MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

METODOS GENERALES DE ANALISIS

MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS. II.

ANALISIS DE LOS MICROORGANISMOS TOTALES

Recuento  de  microorganismos  viables  totales.  Métodos  físicos  para  la  detección  de  microorganismos.  Métodos
químicos  para  la  detección  de  microorganismos.  Métodos  inmunológicos.  Exámen  de  superficies.  Recuentos  de
mohos y levaduras.

1. Recuento de microorganismos viables totales. (Muestras líquidas u homogeneizadas).

­  Se  trata  de  conocer  el  número  total  de  microorganismos  presentes  en  el  alimento.  Este
número no guarda relación con el de microorganismos patógenos por lo que no puede usarse
como  índice  de  su  presencia  y  sólo  debe  considerarse  un  indicador  de  las  características
higiénicas generales del alimento.

­  Dependiendo  de  las  características  del  medio  utilizado  (medio  rico,  medio  limitado  en
nutrientes para medida de la flora no láctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de
incubación  (mesófilos,  psicrófilos)  los  microorganismos  analizados  serán  miembros  de
poblaciones  diferentes.  En  general  se  investiga  la  presencia  de  microorganismos  aerobios  o
aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados
al vacío), puede ser de interés hacer recuentos de anaerobios totales.

­ Se han desarrollado técnicas que hacen posible la automatización del proceso.

­ Hay cuatro técnicas biológicas básicas técnicas de recuento de viables:.

1.­ Contaje en Placa Standard (Standard Plate Count).

2.­ Determinación del número más probable.

3.­ Métodos basados en la reducción de colorantes por viables.

4.­ Contaje microscópico directo.

1.­  Contaje  de  Placa:  Consiste  en  el  plaqueo  de  una  muestra  de  volumen  conocido  del
alimento que se analiza. El resultado es función de una serie de factores como son el método
de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las características del medio de
cultivo.  Los  cultivos  pueden  hacerse  tanto  en  masa  como  en  superficie,  aunque  hay  que
considerar  que  los  cultivos  en  masa  son  letales  para  la  flora  psicotrofa.  Cada  bacteria  viable
formará  una  colonia,  el  plaqueo  puede  hacerse  en  una  placa  normal  o  por  medio  de  un
plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente más diluídas de la
muestra.

2.­ Filtros de membrana: utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son filtros con un
poro  de  0,45  mm  que  retienen  las  bacterias.  Se  filtra  un  volumen  dado  y  se  coloca  el  filtro
sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para
epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar
con naranja de acridina que tiñe específicamente los ácidos nucleicos).
3.­ Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en ingñlés de Direct Epifluorescence  Filter
Technique (técnica deepifluorescencia directa en filtro). En esta técnica las bacterias se filtran
para  retenerlas  en  una  membrana  apropiada  que  posteriormente  se  trata  con  un  agente
fluorescente  (como  la  naranja  de  acridina)  para  teñir  las  células  bacterianas  (se  somete  el
filtrado  a  un  tratamiento  previo  con  detergentes  para  destruir  las  células  somáticas).  La
detección de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopía de fluorescencia o por
cualquier otro método de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se
incuban para producir colonias que son más fácilmente dtectables.

4. Contaje de microcolonias al microscopio: Se añade un pequeño volumen de agar­cultivo a
un porta y se incuba para seguir la formación de microcolonias al microscopio.

5.­ Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solución madre) y se depositan gotitas
de  10  ml  en  una  placa  Petri  (gotitas  de  cultivo  +  agar).  Se  examina  el  crecimiento  de  las
colonias en las gotitas tras la incubación.

6.­  Films  secos  (Petrifilm):  Son  películas  deshidratadas  de  medios  de  cultivos  generales  o
selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubación
se hace el recuento.

7.­ Método del número más probable: Basado en series de diluciones y cálculo estadístico del
número de bacterias presentes en las diluciones más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. El
método es popular aunque poco exácto.

8.­  Métodos  basados  en  la  reducción  de  colorantes:  Usando  azul  de  metileno  o  resazurina.
Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado
en medios líquidos (lácteos).

9.­ Tubos rodantes: son tubos herméticamente cerrados en los que haciéndolos girar se forma
una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios.

10.­  Contaje  microscópico  directo:  Usando  cámaras  de  cuenta,  se  coloca  un  volumen
determinado y se recuentan las bacterias.

­­­­­­­­­­­­­­­­ X ­­­­­­­­­­­­­­­­

­  Además  de  las  técnicas  de  recuento  basadas  en  la  formación  de  colonias  observable
(técnicas  biológicas)  hay  una  serie  de  procedimientos  de  recuento  basado  en  técnicas
químicas, físicas e inmunológicas.

2. Métodos físicos para la detención de microorganismos.

A) Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. En un cultivo los
microorganismos  alteran  las  substratos  cambiando  su  conductividad  eléctrica  y  esto  varía  la
impedancia. El método se basa en detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos
se  expresa  como  función  del  tiempo  que  tarda  el  cultivo  en  alcanzar  unos  valores  de
impedancia correspondientes a 106 ­ 107 células por ml­1. (IDT: Imdepedance Detection Time).
Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento homogéneo sin «escalones».

B)  Microcalorimetria:  Estudio  de  los  pequeños  cambios  de  calor  producidos  como
consecuencia  del  antabolismo  de  nutrientes.  Los  diferentes  tipos  de  microorganismos
metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello, se ha usado la microcalorimetría para
poder identificar las especies presentes en un alimento: usando un medio de cultivo con una
composición  definida  de  azúcares  pueden  llegar  a  identificarse  diferentes  tipos  de  bacterias
lácticas  mediante  los  termogramas  de  su  metabolización  de  los  azúcares  presentes  en  el
medio.

C) Citometria de flujo: Método basado en hacer pasar una a una las células de una suspensión
por  un  sistema  de  detección;  este  sistema  puede  contener  un  detector  capaz  de  medir
diferentes parámetros (diferentes tipos de fluorescencia, absobancia, dispersión de luz, etc.) lo
que permite identificar las bacterias durante su paso por el detector.

3. Métodos químicos de detección de microorganismos.

A) Nucleasa Termoestable: S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapidez y
en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicación. La endonucleasa puede
detectarse  experimentalmente  como  un  índice  de  la  presencia  de  S.  aureus  incluso  en
concentraciones demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de
enterotoxina.

B)  Lisado  de  Limulus:  Usado  para  detección  de  endotoxinas  (derivadas  del  lipopolisacárido
LPS de las bacterias Gram negativas). Se basa en la aglutinación de extractos de amebocito
de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de
LPS. Puede detectar 300 células de E. coli. El método detecta células viables y no­viables. Es
muy rápido.

C)  Sondas  de  ácidos  nucleicos:  Sirven  para  identificar  microorganismo  desconocidos  por
medio de Southern.

D)  PCR:  Método  para  detectar  número  extremadamente  bajos  de  microorganismos  con  una
cierta rapidez basado de la producción de copias de genes específicos de un microorganismo
en cuestión.

E) Medida de ATP­:  Se  detecta  la  presencia  de  ATP  usando  luciferasa,  aunque  hay  algunos
problemas experimentales que hacen que la técnica sea controvertida.

F)  Radiometria:  Medida  de  la  transformación  de  un  substrato  con  14C  en  14CO2:  el  tiempo
necesario  para  detectar  el  14CO2  es  inversamente  proporcional  a  la  cantidad  de
microorganismos presente.

G) Substratos Fluoro y Cromogénicos: Se añaden como aditivos a los medios de cultivos para
facilitar y acelerar la detección de los microorganismos.

4. Métodos inmunológicos.

Normalmente  se  usan  antisueros  que  detectan  flagelos  (responsables  de  las  formas  móviles
de Salmonella y otras bacterias)
A) Anticuerpo fluorescentes: Se utiliza anticuerpo marcado con una molécula fluorescente o un
segundo  anticuerpo  que  reconozca  el  primero.  Se  pueden  usar  antisueros  complejos  en  el
primer  anticuerpo  y  de  esta  forma  detectar  cualquier  tipo  de  Salmonella  sin  necesidad  de
aislarlas. El método también se ha usado para Clostridios aunque su mayor aplicación ha sido
en Salmonella donde es muy conveniente por la sensibilidad y rapidez.

B)  Serologia  de  enriquecimiento:  En  este  procedimiento  especialmente  desarrollado  para  la
detección  de  Salmonella,  el  antisuero  no  se  añade  al  alimento  sino  que  se  efectúa  un  paso
previo de enriquecimiento del cultivo y de selección para evitar falsos positivos.

C) Test 1 ­ 2 de Salmonella: Sistema con dos cámaras de agar blando. Una de las cámaras (la
de siembra) contiene un medio selectivo para Salmonella, las bacterias móviles de este género
atraviesan  la  cámara  selectiva  y  pasan  a  la  no  selectiva  pero  portadora  de  un  anticuerpo
específico por lo que se forma una banda de aglutinación cuando entre Salmonella.

D)  Radioinmunoensayo:  se  basa  en  el  marcaje  con  un  radioisótopo  de  un  antígeno
determinado  (toxina  producida  por  una  bactería  patógena)  y  su  posterior  detección  por
anticuerpos específicos fijados sobre un soporte sólido.

E) ELISA: El método es similar al radioinmunoensayo: el antígeno se fija en un soporte sólido,
se  trata  con  el  antisuero  correspondiente  y  la  interacción  se  detecta  mediante  una  actividad
marcadora  (peroxidesa)  unida  al  anticuerpo  en  cuestión  o  a  un  segundo  anticuerpo  de
revelado.

El  método  se  ha  usado  para  detección  de  Salmonellas.  Toxinas  de  S  aureus,  micotoxinas,
toxinas de C. botulinum, enterotoxinas de E. coli.

F) Difusión en gel: Método de Ouchterlony para detección de antígenos.

5. Examen de superficies.

­  Métodos  dirigidos  a  detectar  y  medir  los  números  de  microorganismos  presentes  en

superficies contaminadas.

­  Algunas  veces  es  necesario  añadir  agentes  neutralizantes  para  eliminar  el  efecto  de
detergentes que han sido utilizados para limpiar la superficie.

­  El  método  más  clásico  de  obtención  de  muestra  es  el  uso  de  torundas  de  algodón  o  de
alginato cálcico. Las muestras se recogen en seco o en húmedo y se depositan sobre medios
de cultivo líquido (generales o de enriquecimiento).

­ En algunos casos se usan otros metodos como el contacto con placa o la jeringa de agar.

6. Recuento de mohos y levaduras.

Se realiza o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a 22ºC o bien mediante
diluciones  sucesivas  y  siembra  en  placa  en  superficie.  Es  necesario  añadir  agentes
antibacterianos  al  medio  de  cultivo  para  evitar  el  crecimiento  de  las  bacterias,  que  es  más
rápido que el de los mohos.
 

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