Práctica 3: Métodos de

cuantificación de
proteína.
Georgina Mitjans
David Andreu
Tomás Moliner
Alex Hionides
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
● Cuantificar la concentración de proteína de una muestra problema.
Cómo? Mediante los métodos de Bradford y de Lowry
Métodos Características
Lowry Método colorimétrico de análisis cuantitativo que
consiste en dos reacciones:
1. Reacció n de Biuret
2. Reacció n de Folin: caracterı́stica de los grupos
–OH reductores de los aminoá cidos tirosina y
triptó fano que, junto con los complejos Cu+2,
reducen el reactivo de Folin generando un color
azul.
Bradford Método colorimétrico de análisis cuantitativo,
basado en el cambio de color del colorante
Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a
diferentes concentraciones de proteínas.
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● Calcular el coeficiente de extinción molar a A280 de la proteína
patrón, y utilizarlo para calcular la concentración de la muestra
problema.
ε es la absortividad molar (L mol-1cm-1 )
- Ley de Beer A=εbc c concentración (mol/L )
b longitud del camino ó ptico (cm)
● Comprobar las compatibilidades de los métodos de Bradford y de
Lowry con detergentes y agentes reductores:
- Detergentes: Tween 20, del SDS
- Agente reductor: β-mercaptoetanol
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MÉTODO DE LOWRY
Reactivo C
Añadir
Reactivo Folin-Ciocalteu 1X
Longitud de onda a 750nm
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MÉTODO DE BRADFORD
Unión colorante azul de Coomasie a proteína
Longitud de onda a 595nm
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LEY LAMBERT-BEER
A= ε b c
Coeficiente de extinción molar (ε )
ε (M-1 · cm-1 )
Longitud de onda a 280nm
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 Grupo 2
RESULTADOS BRADFORD
Grupo 3
Grupo 1 Media = 0,588 mg/ml
Media = 0,50 mg/ml
Media = 0,577 mg/m 7
 Grupo 2
RESULTADOS LOWRY
Grupo 3
Media = 0,596 mg/ml
Grupo 1
Media = 0,666 mg/ml
Media = 0,619 mg/ml
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 RESULTADOS ABSORBANCIA 280 NM
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Fórmula Lambert-Beer: A = ε c I Fórmula Lambert-Beer: A = ε c I Fórmula Lambert-Beer: A = ε c I
1) Absorbancia (A): 0.083 nm 1) Absorbancia (A): 0.086 nm 1) Absorbancia (A): 0.088nm
2) Concentración (c): 0.5 µg/µl 2) Concentración (c): 0.5 µg/µl 2) Concentración (c): 0.5 µg/µl
3) Longitud Cubeta (l): 1 cm 3) Longitud Cubeta (l): 1 cm 3) Longitud Cubeta (l): 1 cm
ε = 54433,24 (M-1·cm-1) ε = 57338,3 (M-1·cm-1) ε = 58416,16 (M-1· cm-1)
Cuantificación total: 0,51 g/l Cuantificación total: 0,42 g/l Cuantificación total: 0,43 g/l
Valor de ε teórico : 43824 L/mol·cm
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 RESULTADOS COMPATIBILIDAD
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Tubo Abs Tubo Abs Tubo Abs
Tween 20 1,534 Tween 20 1,252 Tween 20 1,525
Bradford SDS 0,664 SDS 1,229 SDS 0,944
β-mercaptoetanol 1,050 β-mercaptoetanol 1,399 β-mercaptoetanol 0,775
H2O Milli-Q 0,940 H2O Milli-Q 1,207 H2O Milli-Q 0,782
Tubo Abs Tubo Abs Tubo Abs
Tween 20 1,906 Tween 20 1,952 Tween 20 1,555
Lowry
SDS 1,433 SDS 1,076 SDS 0,524
β-mercaptoetanol Superior β-mercaptoetanol 1,239 β-mercaptoetanol Superior
LD LD
H2O Milli-Q 1,389 H2O Milli-Q 1,274 H2O Milli-Q 0,541
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CONCLUSIONES
● Con los tres métodos de cuantificación hemos logrado obtener un resultado parecido
para la concentración de la muestra problema.
● Sobre el método de Bradford afectan los detergentes (Twin20 y SDS) pero no afectan
los agentes reductores.
● Sobre el método de Lowry afectan el Twin20 y el β-mercaptoetanol. El SDS no afecta
por debajo de un 0,5%.
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 CONCLUSIONES
Absorción UV Bradford Lowry
Límite de detección 0,1-100 mg/ml 20-2000 mg/ml 10-1000 mg/ml
Ventajas - Volumen pequeño de - Compatible con - Alta sensibilidad y
muestra agentes reductores precisión
- Rápido y barato - Rápido
Desventajas - Detergentes, agentes - Incompatible con - Incompatible con
desnaturalizantes y detergentes detergentes y
nucleótidos producen - El complejo puede agentes
interferencias. unirse a celdas de densaturalizantes
- Variablilidad entre cuarzo. (SDS hasta un 0,5%)
distintas proteínas. - Proteínas superiores - Largo
a 3 KDa.
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BIBLIOGRAFÍA
● INTRODUCTION TO PRACTICAL BIOCHEMISTRY. György Hegyi, József Kardos, Mihály
Kovács, András Málnási-Csizmadia, László Nyitray, Gábor Pál, László Radnai, Attila
Reményi, István Venekei. 2013 Eötvös Loránd University.
http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/IntroductionToPracticalBiochemi
stry/index.html
● LABOME Protein Quantitation Methods
http://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html
● Thermofisher: Chemistry of Protein Assays.
https://www.thermofisher.com/es/en/home/life-science/protein-biology/protein-biolog
y-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/chemistry-
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● Protocolo de prácticas Laboratorio 3: Bioquímica 2017
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