OBJETIVO:

 Comprender los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram.

 Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos.
 Conocer o manejo del microscopio óptico para la observación de bacterias.
 Reconocer las distintas bacterias.
MARCO TEORICO:
La tinción de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX y puede
utilizarse para separar la mayoría de las especies bacterianas en dos grandes
grupos, a saber, las que captan el colorante básico, cristal violeta (es decir las
bacterias gran positivas),y las que pierden ese colorante por el lavado con el
decolorante alcohol o acetona (es decir las bacterias Gram negativas).
TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA
PREPARACIÓN DEL EXTENDIDO:
Los métodos de tinción se utilizan en forma directa con las muestras del paciente o
se aplican a los preparados obtenidos a partir del desarrollo de los microorganismos
en cultivos. Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con un
hisopo que contiene el material del paciente o con una pipeta dentro de la cual se
encuentra la muestra de líquido aspirado (El material que se va a teñir se coloca en
forma de una gota (si la muestra es líquida) o se rota (si la esta e un hisopo) sobre
la superficie de un portaobjeto limpio y seco.
PROCEDIMIENTO:
El procedimiento clásico de la tinción de Gram consiste en fijar el material orgánico
a la superficie del portaobjetos del microscopio ya por calor o con metanol. Después
de la fijación el primer paso en la tinción de Gram es la aplicación del colorante
principal cristal violeta (metil rosanilina ovioleta de genciana). Luego se aplica un
mordiente, el yodo de Gram(lugol), para que el colorante alcalino se una a la pared
celular a través de enlaces químicos. La decoloración distingue las bacterias gram
positivas de las gram negativas. Después de la decoloración los microorganismos
aparecen como gram positivos retienen el cristal violeta y los gramnegativos lo
pierden. El agregado colorante de ontraste safranina (Contratinción) teñirá de color
rosa o rojo las bacterias gram negativas claras.
 Tinción Primaria: Se utiliza Cristal Violeta, que tiñe todas las células moradas.
 Mordiente: Yodo o lugol. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa la
afinidad del colorante primario con la célula, formando complejos insolubles

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 con este. El complejo cristal violeta-yodo sirve para intensificar el color del
tenido.
 Agente decolorante: Se utiliza alcohol etílico al 95%. El etanol tiene doble
función: deshidratante de proteínas y solvente de lípidos. El alcohol disuelve
los lípidos de la parte externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo la
pared más porosa. De esta manera, el complejo Cristal violeta-yodo es
removido de la capa de mureina más fina de las bacterias Gramnegativas,
mientras que la pared más gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte en
su interior.
 Tinción de Contraste: Safranina. Este tinte se utiliza para teñir de rojo las
células previamente decoloradas, o sea, las Gram-negativas.
EN LA MESA DE TRABAJO
MATERIALES:
Cultivos en agar nutritivo
Reactivos:
Cristal violeta, Yodo de Gram, Alcohol Etílico 95%, Safranina.
Equipos y materiales:
Mechero de alcohol, asa de siembra, cubeta de tinción, porta objetos,
microscopio
PROCEDIMIENTO
1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio.
Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa
de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida
una mínima gota de agua, que es suficiente.
2. Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Tomar, en condiciones
asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y
transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra
hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida
para facilitar su secado.
3. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación
acercando el portaobjetos a la llama del mechero. En este caso hay que
tener mucha precaución de no calentar demasiado el portaobjetos pues
las células pueden deformarse o romperse.
4. Permita que los frotis se sequen al aire y luego fíjelos con calor.
5. Tiña con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que actúe
durante 1 minuto
6. Lave suavemente con agua.

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 7. Inunde suavemente con el mordiente, yodo de Gram, y deje actuar
durante 1 minuto.
8. Lave suavemente con agua.
9. Decolore con alcohol etílico al 95%. Nota: no sobre de colore, agregue el
alcohol gota agota hasta que este salga casi claro, solo ligeramente azul.
10. Lave suavemente con agua.
11. Agregue la safranina para la tinción de contraste.
12. Lave suavemente con agua.
13. Seque la preparación.
14. Examine las muestras con el microscopio.

BIBLIOGRAFIAS
http://biologia.laguia2000.com/histologia/tincion-gram