nivel de ácidos grasos libres y su
captación por el hígado, los acil-CoA inhiben alostéricamente la acetil-CoA carboxilasa,
que también se inhibe por fosforilación inducida por glucagon. Como resultado, la síntesis
de ácidos grasos en el hígado se inhibe.
Catecolaminas
Las catecolaminas, adrenalina y noradrenalina, funcionan como hormonas al
liberarse a la sangre por la médula adrenal. La hipoglucemia es uno de los estímulos para
la liberación de estas hormonas. En el músculo, sus receptores están acoplados a la
adenilato ciclasa y se produce un incremento en los niveles de AMPc activando la
glucogenólisis. En consecuencia, la captación de glucosa por el músculo disminuye y la
glucemia aumenta. La adrenalina también inhibe la secreción de insulina y estimula la de
glucagon. Este efecto aumenta la producción y liberación de glucosa por el hígado con
incremento en la glucemia. Al igual que el glucagon, la adrenalina estimula la lipólisis (a
través de la proteína quinasa A).
Glucocorticoides
Los glucocorticoides tienen acciones diversas que afectan la mayoría de los tejidos
del organismo, algunos de estos efectos parecerían ser contradictorios, pero si se los
analiza en conjunto, se puede ver que promueven la sobrevida en situaciones de estrés.
Son moduladores lentos del metabolismo de los combustibles circulantes. Sus efectos se
relacionan con la regulación de la expresión de enzimas clave de varias vías metabólicas.
Inducen la expresión de las enzimas de la gluconeogénesis: piruvato carboxilasa,
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, fructosa-1,6-difosfatasa y glucosa-6-fosfatasa.
Asimismo, por sus efectos catabólicos sobre las proteínas tisulares en condiciones de
estrés, aportan sustratos para la gluconeogénesis. Además, facilitan la lipólisis inducida
por otros agentes como glucagon y catecolaminas.
Hormona de crecimiento
Ejerce un efecto hiperglucemiante y lipolítico, es decir, opuesto al de la insulina. En
ese sentido, disminuye la utilización periférica de glucosa y estimula su producción
hepática por gluconeogénesis. Se ha demostrado también que la hormona de crecimiento
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acentúa la movilización de grasas de los depósitos, incrementando los niveles de glicerol
y ácidos grasos libres en plasma.
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CICLO ATP-ADP
INTEGRACIÓN del
METABOLISMO ENERGÉTICO
PANCREAS HÍGADO
Hígado Músculo • CONTROL DE LA GLUCEMIA – reservas de glucógeno,
INSULINA/ gluconeogénesis
GLUCAGON
•Almacena glucógeno
• En condiciones normales sólo usa glucosa en condiciones • El glicerol-3-P para la síntesis de TAG proviene de la
aeróbicas glucólisis (DHAP)
• Luego de un ayuno prolongado, además de glucosa, puede • En post-ingesta acumula TAG (insulina)
utilizar cuerpos cetónicos
• En ayuno degrada TAG (glucagon, adrenalina)
ERITROCITOS Mecanismos de regulación de la
velocidad de las vías metabólicas
• Utilizan exclusivamente glucosa en anaerobiosis: la 1. Disponibilidad de sustrato
lactato deshidrogenasa permite reoxidar el NADH y 2. Compartimentación celular
produce lactato
3. Regulación alostérica
• La vía de las pentosas permite obtener NADPH (evitar
la oxidación del Fe de la Hemoglobina y mantener el
4. Modificación covalente
glutation en estado reducido) 5. Inducción y represión enzimáticas
Reservas
Combustible Tejido gramos kilocalorías / %
Almacenado
Glucógeno Hígado 70 – 200 280 / 0,2
Glucógeno Músculo 120 480 / 0,4
Glucosa Fluidos Corporales 20 80 / 0,05
Lípidos TAG Adiposo 15000 135000 / 85
Proteínas Músculo 6000 24000 / 14-15
CONSECUENCIAS DE LAS VARIACIONES DE LA GLUCEMIA PANCREAS
Hígado Músculo
INSULINA/
GLUCAGON
(Glucagon =
glucose is gone)
Homeostasis
Metabólica
Adiposo
Tracto GI SNC
3 formas de integración entre tejidos
Glucose
0 1 2 3
REGULACIÓN DEL METABOLISMO POST-INGESTA
CICLOS DE INGESTA/AYUNO SECRECIÓN DE INSULINA
Glucosa
Transportador de glucosa
DIETA RICA EN PROTEÍNAS Umbral GLUT2 Espacio extracelular
80 mg%
Célula β pancreática
Glucosa
hexoquinasa IV
(glucoquinasa)
Glucosa-6-fosfato
Glucólisis Núcleo
Ciclo de Krebs
Glucose (mg%)
Fosforilación
oxidativa
Sulfonilureas
(glibenclamida) -
Canal de K+ Fusión y
Hipoglucemiante oral Gránulos de
dependiente de ATP exocitosis
insulina
Secreción
de insulina
Canal de Ca2+
despolarización dependiente de voltaje
Insulina - procesamiento
RER
proteólisis
proteólisis
Golgi
heterodímero
POST-INGESTA
(150 g/día)
(h/200-300 g)
(sín límite)
Insulina
Membrana plasmática
El influjo de glucosa en el
músculo esquelético y en
el tejido adiposo
(transportadores GLUT4)
aumenta hasta 15 veces !!!
¿CÓMO SE METABOLIZAN LOS AMINOÁCIDOS DE LA DIETA?
TRANSPORTADORES DE GLUCOSA
urea
Hígado
REGULACIÓN DEL METABOLISMO REGULACIÓN DEL METABOLISMO
AYUNO AYUNO
Ingesta
12 hs 5 semanas
Glucosa: -20% Glucosa: -40%
Acetoacetato: constante Acetoacetato: x 30
Ácidos grasos: x 4 Ácidos grasos: x 10
β-hidroxibutirato : x 3 β-hidroxibutirato : x 200
AC
AMPc
AMP PDE
AMPc ATP
R R Inhibición de
fosfatasas P
C C
PKA inactiva PKA activa
C C
R R
glucógeno
P-OH P-O-P fosforilasa ACTIVA
Variación de actividades
enzimáticas sintasa INACTIVA
Transcripción
TRADUCCION Variación del nivel
de expresión de enzimas
ESTADO POST - ABSORTIVO
POST - AYUNO NOCTURNO
(80 g)
post ayuno
12 hs)
Glicerol
Glucogenólisis
Gluconeogénesis
Horas Días
I II III IV V
Ingesta Ayuno Ayuno Ayuno Inanición
corto medio prolongado
ggeno gneo çc mm
3/5-10/12 d
Lactato
deshidrogenasa
Lactato Piruvato
Alanina
aminotransferasa
Alanina Piruvato
Adrenalina
Activación de Activación de
Adenilil Ciclasa Fosfolipasa C
Inducción de enzimas
clave de la
gluconeogénesis
Catabolismo de
proteínas musculares
Ingesta
urea
12 hs 5 semanas
Glucosa: -20% Glucosa: -40%
Acetoacetato: constante Acetoacetato: x 30
Ácidos grasos: x 4 Ácidos grasos: x 10
β-hidroxibutirato : x 3 β-hidroxibutirato : x 200
AYUNO (3-5 días de ayuno)
PANCREAS
Hígado Músculo
INSULINA/
GLUCAGON
(Glucagon =
glucose is gone)
Homeostasis
Metabólica
Adiposo
Tracto GI SNC
AMP
AMPKK PPasa
AMPK AMPK
Transcripción
Impulso nervioso
AMPc
Retículo
sarcoplásmico
Ca2+ proteína quinasa A
ATP
contracción
muscular ADP Ca2+-calmodulina
AMP/ Fosforilasa
quinasa
P
AMPK
FFQ 1
glucógeno glucógeno
Glucólisis fosforilasa b fosforilasa a
activa
Glucogenolisis
Pi
SEMINARIO 19
1
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MATERIA QUÍMICA BIOLÓGICA - CICLO LECTIVO 2017
5.- ¿Qué destinos tiene la glucosa que llega al hígado? Indique todos,
independientemente de la ingesta. Señale las diferencias entre ayuno y saciedad.
6.- ¿Cómo se regula la gluconeogénesis durante el ayuno? ¿Cuáles son sus sustratos y
su fuente de energía? ¿a partir de qué sustrato gluconeogénico se requiere la menor
cantidad de energía para sintetizar glucosa? Compare el efecto regulador del glucagon y
del cortisol.
11.- ¿En qué situaciones la concentración de lactato en sangre aumenta? ¿Qué problema
puede acarrear una concentración elevada de lactato en sangre? ¿Qué tejido(s) sintetizan
y cuáles consumen lactato? ¿Qué destino puede tener el lactato?
12.- La síntesis de triacilglicéridos por los adipocitos no puede proceder sin el aporte
externo de glucosa. Justifique.
¿Qué diferencia existe entre la síntesis de triacilglicéridos en el tejido adiposo y en el
hígado?
13.- ¿Qué sucede con el metabolismo del tejido adiposo en el ayuno prolongado?
14.- Marque con la letra E los siguientes procesos metabólicos que son estimulados por
insulina y con la letra I aquellos procesos que son inhibidos por la hormona.
a) Gluconeogénesis en hígado………
b) Entrada de glucosa al músculo y tejido adiposo……
c) Glucólisis en el hígado…
d) Degradación proteica intracelular…………
e) Síntesis de glucógeno en el hígado y el músculo….
f) Captación de aminoácidos ramificados en el músculo…………
g) Síntesis de triacilglicéridos en el tejido adiposo……………
2
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MATERIA QUÍMICA BIOLÓGICA - CICLO LECTIVO 2017
15.- ¿Cuál de las siguientes afirmaciones es incorrecta en relación a la utilización de
combustible metabólico después de 3 días de ayuno?
a) más glucosa es consumida por el cerebro.
b) los triacilglicéridos del tejido adiposo son degradados para proveer ácidos grasos a la
mayoría de los tejidos.
c) es posible detectar consumo de cuerpos cetónicos como combustible en el cerebro.
d) las proteínas son degradadas para proveer precursores de 3 carbonos para la síntesis
de glucosa.
17.- Dadas las fuentes de energía de la pregunta anterior, ordénelas en orden decreciente
de la producción total potencialmente disponible de ATP
(a) Una carrera de 100 metros
(b) Una carrera de 1000 metros
(c) Una maratón
24.- Un paciente diabético tipo I no tratado puede entrar en coma por descenso del pH
sanguíneo y deshidratación. Explique por qué la falta de insulina promueve estos dos
efectos.
4
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SEMINARIO 20
Radioinmunoensayo
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TÉCNICAS DE RADIOCOMPETICIÓN PROTEICA
Nociones de Radioactividad
Recordemos que los átomos están formados por un núcleo, que contiene protones,
neutrones y la energía de interacción nuclear y por una zona extranuclear donde se
mueven los electrones por caminos energéticos definidos llamados órbitas. La
radioactividad es un fenómeno nuclear, por el cual un núcleo inestable se desintegra,
perdiendo partículas o energía de excitación para formar una especie nuclear más
estable.
Los átomos poseen en su núcleo protones y neutrones. Se pueden definir el
número atómico Z (es el número de protones) y el número másico A (número de protones
y neutrones) de un elemento. La identidad del átomo viene dada por su número atómico Z
(un elemento de Z = 6 siempre va a ser C, no importa el número de neutrones). Sin
embargo, podemos encontrar en la naturaleza un elemento con más de un número
másico, en este caso se los denomina isótopos (podemos encontrar C con 6, 7 u 8
neutrones, pero siguen siendo C porque su Z = 6. Muchos de los isótopos de los
elementos representados en la tabla periódica de Mendeleiev son inestables en su
núcleo, ya sea por exceso de masa, neutrones, protones o energía. Para ganar
estabilidad deben perder ese exceso emitiendo partículas o fotones (desintegración), en
otras palabras, estos isotopos son radioactivos. En la técnica de Radioinmunoanálisis
(RIA), los se utilizan elementos radioactivos, los más frecuentemente utilizados para
“marcar” los antígenos (Ag) son 125I y 3H (tritio).
El 125I posee un exceso de energía y para ganar estabilidad desintegra emitiendo
fotones (energía). Como los fotones no poseen masa, su interacción con la materia es
baja, por lo que pueden recorrer grandes distancias antes de colisionar con moléculas del
medio circundante (tienen alta penetrancia). El número de desintegraciones que el 125I
emite en la unidad de tiempo puede medirse en un contador de centelleo sólido. El
funcionamiento de este instrumento se basa en la interacción que se produce entre los
fotones emitidos y un cristal de NaI (figura).
Figura: Contador de Centelleo Sólido
RADIOINMUNOANÁLISIS
En el radioinmunoanálisis, la proteína ligadora es un anticuerpo (Ac) y la sustancia
que se quiere valorar en el suero del paciente es considerada el antígeno (Ag)
Al enfrentar en un tubo el Ag con el Ac, ocurre la siguiente reacción y se establece
el equilibrio:
Ac + Ag Ag-Ac
Pero qué pasaría si al tubo de ensayo le agregáramos una cantidad conocida de
la sustancia a dosar, o sea el Ag, pero marcada radioactivamente (Ag*, también llamada
trazador). Las características inmunoquímicas del Ag* deben permanecer idénticas a las
del Ag sin marcar, en otras palabras, la presencia del átomo radiactivo en la molécula no
debe distorsionar ningún epitope.
De esta forma, el Ag y el trazador competirán por su unión al Ac que no podrá
distinguir entre ellos. Por lo tanto, existirán dos equilibrios simultáneos:
Nos resta poder separar dichas fracciones (unida y libre) por algún método, luego
podemos medir la radioactividad presente en cada una de estas fracciones, de manera tal
de poder cuantificar la proporción de trazador que se encuentra en cada una de las
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fracciones. Cuanto mayor haya sido la cantidad de Ag presente en la muestra original,
mayor será la cantidad de complejos Ag-Ac y menor la de complejos Ag*-Ac formados, y
mayor será la cantidad de Ag* libre.
La separación de ambas fracciones puede efectuarse por alguno de los siguientes
métodos:
- precipitación con segundo anticuerpo: los complejos formados se precipitan
con un segundo anticuerpo dirigido contra el anticuerpo utilizado en el ensayo. Este
método se usa principalmente cuando el Ag es una hormona proteica, ya que se forman
complejos proteicos de alto peso molecular que precipitan fácilmente.
- adsorción de la fracción libre: se emplean materiales de alto poder adsorbente
como el carbón activado con o sin agregado de dextrano, talco, florisil, etc., que retienen,
por el fenómeno físico de adsorción, las moléculas de bajo peso molecular. Al centrifugar
el carbón activado con las partículas adsorbidas se encuentran en el precipitado. Se
emplea para hormonas esteroides.
Separadas ambas fracciones, se mide la radioactividad en general en la fracción
donde se encuentran los complejos Ag-Ac, llamada fracción unida. Si se usó el método
del 2do Ac, la fracción unida se encuentra en el precipitado; pero si se usó el método del
carbón activado, la fracción unida se encuentra en el sobrenadante.
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Cada vez que se realice un ensayo deben considerarse:
• Las uniones inespecíficas que corresponden a la unión del Ag* a otras
sustancias que no sean el Ac. Para ello utilizamos tubos procesados de la misma manera
que los restantes pero que carecen del Ac. Toda unión que se observe en estos tubos se
deberá a la fijación del Ag y Ag* a moléculas distintas al Ac. El valor de esta unión
inespecífica se sustrae a los tubos restantes, ya que se asume que en todos los tubos
ocurre en la misma proporción.
• La unión máxima que corresponde a la unión que puede darse entre el
antígeno marcado y el anticuerpo en ausencia de antígeno frío. Este tubo se procesa de
igual manera que las demás muestras no se le adiciona antígeno frío.
• La unión total que corresponde a la radioactividad total que se incorpora en
el ensayo en todos los tubos. En este tubo se adicionan todos los compuestos, pero no se
realiza la fase de separación y se mide la radioactividad de ambas fracciones (unida y
libre).
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EJEMPLO - UN ENSAYO RIA
Se realiza un RIA para determinar la concentración de LH en 2 muestras de suero
(A y B). El contenido de cada tubo y los datos obtenidos se muestran en la siguiente tabla:
Nombre del Tubo Componentes y procesamiento de cada tubo Radioactividad
Standard de Método
Muestra concentración Trazador Ac 1° de
a Dosar conocida (LH*) (anti LH) Ac 2° separación cpm
Total No No Si No No No 43399/43687
Unión Inespecífica No No Si No Si Si 396/418
Unión Máxima No No Si Si Si Si 17486/17542
5 UI/ml No Si Si Si Si Si 16208/16301
15 UI/ml No Si Si Si Si Si 13502/13804
30 UI/ml No Si Si Si Si Si 10078/10971
75 UI/ml No Si Si Si Si Si 6711/6424
150 UI/ml No Si Si Si Si Si 4145/4218
Resolución
300 UI/ml No Si Si Si Si Si 3011/3077
o -Primero hay queNopromediar los valores de radioactividad (cpm) para cada
Muestra A Si Si Si Si Si 14269/13768
par de duplicados. No
Muestra B
o La uniónSi específica de cadaSi tubo seSi obtieneSi restando
Si 9901/9523
el promedio de la
unión inespecífica [(396+418)/2=407].
Nombre del Tubo cpm cpm promedio cpm específico T logit log [LH]
Total 43399/43687
Unión Inespecífica 396/418 407
Unión Máxima 17486/17542 17514 17107
5 UI/ml 16208/16301 16254,5 15847,5 0,93 2,53 0,70
15 UI/ml 13502/13804 13698 13291 0,78 1,25 1,18
30 UI/ml 10078/10971 10974,5 10567,5 0,62 0,48 1,48
75 UI/ml 6711/6424 6567,5 6160,5 0,36 - 0,57 1,87
150 UI/ml 4145/4218 4181,5 3774,5 0,22 - 1,26 2,17
300 UI/ml 3011/3077 3044 2637 0,15 - 1,70 2,48
Muestra A 14269/13768 14018,5 1361,5 0,79 1,36
Muestra B 9901/9523 9762 9355 0,55 0,19
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Resultados exactos:
[LH] A = 13,72 mUI/ml [LH] B = 41,58 mUI/ml
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Cuestionario de RIA
1.- ¿Qué tipo de compuestos pueden ser evaluados por RIA?
2.- ¿Cuál es la sensibilidad de un ensayo de RIA?
3.- ¿Cuáles son los tres reactivos específicos que deben estar presentes en la
determinación de un compuesto por el método RIA? ¿Qué función cumple cada uno de
ellos? Dé ejemplos.
4.- ¿Cuál es el reactivo utilizado para marcar antígenos?
5.- Al realizar un radioinmunoanálisis, ¿por qué es necesario separar la fase libre
de la unida?
6.- ¿Cómo realizaría una curva patrón para la determinación de LH?
7.- Imagine que está evaluando la concentración de una hormona por RIA. Si
consideramos que está detectando únicamente la radiactividad debida a la fase ligada:
¿esperaría obtener más señal en una muestra con más o con menos concentración de
hormona? Justifique su respuesta.
10.- ¿Cómo procedería si quiere determinar la concentración de prolactina en la
muestra de un paciente?
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TRABAJO PRÁCTICO 15
Sangre – Orina
ELISA
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
SANGRE
Se puede considerar que la sangre es un tejido conectivo fluido, porque está
compuesto por células y una “sustancia intercelular” líquida: el plasma sanguíneo.
La cantidad total de sangre en un individuo adulto es de aproximadamente 5-6
litros, representando así el 7-8% del peso corporal. El plasma corresponde al 54% del
volumen sanguíneo, mientras que la porción celular, representa el 46% restante.
La sangre circula por el organismo a través de los vasos sanguíneos y tiene la
función de transportar:
nutrientes orgánicos
desechos orgánicos resultantes del metabolismo celular y el exceso de iones
minerales hacia los riñones para su excreción
gases (O2 y CO2) desde los pulmones hacia los tejidos y viceversa
vitaminas, hormonas, etc.
Otras funciones de la sangre incluyen:
mantener el equilibrio ácido-básico del cuerpo
regular el balance hídrico
participar en la regulación de la temperatura corporal
mediar en los mecanismos de defensa del organismo (puesto que la sangre
contiene, entre otros, leucocitos y anticuerpos)
La sangre es el líquido más frecuentemente utilizado con finalidades analíticas. Los
tres procedimientos generales para la obtención de sangre de un individuo son:
1) punción arterial
2) punción venosa
3) punción cutánea
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La técnica de elección para la obtención de muestras de sangre dependerá de los
parámetros que se deseen analizar. La punción venosa es técnicamente más fácil y es la
usualmente utilizada para la mayoría de las determinaciones de rutina, pero proporciona
valores incorrectos de saturación de O2 y pCO2, parámetros que deben medirse a partir
de una punción arterial. Estas determinaciones de los gases en sangre son críticas para
valorar los problemas de oxigenación que se encuentran en enfermedades tales como el
asma, neumonías, embolia pulmonar. Los pacientes con oxígenoterapia prolongada o
ventilación mecánica son monitoreados para lograr el nivel de oxigenación adecuado.
La sangre obtenida por punción de la piel (a veces denominada incorrectamente
sangre capilar) es una mezcla de sangre procedente de arteriolas, vénulas y capilares, y
contiene también líquido intersticial e intracelular. Por lo tanto, está compuesta por una
fracción arterial y una fracción venosa. La mayor presión en las arteriolas hace que la
muestra sea más rica en sangre arterial.
En los tres casos, si inmediatamente de extraída la sangre se mezcla en un tubo
con un anticoagulante, se tiene lo que se llama sangre entera, y se mantiene en ese
estado por un tiempo prolongado.
Si luego el tubo se centrifuga a baja velocidad, se obtienen dos fracciones
claramente definidas:
a) un precipitado de células, compuesto por eritrocitos comprimidos
(aproximadamente 45% del volumen total) por encima de los cuales existe un volumen de
glóbulos blancos y plaquetas (aprox. 1%)
b) un sobrenadante fluido que corresponde al plasma y representa el 54%
restante.
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7 g% de proteínas,
900 mg% de electrolitos (especialmente iones sodio (Na +), cloruro (Cl-),
bicarbonato (HCO3-), potasio (K+), calcio (Ca2+), magnesio (Mg2+) y fosfatos.
Bajas concentraciones de pequeñas moléculas orgánicas que comprenden
aproximadamente: 100 mg% de glucosa, 25 mg% de productos de desechos
nitrogenados no proteicos (el principal es la urea), lípidos (triglicéridos, fosfolípidos,
colesterol).
DETERMINACIONES EN SANGRE
Las determinaciones sanguíneas más importantes pueden clasificarse en los
siguientes grupos:
1) Hematología.
a. Hemograma y exámenes hematológicos.
2) Coagulación y hemostasia.
3) Análisis de gases en sangre y saturación de oxígeno.
4) Determinaciones físico-químicas:
a. Características físicas: osmolaridad plasmática, viscosidad de la
sangre, velocidad de sedimentación globular (eritrosedimentación).
b. Concentración de electrolitos: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, H2PO4-
c. Concentración de compuestos orgánicos: glucosa, urea, ácido úrico,
lípidos, bilirrubina, proteínas, etc.
5) Determinación de actividades enzimas: lactato deshidrogenasa (LDH),
creatinfosfoquinasa (CPK), transaminasa glutámico-oxaloacética (TGO), transaminasa
glutámico-pirúvica (TGP), amilasa, colinesterasa, fosfatasa ácida y alcalina, etc.
6) Serología y diagnóstico inmunobiológico: determinación de antígenos y/o
anticuerpos marcadores de enfermedades (SIDA, carcinomas, hepatitis, etc.),
determinación de complemento, anticuerpos antinucleares, anticitoplasmáticos,
antieritrocitarios, antifosfolípidos, inmunocomplejos, etc.
7) Otros: determinación de marcadores oncológicos, tóxicos y fármacos.
Los rangos de referencia son guías valiosas para el médico pero como se dijo
anteriormente, no deben tomarse como indicadores absolutos de salud o enfermedad.
Además, los valores entre laboratorios pueden variar significativamente por diferencias en
la metodología y la forma de estandarización. Por lo tanto, los valores de referencia en
una determinada institución pueden variar con respecto a los listados en esta guía.
HEMATOLOGÍA
El estudio hematológico más frecuente es el Hemograma.
El Hemograma completo consiste en determinar:
1. Cantidad de cada tipo de célula presente en la sangre:
a. Recuento de glóbulos blancos o leucocitos
b. Recuento de glóbulos rojos llamados también hematíes o eritrocitos
c. Recuento de plaquetas.
2. Hematocrito
3. Concentración de hemoglobina
4. Índices hematimétricos:
a. Volumen corpuscular medio (VCM)
b. Hemoglobina corpuscular media (HCM)
c. Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM)
5. Fórmula leucocitaria
6. Evaluación morfológica de las células
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El hematocrito informa el volumen que ocupan los glóbulos rojos como porcentaje
del total de la sangre y se mide centrifugando un pequeño volumen de sangre en un tubo
cilíndrico y midiendo la relación entre la altura de la columna de hematíes con respecto a
altura total de la columna.
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total de eritrocitos, el hematocrito y la concentración de hemoglobina. Son útiles para
clasificar los diferentes tipos de anemias.
el volumen corpuscular medio (VCM) = hematocrito/nº hematíes. Evalúa el
volumen medio de los glóbulos rojos. Pueden presentarse alteraciones hematológicas con
eritrocitos de menor volumen (microcíticas) o de mayor volumen (macrocíticas).
la hemoglobina corpuscular media (HCM) = concentración de hemoglobina/nº
hematíes. Evalúa la hemoglobina contenida en cada glóbulo rojo
la concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) = concentración de
hemoglobina/hematocrito. Evalúa la hemoglobina contenida en todos los eritrocitos.
Pueden presentarse alteraciones donde los eritrocitos tienen menor concentración
de hemoglobina (hipocrómicas) o mayor concentración (hipercrómicas).
Por ejemplo, las anemias ferropénicas (por deficiencia de hierro) presentan valores
disminuidos de HCM (microcíticas) y de CHCM (hipocrómicas).
Hoy en día es muy frecuente que los laboratorios cuenten con contadores
hematológicos, equipos preparados para contar los distintos tipos de células. En este
caso el mismo contador prepara la muestra y está calibrado para contar las partículas de
cada tipo, según el tamaño de cada tipo de células. También mide la concentración de
hemoglobina y a partir de estos parámetros, el equipo calcula los índices hematimétricos.
La fórmula leucocitaria expresa la cantidad de cada tipo de leucocito. Puede ser
absoluta (expresada por volumen de sangre) o porcentual.
En diversas patologías (infecciones, intoxicaciones, reacciones alérgicas,
leucemias, etc.) puede alterarse el número total de leucocitos y/o las cantidades relativas
de cada tipo leucocitario.
La fórmula leucocitaria y la evaluación morfológica (color, tamaño y forma) de las
células se determinan por observación microscópica de una gota de sangre fresca
extendida sobre un portaobjetos de vidrio, preparado que se denomina frotis. Este frotis
se tiñe con colorantes que permiten diferenciar todos los tipos celulares.
Los glóbulos rojos normales se ven como pequeños discos teñidos con menor
intensidad en el centro. Algunas de las anomalías morfológicas de la serie roja son
eliptocitosis (forma oval, pareja), anisocitosis (diferentes formas). La hipercromía,
hipocromía y anisocromía, que indican cantidades anormales de hemoglobina, se pueden
evidenciar de acuerdo a la intensidad con que se tiñen los eritrocitos.
[HCO3-] [HCO3-]
pH = pKa + log ------------ = pKa + log --------------------
[CO2] 0,03 x pCO2
Medidos el pH y la pCO2 y conocido el pKa del sistema (6,1), se calcula la [HCO3-].
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IONOGRAMA
Es la determinación de las concentraciones circulantes de iones en plasma o suero,
en particular de Na+ y K+.
La concentración de Na+ varía entre 135 y 145 mEq/l en los individuos sanos. La
hiponatremia y la hipernatremia son importantes trastornos electrolíticos que requieren
una medición exacta del laboratorio para diagnóstico y para el control de su corrección.
Normalmente, la pérdida urinaria diaria de este ión es equilibrada por la ingestión y el
estado de hidratación, entre otros factores.
El rango fisiológico de concentración sérica de K+ es de 3,5 a 5,5 mEq/l. Una
concentración del ión potasio circulante elevado o deprimido (hipercalemia o hipocalemia,
respectivamente) puede tener profundos efectos adversos sobre el miocardio, lo que hace
de la concentración de potasio uno de los objetos de análisis clínico más importante.
Dado que el potasio es el principal catión intracelular, debe tenerse en cuenta que la
hemólisis de la muestra (post-extracción) eleva espuriamente el resultado.
ERITROSEDIMENTACIÓN
Esta determinación consiste en medir la velocidad de sedimentación globular. Para
ello se utiliza sangre entera anticoagulada con la que se llena un fino tubo graduado
(contiene un volumen estandarizado de muestra) y se lo deja reposar. Habitualmente se
realizan lecturas luego de 1 y 2 hs, tiempo durante el cual en la columna se separan dos
fases, las células en la parte inferior y una fase superior de plasma. Cada lectura implica
medir la altura de la columna líquida superior. Normalmente, en la primera hora la
eritrosedimentación es menor que 12 mm para el hombre y menor que 15 mm para la
mujer. Este parámetro aumenta por variadas razones fisiológicas (embarazo) y
patológicas (procesos inflamatorios agudos y crónicos, infecciosos, anemias,
disproteinemias, etc.), resultando en un dato altamente inespecífico para diagnósticos. Un
resultado de eritrosedimentación acelerada es de escaso valor cuando se lo considera
aisladamente; en cambio, en conjunto con otros datos clínicos y de laboratorio, es un
elemento valioso en el diagnóstico y seguimiento.
QUÍMICA CLÍNICA
El término Química Clínica comprende un alto número de determinaciones de
concentraciones circulantes de compuestos orgánicos y enzimas implicados en una
amplia variedad de procesos metabólicos. Esta guía de estudio no pretende incluir a
todas, sólo se tendrán en cuenta las que tienen significancia en el contexto del curso de
Bioquímica Humana. El alumno deberá poder vincular un determinado test con los
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diferentes temas bioquímicos relacionados, situaciones metabólicas normales y/o
especiales, patologías, etc.
Algunas de las determinaciones listadas en la tabla que sigue suelen agruparse
según el aspecto que evalúan. Así, se denomina hepatograma al conjunto de tests que
evalúan la función hepática: bilirrubina total y directa, transaminasas (TGO y TGP),
fosfatasa alcalina, colesterol, proteínas totales y albúmina. La colestasis se refleja en los
valores de -glutamiltranspeptidasa (-GT) y 5’-nucleotidasa. La función renal se evalúa
determinando las concentraciones de urea y creatinina, junto con el ionograma plasmático
y urinario. Las enzimas CPK, LDH y GPT suelen agruparse para evaluar daño cardíaco.
Además de metabolitos, se pueden determinar concentraciones circulantes de
marcadores tumorales, fármacos y tóxicos.
IMPORTANTE: Observaciones:
- Los valores de referencia indicados son estimativos. Dependen de la
metodología utilizada, por lo que los valores de referencia en una determinada institución
pueden variar con respecto a los listados en esta guía. Además, en algunas
determinaciones los rangos de referencia pueden variar con la edad y sexo, entre otros
factores.
- Prestar atención a las unidades, y evaluar comparativamente las
concentraciones de los distintos elementos.
METABOLITOS
Glucosa 70 - 110 mg% Metabolismo de glúcidos - acción
de insulina y glucagon - curva de
tolerancia oral
Urea 15 - 45 mg% Metabolismo de aminoácidos –
Nutrición - Función hepática -
Función renal
Creatinina 0,6 - 1,4 mg% Metabolismo de fosfocreatina
Ácido úrico < 8 mg% varones Metabolismo de purinas - gota
< 7 mg% mujeres
Triglicéridos 40 - 180 mg% Metabolismo de lípidos y
Colesterol total 140 - 200 mg% lipoproteínas Dislipoproteinemias
Función hepática
Colesterol de HDL Varones > 35 mg% Mujeres >
29 mg%
Colesterol de LDL < 130 mg%
ENZIMAS
HORMONAS
T3 1,5 - 3,4 mg% Glucagon 30 - 210 pg/ml
T4 total 5 - 12 g% PTH 10 – 45 pg/ml
T4 libre 0,8 – 2,4 ng% Calcitonina 3 - 19 pg/ml
TSH 0,35 – 5,0 mU/l Subunidad -hCG Mujeres no
(5 - 60 ng/ml) embarazadas < 5
mUI/ml
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ACTH A las 8 hs, 0 - 54 Estradiol
pg/ml
LH Varones 2 - 12 U/l Estriol Variable según
Mujeres variable edad y ciclo
según ciclo menstrual
FSH menstrual
Varones 1 - 7 U/l Progesterona
Mujeres variable
según ciclo
menstrual Mujeres
postmenopáusicas >
30 U/l
GH < 10 mU/l Testosterona Variable según
edad
Prolactina Mujeres 60 - 500 mU/l Cortisol 8 hs: 5 - 25 µg%
Varones 60 - 360 mU/l 16 hs 3 – 15 µg%
20 hs: < 50%
valor de las 8hs
ORINA
La orina es el producto de excreción del riñón y el líquido orgánico por el que se
excretan la mayoría de los metabolitos hidrosolubles del organismo.
El proceso de formación de orina comienza con la ultrafiltración de la sangre a nivel
del glomérulo renal, continúa en el sistema tubular renal donde se realizan procesos de
secreción y reabsorción de agua y solutos y culmina con la excreción. A través de este
proceso, los riñones conservan en equilibrio el volumen, composición y estado ácido-base
de los líquidos corporales, que además están sujetos al ingreso dietético de solutos
(incluyendo fármacos y tóxicos) y agua y a la velocidad y tipo de transformación
metabólica de glúcidos, lípidos, aminoácidos y ácidos nucleicos tanto endógenos como
exógenos.
La obtención de una orina dentro de parámetros normales implica un correcto
funcionamiento del riñón y una relación equilibrada entre este órgano y los distintos
órganos de la economía.
La orina normal está compuesta por:
agua (90%)
compuestos inorgánicos:
o cationes inorgánicos: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, NH4+, trazas de Fe, Zn, Cu.
o aniones inorgánicos: Cl-, fosfatos, sulfatos, trazas de nitratos, bicarbonato, etc.
compuestos orgánicos:
o Nitrogenados: los principales son urea, creatinina, ácido úrico, creatina,
aminoácidos y péptidos.
o No nitrogenados: están en mucha menor cantidad e incluyen trazas de ácido
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glucurónico, ácido cítrico, oxalatos, metabolitos de hormonas esteroideas. En muy
pequeña concentración hay también glucosa, colesterol y cuerpos cetónicos.
Es importante remarcar que mediante el análisis de orina pueden obtenerse datos
referentes a la función renal, a lesiones del parénquima y vías urinarias y, además, se
podrá rescatar información sobre el funcionamiento de vías metabólicas variadas y la
capacidad funcional de varios órganos, mediante la determinación de distintos metabolitos
urinarios. El examen urinario de rutina aporta datos que deben asociarse al contexto
clínico del paciente para que brinde una apreciación diagnóstica.
Tirillas reactivas
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En el laboratorio de análisis clínicos es corriente el uso de tiras reactivas para
investigar la presencia de varios elementos químicos en la orina.
Las tiras reactivas de orina consisten en unas pequeñas cintas de plástico rígido a
las que van pegados unos cuadraditos impregnados de reactivos, que son diferentes
dependiendo de lo que se quiera analizar. Si el compuesto que se quiere analizar se
encuentra en la muestra, se pone en contacto con los reactivos presentes en el
cuadradito, produciendo una reacción de color fácilmente observable. Además de ser
positivo (cambio de color) o negativo (sin cambio), las diferentes intensidades de color
darán idea de la cantidad de compuesto analizado presente en la muestra, permitiendo
una semicuantificación de dicho compuesto. La semicuantificación se logra por
comparación del color desarrollado por la muestra con una curva de calibración que
provee el fabricante como 5-6 recuadros con tonalidades relacionadas con la
concentración correspondiente a cada metabolito que se quiere analizar. Si el análisis de
un metabolito da positivo con las tirillas reactivas, su cuantificación exacta deberá
realizarse con otro método químico, más específico y sensible.
De esta manera se puede determinar: densidad, pH, leucocitos, nitritos, proteínas,
glucosa, cuerpos cetónicos, urobilinógenos, bilirrubina, hemoglobina y sangre.
La ventaja de este método es que es muy rápido y muy específico ya que cada tira
tiene diversos segmentos en los cuáles está el reactivo apropiado para cada
determinación.
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motivo el aclaramiento renal de la misma no es una expresión fidedigna del
funcionamiento renal. Por ello, el clearance de urea no se usa para evaluar el
funcionamiento renal. Cabe acotar que la concentración plasmática de urea se elevará
recién cuando el deterioro renal afecte a más del 50% del parénquima.
- Creatinina: resultado de la transformación espontánea de la fosfocreatina
muscular. Este compuesto filtra libremente en glomérulo y prácticamente no es secretada
o reabsorbida a nivel de los túbulos. A diferencia de la urea, la excreción de creatinina no
depende de la proteína dietaria, encontrándose sujeta únicamente a la masa muscular.
Estas circunstancias hacen que el aclaramiento renal de creatinina (clearance) sea un
recurso clínico para el diagnóstico y control evolutivo de la insuficiencia renal. Sumado a
esta característica se asocia la buena relación entre la disminución del clearance de
creatinina y la elevación de su concentración en plasma.
- Acido úrico: producto final del catabolismo de las bases púricas, excretado por
orina. Debido a que el pKa del N9 del ácido úrico es 5,5 y el del N1 es 10,3, a pH
plasmático fisiológico se encuentra en forma de urato monosódico. En orina, el estado
iónico dependerá del pH: si el pH urinario es menor que 5,75, se encontrará
predominantemente como ácido úrico y si es mayor en forma de urato. El ácido es soluble
hasta concentraciones de 6-7 mg%, precipitando en concentraciones mayores. En esa
situación se puede precipitar en el parénquima renal o en las vías urinarias, llevando a
cambios histológicos que conducen a nefropatías o a urolitiasis, respectivamente.
Orinas ácidas:
Cristales de ácido úrico: formas de huso y piedra de afilar, cuando se agrupan
están como rosetas o estrellas. Son amarillos a pardo rojizos.
Se encuentran fisiológicamente y están aumentados en gota, estados febriles,
nefritis crónica, litiasis úrica y procesos de intensa destrucción leucocitaria, por ejemplo
leucemia.
Cristales de oxalato de calcio: también se encuentran en orinas alcalinas. Forma de
sobres de carta. Son incoloros y brillantes.
Se encuentran fisiológicamente y abundan en sujetos con litiasis cálcicas renales y
en los vegetarianos, pues los tomates, espinacas y espárragos son ricos en ácido oxálico.
Uratos amorfos: mezcla de urato de calcio, magnesio y potasio, que forman un
sedimento visible llamado “polvo de ladrillo”.
Son propios de los estados febriles, leucemia y cirrosis hepática.
Orinas alcalinas
Fosfatos amorfos: pueden precipitar formando un sedimento blanco visible.
Se encuentran fisiológicamente y abundan en trastornos del metabolismo
fosfocálcico, como ocurre en osteopatías, hiperparatiroidismo y estado de alcalosis.
Fosfato de calcio: forma de estrellas o prismas largos, finos, agujas.
Fosfato amónico-magnésico (fosfato triple): Son incoloros y con forma de tapa de
ataúd. Se encuentran en grandes cantidades en cistitis crónicas, hipertrofia prostática,
pielitis crónica y retención vesical.
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ELISA
ELISA INDIRECTO
Si bien existen muchas formas de llevar a cabo un ELISA y se los puede clasificar
según varios criterios diferentes, describiremos el método más comúnmente utilizado,
denominado Elisa Indirecto. Este método es ampliamente utilizado para la determinación
de anticuerpos (Ac). La técnica es la siguiente:
1) El antígeno (Ag) correspondiente se adsorbe a las placas de poliestireno, y luego
se lavan.
2) Las muestras a ensayar se incuban en las concavidades y las placas se lavan
nuevamente; el anticuerpo presente reacciona con el antígeno inmovilizado en la
superficie de las concavidades.
3) El conjugado de antiinmunoglobulinas humana marcado con enzima se incuba
en las concavidades; éste reacciona con cualquier anticuerpo "capturado” en el paso
anterior. El exceso de reactivo se lava.
4) Se agrega el sustrato enzimático y las placas se incuban; la velocidad de la
degradación se indica por el cambio de color, que es proporcional a la concentración de
anticuerpo de las muestras del paso (2).
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5) Se detiene la reacción y la intensidad del color se estima visualmente o se mide
en un espectrofotómetro.
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TP 17
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ADP
[ ATP ]
[ O2 ]
ADP
tiempo tiempo
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CASOS CLÍNICOS
I - Infarto de miocardio
Un hombre de 55 años se sintió mal después de almorzar, quejándose de dolor de
estómago y pecho. Se retiró a su domicilio a descansar y al fumar un cigarrillo se sintió
peor. Fue al hospital, donde se le indicó una radiografía de tórax, un electrocardiograma
(ECG) y se le determinaron enzimas séricas.
El trazado del ECG fue anormal por lo que se internó al paciente de inmediato.
Las enzimas CPK, LDH, GOT y GPT estaban elevadas.
Había sufrido un infarto de miocardio.
El infarto de miocardio se produce como consecuencia de una obstrucción en
alguna rama de la circulación coronaria. El flujo de sangre disminuye y como
consecuencia se produce isquemia. La falta de oxigenación produce necrosis celular de la
parte del tejido con defecto de irrigación.
Cuestionario
1) ¿Cuáles son los efectos de la anoxia sobre...
a) la respiración celular?
b) la relación NAD+/NADH intramitocondrial?
c) la cadena de transporte de electrones?
d) la síntesis de ATP?
e) la velocidad del ciclo de Krebs?
f) el pH del tejido?
2) ¿Por qué al romperse las células del miocardio la enzima succinato deshidrogenasa es
la única enzima del ciclo de Krebs que no se detecta en plasma?
3) ¿Por qué el cigarrillo empeoró la situación del paciente? (hay que tener en cuenta que
la nicotina es vasoconstrictora).
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III - Infección bacteriana
Una mujer de 34 años ingresa al servicio de emergencia de un hospital
presentando dolor agudo de abdomen de 20 horas de evolución. Se le diagnostica una
infección con bacterias Gram negativas, productoras de endotoxinas. El análisis de
laboratorio de una muestra de sangre arrojó los siguientes resultados:
PACIENTE NORMAL
Piruvato (mM) 3,5 30-60
Lactato (mM) 26,8 0,5-18
Diferencia arterio-venosa de O2 (vol) 0,5 5
Se realizaron los trazados polarográficos de la función mitocondrial del tejido
muscular (normal: A; de la paciente: B) y se obtuvieron los siguientes resultados:
A
Cuestionario:
1) ¿Qué conclusión se puede sacar de la acción de la endotoxina sobre la cadena de
transporte de electrones? ¿A qué nivel de la misma ejerce su acción? Justifique.
2) ¿Cuál será el efecto de la endotoxina sobre la fosforilación oxidativa? ¿Y sobre la
velocidad del ciclo de Krebs?
3) ¿A qué se debe la disminución de la diferencia arterio-venosa de O2?
4) ¿A qué se deben las concentraciones de piruvato y lactato hallados en la sangre del
paciente?
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TRABAJO PRÁCTICO 19
Metabolismo de la fenilalanina –
Productos especializados de aminoácidos
Objetivos de la clase:
•Identificar el origen aminoacídico de ciertas sustancias de importancia biológica
•Reconocer la enzima clave en la conversión de aminoácidos en productos
especializados
•Identificar los cofactores necesarios en la conversión de los aminoácidos en
productos especializados
•Reconocer las enfermedades congénitas relacionadas con las vías metabólicas
involucradas en la conversión de aminoácidos en productos especializados
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Los aminoácidos, además de ser componentes esenciales de las proteínas, son
precursores de otros compuestos relevantes tales como porfirinas, fosfolípidos,
catecolaminas, hormonas, ácido nicotínico, melanina, creatina, carnitina, poliaminas y
muchos otros. Enunciamos esta larga lista de compuestos para hacer hincapié en la
importancia de los aminoácidos en el metabolismo intermedio. A continuación,
analizaremos algunos de estos compuestos en particular.
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La tirosina se degrada por una vía principal, pero también sigue otras vías
minoritarias de gran importancia fisiológica. La vía principal ocurre en el hígado donde
comienza con su transaminación a p-hidroxifenilpiruvato. La aminotransferasa es una
enzima inducible, cuyos niveles aumentan considerablemente en animales tratados con
tirosina o con glucocorticoides. La oxidación del p-hidroxifenilpiruvato es compleja. Una
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única enzima agrega los átomos del O2 al carbono α de cadena lateral y al carbono del
anillo que lleva unida esta cadena lateral. La enzima contiene Fe2+ que se mantiene en
estado reducido por el ácido ascórbico. La oxidación del grupo carbonilo a carboxilo se
acompaña de la descarboxilación del grupo ácido. Para acomodar el nuevo grupo OH, la
cadena lateral, ahora más corta, se transfiere a un carbono adyacente. El producto se
denomina homogentisato. Otra oxigenasa que contiene hierro cataliza la ruptura del anillo
aromático agregando átomos de oxígeno a los C1 y C2. La configuración cis del doble
enlace del compuesto generado le da su denominación como maleil-acetoacetato. Este
doble enlace se isomeriza a fumaril-acetoacetato en una reacción en la que participa una
isomerasa que requiere glutation. La hidrólisis de este compuesto produce fumarato (un
intermediario del Ciclo de Krebs) y acetoacetato (un cuerpo cetónico). Por lo tanto, la
fenilalanina y la tirosina son aminoácidos tanto glucogénicos como cetogénicos.
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3. Síntesis de γ-aminobutirato (GABA) a partir de GLUTAMATO
El ácido γ-aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibitorio del
sistema nervioso central. La enzima glutamato descarboxilasa cataliza la remoción del
grupo γ-carboxilo del glutamato y la consecuente síntesis de GABA. Esta reacción ocurre
principalmente en el cerebro. En su metabolización, el GABA se transamina con α-
cetoglutarato por la enzima GABA transaminasa y finalmente forma succinato, que puede
ingresar al ciclo de Krebs.
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4. Síntesis de S-adenosilmetionina (SAM) a partir de METIONINA
La S-adenosilmetionina (SAM) es un cofactor en reacciones de transferencia de
metilos (metiltransferasas) y en reacciones de descarboxilación. Se sintetiza a partir de
metionina, que se activa con ATP en una reacción catalizada por la metionina
adenosiltransferasa. En esta reacción los grupos fosfato del ATP se eliminan (uno como
fosfato (Pi) y los otros dos como pirofosfato (PPi)), dejando libre el C-5' de la ribosa que
forma parte del ATP. Este C de la ribosa se une con el átomo de azufre de la metionina.
El producto resultante, la S-adenosilmetionina es una molécula muy reactiva debido a la
carga positiva sobre el azufre. Existen reacciones en las que se transfiere el grupo metilo,
fragmentos de tres o cuatro carbonos del resto de la estructura de la metionina o el grupo
adenosilo a aceptores específicos. En cada caso quedan otros dos sustituyentes en el
tioéter.
Las reacciones más importantes en las que interviene la S-adenosilmetionina son
las catalizadas por metiltransferasas. En cada uno de estos casos, luego de ceder el
grupo metilo, la SAM se transforma en S-adenosilhomocisteína, cuya hidrólisis produce
adenosina y homocisteína. Los destinos posibles de la homocisteína son:
a) ser metilada por el N5-metil-H4 folato para producir metionina (ver figura)
b) reaccionar con serina para producir cisteína
c) ser hidrolizada a α-cetobutirato, amoníaco y ácido sulfhídrico
La SAM puede ser descarboxilada por una enzima específica que da como
producto S-adenosil-metiltiopropilamina. Este compuesto es el dador del fragmento de 3C
utilizado para la síntesis de poliaminas. La síntesis de poliaminas requiere una enzima
llamada ornitina descarboxilasa. Las poliaminas son altamente catiónicas y se unen
fuertemente a los ácidos nucleicos y a otros polianiones. Entre otras funciones, son
esenciales para la función de las topoisomerasas. Esto podría explicar el incremento
temprano de la actividad de ornitina descarboxilasa durante la división celular.
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Reacciones en las cuales interviene la SAM
Precursor Producto metilado
noradrenalina adrenalina
guanidinoacetato creatina
nucleótidos nucleótidos metilados
fosfatidiletanolamina fosfatidilcolina
acetilserotonina melatonina
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La colina reacciona con acetil-CoA y forma acetil-Colina. Esta reacción es
catalizada por la enzima colina acetil transferasa.
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8. Síntesis de creatina a partir de GLICINA y ARGININA
La síntesis de creatina comienza en el riñón y se completa en el hígado. En el
primer paso, la glicina se combina con arginina para formar guanidinoacetato. En esta
reacción, el grupo guanidino de la arginina (el grupo que también forma urea), se
transfiere a la glicina y lo que queda de la molécula de arginina se libera como ornitina. El
guanidino acetato se metila luego en el hígado, utilizando SAM, para formar creatina. La
creatina se transporta a través del torrente sanguíneo particularmente al músculo y
cerebro, donde reacciona con ATP para formar creatina-fosfato. Las células pueden usar
creatina-fosfato para regenerar ATP a partir de ADP por lo cual esta molécula desempeña
un rol muy importante en el músculo durante el ejercicio. La creatina-fosfato es un
compuesto inestable que se recicla espontáneamente formando creatinina, que no puede
ser metabolizada y es excretada por orina y representa un buen indicador de la función
renal.
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10. Síntesis de serotonina a partir de TRIPTOFANO
La serotonina o 5-hidroxitriptamina se sintetiza y almacena en diversos tejidos, pero
la mayor cantidad de serotonina se encuentra en las células de la mucosa intestinal. Se
sintetiza a partir del triptofano en una reacción catalizada por una hidroxilasa similar a la
fenilalanina hidroxilasa, dando como producto 5-hidroxitriptofano, que se descarboxila
para formar 5-hidroxitriptamina o serotonina. La serotonina está involucrada en diversos
procesos tales como la percepción del dolor, trastornos afectivos y regulación del sueño,
regulación de la temperatura corporal y de la presión sanguínea.
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12. Síntesis de niacina a partir de TRIPTOFANO
La niacina se sintetiza en el hígado a partir del aminoácido triptófano. La síntesis
requiere tiamina, riboflavina y fosfato de piridoxal. La síntesis es sumamente ineficiente ya
que se requieren unos 60 mg de triptofano para sintetizar 1 mg de niacina. La niacina se
activa al combinarse con adenina para formar NAD+ y NADP+, importantes coenzimas en
procesos rédox.
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CUADRO RESUMEN DE PRODUCTOS ESPECIALIZADOS DE AMINOACIDOS
PRODUCTO
AMINOÁCIDO FUNCIÓN DEL PRODUCTO ESPECIAL
ESPECIAL
CATECOLAMINAS NEUROTRANSMISORES
FENILALANINA
MELANINAS PIGMENTOS
COFACTOR PARA LAS METILACIONES
METIONINA SAM
SÍNTESIS DE POLIAMINAS
LISINA +
CARNITINA TRANSPORTE DE ÁCIDOS GRASOS
METIONINA
SEROTONINA NEUROTRANSMISOR
TRIPTOFANO MELATONINA PINEAL -SUEÑO/VIGILIA
NAD COFACTOR REDOX
ARGININA NO VASODILATACION
GLUTAMATO +
CISTEINA + GLUTATION ANTIOXIDANTE
GLICINA
GLICINA HEMO HEMOPROTEÍNAS
GLICINA,
ASPARTATO, NUCLEÓTIDOS ARN - ADN
GLUTAMINA
TAURINA Y TAURO Y CONJUGACIÓN HEPÁTICA DE ÁCIDOS
GLICINA GLICOCONJUGADOS BILIARES
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CUESTIONARIO DE PRODUCTOS ESPECIALIZADOS DE AMINOÁCIDOS
1) ¿Qué características tiene el óxido nítrico (NO)? ¿En qué procesos
fisiológicos o patológicos participa? ¿Qué funciones tiene? ¿En qué tejidos se produce?
2) Escriba la reacción enzimática que genera NO, nombrando sustratos,
productos, enzimas y cofactores involucrados.
3) Escriba la estructura del GABA. ¿De qué clase de molécula se trata? ¿Cuál
es su función y en qué tejidos se produce?
4) ¿De qué aminoácido deriva el GABA, qué tipo de reacción lo genera y cuál
es la enzima involucrada en su síntesis?
5) ¿Qué función tiene la S-adenosilmetionina? ¿En qué reacciones participa?
¿A partir de qué moléculas se sintetiza?
6) ¿Qué función tiene la taurina y de qué aminoácido deriva?
7) ¿Qué grupo funcional se genera del metabolismo de la cisteína? ¿En qué
reacciones participa? ¿Qué función tiene su agregado a diferentes moléculas?
8) Un paciente con un tumor de médula adrenal presenta palpitaciones,
sudoración excesiva y dolores de cabeza por hipertensión. Su orina contiene cantidades
elevadas de ácido vainillínmandélico. ¿Al aumento de qué metabolito podrían atribuirse
estos síntomas?
9) ¿Qué función tiene la 5-hidroxitriptamina (serotonina)? ¿A partir de qué
aminoácido se sintetiza? ¿En qué tipo de reacción?
10) ¿Qué es la creatinina? ¿Qué función tiene? ¿A partir de qué aminoácidos se
sintetiza?
11) ¿Qué neurotransmisores son catecolaminas? ¿A partir de qué aminoácido
se forman?
12) ¿Qué papel juega la S-adenosilmetionina en la síntesis de catecolaminas?
13) Un pequeño número de niños que padecen fenilcetonuria presentan una
actividad de fenilalanina hidroxilasa normal, pero al consumir dietas normales acumulan
fenilalanina y otros metabolitos, incluyendo fenilpiruvato, fenillactato y fenilacetato.
También tienen altos niveles de tetrahidrobiopterina quinoide (forma oxidada de la
coenzima).
a) Indique cual podría ser la enzima deficiente
b) Escriba brevemente las vías para la formación de los metabolitos de fenilalanina
en estos pacientes.
14) ¿Por qué los pacientes de fenilcetonuria deben evitar el consumo de
aspartame?
Aspartame: L-aspartil-L-fenilalanina metil éster
15) ¿Cuál es el déficit enzimático en la alcaptonuria? ¿Qué metabolitos se
acumulan? ¿Por qué? ¿Qué consecuencias tiene?
16) ¿Qué es la melanina? ¿Qué función tiene? ¿A partir de qué aminoácido se
sintetiza?
17) Para los siguientes compuestos indique: a) los aminoácidos de los que
derivan, b) su función, c) el tipo de reacción en la que se forman.
i) Histamina
ii) Melatonina
iii) Niacina
18) ¿Qué es el glutation? ¿A partir de qué aminoácidos se sintetiza? ¿Qué
función tiene?
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TRABAJO PRÁCTICO 20
Hemoglobina
Está constituida por una ferroporfirina unida a la proteína globina. Esta proteína
conjugada posee la propiedad de combinarse de manera reversible con el oxígeno. Sirve
como medio de transporte del oxígeno en la sangre. La estructura y función de esta
hemoproteína ya fue descripta en detalle en clases anteriores. (Estructura de proteínas)
Mioglobina
Es un pigmento respiratorio que existe en las células musculares de los
vertebrados e invertebrados. Una molécula de mioglobina es semejante a una subunidad
de hemoglobina. También se combina con el oxígeno. La estructura y función de esta
hemoproteína ya fue descripta en detalle en clases anteriores. (Estructura de proteínas)
Citocromos
Son compuestos que actúan como agentes de transferencia de electrones en las
reacciones de oxidorreducción. Varios ejemplos se citaron en clases anteriores (Cadena
de Transporte de Electrones). Otras funciones: participa en el metabolismo de
xenobióticos en el hígado y en la hidroxilación de hormonas esteroideas en el proceso de
síntesis y degradación.
Catalasa
Enzima con porfirina férrica que degrada al peróxido de hidrógeno. Se detalló su
función en clases anteriores (Toxicidad del Oxígeno).
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METABOLISMO DE LA BILIRRUBINA
La transformación de los anillos pirrólicos del grupo hemo en bilirrubina implica una
serie de transformaciones bioquímicas absolutamente esenciales para su excreción.
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Aproximadamente el 80% de la bilirrubina proviene de la destrucción diaria de los
glóbulos rojos. El otro 20% proviene de una eritropoyesis inefectiva de la médula ósea y
en el hígado de las enzimas microsómicas P450 y citocromo b5.
Una vez sintetizada, la bilirrubina debe ser excretada, proceso que involucra varios
pasos.
1) Transporte de la bilirrubina
El proceso descripto arriba genera la bilirrubina libre o no conjugada, también
denominada indirecta por el modo en que se determina su concentración en sangre. Esta
forma de bilirrubina es apolar, insoluble en agua y lipofílica, por lo que no circula libre en
sangre sino unida a la albúmina. Normalmente en estas condiciones no atraviesa la
barrera hematoencefálica. Por circulación unida a la albúmina la bilirrubina no conjugada,
libre o indirecta llega a la membrana sinusoidal del hepatocito.
Cuando la cantidad de bilirrubina supera la capacidad de unión de la albúmina
puede circular bilirrubina no conjugada no unida a la albúmina. Esto puede ocurrir porque
la concentración de bilirrubina es muy alta (a partir de los 4-5 mg/dl), porque la
concentración de albúmina es baja (hipoalbuminemia) o por la presencia de sustancias y
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factores que desplazan o debilitan la unión de la bilirrubina con la albúmina. La presencia
de bilirrubina no conjugada no unida a la albúmina es siempre anormal y lleva al pasaje al
SNC y eventual daño del cerebro.
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ALTERACIONES EN EL METABOLISMO DE LOS PIGMENTOS BILIARES
HIPERBILIRRUBINEMIA
La bilirrubinemia normal del adulto y del niño mayor es menor de 1 mg/dl. Cuando
la concentración de bilirrubina en la sangre excede de 1 mg/dl, existe
hiperbilirrubinemia. Cuando la bilirrubinemia alcanza una cierta concentración, la
bilirrubina difunde a los tejidos y se evidencia por la coloración amarilla en piel y mucosas.
Este signo es una manifestación clínica muy común y se denomina ICTERICIA. La
ictericia en los adultos aparece con bilirrubinemia mayor de 2 mg/dl. Para que un recién
nacido esté ictérico, la bilirrubinemia debe ser mayor de 7 mg/dl. Más del 50% de todos
los recién nacidos y un porcentaje más alto de prematuros desarrollan ictericia. Más del
5% de los recién nacidos a término normales presentan bilirrubinemia mayor de 13 mg/dl.
La hiperbilirrubinemia puede deberse a la producción excesiva de bilirrubina que el
hígado normal puede excretar o puede resultar de la insuficiencia del hígado dañado para
excretar la bilirrubina producida en cantidades normales. La obstrucción de conductos
excretorios del hígado, también causará hiperbilirrubinemia. La hiperbilirrubinemia se
observa en numerosas enfermedades, que van desde la hepatitis viral hasta cáncer de
páncreas.
TIPOS DE ICTERICIAS
El aumento de la concentración de bilirrubina sérica puede ocurrir por cuatro
mecanismos:
- sobreproducción,
- disminución de captación hepática,
- disminución en la conjugación y
- disminución en la excreción de la bilis (intra o extrahepática).
Ictericia pre-hepática
La hemólisis es la causa más común del exceso de bilirrubina libre, no conjugada o
indirecta. En estos casos, existe un aumento de la producción de bilirrubina por una
destrucción excesiva de los eritrocitos.
Si existe dificultad en la captación de la bilirrubina plasmática por el hígado,
también se producirá una hiperbilirrubinemia a expensas de la bilirrubina no conjugada.
En ambos casos, hay un aumento de la concentración de bilirrubina total en
sangre, a expensas de su forma no conjugada. No existe coluria (coloración en orina).
Hay coloración oscura de las heces fecales por acúmulo de estercobilinógeno (hipercolia).
Las pruebas de función hepática son normales.
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b) no hemolíticas
1) Ictericia por hematomas: se produce por reabsorción de hematomas. 1 litro de sangre
puede producir 5 gramos de hemoglobina
2) Ictericia por desplazamiento de la albúmina: varias sustancias endógenas (ácidos
grasos de cadena larga o ácidos biliares) o exógenas (medicamentos) compiten con la
bilirrubina por la unión a la albúmina pudiendo desplazarla
3) otras
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La anemia falciforme es una enfermedad hereditaria de los glóbulos rojos. Se
caracteriza por la presencia de la hemoglobina S (HbS), de estructura anómala. La HbS
contiene la mutación más común de la hemoglobina que consiste en el cambio de un
único aminoácido en la subunidad de la HbA. Esta modificación cambia la solubilidad de
la proteína, que precipita y hace al glóbulo rojo más susceptible de ruptura y degradación,
disminuyendo la vida media del eritrocito.
- Talasemias
Para una función óptima, las subunidades y de globina de la hemoglobina no
solo deben tener una estructura adecuada sino que se deben sintetizar en una relación
1:1. Las mutaciones que producen una disminución en la síntesis de una subunidad
generan un grupo de enfermedades denominadas talasemias, de tipo o según el tipo
de subunidad sintetizada en menor cantidad. Algunos tipos de talasemias cursan con una
alta tasa de hemólisis y la consecuente hiperbilirrubinemia a expensas de la bilirrubina no
conjugada.
Ictericia Hepática
Este tipo de ictericia puede deberse a fallas en la captación, conjugación o
excreción de bilirrubina por el hígado. A este tipo de ictericias se las denomina también
mixtas ya que pueden cursar con incremento de la bilirrubina no conjugada, de la
conjugada, o de ambas, dependiendo de la alteración primaria.
Las causas de la ictericia hepática son:
1) Disminución de la captación de bilirrubina por el hígado (poco frecuentes, son
desórdenes genéticos)
2) Disminución de la conjugación de bilirrubina (deficiencia de glucuroniltransferasa)
3) Daño hepatocelular (muy frecuentes):
a) Hepatitis
b) Cirrosis
c) Cáncer del hígado
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d) Necrosis hepática por shock severo
e) Tóxicos
f) Congestión hepática por falla cardiaca
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Ictericia post-hepática
Se debe al fallo para excretar la bilirrubina desde el hepatocito al duodeno. Se
diagnostica por valores de bilirrubinemia conjugada o directa mayores de 2 mg/dl o por un
bilirrubinemia directa mayor del 15% de la bilirrubina total. Es siempre patológica. Se
caracteriza porque la bilis no llega al duodeno.
A su vez, la ictericia post-hepática se puede clasificar en intrahepática (litos
intrahepáticos, colangitis, colangitis esclerosante primaria, granulomas, tumores, quistes,
degeneración amiloide) y extrahepática por obstrucción de la vía biliar (litos en vía biliar,
tumores, parásitos, estenosis por cicatrices).
En la ictericia post-hepática no hay coloración en materia fecal (acolia) y hay
coloración excesiva en orina (coluria).
Las causas de la ictericia post-hepática son:
1) Alteraciones estructurales del tracto biliar.
2) Colelitiasis (cálculos en la vesícula): el cálculo obstruye el paso de la bilis.
3) Atresia congénita de las vías biliares extrahepáticas.
4) Obstrucción biliar por tumores: principalmente causados tumores en la cabeza de
páncreas y en la ampolla de Vater.
Generalmente los pacientes con ictericia obstructiva (post-hepática) tienen una
coloración amarillo-verdosa. Además hay prurito debido a que la bilirrubina se fija en la
grasa de los tejidos.
INTEGRACIÓN
Bilirrubina predominio No conjugada Bilirrubina predomino Conjugada
Sobreproducción Bilirrubina Disminución de la Excreción de Bilirrubina
Disminución Captación Hepática de Bilirrubina Disfunción de los hepatocitos
Disminución del Almacenamiento de Bilirrubina Obstrucción Biliar
Disfunción de la Conjugación
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Casos Clínicos
Caso Clínico N° 1
A usted le llega un paciente a su consultorio con ictericia. ¿Qué determinaciones de
laboratorio le pediría?
Caso clínico Nº 2
Mirtha tiene 25 años de edad, es maestra en una escuela rural, con agua de pozo e
instalaciones sanitarias precarias. Hace siete días comienza con dolores musculares,
decaimiento, falta de apetito y malestar general, en los últimos tres días se constataron
registros febriles que ceden con la administración de antitérmicos. La orina es muy oscura
y las heces claras.
Al examinarla se observa coloración amarillenta de piel, mucosa y escleróticas, dolor leve
a la palpación del hígado. Los datos de laboratorio en sangre muestran GO T 200 UI/l, GP
T 250 UI/l, bilirrubina total 10 mg/dl, bilirrubina directa 5 mg/dl, bilirrubina indirecta 5 mg/dl.
Caso clínico Nº 3
Pedro es cocinero en una parrilla, tiene 55 años de edad y desde hace cinco meses
aproximadamente refiere el dolor epigástrico luego de probar sus recetas de cocina. El
dolor tiene periodicidad y curva con exacerbaciones y remisiones. En las últimas 48 horas
presentó varios episodios de náuseas y vómitos, además de intenso prurito, por lo que
consulta.
Al examinarlo presenta coloración amarillenta de la piel, mucosas y escleróticas, dolor
localizado a la palpación del hígado. El examen de laboratorio tiene valores de bilirrubina
directa 5 ml/dl y amilasa 100 mg/dl en sangre.
CUESTIONARIO
1) ¿Por qué las tres personas descriptas en los casos clínicos 2,3 y 4 tienen coloración
amarillenta de piel, mucosas y escleróticas?
2) ¿Qué tipo de ictericia presenta cada una de las personas de los casos clínicos?
3) ¿Cuáles son las causas más frecuentes de ictericia? ¿Cuál se corresponde con cada
caso clínico?
4) ¿Qué importancia tiene la determinación de la bilirrubina directa e indirecta y de las
enzimas séricas en las personas con ictericia? Correlaciónela con cada caso clínico.
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TRABAJO PRÁCTICO
DE LABORATORIO 2
GLUCEMIA
ORINA
ELISA CHAGA TEST
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DETERMINACIÓN DE GLUCEMIA
Glu-oxidasa
Glucosa + O2 + H2O ácido glucónico + H2O2
peroxidasa
H2O2 + 4-aminofenazona + 4-hidroxibenzoato quinonimina roja
PROTOCOLO
La concentración del testigo es de 250 mg%. Los alumnos deberán calcular la concentración de
glucosa de cada uno de los tubos testigo.
0.4
0.3
Absorbancia
0.2
0.1
0.0
0 100 200 300
Concentración glucosa mg%
Valores obtenidos por cada grupo de alumnos.
milimetrada, y luego obtener el valor de Glucemia del paciente X o el paciente Z. Informar este
Testigo 1
Testigo 2
Testigo 3
Testigo 4
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Fundamento:
Protocolo:
1. Por grupo se utilizan dos pocillos para procesar:
una Muestra X (paciente X)
una Muestra Z (paciente Z)
Rotular los pocillos con Número de GRUPO y Número de Muestra. Mantener cubiertos con
cinta los pocillos sin usar y solo descubrir los que se vayan a usar en esa determinación. Si el
pocillo está rotulado, significa que ya ha sido usado.
2. Con el frasco gotero agregar 1 gota de MUESTRA X en uno de los pocillos previamente
rotulado como (1).
3. Con el frasco gotero agregar 1 gota de MUESTRA Z en uno de los pocillos previamente
rotulado como (2).
4. Cubrir con cinta los pocillos para evitar la evaporación e incubar durante 30 minutos a 37°C
en baño termostático. Fijarse que los pocillos estén en contacto con el agua, pero que no se
hundan por completo. Se pueden colocar sobre una placa de Petri plástica que flota en el
líquido del baño.
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7. Mezclar con golpes laterales suaves. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a 37°C en baño
termostático.
8. Descartar el líquido de los pocillos y lavar 5 veces con BUFFER DE LAVADO, como se
realizó anteriormente.
9. Agregar en cada pocillo 1 gota de REVELADOR . Mezclar con golpes laterales suaves. Puede
llevarse a 37°C y esperar hasta el desarrollo de color celeste en la Muestra X (de 15 a 30 min).
10. Detener la reacción con 1 gota de STOPPER. El color celeste vira a amarillo. Evaluar a
simple vista los resultados. El color es estable durante 30 minutos.
Se colocará una gradilla con dos tubos, uno de orina del paciente X y otro de orina del paciente Z
en las puntas de cada mesada. Cada grupo de alumnos usará la orina correspondiente a la
muestra del paciente que le tocó de la glucemia.
Protocolo:
1- Familiarizarse con la forma y la dirección de cómo debe sumergirse la tirilla reactiva dentro de
la orina (NO DEBEN APOYARSE LOS DEDOS SOBRE LAS ALMOHADILLAS !!).
2- Sumergir la tirilla dentro del tubo con la orina, retirándola a los pocos segundos.
3- Esperar un minuto, apoyando la tirilla sobre un papel absorbente sobre la mesada.
4- Comparar los colores de la tirilla reactiva con los resultados de la fotocopia del kit comercial.
5- Anotar los resultados
6- Descartar las tirillas utilizadas.
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PACIENTE X
El señor O.G. de 35 años nacido en la provincia de Chaco concurre al servicio de Clínica Médica a
fin de realizarse un examen de rutina y serología para Chagas por un estudio catastral que están
realizando en la fábrica donde trabaja.
Antecedentes personales: fumador de 30 cigarrillos diarios desde hace 15 años. Peso: 95 kg, talla:
1, 67 m.
Sin antecedentes familiares de importancia.
Al interrogatorio refiere conocer la vinchuca y provenir de un área rural del norte de la provincia.
En la consulta se le detecta TA: 160/95.
Examen de laboratorio
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Orina:
URO (Urobilinógeno):
GLU (glucosa):
KET (cetonas):
BIL (bilirrubina):
PRO (proteínas):
NIT (nitrito):
pH:
BLO (sangre):
SG (densidad):
LEU (leucocitos):
CUESTIONARIO:
En base a los valores indicados más arriba y los obtenidos en el trabajo práctico, indique posibles
alteraciones metabólicas presentes en este paciente.
1.- Qué características considera presentará la orina de este paciente a nivel de:
a) examen físico, b) químico y c) microscópico.
2.- Si el análisis de Chagatest por ELISA diera positivo, que otra técnica ¿que conoce podría ser
utilizada para confirmar el diagnóstico?
PACIENTE Z
Un paciente de 18 años de edad acude al servicio de urgencias con alteración del estado de
conciencia. Sus padres refieren que el paciente fue diagnosticado de diabetes hace 3 años y está
siendo tratado con insulina, manteniendo un aceptable control glucémico. Cinco días antes del
ingreso había comenzado con diarrea y malestar general, pese a lo cual fue a pasar unos días a la
costa con amigos. Durante los últimos dos días, además de la diarrea, presentó vómitos y en el
último día había dejado de ponerse la dosis de insulina de la noche.
Examen Físico: Impresión de enfermedad aguda grave. Presenta signos de deshidratación con
mucosas secas y signo del pliegue. Aliento cetónico. Responde a estímulos dolorosos.
Temperatura: 38°C; TA: 100/60; pulso: 94/min. Pupilas normales y normorreactivas. Auscultación
cardiopulmonar normal. Abdomen distendido, doloroso a la palpación, sin visceromegalias, ruidos
intestinales aumentados. Peso aproximado: 60 kg
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Datos Complementarios
Orina:
URO (Urobilinógeno):
GLU (glucosa):
KET (cetonas):
BIL (bilirrubina):
PRO (proteínas):
NIT (nitrito):
pH:
BLO (sangre):
SG (densidad):
LEU (leucocitos):
CUESTIONARIO:
1- Qué enfermedad tiene este paciente?
2- Analice las alteraciones metabólicas presentes en sangre y orina.
3- Qué tratamiento en líneas generales le daría a este paciente?
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TEÓRICO 13
Metabolismo de aminoácidos
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METABOLISMO DE AMINOACIDOS
Comparativamente con los carbohidratos y los lípidos, el metabolismo de los aminoácidos es
considerablemente más complejo, porque si bien los aminoácidos son también utilizados
como fuente de energía, su función biológica está muy ligada al hecho de que los
aminoácidos son los constituyentes de las proteínas. Las proteínas, además de su función
estructural, son también necesarias para una gran variedad de funciones biológicas, tales
como la secreción de hormonas digestivas y proteínas plasmáticas, el transporte de
sustancias y la respuesta inmune, además de sus funciones como enzimas, entre muchas
otras. Por lo tanto, la incorporación de proteínas es indispensable para mantener la
estructura y función del organismo. El exceso de proteínas de la dieta puede ser utilizado
como fuente de energía, dado que como veremos más adelante, los aminoácidos
glucogénicos se pueden convertir en glucosa y los cetogénicos en ácidos grasos o
cetoácidos, o bien ser excretados como productos metabólicos (ej. urea). Una dieta libre de
proteínas produce una pérdida neta de proteínas corporales de alrededor de 0.34 g/kg de
peso/día.
El destino metabólico de las proteínas dietarias dependerá del ingreso energético. Un
aumento de este último permitirá la conservación de proteínas, en cambio, una disminución
en el aporte calórico resultará en la degradación proteica. Además, un factor importante es la
“calidad” de las proteínas dietarias que está determinada por su valor biológico y su facilidad
de absorción y digestión. El valor biológico de una proteína depende de la proporción en la
que se encuentran los aminoácidos esenciales. Por ejemplo, las proteínas del huevo y la
leche tienen mayor valor biológico que las proteínas de origen vegetal. Se recomienda que
entre el 10 al 15% del ingreso calórico provenga de proteínas.
Cuando la ingesta diaria de proteínas es baja, la mayoría de los aminoácidos se utiliza para
la síntesis proteica, debido a que los aminoacil-tRNA tienen una afinidad muy alta por los
aminoácidos. En cambio, cuando la ingesta proteica es alta, los aminoácidos son
catabolizados en reacciones catalizadas por enzimas de Km elevado.
El plasma contiene los 20 aminoácidos que se encuentran habitualmente en las proteínas,
además de otros como la citrulina, la ornitina, la taurina y la 3-metilhistidina.
Los aminoácidos se clasifican en esenciales (aquellos que no pueden ser sintetizados por el
hombre, y por lo tanto deben ser ingeridos en la dieta) y los no esenciales que en su
mayoría son sintetizados a partir de intermediarios anfibólicos por vías metabólicas cortas o
a partir de aminoácidos esenciales. La tabla siguiente indica a qué categoría pertenecen los
aminoácidos más abundantes.
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Esenciales No esenciales
Fenilalanina Alanina
Isoleucina Arginina
Leucina Asparragina
Lisina Aspartato
Metionina Cisteína
Treonina Glicina
Triptofano Glutamato
Valina Glutamina
Histidina (es esencial en lactantes y niños)
Prolina
Serina
Tirosina
La mayor parte de los aminoácidos utilizados por el organismo para sintetizar proteínas o
precursores derivados de aminoácidos se obtiene de la dieta o del recambio de proteínas.
Las mezclas de aminoácidos obtenidas de la dieta no están presentes en las proporciones
exactas requeridas por el organismo, pero se interconvierten a través de diversas reacciones
metabólicas. De hecho, la mezcla de aminoácidos liberados a la sangre portal desde el
intestino ya muestra cambios en su composición (por ejemplo: la concentración de alanina
es mayor en la sangre portal que la ingerida). El exceso de aminoácidos respecto a las
necesidades para la síntesis de proteínas no puede ser almacenado ni excretado como
tales, sino que son degradados a productos que pueden ser oxidados para obtener energía
o acumulados como grasas.
El catabolismo de aminoácidos está regulado por la inducción de las enzimas catabolizantes.
La velocidad de este proceso varía considerablemente entre las diversas proteínas y está
regulada por la demanda fisiológica. Todas las vías de degradación de los aminoácidos
involucran una etapa clave que es la separación del grupo amino del esqueleto
carbonado.
Virtualmente todos los tejidos producen amoníaco (NH3) por el catabolismo de los
aminoácidos. El NH3 es altamente tóxico sobre todo para el sistema nervioso, pero existen
mecanismos de detoxificación que lo eliminan o lo convierten en metabolitos no tóxicos. En
condiciones normales, la concentración de amoníaco se mantiene baja en la sangre
periférica, pero aumenta mucho en patologías hepáticas
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REACCIONES DEL CATABOLISMO DE AMINOACIDOS
Sólo tres -cetoácidos pueden actuar como aceptores de grupos amino en este tipo de
reacciones: el -cetoglutarato, el piruvato y el oxalacetato, dando como producto glutamato,
alanina, y aspartato, respectivamente. De estos tres -cetoácidos, el más importante
cuantitativamente es el -cetoglutarato, de manera tal que el grupo amino de la mayoría de
los aminoácidos termina formando glutamato.
Las reacciones de transaminación tienen constantes de equilibrio cercanas a 1, por lo tanto
son fácilmente reversibles. Por este motivo, este tipo de reacciones funciona tanto en el
catabolismo como en la biosíntesis de aminoácidos. Las transaminasas son responsables de
la redistribución de grupos amino de los aminoácidos y proveen al organismo de aquellos
aminoácidos no esenciales que están en déficit. Existen transaminasas específicas para el
aminoácido dador del grupo amino.
Todas las transaminasas requieren fosfato de piridoxal (forma activa de la vitamina B6 o
piridoxina) como grupo prostético. En el curso de la reacción, el aminoácido entrante se une
al sitio activo de la enzima, cediendo el grupo amino al fosfato de piridoxal (que se
transforma en piridoxamina) y saliendo como -cetoácido. Luego, el -cetoácido entrante
recibe al grupo amino del fosfato de piridoxal y sale como aminoácido y el grupo prostético
se recupera en su estado original, es decir como fosfato de piridoxal. La distribución de
algunas transaminasas se utiliza como indicio diagnóstico; la liberación de una enzima
específica como consecuencia de una lesión tisular, por ejemplo la glutamato-oxalacetato
aminotransferasa (GOT) en plasma, es un índice de lesión hepática. Las reacciones de
transaminación ocurren mayoritariamente a nivel citoplasmático.
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Desaminación oxidativa
Como ya dijimos, el producto más abundante que resulta de las reacciones de
transaminación es el glutamato. Éste, a su vez, es capaz de perder su grupo amino por una
reacción de desaminación oxidativa catalizada por la glutamato deshidrogenasa. Esta
enzima está altamente expresada en el hígado y se localiza en la matriz mitocondrial. Utiliza
NAD+ o NADP+ como cofactor que se reduce durante la reacción. El glutamato pierde el
grupo amino y el carbono se oxida a carbonilo, dando -cetoglutarato como producto,
como se indica en la reacción:
glutamato-deshidrogenasa
glutamato -cetoglutarato
La glutamato deshidrogenasa es una enzima alostérica sujeta a control inhibitorio por GTP (y
ATP) y estimulatorio por ADP (y GDP). De esta forma, cuando los aminoácidos son
necesarios para la producción de energía, la actividad de la enzima aumenta y, por el
contrario cuando los niveles de nucleótidos trifosfatos son altos, su actividad disminuye. La
reacción de la glutamato deshidrogenasa es reversible y el sentido de la misma depende de
la concentración de reactivos y productos. Por lo tanto, la enzima forma parte tanto de la
degradación de aminoácidos como de su biosíntesis, dado que el glutamato puede participar
en reacciones de transaminación. La acción combinada de transaminasas y la glutamato
deshidrogenasa se conoce como transdesaminación, según se esquematiza en la
siguiente figura:
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aminoácido1 α-cetoácido1
-cetoglutarato glutamato
AMONÍACO
El H2O2 formado se desdobla en agua y oxígeno en una reacción catalizada por la catalasa:
H2O2 H2O + ½ O2
Ciertos aminoácidos hidroxilados como serina y treonina pueden ser desaminados en forma
no oxidativa por deshidratasas, generando piruvato y -cetobutirato.
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Por otra parte, la cisteína puede perder su grupo amino por la acción de una desulfhidrasa,
originando piruvato.
En estos últimos casos, el fosfato de piridoxal también actúa como coenzima, formándose
amoníaco y el correspondiente -cetoácido sin que haya una oxidación real de la molécula.
Por este motivo, se llama a estas reacciones desaminaciones no oxidativas.
De acuerdo a estas consideraciones, el metabolismo de los L-aminoácidos requiere un
proceso inicial de transaminación, generando mayoritariamente glutamato, y posteriormente
la desaminación oxidativa de éste, a través de reacciones reversibles. Esta vía es de gran
importancia desde el punto de vista de la economía celular. Al estar en equilibrio con sus
cetoácidos y entre sí, muchos aminoácidos pueden sintetizarse fácilmente a partir de otros
aminoácidos, o bien desaminarse, lo que depende del estado metabólico. Si el sistema
estuviera lejos del equilibrio, esta interrelación no existiría. Asimismo, el hecho de que el
glutamato sea el producto común de las reacciones de transaminación, reduce la cantidad
de enzimas necesarias. La reversibilidad de las reacciones de transaminación asegura la
utilización correcta de los aminoácidos-cetoácidos dependiendo de la situación metabólica:
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Proteínas
AMONIACO
Síntesis de glutamato
Como ya dijimos, la reacción de la glutamato deshidrogenasa es reversible y la enzima
forma parte no sólo de la degradación de los aminoácidos, sino también de su biosíntesis.
De esta forma, es posible sintetizar glutamato a partir de -cetoglutarato, incorporando
amonio y oxidando NADPH o NADH.
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Síntesis de glutamina
La síntesis de glutamina a partir de glutamato es catalizada por la enzima glutamina
sintetasa, que se localiza a nivel mitocondrial y cataliza la siguiente reacción:
glutamina sintetasa
glutamato glutamina
Síntesis de alanina
En el músculo, se forma alanina a partir de piruvato y glutamato en una reacción catalizada
por la enzima alanina amino transferasa (ALAT). La alanina así sintetizada llega por la
sangre al hígado donde se utiliza como precursor en la gluconeogénesis.
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Síntesis de urea
La urea es el producto final no tóxico de eliminación del nitrógeno en el hombre y muchos
otros vertebrados superiores (a los que se denomina ureotélicos), en tanto que las aves y los
reptiles excretan el amoníaco como ácido úrico y por ello se los denomina uricotélicos.
Algunos peces y anfibios, eliminan directamente amoníaco (amonotélicos).
En los animales ureotélicos, el amoníaco proveniente de la pérdida de los grupos amino se
convierte en urea en las mitocondrias hepáticas a través del denominado ciclo de la urea.
El ciclo de la urea es un proceso que abarca dos compartimientos intracelulares. Se inicia en
el interior de las mitocondrias de los hepatocitos, donde se forma amoníaco a partir del
glutamato por desaminación oxidativa. Otro origen posible de amoníaco hepático es la
degradación bacteriana de los aminoácidos intestinales. El amoníaco así liberado, se
absorbe y llega al hígado por la vena porta. Asimismo, el amoníaco puede provenir del
catabolismo de algunos neurotransmisores como catecolaminas, serotonina e histamina, que
son degradadas por enzimas específicas localizadas a nivel cerebral o periférico. Estas
enzimas liberan amoníaco por oxidación de la amina. Finalmente, el amoníaco circulante
puede originarse a partir de la degradación de bases púricas y pirimidínicas.
EL CICLO DE LA UREA
En la primera reacción de este ciclo, el amoníaco se combina con bicarbonato para formar
carbamoil-fosfato, con consumo de 2 uniones fosfato de alta energía.
carbamoil-fosfato sintetasa I
O
CO2 + NH4+ + 3 ATP + aspartato + 2 H2O UREA + 2 ADP + 2 Pi + AMP+ PPi + fumarato
Las enzimas citosólicas y las mitocondriales del ciclo de la urea forman complejos
multienzimáticos, de forma tal que el producto de una reacción pasa inmediatamente a ser el
sustrato de la reacción siguiente sin difundir, lo que asegura una gran eficiencia de todo el
proceso. La urea no puede ser metabolizada en el organismo y se elimina por la orina. Si
algo de urea penetra en el tracto intestinal, ésta puede ser degradada por bacterias
intestinales que contienen ureasa y el amoníaco resultante es reabsorbido y utilizado en el
hígado.
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expresión de las cinco enzimas que participan en el ciclo aumenta en los casos de dietas
ricas en proteínas o en caso de ayuno severo. Estos mecanismos regulatorios se hacen
evidentes a tiempos relativamente prolongados. En cambio, a tiempos cortos, la actividad del
ciclo está regulada por mecanismos alostéricos. En este sentido, la carbamoil-fosfato
sintetasa I es activada alostéricamente por N-acetilglutamato. Este modulador se sintetiza a
partir de glutamato y acetil-CoA, en una reacción catalizada por la N-acetilglutamato
sintetasa. Esta enzima, a su vez es activada por arginina, que se acumula cuando la
producción de urea es muy baja.
Se han descripto deficiencias de origen genético en las enzimas del ciclo de la urea. Los
pacientes que poseen estas alteraciones no toleran dietas ricas en proteínas, pues un
exceso de aminoácidos generaría una sobreproducción de amoníaco a nivel hepático que no
llegaría a ser metabolizado. Por otra parte, una deficiencia a nivel renal puede provocar la
acumulación de urea en sangre. En esos casos, es crítico frenar la acumulación de urea,
que puede ser tóxica en concentraciones elevadas y puede aumentar la concentración de
amoníaco en forma indirecta. Para ello, es importante un control estricto de la dieta con
cantidades adecuadas de proteínas de alto valor biológico, es decir cuya composición
aminoacídica sea similar a las proteínas del ser humano, evitando excesos y defectos de
determinados aminoácidos.
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glutamato
Acetil-CoA
N-acetil
glutamato
sintetasa
N-acetilglutamato
carbamoil-fosfato
sintetasa I
α-cetoácido
citrulina
0 aspartato
Carbamoil aminoácido
fosfato
Arginino oxalacetato
ornitina succinato
malato
arginina fumarato
1) INTESTINO
El intestino es un órgano de alto recambio celular debido a la continua descamación de las
células de su epitelio. Por ese motivo, la síntesis de ADN, ARN y proteínas ocurre a alta
velocidad. El intestino capta preferencialmente aquellos aminoácidos que intervienen en la
síntesis de bases nitrogenadas, glutamina y aspartato, así como sus derivados, glutamato y
asparagina, que provienen de la digestión de las proteínas de la dieta. Durante períodos de
ayuno, la glutamina que se utiliza en el intestino para la síntesis de purinas y pirimidinas,
proviene del músculo. Por otra parte, el nitrógeno liberado en el intestino a partir del
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metabolismo de las bases nitrogenadas es captado por el piruvato, que se transforma en
alanina, o bien se libera a la sangre portal directamente como amoníaco, que es captado y
detoxificado en el hígado. Además, las bacterias entéricas descomponen compuestos
nitrogenados y liberan amoníaco que se absorbe y contribuye a la síntesis de urea. De
acuerdo a estas consideraciones, es evidente que el intestino modifica marcadamente la
proporción de aminoácidos que provienen de las proteínas de la dieta, incrementando la
carga de alanina y disminuyendo la de los aminoácidos diácidos y sus amidas.
La glutamina se transforma en glutamato en una reacción catalizada por la glutaminasa o
bien por las enzimas que participan en la síntesis de bases. Posteriormente, el glutamato se
desamina por la glutamato deshidrogenasa o se transamina a -cetoglutarato. En cuanto al
aspartato, luego de ceder el nitrógeno a la síntesis de bases, se transforma en fumarato.
Ambos compuestos resultantes (fumarato y -cetoglutarato) son intermediarios del ciclo de
Krebs, de manera que terminan transformados en malato, y éste produce CO 2, NADPH y
piruvato por acción de la enzima málica (malato deshidrogenasa descarboxilante). Parte del
piruvato resultante puede transaminarse con glutamato, formando -cetoglutarato (que se
reincorpora al proceso) y alanina, que sale a la sangre portal. El resto del piruvato, se
consume en el ciclo de Krebs y sirve como fuente de energía. De esta manera, el intestino
obtiene hasta el 50% de la energía necesaria para su funcionamiento, el resto proviene de la
utilización de cuerpos cetónicos y glucosa, ya que no utiliza cantidades apreciables de
ácidos grasos como combustible energético.
2) HÍGADO
El hígado es el primer destinatario de los aminoácidos absorbidos en el intestino que llegan
por vía portal. También es el sitio primario de captación de la alanina liberada en el músculo
que se utiliza para gluconeogénesis cuando se agota el glucógeno hepático. En el hígado
hay una activa síntesis de proteínas, no sólo propias, sino también de exportación (proteínas
plasmáticas, enzimas de coagulación, etc.). También en el hígado hay una síntesis
considerable de diversos compuestos nitrogenados. El exceso de aminoácidos es
desaminado en el hígado y los esqueletos carbonados generados pueden ser utilizados para
la síntesis de glúcidos o cuerpos cetónicos (dependiendo de la estructura de su esqueleto
carbonado), o bien utilizados como fuentes de energía. La actividad de las transaminasas y
de otras enzimas que participan en la degradación de aminoácidos disminuye cuando el
aporte proteico de la dieta es bajo. Esto permite priorizar, en estas condiciones, la síntesis
de proteínas.
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El hígado carece de las enzimas necesarias para la metabolización de aminoácidos
ramificados. Estos últimos se metabolizan principalmente en el músculo, que controla la
concentración sanguínea de estos compuestos y los utiliza como fuentes de energía.
Cuando se ingiere un exceso aminoácidos cetogénicos, sus esqueletos carbonados se
transforman en el hígado en acetil-CoA, que dependiendo del estado metabólico puede ser
utilizado para la síntesis de ácidos grasos (por ejemplo en estado de saciedad) o para la
síntesis de cuerpos cetónicos (en estado de ayuno o en una diabetes no controlada) que
pueden utilizarse en tejidos periféricos como fuente de energía. Indudablemente, una función
clave del hígado en el metabolismo de los aminoácidos es la eliminación del amoníaco a
través del ciclo de la urea. El amoníaco, no sólo proviene de los aminoácidos, sino también
de la descomposición bacteriana intestinal de compuestos nitrogenados. La urea es una
sustancia no tóxica y altamente soluble, que se elimina en la orina. En un individuo normal,
los niveles plasmáticos de urea no superan los 40 mg/100 ml, valores mayores indican
alteraciones a nivel renal. Cuando la función hepática está deteriorada, como en la cirrosis,
la detoxificacion del amoníaco es insuficiente y su concentración aumenta marcadamente.
Del total de aminoácidos que llegan al hígado por sangre portal, aproximadamente el 75% es
metabolizada en el hígado y el resto en los demás tejidos. Por lo tanto, el destino de los
aminoácidos hepáticos involucra las siguientes opciones:
1) síntesis de proteínas hepáticas
2) síntesis de proteínas plasmáticas
3) detoxificación del amoníaco como urea
4) síntesis de ácidos grasos
5) síntesis de glucosa
6) síntesis de cuerpos cetónicos
3) MÚSCULO
El músculo capta los aminoácidos ramificados (leucina, isoleucina y valina) provenientes de
la dieta y no captados por el hígado. Estos aminoácidos son transformados, parte se utiliza
como fuente de energía y otra parte se libera a la circulación como alanina, glutamina y
glicina. En el músculo las reacciones de transaminación son muy activas. En general, las
transaminasas para aminoácidos ramificados del músculo esquelético son más afines por el
-cetoglutarato que por el piruvato, por lo que se forma mayoritariamente glutamato. El
glutamato se transamina con piruvato regenerando -cetoglutarato y formando alanina que
sale a la circulación. El esqueleto carbonado de los aminoácidos ramificados es degradado
por diversas enzimas, dando intermediarios del ciclo de Krebs, fundamentalmente
16
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oxalacetato. El oxalacetato se transforma en fosfoenolpiruvato en una reacción catalizada
por la enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinasa) y posteriormente en piruvato por la piruvato
quinasa. El piruvato derivado de aminoácidos ramificados, contiene los átomos de carbono
que originarán alanina por transaminación, de manera que el nitrógeno de la alanina también
provendrá del mismo aminoácido, en forma indirecta. Parte del piruvato puede utilizarse en
la obtención de energía. En una dieta normal, es posible que la mayor parte del piruvato
formado por esta vía se oxide en el músculo y sirva como fuente de energía, dada la alta
capacidad del músculo de degradar aminoácidos ramificados. En cambio, en una dieta pobre
en glúcidos o en estado de ayuno, la oxidación del piruvato es poco probable, dado que la
piruvato deshidrogenasa estará en estado inactivo, por el aumento en los niveles de acetil-
CoA provenientes de la -oxidación e incluso de la cetólisis. En estas condiciones, el
piruvato preferentemente se transaminará para formar alanina. La alanina resultante llega al
hígado donde se transamina para dar piruvato que se utiliza como sustrato de
gluconeogénesis. La glucosa resultante puede derivarse a otros tejidos incluso al propio
músculo. Se ha postulado que en el músculo, la glucosa se oxida y forma piruvato, que
nuevamente genera alanina a partir de aminoácidos ramificados, lo que se denomina ciclo
glucosa-alanina, que se esquematiza a continuación:
HÍGADO MÚSCULO
glucosa glucosa
urea glucólisis
gluconeogénesis piruvato
aminoácido
NH3 + piruvato cetoácido
alanina alanina
Sin embargo, es poco probable que el ciclo glucosa-alanina ocurra en ayunas, dado que la
velocidad de entrada de la glucosa al músculo es baja por falta de insulina. Tampoco es muy
probable que este ciclo funcione luego de una buena alimentación, porque las enzimas de la
gluconeogénesis no se encontrarán en estado activo en el hígado. En ayuno, es más
probable que la alanina generada en el músculo llegue al hígado y allí se utilice para la
gluconeogénesis, pero la glucosa así formada podría ser captada por otros órganos insulino-
independientes y glucosa-dependientes, como el cerebro o los eritrocitos. Otra posibilidad es
17
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que este mecanismo opere en el músculo en actividad, porque en este estado, la entrada de
glucosa al músculo no depende de insulina. En estas condiciones, se genera lactato por
glucólisis anaeróbica y a partir del amoníaco de los aminoácidos aromáticos se forma
alanina. En el hígado, se genera piruvato (precursor de glucosa) a partir de la alanina y los
grupos amino se eliminan como urea.
En el músculo también se puede producir glutamina a partir de aminoácidos ramificados a
través de un mecanismo complejo que se represente en el siguiente esquema. En el
músculo, se puede sintetizar glutamina a partir de los aminoácidos ramificados leucina y
valina. La leucina se desprende de su grupo amino por transaminación con -cetoglutarato,
generando glutamato y el -cetoácido correspondiente. La degradación de su esqueleto
carbonado genera acetil-CoA, que se combina con oxalacetato para dar citrato, que a través
de las reacciones del ciclo de Krebs puede generar -cetoglutarato. Por su parte, la valina se
puede transaminar con ese -cetoglutarato para dar glutamato y su cetoácido
correspondiente, el -ceto-3-metil butirato. Los pasos metabólicos que siguen son complejos
y dan como producto succinil-CoA, otro intermediario del ciclo de Krebs. Es decir que la
leucina y la valina pueden aportar los carbonos y el nitrógeno necesario para la síntesis de
glutamato, que a su vez se transforma en glutamina por acción de la glutamina sintetasa.
El nitrógeno también puede provenir en forma indirecta de la leucina. Existe otro mecanismo
alternativo para la síntesis de glutamina en el músculo. Por ejemplo, la glucosa puede
aportar los carbonos necesarios para sintetizar -cetoglutarato, que necesita de un nitrógeno
18
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amínico y amoníaco para sintetizar glutamina. El nitrógeno amínico puede provenir de
cualquier aminoácido que se transamine con -cetoglutarato para dar glutamato y el
amoníaco tiene varias fuentes posibles:
1) fuentes exógenas
2) desaminación oxidativa del glutamato (que es poco importante en el músculo)
3) desaminación de la adenosina a inosina por acción de la adenosina deaminasa. Esta
enzima que interviene en la degradación de nucleótidos de adenina es muy importante
en el músculo en actividad que consume grandes cantidades de ATP.
4) RIÑÓN
El riñón capta glutamina, prolina y glicina de la circulación. La glutamina es metabolizada
en el riñón como parte del mecanismo de regulación del equilibrio ácido-base. Esto ocurre a
nivel de los túbulos renales, dado que el amoníaco que aparece en la orina no proviene del
filtrado glomerular. La glutamina es captada desde la sangre e incluso del filtrado glomerular
y es convertida en glutamato y amoníaco por la glutaminasa que es de localización
mitocondrial en el riñón. Existe un sistema de transporte de glutamina a través de la
membrana mitocondrial interna. El glutamato se metaboliza a -cetoglutarato (reacción
catalizada por la glutamato deshidrogenasa), liberando una nueva molécula de amoníaco. El
19
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-cetoglutarato se convierte en malato a través del ciclo de Krebs y éste último sale de la
mitocondria y se transforma en oxalacetato (malato deshidrogenasa citoplasmática). A
continuación, el oxalacetato se convierte en fosfoenolpiruvato y luego en piruvato,
generando finalmente ATP. También puede ocurrir que el malato se convierta directamente
en piruvato por la enzima málica (malato deshidrogenasa descarboxilante). Por cualquiera
de estas vías, se genera piruvato que permite la obtención de energía. En ayuno, la piruvato
deshidrogenasa está inactiva y entonces el fosfoenolpiruvato entra a la vía de
gluconeogénesis. De acuerdo a estos mecanismos la glutamina en el riñón genera dos
moléculas de amoníaco que captan protones para formar el ión amonio y de esta manera se
excretan usando cloruro como contraión. De esta forma se elimina el exceso de ácido. Este
es uno de los mecanismos compensatorios en la acidosis metabólica, según se representa
en el siguiente esquema:
20
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transporte de glutamina a través de la membrana mitocondrial interna, acelerando de esta
forma la generación de amoníaco. De esta forma, un descenso agudo de pH que no puede
ser compensado por mecanismos rápidos de regulación (proteínas plasmáticas, sistemas
buffer plasmáticos) desencadenará la degradación de glutamina por el riñón.
Además de este mecanismo de regulación aguda, la capacidad del riñón de excretar amonio
se incrementa si la acidosis continúa por varios días, probablemente a través de la inducción
de enzimas y transportadores de glutamina.
Es muy importante remarcar que el metabolismo de la glutamina está fuertemente integrado
entre el músculo, el riñón y el intestino. El origen de la glutamina para su metabolización
renal durante la acidosis es preponderantemente muscular. El músculo incrementa en estas
condiciones la producción del aminoácido por un mecanismo concertado con el riñón que
todavía se desconoce. En estas condiciones, el intestino, que es el principal consumidor de
la glutamina producida por el músculo en condiciones de no acidosis, reduce su consumo
por la falta de disponibilidad del sustrato que es consumido en mayor medida por el riñón. En
la siguiente se representa la interrelación de distintos tejidos respecto a la producción y
consumo de glutamina y alanina.
5) SISTEMA NERVIOSO
El cerebro está relativamente aislado de la circulación general por un sistema de filtración
selectivo, la barrera hematoencefálica. La mayoría de las moléculas que llegan al cerebro, lo
hacen a través de sistemas de transporte específico. Existen 3 sistemas de transporte de
aminoácidos al cerebro, según sean ácidos, básicos o neutros. Entre estos últimos, los
aminoácidos ramificados se captan con gran afinidad. La concentración de aminoácidos en
el cerebro es mayor que en el plasma y las proporciones son también diferentes. Además, el
21
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cerebro es capaz de sintetizar muchos aminoácidos no esenciales a partir de los
correspondientes cetoácidos, que a su vez derivan de la glucosa.
El amoníaco del cerebro proviene de la sangre o es de origen endógeno, principalmente a
partir de glutamina, glutamato o aspartato. También se produce a partir de AMP por la
adenosina deaminasa, como en el músculo.
La intoxicación por amoníaco responde a distintas causas en niños y en adultos. En el
primer caso, la causa más frecuente es la deficiencia de alguna de las enzimas del ciclo de
la urea, en cambio, en adultos suele estar causada por el daño hepático provocado por el
alcohol, venenos o procesos infecciosos. La intoxicación por amoníaco se caracteriza por un
estado comatoso debido a la alcalinización del medio intracelular y a la disminución de los
intermediarios del ciclo de Krebs. Para la detoxificación del amonio, éste se combina con -
cetoglutarato para formar glutamato (a través de la reversión de la reacción catalizada por la
glutamato deshidrogenasa). El glutamato se convierte en glutamina por acción de la
glutamina sintetasa. Ambas enzimas tienen alta actividad en el cerebro. La formación de
glutamato a partir de -cetoglutarato consume equivalentes de reducción que, por otra parte,
son necesarios para la síntesis de ATP:
22
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Líquido cefalorraquídeo
NH3 NH3
+ +
glutamina glutamina
La glutaminasa (2) está sujeta a un complejo control alostérico inhibitorio por los productos
glutamato y amoníaco, de manera tal que si se acumula amoníaco puede frenarse la síntesis
de neurotransmisores.
glutaminasa
Glutamina glutamato + NH3 neurotransmisores
6) SANGRE
La concentración plasmática de aminoácidos está sujeta a control hormonal. Las hormonas
anabólicas como la insulina, promueven la incorporación de aminoácidos del plasma a
proteínas tisulares, particularmente en el músculo e inhibe la proteólisis muscular. Las
hormonas catabólicas como el cortisol, en cambio, estimulan la degradación de proteínas
musculares, aumentando la oxidación de aminoácidos en el músculo y su liberación a la
sangre.
23
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INTEGRACION DEL METABOLISMO DE AMINOACIDOS EN ESTADOS DE AYUNO Y
SACIEDAD
Dieta rica en proteínas
Luego de la digestión, los aminoácidos absorbidos en el intestino pasan directamente al
hígado a través de la vena porta, aunque el intestino retiene gran proporción de glutamina.
En una dieta rica en proteínas, habrá sustrato disponible para las enzimas catabolizantes de
aminoácidos. Dado que no existen reservas de proteínas en el organismo, los aminoácidos
en exceso perderán sus grupos amino por transdesaminación, y a partir de ellos se
sintetizará urea, que se eliminará a la sangre y de allí a la orina. Los esqueletos carbonados
podrán ser oxidados para obtener energía, o bien usados en la síntesis de ácidos grasos
(dependiendo de la estructura de su esqueleto carbonado). En los tejidos periféricos, la
insulina aumentará la captación de aminoácidos, que se utilizarán para la síntesis de
proteínas. Dado que el hígado no metaboliza aminoácidos ramificados, estos serán captados
preferencialmente en los músculos
Ayuno
Luego de varias horas post-ingesta, el metabolismo de aminoácidos en el músculo genera
alanina y glutamina. La alanina puede pasar al hígado donde podrá convertirse en glucosa
por gluconeogénesis. La glutamina puede ser captada por el intestino, y se utilizará para la
síntesis de bases nitrogenadas y obtención de energía.
En la medida en que el ayuno persista, el metabolismo de aminoácidos se acelerará, lo que
incluye la proteólisis muscular. Como consecuencia de ello, se libera glicina, alanina y
glutamina que se emplean en la gluconeogénesis hepática y renal. La glicina puede
transformarse en serina y luego en glucosa en el riñón. En el intestino se incrementa el
consumo de glutamina como fuente de energía, y su transformación parcial en alanina
puede servir como fuente de carbonos para la gluconeogénesis hepática. En estas
condiciones, se inducen las enzimas del ciclo de la urea, cuyos niveles aumentan como
resultado de la utilización de aminoácidos como fuente de energía. Finalmente, en un ayuno
muy prolongado, dejarán de sintetizarse proteínas plasmáticas y de regenerarse el epitelio
intestinal. La proteólisis muscular es el último aporte de esqueletos carbonados para la
gluconeogénesis.
24
Metabolismo del HEMO
Importancia biomédica:
1
Porfirinas y Hierro
Síntesis
Degradación
Pigmentos
Biliares y Hierro
HEMO
15% sintetizado por el hígado (para el citocromo P450 y otras hemoproteínas)
2
Síntesis del HEMO
ALA sintasa
Matriz mitocondrial
Acido δ aminolevulínico
(ALA)
3
ALA sintasa
Se sintetiza en
Importación el citoplasma
mitocondrial con la
participación de
chaperonas, en la
mitocondria se escinde
el péptido señal y se
pliega utilizando ATP
Actúa en la
mitocondria
Devlin
ALA dehidratasa
(o PBG sintasa)
2 Anillo pirrólico
Citoplasma
+ 2 H2O
4
Síntesis del HEMO
Ac : acético
Pr : propiónico Hidroximetilbilano
Tetrapirrol lineal
Porfobilinógeno (PBG)
Ac Pr
A B
espontánea
Pr
D C
Uroporfirinógeno III
PBG deaminasa (PBG-D)
co- sintasa
oxidación Oxidación
Uroporfirina III Luz
Excretada Uroporfirina I
CO2 Excretada
Uroporfirinógeno III
Coproporfirinógeno I
Uroporfirinógeno
descarboxilasa (Uro-D) Oxidación
Luz
citosólica
Coproporfirina I
Coproporfirinógeno III
5
Síntesis del HEMO
Grupo vinilo
Decarboxilación oxidativa
2 CO2 + 2H2O
Coproporfirinógeno
oxidasa
(Mitocondria; espacio
intermembrana)
Coproporfirinógeno III
Ingresa a mitocondria Protoporfirinógeno III o IX
(Producto no coloreado)
Descarboxilación oxidativa
(Membrana
mitocondrial interna)
Grupo metileno
Protoporfirina IX o III
Protoporfirinógeno IX o III
6
Síntesis del HEMO: paso final
Ferroquelatasa
(Membrana mitocondrial
interna)
Fe2+
Protoporfirina IX o III
7
Regulación de la síntesis del HEMO
Hígado
a) ALA sintasa, enzima reguladora clave en biosíntesis del Hemo
Inducción – represión: reprimida por el grupo hemo
La regulación de la ALA-S en el hígado es muy sensible a los niveles de
Hemo (para mantener los citocromos P450 involucrados en la síntesis de
sales biliares, colesterol, detoxificación de fármacos, etc)
8
Regulación de la síntesis del HEMO
Hígado
a) Inhibición de la expresión de ALA-S
El hemo unido a una proteína (apo-rrepresor) actuaría reprimiendo la
expresión del gen de ALA-S
Inducen citocromo
P450 que usa Hemo:
al disminuir cantidad
de Hemo, se
estimula ALA-S
9
Regulación de la síntesis del HEMO
Porfirias
Grupo de enfermedades metabólicas provocadas por alteraciones
en el camino de la biosíntesis del Hemo
10
Porfiria aguda intermitente (PAI)
11
Coproporfiria hereditaria
12
Porfirias
Porfiria eritropoyética congénita
Defecto en la URO-CoS (no se sintetiza uroporfirinógeno III), expresado
predominantemente en tejido eritropoyético
Aumenta la uroporfirina I en GR
Las porfirinas tipo I en exceso producen fotosensibilidad
Protoporfiria eritropoyética
13
Catabolismo del hemo
Hemo de los GR Hemo de las hemoproteínas
(120 días) Catalasa, peroxidasa, citocromos
Macrófago Hígado
se oxida Microsomal
Se abre anillo
tetrapirrólico
14
II III IV I
Citoplasma
Naranja - amarillenta
No conjugada o indirecta (BI)
Estos cambios catabólicos en la estructura de los
tetrapirroles son responsables por el cambio progresivo
en el color de un hematoma: rojizo—azul—verde
amarillento, finaliza en amarillento, cuando abandona el
tejido afectado (se transporta con albúmina hasta el
hígado)
UDP-
glucuronil-
transferasa
REL
Diglucurónido de bilirrubina
Soluble
Marrón
15
Catabolismo del hemo
Excreción y absorción de Bilirrubina- circulación entero hepática
urobilinógeno estercobilinógeno
Oxidación Oxidación
por aire Incoloro por aire
urobilina estercobilina
Amarilla Marrón Coloración de
las heces
Ictericias
Ictericia : acumulación de bilirrubina en sangre que difunde a los
tejidos, que adquieren coloración amarilla (piel y mucosas)
16
Fisiológica del recién nacido
Esta hiperbilirrubinemia resulta de un sistema hepático inmaduro para la
captación, conjugación y secreción de la bilirrubina
VN en el
recién nacido:
7 mg/dl.
Pre-hepática
Causada por la hemólisis aumentada
El aumento en la destrucción de GR
produce mayor cantidad de bilirrubina
transportada por albúmina (bilirrubina
indirecta) en sangre, que no filtra en riñon
(No hay coluria)
Hipercolia
17
Hepática o mixta
Fallas en la captación, conjugación o excreción de bilirrubina por el hígado.
Post-Hepática
Se debe al fallo para excretar la bilirrubina desde el hepatocito al duodeno
(obstrucción)
Producción de bilirrubina en SER normal,
BI es normal
18
Especies Reactivas del Oxígeno
(EROS)
Prof. Dr. Héctor Coirini
Definición
X : Y !X . + Y .
A ! A+. + e-
A + e- ! A-.
O2 + e- ! O2.-
O2.-+ 2 H+ + e- ! H2O2
H2O2 + H+ + e- ! .OH + H2O
.OH + H+ + e- ! H O
2
e- = electrón
H+ = hidrogeniones
O2.- = radical anión superóxido
H2O2 = peróxido de hidrógeno
.OH = radical hidroxilo
H2O = agua
Primera reducción del oxígeno molecular
O2 + e- ! O2.-
** ** ** ** -
* O O*
**
*
*
**
+e * * O O **
**
*
*
**
OXÍGENO Molecular electrón Anión SUPEROXIDO
2 O2.- + 2 H+ ! H2O2 + O2
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
** **
** ** -
* O O *
*
*
*
H ** O ** O ** H
** **
**
**
**
** -
+ 2H+ +
* O ** O ** ** **
** ** * O ** O *
** **
2 Anión SUPEROXIDO
OXÍGENO Molecular
Un tercer electrón entra en juego
(Reacción de Fenton)
Fe3+
Anión Oxidrilo
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
** ** ** - **
H ** O ** O ** H * O ** H
**
+ ** O
**
*H
*
** **
Fe2+ Radical
HIDROXILO
Anión Oxidrilo
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
** ** - **
+ O
**
H ** O ** O ** H * O H *
* *H
**
*
+
** ** ** **
Radical HIDROXILO
** **
** ** -
* O O *
*
* * O ** O *
* ** **
** **
Anión SUPEROXIDO OXÍGENO Molecular
O hv
1O
(ozono) O3 O2 2 (oxígeno singulete)
e-
.- (radical
O2 superóxido)
4H+ + 4e- 2H+ + e-
e- e-
H+
2 H2O
NOS
Arg NO. (óxido nítrico) NO. + O2-. ONOO-
+ citrulina (peroxinitrito)
Citocromos P450 y b5
Oxidasas presentes en peroxisomas
RH2 + O2 ! R + H2O2
N ADP H + H +
NADPH O2
NADPH
NA DPH o xid asa
oxidasa
ADP +
NADP
N O 2-
SOD
Bacter ia
H 2O 2 Fe2+
Reacción de Fenton
HOCl
Cl-
Fe3+
MIEL OPEROXID A SA
OH
Invaginación
Inva
vaa ginación de la memb
membrana
brana Bacter ia
de un NEUTROFILO
La enzima xantino oxidasa
O xantina
N
HN
+ S-Fe2+ O2
N N MoVI
O H H H2O
O
.-
N O2
HN MoIV S-Fe3+
O -
N
O N
H H +
2 H+
urato
Lípidos
Proteínas
Hidratos de carbono
Ácidos nucléicos
Formación de Radicales Libres de Lípidos
y Lipoperóxidos
Iniciación LH + .OH ! L. + H2O
L. + O2 ! LOO.
LOO. = radical peroxilo,
Propagación LOOH = hidroxiperóxido lipídico
LOO. + LH ! LOOH + L.
Terminación
L. + vitamina E ! LH + vitamina E.
L. + vitamina E. ! LH + vitamina E oxidada
X
o O
o OH
Ma
Ma lo
lo n dia
d ia ldehido
l d e h id o L iip
pope ró x
eró id o
xido
d e g rradado
deg ada do
O
CH3
H
OH
4-hidroxi-2-nonenal
Lipoperoxidación en fosfolípidos
O
e++
Me
M e++
Fe
F e++
Fe
F H2O2
=
s
o
b
r
e
l
a
m
e
m
b
r
a
n
a
3' 3'
R R
O O
-O -O P O
P O
O O
CH 2 - COO - H BASE
H 2C
O
BASE
C
Radicales
Libr es H C
C H
O O
O-
-O P O -O P O
O O
R' R'
5' 5'
O NH 2 O
CH 3 N N
HN N HN
O N N H 2N N N
N H H
H
Timina A d enina Guanina
Especies
Es
species R
React
Re
e
eact ivas de Oxígeno
O O
NH 2 H
H O N
CH 3 N C HN
HN HN
OH H O
OH
O NH H 2N N N
N H N H
Antioxidantes
Vitamina E
Vitamina C
LOO. + vitamina E ! LOOH + vitamina E.
vit E. + ascorbato ! ! semi-dehidro-ascorbato + vitamina E
Antioxidantes
Vitamina A
retinol
vitamina E. + GSH ! vitamina E + GS. 2GS. ! GSSG
Glutation GSSG + NADPH + H+ ! 2 GSH + NADP+
Antioxidantes
Melatonina
Sistemas enzimáticos
2 O2-. + 2 H+ ! H2O2 + O2
mitocondria (Mn SOD, tetrámero)
citoplasma (Cu/Zn SOD, dímero)
Catalasa
2 H2O2 ! 2 H2O + O2
Antioxidantes
Su
Supperó xid
e ró xido Fe2+
Fe3+
D is m u ttasa
Dis a sa
2 O2-. H2O2 .OH
2 H+ O2 2 GSH NADP+
G llu
u tta
a ttio
io n
Glu
G lu tta
a ttio
io n
Pe
eroro x id a s a
xidasa
2 H2O + O2 R e d u c ta s a
Reductasa
GSSG
+ NADPH
C a tta
a la
la sa
sa
2 H2O
1- Enzimas Lipolíticas:
2- Enzimas Proteolíticas:
flavonoides
flavo
antocianos
Estrés Oxidativo
Especies Reactivas
del Oxígeno Defensa Celular
El Óxido Nítrico NO
* **
*
* N ** ** O **
** **
Electrones N = 7
Electrones O = 8
Total = 15
Síntesis del Óxido Nítrico
2 ARGININA + 3 O2
NADPH + H+
NADP+
2 CITRULINA +
2 NO + 3 H2O
NADPH + H+
NOS 1.- endotelial (eNOS)
NADP+
2.- macrofágica (mNOS o iNOS)
Oxihemoglobina
nitrito
nitrato
NO
Guanilato
NO Ciclasa
soluble
NO
LDL oxidadas son captadas por monocitos y macrófagos, las cuales son
transformados en células espumosas.
Por otro lado, las LDL oxidadas dañan la íntima de la arteria, contribuyendo al
proceso aterogénico por disrupción del endotelio.
Efisema / Bronquitis
Enfermedades neurodegenerativas
Parkinson
Huntington
Alzheimer
Preclamsia
Cáncer
Diabetes
Alteraciones Cardiovasculares
Envejecimiento
BIOQUÍMICA CLÍNICA
PACIENTE MÉDICO
ACCIÓN = TRATAMIENTO
CLÍNICA INVESTIGACIÓN
BEDSIDE BENCH
1
BIOMARCADOR …
parámetro biológico medible y cuantificable
(analito o función: concentración o actividad de una enzima
específica, concentración de una hormona específica, la
distribución del fenotipo de un gen especifico en una población, o la
presencia de sustancias biológicas)
Diagnóstico in vitro
- influencia 60-80% de las decisiones clínicas
- consume sólo aproximadamente el 2% del gasto en salud
4
2
USOS DE LOS ANÁLISIS DE LABORATORIO -
BIOMARCADORES
PARTE INTEGRAL DEL PROCESO DE
TOMA DE DECISIONES
- Diagnóstico
- Screening de enfermedades
- Monitoreo de tratamiento
- Detección de complicaciones
- Medicina legal
- Investigación
Antes de solicitar una determinación o práctica,
los médicos deberían considerar si el resultado lo
influenciará en el manejo clínico del paciente.
5
RIESGO
PESQUISA CPK-MB
Fenilalanina Troponina T hEGF receptor
17-OH-P4
Saber si un Saber si un
recién nacido paciente
sufre sufrió/está
fenilcetonuria sufriendo
o hiperplasia un infarto
suprarrenal agudo de
congénita miocardio
3
¿Qué es un
análisis bioquímico?
Es el estudio de las
biomoléculas y células
característicos de procesos
vitales (metabolismo, inmunidad,
etc.) utilizando diferentes
métodos fisicoquímicos
Esto se realiza con diversas
muestras del paciente como:
sangre, orina, LCR y otros
materiales/fluidos.
Procesos en un
Laboratorio de Análisis Clínicos
Pre-Analítico Analítico Post-Analítico
• Indicaciones • Puesta a punto • Validación de
• Preparación del de resultados
paciente instrumentos • Informe de
• Identificación • Calibración resultados
• Toma de • Control de • Informe de
muestra Calidad valores críticos
• Acondiciona- • Análisis de • Asesoramiento
miento de muestras en
muestra interpretación
de resultados
4
Pre-Pre Instancias de interacción
Analítico
●Elección
Médico-Bioquímico
de análisis
Pre-Analítico
●Requisitos Analítico Post-Analítico
● Momento
de Post-Post
• Indicaciones • Puesta a punto • Validación de
Analítico
realización
• Preparación del de resultados
Interpretación
paciente instrumentos de Resultados
• Reporte de
• Identificación • Calibración resultados
Evaluación de
• Toma de • Control de • Reporte de
interferencias
Muestra Calidad valores críticos
• Acondiciona • Análisis de • Asesoramiento
miento de muestras en
muestra interpretación
de resultados
Espectrofotometría
Electroforesis
Turbidimetría
Citometría de Flujo
RIA/EIA
Microscopía
Inmunofluorescencia
Quimioluminiscencia
Reacción en cadena de
polimerasa PCR
Secuenciación
10
5
VOCABULARIO
XXemia: concentración de XX en sangre
XXuria: concentración de XX en orina
natremia : Na - natrium
calemia : K
calcemia : Ca
11
VOCABULARIO
12
6
AUTOANALIZADORES – CONTADORES DE CÉLULAS
BIOINGENIERÍA
13
AUTOANALIZADORES
BIOINGENIERÍA
14
7
AUTOANALIZADORES
CARACTERÍSTICAS
•GESTIÓN SIMPLE
•FLEXIBILIDAD
•LECTURA DE CÓDIGO DE BARRAS EN
MUESTRAS Y REACTIVOS
•CONSUMIBLES Y REACTIVOS COMERCIALES LISTOS
PARA EL USO
•REGISTRO DE CALIBRACIONES
•REGISTRO DE CONTROLES
•REGISTRO DE MUESTRAS
•REGISTRO DE ERRORES
•SIMULTANEIDAD DE PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
•SIMULTANEIDAD DE PROCESAMIENTO DE ENSAYOS
•COMUNICACIÓN INFORMATIZADA
•PROGRAMACIÓN
•REPETICIONES AUTOMÁTICAS
ESPECIFICIDAD ANALÍTICA
DETECTABILIDAD - LÍMITE DE DETECCIÓN/CUANTIFICACIÓN
LINEALIDAD
SENSIBILIDAD/RESOLUCIÓN ANALÍTICA
EXACTITUD
PRECISIÓN
8
VALIDACIÓN TÉCNICA DE RESULTADOS NUMÉRICOS
EN INFORMES DE LABORATORIO
ESPECIFICIDAD Y DETECTABILIDAD
17
ESPECIFICIDAD ANALÍTICA
habilidad del método en cuestión para detectar exclusivamente a la
sustancia que se desea analizar,
presente en una mezcla compleja de sustancias - interferencias
• ENZIMAS ENZIMOENSAYOS
• ANTICUERPOS INMUNOENSAYOS
18
9
VALIDACIÓN TÉCNICA DE RESULTADOS NUMÉRICOS
EN INFORMES DE LABORATORIO
DETECTABILIDAD
LÍMITE DE DETECCIÓN/CUANTIFICACIÓN
resultado: no detectable
DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN basada en la medida de de
• AGLUTINACIÓN
• TURBIDEZ
• ABSORCIÓN DE LUZ MÉTODO
COLORIMÉTRICO/ESPECTROFOTOMÉTRICO
• RADIOACTIVO MÉTODO RADIOMÉTRICO
• FLUORESCENCIA MÉTODO FLUOROMÉTRICO
• LUMINISCENCIA, ETC
• REACCIÓN ENZIMÁTICA MÉTODO ENZIMOMÉTRICO
19
20
10
VALIDACIÓN TÉCNICA DE RESULTADOS NUMÉRICOS
EN INFORMES DE LABORATORIO
ESPECIFICIDAD Y DETECTABILIDAD
INMUNOENSAYOS
INMUNOAGLUTINACIÓN (semicuantitativo)
grupo sanguíneo, VDRL
INMUNOTURBIDIMETRÍA (precipitación)
crioglobulinas
22
11
VALIDACIÓN TÉCNICA DE RESULTADOS NUMÉRICOS
EN INFORMES DE LABORATORIO
PROCESAR REPETIDAMENTE
PATRONES DE CONCENTRACIÓN CONOCIDA –
ESTADÍSTICA – INTERPRETACIÓN
Blanco: concentración 0
Estándares/patrones de concentración conocida
Aplicar el método
Medir señal
23
24
12
VALIDACIÓN TÉCNICA DE RESULTADOS NUMÉRICOS
EN INFORMES DE LABORATORIO
25
26
13
VALIDACIÓN TÉCNICA DE RESULTADOS NUMÉRICOS
EN INFORMES DE LABORATORIO
SENSIBILIDAD/RESOLUCIÓN:
capacidad del método en cuestión para
discriminar entre concentraciones
semejantes de la sustancia que se
desea analizar
Señal
27
EXACTITUD Y PRECISIÓN
PROCESAR REPETIDAMENTE UN
CONTROL DE CONCENTRACIÓN CONOCIDA
– ESTADÍSTICA – INTERPRETACIÓN
28
14
VALIDACIÓN TÉCNICA DE RESULTADOS NUMÉRICOS
EN INFORMES DE LABORATORIO
EXACTITUD (medida)
PRECISIÓN (desviación estándar)
15
VALIDACIÓN TÉCNICA DE RESULTADOS NUMÉRICOS
EN INFORMES DE LABORATORIO
EXACTITUD (medida)
PRECISIÓN (desviación estándar)
PROCESAR REPETIDAMENTE UN
CONTROL DE CONCENTRACIÓN CONOCIDA –
ESTADÍSTICA – INTERPRETACIÓN
Curva/Gráfico
Levey Jenning
Reglas Westgard
31
fecha
DETERMINACIÓN DE GLUCEMIA
FUNDAMENTO
W---– glucosa oxidasa-peroxidasa – produce H2O2 - colorimétrico
A--– hexoquinasa-G6PDH – produce NADH – espectrofotométrico
Linealidad:
W---: hasta 500 mg% A---: entre 5 y 800 mg%
Límite de detección:
W---: 0,54 mg% A---: 2,5 mg%
Límite de cuantificación:
W---: 4,2 mg% A---: 5 mg%
32
16
VALIDACIÓN TÉCNICA DE RESULTADOS NUMÉRICOS
EN INFORMES DE LABORATORIO
DETERMINACIÓN DE GLUCEMIA
Precisión
A--- W---
media (mg%) 79,6 281,3 90,7 278
Intraensayo
SD 1,58 1,83 1,26 3,08
%CV 1,98 0,65 1,39 1,11
Entreensayo
SD 0,67 2,62 1,73 4,86
%CV 0,84 0,93 1,92 1,62
33
DETERMINACIÓN DE GLUCEMIA
A--- W---
0,84% = 0,7 1,92% = 1,6
34
17
VALIDACIÓN TÉCNICA DE RESULTADOS NUMÉRICOS
EN INFORMES DE LABORATORIO
DETERMINACIÓN DE COLESTEROLEMIA
35
DETERMINACIÓN DE COLESTEROLEMIA
18
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS NUMÉRICOS EN
INFORMES DE LABORATORIO
VALORES NORMALES O RANGO DE REFERENCIA
- Intervalo de valores que usualmente
incluye el 95% de los resultados obtenidos en una
población sana;
2,5% de la población normal fuera del
rango de referencia en cada extremo
2,5 % = 1/40
19
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS NUMÉRICOS EN
INFORMES DE LABORATORIO
VALORES NORMALES O RANGO DE REFERENCIA
ESTANDARIZACIÓN
39
IDEAL REAL
Sujetos Sujetos Sujetos Sujetos
“normales” “enfermos” “normales” “enfermos”
“Ill”
40
20
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS NUMÉRICOS EN
INFORMES DE LABORATORIO
EVALUACIÓN DE PREDICCIÓN
VALIDEZ CLÍNICA DE UNA PRUEBA
UNA PRUEBA DIAGNÓSTICA SERÁ VÁLIDA SI ES CAPAZ DE MEDIR
CORRECTAMENTE EL FENÓMENO QUE PRETENDE ESTUDIARSE
Sujetos Sujetos
“normales” “enfermos”
41
42
21
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS NUMÉRICOS EN
INFORMES DE LABORATORIO
EVALUACIÓN DE PREDICCIÓN
VALIDEZ CLÍNICA DE UNA PRUEBA
TEST A “GOLDSTANDARD”
VALIDAR prueba o criterio usado para identificar
definitivamente a los que tienen la enfermedad
RESULTADO ENFERMO SANO
DEL TEST
POSITIVO VERDADERO FALSO POSITIVO
POSITIVO FP
VP
NEGATIVO FALSO VERDADERO
NEGATIVO NEGATIVO
FN VN
PREVALENCIA:
proporción de enfermos en una población determinada,
en un momento o período dado. 43
44
22
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS NUMÉRICOS EN
INFORMES DE LABORATORIO
EVALUACIÓN DE PREDICCIÓN
VALIDEZ CLÍNICA DE UNA PRUEBA
SENSIBILIDAD CLÍNICA: proporción de verdaderos positivos
mide enfermos identificados correctamente por la prueba.
45
S = VP/(VP+FN) 46
23
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS NUMÉRICOS EN
INFORMES DE LABORATORIO
EVALUACIÓN DE PREDICCIÓN
VALIDEZ CLÍNICA DE UNA PRUEBA
TEST A “GOLDSTANDARD”
VALIDAR
RESULTADO ENFERMO SANO
DEL TEST
POSITIVO VERDADERO FALSO
POSITIVO POSITIVO
VP FP
NEGATIVO FALSO VERDADERO
NEGATIVO NEGATIVO
FN VN
ESPECIFICIDAD CLÍNICA
PROBABILIDAD QUE SANO DE RESULTADO NEGATIVO
E = VN/(FP+VN) 47
TEST A VALIDAR
SENSIBILIDAD = 400/500 = 80%
ESPECIFICIDAD = 450/500 = 90% 48
24
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS NUMÉRICOS EN
INFORMES DE LABORATORIO
EVALUACIÓN DE PREDICCIÓN
VALIDEZ CLÍNICA DE UNA PRUEBA
49
50
25
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS NUMÉRICOS EN
INFORMES DE LABORATORIO
EVALUACIÓN DE PREDICCIÓN
SEGURIDAD DE UNA PRUEBA
51
26
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS NUMÉRICOS EN
INFORMES DE LABORATORIO
EVALUACIÓN DE PREDICCIÓN
SEGURIDAD DE UNA PRUEBA
TEST A “GOLDSTANDARD”
VALIDAR
RESULTADO ENFERMO SANO
DEL TEST
POSITIVO VERDADERO FALSO
POSITIVO POSITIVO
VP FP
NEGATIVO FALSO VERDADERO
NEGATIVO NEGATIVO
FN VN
Valor predictivo positivo:
número real de enfermos respecto de todos los resultados que
indican presencia de enfermedad.
VPP=(VP)/(VP+FP)
53
27
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS NUMÉRICOS EN
INFORMES DE LABORATORIO
EVALUACIÓN DE PREDICCIÓN
SEGURIDAD DE UNA PRUEBA
VALOR PREDICTIVO - depende de la prevalencia de la enfermedad
en la población en estudio.
INFLUENCIA DE LA PREVALENCIA
56
28
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS NUMÉRICOS EN
INFORMES DE LABORATORIO
EVALUACIÓN DE PREDICCIÓN
SEGURIDAD DE UNA PRUEBA
TEST A “GOLDSTANDARD”
VALIDAR
RESULTADO ENFERMO SANO
Población 20000 habitantes DEL TEST
20 enfermos
Técnica de diagnóstico
POSITIVO 19 200 219
ELISA NEGATIVO 1 19780 19781
sensibilidad 95%
especificidad 99% 20 19980 20000
57
29
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS NUMÉRICOS EN
INFORMES DE LABORATORIO
EVALUACIÓN DE PREDICCIÓN
SEGURIDAD DE UNA PRUEBA
INFLUENCIA DE LA PREVALENCIA
PACIENTE
“El test para enfermedad celíaca me dio negativo, significa que no me
tengo que preocupar?”
MÉDICO CLÍNICO
Enfermedad celíaca baja prevalencia
bajo VPP
alto VPN
59
FRECUENCIA DE LOS
ANÁLISIS DE LABORATORIO
60
30
ENFERMEDAD METABÓLICA
HIPÓTESIS DE GARROD: estudió alcaptonuria -
publicó en 1923 “Errores congénitos del metabolismo”
ENZIMA
A B C
C
D
d
61
ENFERMEDADES METABÓLICAS –
ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO
31
ENFERMEDADES METABÓLICAS –
ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO
-FENILCETONURIA
-ALCAPTONURIA
-GALACTOSEMIA
-MUCHOS OTROS!!!!!
63
ENFERMEDADES METABÓLICAS –
ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO
ENZIMA
A B C
C
D
d
64
32
ENFERMEDADES METABÓLICAS –
ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO
Phe-hidroxilasa
Phe Tyr
Tyr
Phe-Pyr
Phe-Pyr
Phe-Lact
Phe-Lact
65
66
33
ARTICULO 1º - A todo niño/a al nacer en la República
Argentina se le practicarán las determinaciones para la
DETECCIÓN y posterior TRATAMIENTO de
FENILCETONURIA, HIPOTIROIDISMO NEONATAL,
FIBROSIS QUÍSTICA, GALACTOSEMIA,
HIPERPLASIA SUPRARENAL CONGÉNITA,
DEFICIENCIA DE BIOTINIDASA, RETINOPATÍA DEL
PREMATURO, CHAGAS Y SÍFILIS; siendo obligatoria su
realización y seguimiento en todos los
ESTABLECIMIENTOS PÚBLICOS de gestión
estatal o de la seguridad social Y PRIVADOS de la
República en los que se atiendan partos y/o a recién
nacidos/as. Toda persona diagnosticada con anterioridad a
la vigencia de la presente ley queda incluida
automáticamente dentro de la población sujeta de
67
tratamiento y seguimiento.
68
34