Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
La tinción propuesta por el médico Danés Christian Gram en 1984, es una de las tinciones
diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de 24
horas en Gram positivas y Gram negativas. El fundamento radica en la diferente estructura
de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de
peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de
peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacárida externa. (ver figura N° 1).
Gram + Gram -
Peptidoglicano Peptidoglicano
Tras la tinción con el colorante primario (cristal violeta), se tiñe por igual a todas las
bacterias; pero la combinación con el colorante es más permanente en los Gram positivos.
Para establecer la diferencia entre estos dos grupos (ver figura Nº 2), se aplica un disolvente
del colorante primario que no tiene efecto sobre el grupo de microorganismos que lo retienen
firmemente; pero lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo
tanto completamente decolorados. En estas circunstancias, sería muy difícil su observación
por lo que es preciso tratarlos con otro colorante, como la safranina. Este colorante no
modifica el color de los microorganismos que habían retenido el color primario; pero tiñe a
los microorganismos decolorados.
Otras tinciones que permiten mayor información son la negativa y la selectiva. La tinción
negativa facilita las observaciones de la morfología y tamaño de las bacterias sin alteración
por efecto del calor así, como de estructuras especiales, como la capsula de algunas especies
bacterianas. La capsula también llamada: Glicocálix es una estructura externa a la célula,
formada de polisacáridos o polipéptidos, que confiere de protección a las bacterias contra la
desecación y fagocitosis.
La extensión sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla de las bacterias con
tinta china o nigrosina, permite observar en el microscopio estructuras especiales como las
capsulas, que aparecen como una zona clara que rodea la célula bacteriana en un fondo
oscuro.
Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como las endosporas
de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su presencia, forma y localización son de
importante criterio para su clasificación taxonómica.
Además, debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas especies son
microorganismos patógenos de gran toxicidad, su detección en microbiología alimentaria y
médica adquiere gran interés.
OBJETIVOS
MATERIALES
Probeta de 100 mL
Beacker de 100 mL
Mecheros bunsen
Microscopio compuesto
Portaobjetos
Cristal violeta
Safranina
Lugol
Alcohol-acetona
Tinta china
Fenol o metanol al 95%
Aceite de inmersión
PROCEDIMIENTO
4. Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar
enfriar el portaobjetos entre los pases. En este caso hay que tener mucha precaución
de no calentar demasiado el portaobjeto, pues las células pueden deformarse o
romperse.
5. Con metanol: Añadir unas gotas de metanol sobre la extensión completamente seca.
Golpear el portaobjetos por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar
de inmediato el exceso de metanol. Esperar a que el metanol se evapore
completamente.
Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al
microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tinción.
Método convencional
PROCEDIMIENTO:
El docente proporcionará a los alumnos cultivos sólidos de: Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis.
El estudiante preparará los frotis de cada cultivo solido, para realizar la Tinción de Gram.
a) Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos; colocar junto
una gota del cultivo liquido de Klebsiella sp. (Figura N°3). Si se trata de un cultivo solido,
hacer una suspensión del microorganismo en una gota de agua destilada y mezclar
cuidadosamente con la tinta china.
c) Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa
fina de mezcla.
- Observación al microscopio:
- Resultados:
Escherichia coli
Forma
Clasificación
Staphylococcus aureus
Forma
Clasificación
Pseudomonas aeruginosa
Forma
Clasificación
Enterococcus faecalis
Forma
Clasificación
CUESTIONARIO
1. Explique en forma completa la teoría que explica la tinción de Gram. Investigue otros
ejemplos de tinción diferencial.