2015

Laboratorio de microbiología

METABOLISMO BACTERIANO
Informe No.8
Practica Laboratorio de Microbiología
Universidad Nacional de Colombia sede Palmira
Facultad de Ingeniería y administración
Abril 15 del 2015

OBJETIVOS

 Conocer, analizar e identificar el tipo de bacteria teniendo en cuenta el

metabolismo que realiza.
 Conocer los diferentes procesos que lleva acabo una bacteria relacionados con
fuente de energía, enzimas de utilidad, utilización de azucares, crecimiento,
reproducción etc.; en síntesis todo aquello que tenga que ver con procesos
bioquímicos.
 Al final de la práctica el estudiante conocerá la importancia de cada prueba y por
consiguiente averiguara el tipo de bacteria trabajada.

Realice la siembra de cada una de las pruebas proporcionadas por su tutor y reporte correctamente
los resultados (incluirimágenes).

Conclusión del informe: Definir tentativamente "Familia" y/o " Género-Especie" de la bacteria,
utilizando los «diagramas de flujopara identificación» del Manual de Bacteriología Determinativa de
Bergey o bases de datos para identificación bacteriana. Sidefine Género y/o Especie, registrar en la
discusión la taxonomía completa actualizada (ver bases de datos en línea).

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PRUEBAS BIOQUIMICAS

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TABLA MODIFICADA DE COWAN´S & STEEL PARA IDENTIFICACION DE BATERIAS

HETERÓTROFAS

tinción Gram
+ + + + + + + + – – – – –
(cultivo fresco)
bastó bastó bastó bastó bastó bastó bastó bastó
Forma coco coco coco coco coco
n n n n n n n n
racimo racimo cadena tétrada pare
Agrupación
s s s s s
Crecimiento
+ + + + + – + + + + + + +
aerobio
Crecimiento
– + + + + + + – – – + + –
anaerobio
Esporas – – – – – + + + – – – – –
Movilidad – – – – – +o– +o– +o– +o– +o – +o- + –
Catalasa + + – – – – + + + + + + +
Oxidase + + – + +
Fermentación de
glucosa a acido – + + + + + (o –) + – – – + + –
o a acido+gas
O/F – O F F O
Micrococcus X
Staphylococcus X
Streptococcus X
Lactococcus X
Enterococcus X
Leuconostoc X
Pediococcus X X
Aerococcus X
Lactobacillus X
Clostridium X
Bacillus X X
Alcaligenes X
Pseudomonas X
Enterobacterias X
Aeromonas X
Chromobacteriu
X
m
Neisseria X

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PRUEBA RESULTADO
Reacción de Gram Gram negativas
Forma y disposición Bacilos
Tinción de esporas -
tinción de capsulas bacterianas -
Oxidasa -
Catalasa +
Fermentación de carbohidratos
 Glucosa  +
 Lactosa  +
 Sacarosa  +
 Manitol  -
Fermentación de azúcares en Agar Reacción acido/ acido /gas (-) / H2S (-)
Prueba de oxidación-fermentación (OF) +
Prueba de Rojo de Metilo – VogesProskauer +/-
(RM-VP)
Tubo Citrato +
Prueba de descarboxilacion de Lisina en +
Agar
SIM - Movilidad -
Prueba Ureasa -
Hidrolisis de Almidón -
Producción de pigmentos King A -
Producción de pigmentos King B -
Crecimiento Aerobio - Anaerobio Crecimiento únicamente en la parte
inferior
Reducción de nitratos +
Prueba con NaCl al 1% -
Prueba con NaCl al 5% -
Prueba con NaCl al 20% -
Antibiograma NV-5 ( + ), MY ( - ), K-30 ( + ), FOS-50
(+)
Hidrolisis de gelatina -
Desoxirrubonucleasa -

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DISCUSIÓN

En esta práctica de laboratorio de metabolismo bacteriano se elaboraron en pruebas bioquímicas para la identificación
del microorganismo con el que se ha estado trabajando. El fundamento general de estas pruebas es determinar la
actividad de una vía metabólica, a partir de un sustrato que se incorpora en el medio de cultivo y que cuando la bacteria
se desarrolle pueda o no modificarlo. Es decir que las pruebas se han desarrollado para demostrar una vía metabólica y
características bioquímicas (enzimáticas) determinadas. Todas estas pruebas claramente incluyen las reacciones
anabólicas y catabólicas para poder realizar dicha identificación de género y en algunos casos de la especie bacteriana.

Las primeras dos prueba realizadas se hicieron para determinar si la bacteria de estudio posee enzimas vinculadas con la
respiración: Oxidasa y catalasa. En la prueba de oxidasa la tira de papel con el reactivo en una punta no mostro ningun
cambio de coloracion, por lo tanto se descarta la presencia de enzimas del sistema citocromo-oxidasa, capaces de oxidar
rápidamente al colorante redox. En la segunda prueba para la enzima catalasa en una gota de peroxido de Hidrogeno se
agrego una alicuota del microorganismo e inmediatamente se observo una efervecencia lo que indica presencia de la
enzima catalasa que descompone el peróxido de hidrógeno, en oxígeno y agua, y permite que la bacteria se desarrolle
en presencia del peroxido de hidrogeno, en ocasiones letal para estos microorganismos.

Un conjunto de cuatro pruebas denominadas fermentacion de carbohidratos, se uso para determinar la capacidad en la
bacteria de descomponer la glucosa, lactosa, sacarosa y el manitol para usarlos en su proceso de crecimiento y
desarrollo. La fermentacion de glucosa (tercera prueba de la practica) es una prueba muy importante en las primeras
etapas de identificación de bacterias quimiótrofas, con la bacteria estudiada se presencio que el medio de cultivo habia
cambiado de color a una tonalidad de amarillo mas clara, ademas de llenar la campana Durham para gases por lo que se
dice que es capaz de obtener su energia del azucar glucosa. En la cuarta prueba de fermentacion de lactosa se observo
que el medio habia cambiado de color, agregando que la bacteria tambien expulso gases dentro de la campana Durham,
lo que indica que es capaz de fermentar la lactosa. La quinta prueba mostro que el medio cambio solo un poco el color
del medio y no expulso gases en la campana Durham, el leve cambio de coloracion en el medio nos indica que la bacteria
es positiva en fermentacion de sacarosa. En la sexta prueba de fermentacion de manitol no se evidencio ni un cambio de
color en el medio, ni gases en la campana, por lo que se dice que la bacteria es incapaz de fermentar el polialcohol
manitol.

En la septima prueba de fermentacion de azucar en agar en tubo con agar en bisel tomo 48 horas para dar un cambio a
una coloracion amarilla por la presencia de acidos liberados por el microorganismo, lo que se da porque este fermenta la
lactosa y/o la sacarosa, del agar produciendo gran cantidad de ácido que no puede ser neutralizado por la producción de
aminas que se da en la superficie, lo que hace que el medio cambie al color amarillo (indicativo de ácido). La octava
prueba donde se usaron 2 tubos los cuales eran uno sellado y otro no, ambos presentaron un color amarillo
trasparentoso donde el sellado se ve un poco turbio, esto indica que la bacteria es fermentativa y oxidativa positiva,
deduciendose ademas que es anaerobia facultativa. La novena prueba llamada prueba de Rojo de Metilo – Voges
Proskauer (RM-VP), fue descrita en ese caso asi, prueba VP negativa osea sin presencia de diacetilo, y prueba RM

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positiva, el microorganismo si fermento la glucosa por la via acido-mixta; en estos dos casos se presento una coloracion
rosa leve.

En la decima prueba del tubo citrato se examina la utilización de Citrato como única fuente de carbono por parte de la
bacteria, se detecto que el medio cambio de color verde a color azul, esto es debido a que por el crecimiento y la
alcalinización del medio aumenta el pH y se visualiza dicho color por el indicador azul de bromotimol, que vira a pH 7,6.
La prueba numero 11, prueba de decarboxilacion de lisina en agar el medio se torno de un color violeta debida a la
liberación de aminas por decarboxilación, dicho cambio de color indica que la prueba es positiva para decarboxilacion y
negativa para H2S. En la prueba 12, prueba de movilidad-SIM se evidencio crecimiento de la bacteria sin embargo este
no seextendio de la forma adecuada por lo que se concluye que la prueba es negativa.

La prueba numero 13, prueba de ureasa el medio no cambio de color ni a las 24 ni a las 48 horas por lo que se dice que
es negativa y no hubo hidrolisis de la urea. En la prueba 14, prueba para hidrolisis del almidon se concluye que no hay
amilasas que hidrolisen el almidon ya que despues de adicionar en la superficie del agar una solución de Iodo-Ioduro de
Potasio aparecio una coloración azul-violeta.

En la prueba 15, para prueba de pigmentos se determina mediante la usencia de pigemntacion que la prueba da
negativa y no hay produccion de piocianina. En la prueba 16, la prueba de producion de pigmentos King B que se
observo bajo luz ultravioleta no se observo nunguna pigmentacion lo que indica que no hubo produccion de
fluoresceina. En la prueba 17, prueba de crecimiento aerobio-anaerobio en caldo tioglicolato se observo que la bacteria
solo crecio en el fondo del tubo, pero debido a que la bacteria se obtuvo en un principio de una fruta al aire libre se
determina que es anaerobio facultativo. En la prueba 18, prueba para reduccion de nitratos, al adicionar el reactivo de
Griess A tomo un color rosa, luego de que se adiciono el reactivo de Griess B, inmediatamente tomo un color amarillo
con turbiedad por muchos puntos negros, con lo que se concluye que es positiva la prueba, y que la bacteria puede
reducir nitratos a nitritos. La prueba 19, 20 y 21 son prueba de NaCl al 1%, 5% y 20% respectivamente, realizadas para
determinar el crecimiento de bacterias en medio alcalino, se observo que al transcurrir 24 horas los tres tubos se
encuentran trasparentes y no hubo crecimiento de bacterias, lo que indica que las pruebas son negativas.

En la prueba 22, prueba de antibiograma con agar Müeller Hinton, donde se pusieron sensidiscos antibióticos encima de
la siembra masiva de la bacteria se observo que primero, el antibiotico NV-5 tenia un halo de inhibicion muy ligero,
segundo, el MY no impidio el desarrollo de las bacterias alrrededor, tercero, el K-30 tenia un halo de inhibicion leve, y
cuarto, el FOS-50 fue el antibiotico con mas efecto en la bacteria ya que tenia un halo de inhibicion bastante notorio. En
la prueba 23, de hidrolisis de la gelatina, el agar seguia siendo solido al cabo de 24 horas, por lo tanto se concluye que la
prueba es negativa y que la bacteria no tiene capacidad de producir gelatinasas. Finalmente en la prueba 24, prueba de
desoxirribonucleasa (DNAsa) se evidencio despued ed realizarse la inundacion con HCL 0.1M que no se formaron halos
trasparentes alrrededor del crecimiento bacteriano (lo que se esperaria si la prueba fuera positiva), y en si no hubo
ningun cambio por lo tanto la prueba es negativa, concluyendo que la bacteria no es capaz de degradar el DNA.

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CUESTIONARIO
Mencione y explique tres sistemas comerciales, manuales o automatizados, que sean
utilizados para la identificación de bacterias. Explique su uso e interpretación.

Métodos fenotípicos

Está clasificado como un método comercial y está basado en las características

fenotípicas es decir se hace por simple observación de características microscópicas,
Características macroscópicas, Cultivo, Pruebas bioquímicas y Pruebas basadas en la
resistencia a ciertas substancias. Este método permite el aislamiento del
microorganismo implicado, su identificación, el estudio de sensibilidad a los
antimicrobianos y facilita la aplicación de marcadores epidemiológicos. Este método
permite realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana posteriores o en
paralelo a la identificación, además se puede realizar una cuantificación de la especie
evaluada. El plus de este método es que es económico puesto que su realización y
coste los hace más asequibles.

Métodos genéticos- hibridaciones DNA-DNA

Método no dependiente del cultivo bacteriano para identificación de especies;

mediante la detección de fragmentos cortos de DNA marcados (sondas) tras su enlace
a moléculas de DNA complementarias en una muestra. Se lo utiliza para la
identificación y cuantificación de los microorganismos. Este método posee la
capacidad para evaluar mayor número de especies y muestras, permite la
identificación de especies no cultivables, su desventaja radica es que es poco sensible
y especificidad comparadas con otras pruebas genéticas.

Métodos genéticos – PCR

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Método no dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies;

mediante la amplificación de porciones específicas de DNA en una muestra. Posee
mayor sensibilidad y permite la identificación de especies no cultivables. Esta prueba
no permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo con
la identificación.

Definición tentativa de la bacteria según el manual de Bergey

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CONCLUSIÓN

Se puede concluir por medio de los resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas
realizadas en el laboratorio y utilizando los diagramas de flujo para identificación
bacteriana del Manual de Bacteriología Determinativa de Bergey, que la bacteria
estudiada puede ser definida tentativamente como“Klebsiellapneumoniae”

REFERENCIAS

 http://revistabioanalisis.com/arxius/notas/crZD3xk7.pdf
(14 de abril del 2015, martes a las 3:56 pm)
 http://www.uiweb.uidaho.edu/micro_biology/250/IDFlowcharts.pdf

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