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    Prueba bioquímica ureasa

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    . @e CAPITULO. = Ve San, Prueba de ureasa |. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar la urea en dos motéculas de amonfaco por la accién de la enima ureasa, con Ia resultante alcalinidad. Ml, OBJETIVO (Véanse también caps. 44 y 45.) ‘A. Desde un principio, esta actividad enzimstica fue caracteristica de todas las especies de Proteus y se la uiiliz6 sobre todo para diferenciar los microorganismos Proteus répidamente ureasa positivos de otros riembeos de la familia Enterobacteriaceae; los otros géneros pueden dar una reaccisn positiva tarda, 1. Proteus (por lo comin + y répida) 2. inconstans: wreasa ~ P mira: wreasa + P.myrofactens: ease + B,penneri: ureasa = PB retger wreasa + Proulgaris veeasa + 2. Providencia (V, variable; por lo comin -) +B heimbachae:ureasa ~ P. stuart: wreasa V P rusian: urease ~ 3. Morganella morganii de los biogrupos | y 2: ureasa + débil BB. Ayudar a la diferenciacion de especies 1. Actinobacillus seminis (~) de otras especies de Actinobacillus (+) aisladas con més frecuencia 2. Bartonella felis (+) de otras especies de Bartonella (~) aisladas con frecuencia 3. Bordetella avium (~) de B. bronchiseptica (+), B. parapertussis y B. pertussis (+). 4, Pasteurella aerogenes (+), P. dagmatis (+), P.lymphangitidis (+), P. mairii (+) y P. pneumotropi- ca (+) de otras especies de Pasteurella 5. Ureasa de Christensen a. Enterobacter dissolvens (1), E. gergoviae (+), E. hormaechae (V, por lo domdn +), B. cloacae (V)y E. absuriae (V, por lo comtin +) de otras especies de Enterobacter (~). b. Klebsiella ornthinolytica (+), K. oxytoca (+), K. planticola (+) y K. pneumoniae suesp. pneu- moniae (+) de otras especies de Klebsiella (-). Otigelta ureolyica (+) de O. urethralis (-). Weeksella zoohelcum (+) de W. virosa (-) Cepas T de Mycoplasma urealyricum (4); los micaplasmas T son Jos fnicos micoplasmas conoci- dos que contienen ureasa (véase Seccién VIII A), 9. Peptastreptococcus tetradius (+), P.lactolyticus y P, prevoti V, por lo comin ~) de otras especies de Peptostreptococeus~ aisladas con frecuencia. \ 398 Pruebas bioquimicas individuales a 10. Dentro del grupo viridans, Streptococcus vestibularis (+) y S. salivarius (V, pot lo comén +) de otros Streptococcus viridans (-). 11. Especies humanas de Haemophilus, H. influenzae de los biotipos I I, I, 1V (4), H. influenzae del biogrupo aegyptius (+), H. parainfluenzae de los biotipos Il, I, IV, VIL (+), H. haemolyticus (+), HE paracuniculus (+), H. parahaemolyticus (+) y H. paraphrophaemolyticus (+) de otras especies de Haemophilus C. Ayudar a Ia identificacién de 1. Vibrio parahaemolyticus wreasa variable, por lo comin + (25). 2. Helicobacter cinaedi répidamente ureasa + (20, 24, 32). 3. Especies de Mycobacterium (V); (véase Seccién VIILB). 4. Especies de Cryptococcus (levaduras) (+, 1-2 dtas) (35). I, BIOQUIMICA El sustrato urea, una diamida del dcido carbénico, a menudo se designa como una carbamida (8, 29). To- das les amidas, f | son hidrolizadas con fecilidad (30), La urea es hidrolizadf por una enzima cabo espectfica, la ureasa (0 urea amidohidrolasa), para dar dos moléculas de amonfaco. En soluci6n, la urea se hidrolizaa earbonato de amonio como producto final (8, 29) HN, DEO + 2HOH AEE. CO, + HO + 2NH, => MyCO> HN Diéxido de Amoniaco Carbonato Urea ‘eroono deamon La ureasa es una importante enzima microbiana relacionada con la desgomposicién de los compues- tos orgénicos (21). Las enzimas bacterianas se clasifican como constituivas o-adaptativas. Una enzima adaptativa oinducida se produce solo cuando su sustrato espectfico esté presente (7), Laureasa es consi- derada constitutiva debido a que es sintetizada por ciertas bacterias sin tomar en consideraci6n la presen- cia o la eusencia de su sustrato la urea (7,46). Existen dos ampliasdivisiones de enzimas:) hidrolasas, ue estén relacionadas con la hidrlisis (agre- gado de agua) de ésteres, hidratos de carbono, proteinas y amidas, y b) aquellas relacionadas con diver- sas reacciones de oxidacidn-reduccién (17) La ureasa se clasfiea Gomo una amidasa, ya que eataliza la hidrélisis de las amidas (8). Oppenheimer (31) incluyé entre las amidasas a todas las enzimas que pue- den romper los puentes entre el nitrégeno y el cazbono por hidrdlsis. HN. Ureasa (una amidasa) Enel caso dela ureasa, el nitrégeno es disociad como amoniaco (NH) (31) La ureasa (27, 44) aca en tos compuestos a nivel de los puentes C-N, excepto en aquellos que contienen pucntespeptidicos (27). El pH dprimo para la actividad de ln ureasa es de 7 (22. IV. MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS ‘A. Caldo con urea de Rustigian y Stuart, pH 6,8 (1, 13, 15, 40) 1, Ingredientes Fosfato monopotisico, KH,PO, Fosfato disddico, Nayl1PO, (bulfer de Sorensen) Exwacto de levadura Urea, de alta pureza, 20% Rojo fenol Agus desionizada Prueba de ureasa 399 2. Indicador de pH: rojo fenol a. Acido: color amarillo, pH 6.8. i. Alcalino: color rosado rojo, pH 8,4 ¢. Medio no inoculado: pH 6,8, color amarillo-naranja, 3. Productos comerciales disponibles: BBL, “urease test broth” (caldo para la prueba de uressa) (1); Difeo, “urea broth” (caldo con urea) (13). 4. Método de preparacién 1. Pesar la cantidad con precisién segiin las directivas del rétulo. b. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. . No calentar la soluci6n; con el calor, la urea se descompone. 5. Método recomendado de esterlizacién a. Filuacion (1) Filtros de membrana Millipore. (2) Membranas: 0,45 jim de diémetro de poro. b. Demanera aséptica, fraccionar alrededor de 3 mL. (8) por tubo estéril (13 x 100 mm) €. Siel medio se prepara e inocula de inmediato, pueden obtenerse resultados confiables sin fil- tracién (1). 4, El medio basal puede ser reidratado en 900 mL de agua destilada o desmineralizada y esterli- zado en autoclave a 121°C, 15 tb, durante 15 min. Cuando se enfrfa, agregar 100 mL de una so- Iuci6n al 20% de urea estéril(iltrada) y el caldo se fracciona en tubos (3 ml. por tubo estéril de 13x 100mm) (15). 6. Enfriar antes de usar y refrigerar para la conservaci6n (4-10°C).. 7. Inoculacién a. Crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h, agar con hierro de Kligler (KIA) u ‘tro cultivo apropiado. b. Indculo denso: 3 ansadas (ansa de 2 mm) (1, 15, 40). ©. Agitar el tubo con suavidad para,suspender las bacterias (40), 8. Incubacién : a. Estufa o bafio de agua a 35°C (15, 40). 'b. Observar las reacciones después de 8, 12, 24 y 48 h de incubactén, . Las modificaciones en la temperatura cambia la velocidad de produccién de la ureasa (40). Elcaldo con urea de Rustigian y Stuart es un medio altamente tamponado en el que la deteccién de la uti- Tizacién de la urea después de 48 h o menos de incubaci6n estaba restringida en un principio a la produc- ci6n de ureasa sélo por las especies de Proteus (40). En la actualidad el medio brinda resultados positi- vos para la mayor parte de Proteus, Morganelta y unas pocas cepas de Providencia stuartii (5). Otros microorganismos, en particular las especies de Enterobacter pueden atacar la urea de manera lenta y dé- bil, pero la actividad de la ureasa en el caldo de Rustigian y Stuart no se detecta dentro de las 48 h de in eubacién (40). El extracto de levadura incorporado en el medio proporciona los factores de crecimiento requeridos por los géneros fuertemente ureasa positives (incluidos con anterioridad en un Snico género, Proteus); e5- {os microorganismos pueden utilizar el nitrégeno de la urea, si bien otros microorganismos productores, de ureasa requieren una fuente de nitrégeno adicional (12). El indicador de iones hidrégeno rojo fenol muestra la produceién de ureasa por los miembros de la subfamilia Proteeae mediante la demostraciOn disminuida de la concentracién de iones hidrégeno a cau- sa de la formacién de dos moléculas de amonfaco (NH). B, Agar con urea de Christensen, pH 6,8 (1, 10, 13, 15) 1. Ingredientes Peptona 1g Coruro de sodio, NaCl Se osfato monopotisico, KH,PO, 2g Glucose (dextrosa), 0, 1% ir Urea, 20%, méxima pureza 208 Rojo fenel| 0012 Agar 15°20 g ‘Agua desionizada 1.000 ma. 400 Pruebas bioquimicas individuales 2. Indicador de pH: rojo fenol a. Acido: color amarillo, pH 6,8. b. Alealino: color rosado rojo, pH 8.4. e. Medio no inoculado: pH 6,8, color amarillo a color piel. 3. Productos comerciales disponibles a. BBL y Difeo, Urea agar base (1, 13) '. BBL: urea agar base (1). 4, Método de preparacién y esterilizaci6n (1, 13) a, Base de urea deshidratada (29%) (1) Pesar con precisién 29 g de la base deshidratada y disolver en 100 mL de agua destilada 0 desmineralizada. (2) No calentar la solucién. La urea se descompone cuando se la expone al calor. G) Esterilizar por filtros de membrana Millipore, 045 um de didmetro de poro. b Agar (1) Disolver 15 g de agar en 900 mL de agua destilada o desmineralizada ) Avtoclave: 121°C, 15 1b, 15 min. G) Bnfriar a 50°C. cc. Agregar 100 mL de urea base estérl de manera aséptica a 900 mi de la mezela de agar y agua: Ja concentracién final de fa urea es de 10%. 4. Fraccionar el medio de manera aséptica en tubos estériles, alrededor de 4 -5 mi. por tubo de 13x 100 mm (pico de flauta extenso, fondo corto) (1, 13, 15). ¢. Este medio puede utilizarse en la forma liquda si se desea (15). 5. Permitir que el medio se enfrfe en posicién inclinada, 6. Enftiar antes de usar y refrigerar para la conservacién (4-10°C). 7. Inoculacién a. Crecimiento proveniente de un cultivo pro de 18 a 24 h, agar con hierro de Kligler (KIA) u otro cultivo apropiado. . Inéculo denso (5, 10, 15); estriar toda la superficie del pico de flauta, No panzar el fondo: sirve como control del color (1). Enel caso de especies de Brucella mantener a temperatura ambiente (22-25°C) 2 h, lego in- cubar con 2-10% de CO, (4). 8, Incubacién: 35°C, 6 y 24 h y todos los dfas sucesivos durante 6 dis (11). Pueden ser necesarios perfodos més prolongados. poe FE agar con urea de Christensen se utiliza para detectar Ia actividad de ureasa por todos los microorga- nismos Proteus répidamente ureasa positivos. Este medio también detecta la actividad de ureasa en las es- pecies de Enterobacter y en otros miembros de la familia Enterobacteriaceae (10) que exhiben una reaceién de ureasa tarda. Las especies de Enterobacter pueden utilizar la urea como vinica fuente de nitr6geno (43); estos microorganismos pueden perder esta capacidad, pero pueden retener 0 volver a obtener su capacidad, para hidrotizar la rea (10). El medio de Christensen elimina la necesidad del microorganismo de utilizar Jos derivados de la urea (amoniaco) como su tnica fuente de nitrégeno y también exhiben actividad de urea- sa en microorganistos con requerimientos de nitr§geno ms complejos (10). El medio con urea de Rusti- gian y Stuart (34) posee tan pocos nutrients que si un microorganismo no puede utilizar el amoniaco, debe basarse en el extract de levadura en el medio para obtener sus fuentes de nitrSgeno y carbono. El medio de Christensen elimina la necesidad de que un microorganismo utilice el amonfaco como su \inica fuente de nitrégeno (10) y permite la deteccién de la hidrélisis de la urea por otros miembros de la familia Enterobacteriaceae cuya actividad de ureasa es leve y tardfa (10). Esto se cumple por a) el agre- gado de glucosa al medio, b) la disminucién de la concentracién de peptona y c) por la disminucién del sistema buffer; el medio con menos buffer detecta una cantidad més pequefia de dlcali (16). Todos los jembros de la familia Enterobacteriaceae por definici6n fermentan la ghicosa y la acidez producida ac- ta contra laalcalinidad generada por la descomposici6n de la peptona; en consecuencia, a glucosa cons- tituye una fuente de energfa, dejando la peptona intacta (10). El agregado de glucosa elimina los posibles, resultados falsos negativos y estimula la actividad de ureasa en los microorganismos que hidrolizan la urea en forma lenta (10). La energfa proporcionada por la fermentacién de la glucosa estimula la ureasa incrementando la velocidad del metabolismo y la reproduccién celular (10). El agregado de la glucosa no incrementa de manera apreciable la actividad de ureasa en las especies de Proteus, lo que sugiere que su ureasa es constitutiva (10). Prueba de ureasa 401 En el medio de Christensen la velocidad de la hidrélisis de 1a urea diferencia los microorganismos de Ja subfamilia Proteeae que producen urease rdpidamente (especies de Proteus, M. morganii y algunos P.stuarti) de otros microorganismos treasa positivos. Los microorganismos Proteeae positvos exhiben una reaceién positiva en el pico de flauta dentro de 1-6 h de incubacién (10), con el color caracteristico r0- jo-vioieta (rosado rojo) que se extiende en todo el medio al término de las 6 h de incubacién. No es raro que estos microorganismos Protecae exhiban un resultado positive después de s6l0 30 min de incubacién; su ac- tividad de ureasa es aside rpida en el medio de Christensen. La magnitud y la velocidad de penetracin del coloren el medio es una medida de la actividad de ureasa del microorganismo (10). Todos los Proteeae urea- sa positivos dan una reaccién 4+ después de 24 h de incubacién. La velocidad de la hidréisis de la urea no difiere entre los microorganismos Proteeae positivos en el medio de Christensen (10). Los microorganismos ureasa positivo tardfos como las especies de Klebsiella 0 de Enterobacter vi- rian en su velocidad de hidrélisis de la urea. Algunos van de una reacci6n positiva I+ después de 6 h de incubacién a una reaccién 4+ después de 3-5 dfas de incubacién, mientras que otros exhiben sélo una reaccién 1+ después de 6 dias (10). C. Caldo con urea R (répida) (14) 1. Ingredientes; pH 6.9 Extracto de levadura 1g Urea 20 Fosfato monopotisico, KH,PO, 0091 g Fosfato disédico, NayHPO, 0.095 g Rojo fenol 001 Agua desionizada 1.000 mL. El fosfato monopotisico y el fosfato dissdico tienen baja capacidad buffer. 2. Esterilizacién: fitracin (Millipore); 0,45 jum de dimer de poro. 3. Fraccionar: 3 mL por tubo de boresiligato con tapa a rosca estril (13 x 100 mm). 4. Conservacién: reftigerador, 2-8°C; vercimiento méximo, 48 h; se recomienda utilizar el mismo dia de su preparaci6n (14), 5. Indculo: 3 ansadas (ansa de 2 mm) (1, 15,40). 6. Incubacién: en aerobiosis, 35°C, bafo de agua; observara los 10 min, a 1 hy a 2h V. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD A. Positivo (+); répido e intenso Proteus mirabilis ATCC 29906 Proteus vulgaris ATCC 13315 B. Positivo (+); débil Klebsiella pnewnoniae subesp. pneumoniae ATCC 13883, C. Negativo (~) Escherichia coli ATCC AITIS No inoculado Vi. RESULTADOS ‘Véanse figuras 39-1 a 39-4 (Apéndice 1) para los resultados fotograficos en color. ‘Vil. INTERPRETACION ‘A. Caldo con urea de Stuart I. Positive (+) ‘8. Color r0sa-rojo intenso en todo el caldo ». Ciertas especies de Proteeae: 402 Pruebas bioquimicas indivicuales P mirabilis B myxofaciens B pennerl 2 retgeri (ahora Provdenciarenger) B vulgare ‘Me morgant! de los biogropos 1 y 2 Pocas cepas de P stuart 2. Negativo (~): sin cambios de color (amasillo-naranje). B. Agar con urea de Christensen 1. Positivo (+): color rosa-rojo(rojo-violeta)intenso en el pico de flauta. El color puede penetrar en interior del agar; la extensién del color indica la velocidad de la hidedlisis de la urea 2) 4, Grado de hidrolsis (1) 445 todo el bo rosa-roj. (2) 2+; pico de lauta rosa, fondo sin cambios. G) + debit; Ia parte superior del pico de Mlauta rosa, el resto sin cambios. ', Positivo répido: 1-6 h para todos los microorganismos Proteeae positivs. . Positivo tardfo: 24 h a6 dfas de incubacién 0 mas ‘Algunas cepas de Klebsiella ‘Algunas cepas de Enterobacter ‘Algunas cepas de Citrobacter Bacterias dstintas de las pertenecientes a la familia Emterobacteriaceae 2. ‘Negativo (-): sin cambios de color (color piel « amarillo palido). C. Caldo con urea R: positivo (#), color cereza (pirpurarojzo) Vill. MEDIOS DE PRUEBA ALTERNATIVOS A. Caldo U-9 (medio para la prueba de ureasa con color) 1. Fonmulacién de Shepard y Lunceford (36). 2. Objetivo: aislamiento selectivo de micoplasmas de la cepa T a partir de muestras clinicas; ayudar en Ia identificacién de Ureaplasma ureaiyticum (37) en cultivos; el nico micoplasma que contie- ne ureasa. 3. Ingredientes a. Solucionés stock (1) Solucién de urea, 10% (a) De maxima pureza; 3 9/30 mL de agua destilada. (©) Fraccionar 0,7 mL por tubo con tapa a rosea (13 x 100 mm).. 2) Solucién de rojo fenol: I %, 100 mg de fenolsulfonftaleina sédica/10 mL de agua destlada. G) Penicilina G potésiea (a) 0,63 g/10 ml, de agua destilada estéri. (©) Concentracién final: 100.000 unidades/mL. b. Base Caldo con tipticasa y soja (TSB) o ealdo de digerida triptico O75 8 Cloruro de sodio, NaCl O58 Fosfato monopotisico, KH,PO, 002 8 ‘Agua desionizada 100 mL ©. Medio completo; pH 5 Base U9, estéil, enfiada a 45-50°C 95 mL Sueto de caballo, sin ealentar (normal), 4%, estéril Sm Solucién de urea, 10%, estéril OS mL Solucidn de rojo Tenol, 1% estéril OL mL Penicilina G, estéril Vai 4, Modificaciones con aditives . Caldo U-9 con anfotericina (38) (1) Objetivo: sistamiento de ureaplasmas a partir de muestras del tracto genitourinario femeni- ‘0; suprinir el crecimiento de especies de Candida y hongos filamentosos. Prueba de ureasa 403 (2) Alcaldo U-9 estéril, agregar de manera aséptica 2,5 ig/ml, de'anfotericina estéril (Fun- ‘izone) . Caldo U-98 (38) (1) Astegado de suplemento de crecimiento. (2) Para el medio U-9 completo, agregar 0,5 mL de una solucién stock de -cistefna-HC1 al 24% antes de la esterilizaciGn, ¢, Caldo U-9C; ingredientes Caldo con trpticasa y soja (TSB) 1 Extracto de levadura 0. CCloruro de magnesio, MgCf,- 68,0 0: ‘Agua desionizade 90 ‘Ajustar el pH 2 5,5 con HCI2N Cl, Después de la esterilizaciGn, agregar: Suer de cabal, sn caesar (oral esr 10m Urea, 10% estéril 0, L-Cisteina HCI 0, estril 0, “ripéptido GHL, 20 ug/ml, estérit 0: Solucién de rojo fenol, 1%, estérl °. Solucién de Pencilina C, 100,000 unidades/ml, estéil 1 iota: elteipéptide GHL es acetato de gti dice 11.) 5. Esteilizacién a. Filtracién (Millipore), 0,22 pm de diémetro de poro: solucién de urea, t-cistefna, péptido GHL, suero de caballo y agentes antimicrobianos. ». Autoclave, 121°C, 15 Ib, 15 min: base y solucién de rojo fenol. 6. Fraccionar a. Tubos con tapa a rosca: 1,8 mL tubo (13 x 100 mm). b, Frascos ampolla: 1,8 mL/frasco ampolla (Wheaton). 7. Conservacién a. Base: refrigerador, 28°C. , Congelado (1) Soluciones stock, suero de caballo, t-cisteina y tripéptido GHL: -20°C. (@) Extracto de muestra original: ~70°C. (3) Vencimiento de los medios completos: aproximadamente al mes. 8, Inoculacién a. Muestras extraidas en 1,8 mL de caldo U-9 (extracto original). Conservar (congelado, ~70°C) para posibles subcultivos. b, Serealiza una dituci6n de 10-! del extracto original por la transferencia de 0,2 mal frasco am- polla que contiene 1,8 mL. de caldo U-9 (0 U9-B 0 C) (37). 9. Incubacién a. Tanto de los frascos ampolla originales como de los frescos ampolla con la diluci6n. . En aerobiosis, 35°C, 18-24 ¢. Observar durante todo el perfodo de incubacién para determinar el primer cambio en el indica- dor de pH. Continuar la incubacién durante 7 dfas con observaciones diarias antes de informar una prueba de ureasa negativa. 10. Microorganismos utilizados para el control de calidad a. Positivo (+) -histidil-L-lisina; Calbiochem-Novabiochem; véase Apén- reaplasma urealyticum ATCC 27618 b. Negative () Mycoplasma pneumoniae ATCC 15831 Staphylococcus aureus subesp. aureus ‘ATCC 12600, ‘No inoculado| I. Interpretacién (véase también cuadro 39-1) a, Positive (+) 404 Pruebas bioquimicas individuales Cuadro 39-1. Actividad de ureasa: pHi/tiempo BH de la reacoién Periodo de incubacién (A) E872 4 5 24 "Todos los microorganismos Proteoae son ureasa postvos, (1) El color rosa-rojo oscuro permanece en el fondo del tubo y difunde a todo el medio cuan- do se contina Ia incubacién. (2) Hidrélisis de la urea y acumulacién de amonfaco (NH,). @) pH alcalino. (4) Ausencia de turbidez (nubosidad) evidente en el medio liquido. b. Negative (-) (1) Sin cambios de color; e1 medio permanece de color pajizo. (2) Ausencia de hidrolisis de la urea. B. Caldo con urea para micobacterias (39) 1. Ingredientes Peptona Giucosa (dextrosa) Cloruro de sodio, NaCl osfato poisico, monobisico, K:HPO, Urea Rojo fenol, s6tico, 1 % ‘Tween 80 ‘Agua desionizada 10 Eperonce 2. Indculo a. Cultivo joven, en fase de crecimiento activo en medio de Lowenstein-Jensen. bi. Turbidez moderada. * 3, Incubaci6n: 35°C, sin CO,5 interpretar después de 1-7 dias: 4. Microorganismos para el control de calidad a. Positivo (+): Mycobacterium fortuitum ATCC 35931 b. Negativo (-): No inoculado, . Interpretacién; cambio dei amarillo brillante al 34: rojo claro; 44: ojo oscu C. Ayudar a la diferenciacién de especies de Mycobacterium: M. scrofulaceum (+) de cepas pigmen- tadas del complejo M. intraceltulare-avium (~); grupo Ide Runyon (M. tuberculosis, M. bovis, M. kan- ‘sasif y M. marinum) por lo comin +; otros grupos dan reacciones Variables a negativas (23) 1. Medios de prueba; tres opciones a. Prueba de ureasa en discos (28) (1) Discos de urea (Difco) impregnados con caldo para urea R de Ewing (15) agregado a 0,5 ml. de agua destilada estéril en tubos con tapa a rosea (13 x 100 mm), (2) Con algunas marcas comerciales de tubos descartables se observan cambios de color ines- pecificos en el medio no inoculado;el problema se elimina con tubos deusos miltiples 28) b. Para cada medio en tubos fraccionaralfcuotas de 3 ml en tubos de borosilicato con tapa a ros- ca estéril (13 x100 mm). (1) Medio de Toda, Hagihara y Takeya (42) (@) Sistema de buffer fosfato, 0.01 M, pH 6,7. (b) Esterlizaren autoclave y mientras atin esté caliente agregar 3 g de urea y 1 mL de in- dicador de pH rojo fenol al 0,1% por cada 100 ml. de buffer. (2) Medio de Wayne y Doubek (45): agar base con urea de Christensen (Difco) sin agar, dilui- do 1:10 en agua destilada estéril. 2. Para los tes procedimientos (28) a. Inéeulo denso (emulsién) proveniente de un cultivo de’21 dias en medio con base de huevo. 'b Incubacién: 35°C; observar las resultedos en 1 h y luego con intervalos de 24 h hasta las 72h. positive Prueba de ureasa 405 ©. Positivo: color cereza (purpura rojizo) 1D. Medio con urea tamponado, exento de azida 1. Deteceién répida de la ureasa de Helicobacter (Campylobacter) pylori (19) 2. Ingrediemtes: pH 63-65, Urea 2e Solucién acuosa de rojo feno, 0.4%, (v0) 25 mL Fosfato de soi, NaB,PO, 10 mmol, pH 63, ode ‘Agar Oxoid NE4 og ‘Agua desionizada 100' mi 3. Fraccionar: 200 j!L/orificio en placas de microtitulacién de Linborough de fondo plano con 96 ori- ficios; vencimiento refrigeradas (2-8°C) a los 10 dfas. 4, Inoculaci6n: 5 u L (denso) por puncidn en los orificios con pipeta de siembra miltiple, 5S. Incubacién a, Temperatura ambiente (22-25°C), ’b, Bvitar la exposici6n a la luz; colocar en un armario. Si se expone a Ia Iuz, el cultivo puede de- sarrollar peréxido, el cual puede interferir con la reecci6n de urease 6. Interpretacion a. Observar el cambio de color después de 5 y 30 min y en los siguientes tiempos: 1, 2,3, 12 18 h . H. pylori muestra una reacci6n roja oseura, inmediata y persistente. E, Medio no selectivo (NSM) 1. Objetivo: prueba de seleccién répida para el aislamiento y la deteccién de ureasa por H. pylori (9); puede utilizarse para las biopsias del antro géstrico. 2. Ingredientes; pH 6,8 ‘Agar base Columbia 398 IsoViteleX, 2% 20 mL Hemina’ 10mg Urea 7 208 Rojo fenol 12mg ‘Agar granulado 4 ‘Agua desionizada 980 mt. 3, Medio selectivo (SM); aditivos antimicrobianos opcionales; elimina La flora contaminante ‘Trimetoprima Smg ‘Vancomicina 10mg, Anfotericina B Smg Cefsulodina Smg filtraci6n (Millipore); 0,22 um de diémetro de pore, ’. Agar Columbia: autoclave, 121°C, 15 Ib, 15 min; enfriar y agregar la urea, el rojo fenol y los, antibiticos. 5. Fraccionamiento: 15-20 mLéplaca (15 x 100 mm). 66. Inoculacién: muestras de biopsia mantenidas en 0,4 mL, de caldo para brucellas; homogeneizadas y vertidas en las placas dentro de las 2h. Incubacién: 35°C, en atmésfera de microaerofilia (jarra Campy Pak), Microorganismos para el control de calidad = a. Positivo (+): Helicobacter pylori, ATCC 11637, NCTC 11637; cambio de color en el curso de 1h. b. Negativo (-) ‘Proteus vulgaris ATCC 13315; cambio de color en 24% Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; cambio de color en 48 h ‘Campylobacter jejuni ATCC 32292; sin cambio de color 9. Intexpretacién ‘a. Controlar para determinar el cambio de color a los 5 y 30 min y a 1, 2,3, 6.24, 36 y 48 h, ». Positivo (+) (1) Color amarillo a rej. Q) Crecimiento bacteriano visible después de 3 dias. ‘c. Negativo: sin cambio de color. 406 Pruebas bioquimicas individuales H. pylori da una reaccién inmedita en el curso de 1 hy el medio se toma completamente rojo a las 3h. H.py- Jori posee una ureasa altamente activa, de peso molecular alto y produce una abundante cantidad de urea~ ‘sa cuando se lo cultiva en medio sdlido (20, 24, 32). F Solucién salina balanceada (27) 1. Objetivo: biotipficaciém de especies de Haemophilus humans (26). 2. Ingredientes: pH7 Fosfato monopotisico, KH:PO, 0.1% Fosfato potisico dibssico, KH,PO, 01% Cloruro de sadio, NaCl 05% Rojo fenol, 2% 05 mL. Volumen total, 100 mL. 3. Esterlizacién: autoclave, 121°C, 15 Ib, 15 min y agregar 10 mL. de solucién acuosa de urea estéril (Glo Millipore). Fraccionamiento: pequefias cantidades en tubos estriles (13 x 100 mm). Indculo: suspensién densa Incubacién: 35°C, 4, Resultados 1. Positive (+): ojo color Haemophitus influenzae de ios Wiotios 1,1, 1, TV y del bioipo aegyprus Haemophilus parainfluenzae de 1s bieipos i, 1V, VI Haemophilus haemolyius Haemophilus parahaemolyticus Haemophilus paraphrophaemolytius IX. PRUEBAS RAPIDAS. A. Key Urease Test Tablets (prucba de ureasa con comprimidos Key) 1. Fabricante: Key Scientific Products. 2. Formula de Christensen, 3. Resultados en el curso de 4. Procedimiento: seguir las B. Discos de urea 1. Fabricantes 2. BBL, urease (UR) Mintek disks (discos para ureasa (UR) Minitel); junto con Ta coloracién de Gram y la prueba de oxidasa, pueden ser usados para la répida confirmacin de H. pylori (41) », Difeo, urea disks (discos de urea). 2. Resultados dentro de 1-4 de incubacién C. Urea-phenylalanine disks (PDA disks) (discos de urea-fenilalanina) Fabricante: REMBL. Procedimiento: seguir las directivas del fabricate ‘Veanse figuras 39-3 y 39-4 (Apéndice 1). Indculo denso proveniente de un cultivo de 18 a241h en agar pico de flauta TIncubacién: 37°C en bafio de agua; observar alos 10 min yal y 2h, Positivo: color cereza (pirpurarojiz0). D. CLO Striptest (prueba con tra eactiva CLO) 1. Febricante: Delta West Lid, Australia Occidental, Australia. 2. Ureasa répida para Hf. pylori 3,11). 3. Seguir las directivas del fabricante 4, Leer después de los 15 min y a1,3y 20h, 12h de incubaci6n, irectivas del fabricante. X: PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS ‘A, Contador de centelleo liquid; técnica radiométrica aeumulativa de Buddemeyer (6) B. Pruebas no invasivas dela urea en la respiraciGn eon (13C] y {MC} (23) 1 HC a. Fabricant : Pytest, Ballard Medical Products, Draper, Utah. Prueba de ureasa 407 ’, Utliza “C para medir el bicarbonato eliminado por H. pylori prodiuctores de urea, 2 BC 4, Fabricante: Meretel UBT, Nashville, TN. ', Prueba de la urea en le respiracién;[!2CJurea contenida en la prinactina, una soluci6n clara in- colora C. Deteccién de H. pylori mediante el empleo de [15NJurea como trazador; determina la excrecién de NHy. Xl. PRECAUCIONES A. Generales 1, "Todos los modios de prueba con urea, tanto el caldo como el agar en pico de flauta, se basan en la emosiraciGn de la alcainidad; en consecuencia, no son especificos para ureasa, El empleo de peptonas, en especial en el agar en pico de flauta(p. ej. P. aeruginosa), u otras protefnas en el me- dio puede variar el pH a la alcalinidad debido a ls hidrOlisis de la proteina y ala liberacién de un exceso de residuos de aminoscidos y brindar resultados falsos positivos. Para eliminar la posible hidrisis de las proteinas, realizar un control utilizando el mismo medio de prueba sin urea (2). 2. La sensibilidad de la prueba de ureasa puede corregirse con sustancias buffer. El caldo de Stuart esté fuertemente tamponado, 10 veces més que el agar en pico de flauta de Christensen y por lo ccomtin s6lo los microorganistnos Protecae ureasa positives hidrolizan la urea en el caldo de Stuart para producir acalinidad debido a que la cantidad excesiva de NH, originado no puede ser neutra- lizado por el buffer (2) 3. No calentaro recalentar la urea base en solucisn; Ia urea se descompone por el celentamiento. 4, Los medios de urea expuestos ala luz pueden desarrollar perdxido, el que podria interferir con la reacciGn de la ureasa (12) 5. Se sabe que la urea puede suftir autohidrlisis; en consecuencia, es aconsejable conservar los me~ dios en el refrigerador a 4-8°C. Los cambios de color pueden tardar algo més cuando el medio es refrigerado (12) 6. Los medios sin el agregado de-buffer son menos espectficos (13, 15, 16). B. Caldo con urea de Stuart 1. El fuerte sistema buffer enmascara la actividad de ureasa en los microorgenismos que son posi vos en forma tarda; este medio esta ideado s6lo para la detecciGn de la actividad de ureasa en to- das las especies de Proteus, M. morgan, P.rettgeri y en los microorganismos P. stuart ureasa positivos (10). 2M. morganii hidroliza la urea con lentitud (10) y después de 24 h de incubaci6n la reaccién sélo puede mostrar un apagado color rosa. Si se duda acerca del resultado, comparar con un tubo de medio no inoculado o reincubar durante un adicional de 24 h. M. morganii por lo comin requiere cerca de 36 h de incubacién para desarrollar una fuerte reaccién de ureasa positive (40). En los miembros de la subfamilia Proteeae ocurre un resultado ureasa positivo intenso cuando el pH al- ccanza 8,1 0 més (40). Existen variaciones en la reaccién de pH de acuerdo con el perfodo de incu- bacién y con los microorganismos los Proteeae ureasa positiva que se estén probando (cuado 39- 1). vulgaris y P. mirabilis dan wna reaccién de ureasa positivos (pH 8,1) después de alrededor de 8 h de incubacién, P. reitger ataca la urea répidamente, lo que brinda un resultado positivo en cerca de 12 h. M. morganii requiere alrededor de 36 h de incubacién para desarrollar una intensa reaccin de ureasa positiva (40) 3. Bl pH de las reacciones positivas puede variar debido a las diferencias en el tamafto del inéculo utilizado o a diferencias en las velocidades de actividad de la ureasa de las diversas cepas de Pro- ‘eae positivas (34). Si se incrementa el indculo de Ia suspensin de bacterias Proteeae en solucién fisiol6gica de 0,01 a 0,1 mL, disminuye el tiempo requerido para alcanzar el pH 8,1; sin embar- g0, un inéculo més denso no produce una aceleracién posterior (40). El inéculo esténdar aceptado de 0,1 da un resultado positivo alrededor de 3 h antes que el inéculo de 0,01 ml. (40). 4, Lacantidad de sustrato utilizado, la temperatura de incubaciGn o ambos factores pueden alterar la velocidad dela produccién de ureasa por los microorganismos Proteeae ureasa positivos (40). Stuart ¥¥ col. utilizaron un inéculo constante y variaron la cantidad de medio por tubo de 1,53 a4,5y 6 ‘mL y encontraron que el tiempo necesario para desarroliar un resultado positivo aumentaba con el volumen, La cantidad minima aceptable de medio por tubo para una lectura precisa es de 1,5 mL. 0) 408 Pruebas bioquimicas individuales 5. Pueden ocurtir resultados falsos negativos sila cantidad de NH formado es demasiado baja para ‘cambiar la concentracién de ion hidrégeno del alto sistema buffer a un pH alcalino que causaria {que el indicador rojo fenol cambiara de color (46). 6. Ambos ealdos base, preparados 0 deshidratados, deben ser refrigerados; si el sello se rompe, es preferible conservar el frasco con una sustancia desecante en un recipiente sellad. 7. Silos nutrientes proporcionados por el extracto de levadura disminuyen antes de que et microor- ganismo muestre un desarrollo notable, su capacidad de hidrolizar la urea no puede determinarse con precisién (10). 8. Si un microorganismo puede hidrolizar Ia urea pero no puede utilizar el amonfaco (NH) como fuente de nitrégeno, no se produce el desarrollo y puede aparecer un resultado falso negativo (10) . Agar con urea de Christensen 1. Los miembros de la subfamitia Proteeae ureasa positivos producen la alcalinizaci6n del medio de Christensen (rosado rojo) enseguida después de la inoculaci6n. Para que los resultados sean vali- dos para la deteccién de Proteeae, deben ser lefdos dentro de las primeras 2-6 h de incubacién. Citrobacter freundii'y K. pneumoniae subesp. pneumoniae pueden convertirel agar con urea de Christensen dentro de las 24-48 h. Este medio detecta la actividad de ureasa répida sélo de los, miembros de Proteeec ureasa positivos. 2. El medio con urea de Christensen no se emplea para determinar Ie velocidad absoluta de la acti- vvidad de ureasa (10). Muchos microorganismos ureasa positivos, distintos de Ios integrantes de Protceae, pueden hidrolizar la urea dentro de las 24 h y luego lentamente producir una ruptura adicional de la urea, Esto se evidencia por el color alcalino penetrante en todo el medio, fondo y pico de flauta. La degradacién posterior de la urea puede deberse a la fata de tolerancia de algu- nos microorganismos @ la creciente alcalinidad, la que con posterioridad disminuye la actividad de Ia ureasa (10), . El caldo con urea R debe ser preparado en el dis de uso ya que el buffer no mantiene el pH deseado por més de 48 h. E, Medios U-9 + 1. La preparacién del medio basal la conversin al medio U-9 completo yet fraccionamiento siem- pre deben realizarse en el mismo dta (37). 2. Recordar: el crecimiento y Ia actividad de ureasa por los ureaplasmas en el caldo U-9 ocurre sin turbidez (nubosidad) detectable en cualquier momento (37), 3. Enraras ocasiones, los ureaplasmas exhiben reacciones ureasa positivas tardias después de 3-5 dias de ineubacién (37). 4: Las especies de Ureaplasma son los tinicos miembros de Mycoplasmatales que se sabe que con- tienen ureasa; en consecuencia, la reaccién de ureasa es espectfica de ureaplasmas (37) 5. Las formas L de Proteus pueden ser inducidas para hidrolizar la urea en el medio U-9 (37). Se re- quiere un inéculo denso y un periodo de incubacién de 48-72 h (37). Sin embargo, si hay presen- cia de formas L de Proteus en una muestra clinica y tienen &xito en penetrar en el medio a través de la barrera de penicilina, ellas se mmultiplican en la forma bacilar y producen la turbidez eviden- te de tipo bacteriano y dan un resultado de ureasa falso positivo para ureaplasmas (37) 6. Los resultados de ureasa falsos positivos pueden ocurrir también si hay presencia de hongos en la muestra elinica (Sobre todo especies de Candida y ciertos hongos filamentosos); sin embar- 20, exeepto Candida humicola (35), estos microorganismos son ureasa negativos. Pueden mul- tiplicarse en presencia de penicilina y liberar subproductos alcalinos a partir del medio basal so- lo que producen reacciones fuertemente alcalinas y cambios en el medio al color rojo (37). Los resultados falsos positivos debidos a Candida son reconocidos por la turbidez evidente, por el | sedimento denso y el olor s{mil levadura o por ambas caracterfsticas (35). Los resultados falsos | positivos debidos a hongos filamentosos se evidencian por el desarrollo de bolas tipicas vello- | sas, simil algod6n (36). Por lo comiin, estos hongos pueden ser suprimidos por la incomporacién de 2,5 jig/ml del agente antimicético anfotericina B; sin embargo, algunas cepas de Candida 1. pueden no ser inhibidas (35). Robertson (33) mostré que el rojo fenol en el medio U-9 varia de un color pajizo a un color rosa piélidoa pH7 y que a pH 8,2e1 medio es rosa oscuro. El cambio de colorno se evidencia hasta que se aleanza la fase de crecimiento estacionerio (33). Los subcultivos deben realizarse cuando ape- nas se detecta el cambio de color al rosa-rojo: los subcultivos realizados después del desarrollo completo del color rojo (por lo comin a las 9-12 h (33)) por lo general dan un cultivo en agar negativo debido a Ia sla slealinidad (pH 8-9) alcanzada en el medio, que resulta letal para las ‘especies de Ureaplasma (18). $i aparece la ina Prueba de ureasa 409 ci6n, puede utilizarse para inocular el ager una alfcuota descongelada de la muestra congelada del extracto original. 8, Tanto M. hominis como U. urealyticum crecen en el caldo U-9; sin embargo, s6lo U. urealyticum ‘cambia el color del medio (33). REFERENCIAS 1 BBL Manual of Produes and Laboratory Procedu- res, ed 6. Cockeysville MD: BBI. Microbiology Systems,DivisionolBeconDickinsonand Company, 1988:154, 2. Blazovie DJ, Bderer GM. Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. New York: John Wiley & Sons 1975: 103-104,132- 133, 3. 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