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Coordenadores:
WALTER BORZANI
WILLIBALDO SCHM IOELI,
URGEL DEALMEIOA LIMA
EUGCNIO AQUARONE
BIOTECNOLOGIA
INDUSTRIAL
VOLUME 1
FUNDAMENTOS
•I EDITORA
~ BLUCHER 5
O
anos www.blucher.com.br
O 2001 \Va11er lkrani
WilbO.lclo S<luni<lcll
Urge! de 1\1nlf:idJ Lin~
Eugi:tlio Aquarooc
FICl-I;-\ CATALOGllÁFICA
Oor-1.;ini, \\12llcr
Biotttnologia. indiKtrial / \\lalt« 8017.ani · outros ('()(lrdcnadottt.: \\lllliba.k!o
Sctunidcll, Urgtl de Al1nc.MU Lima., Eugênio Aq~rooc •• Slo Paulo: Dluchcr, 2001.
Bibliog:r2fi3.
ISB1'' 978-SS-212-0278-3
BK>lOGlA QUÍMICA
ENGENHARIA
ENGENHARIA
OUIMICA
Literatura Recomendada
1) Anciães, \V. & Cassiolato, J.E. Biotecnologia: seus impactos no setor industrial.
CNPq, Brasília, 1985.
2) Haehn, H. Bio.químjc.:a de 1.:as fenn entaciones. Aguilar $.A. de F.diciones, ~4adri,
1956.
3) Jonas, R. C BF - Scientôfic Annual Report (pp. 35-46). Alemanha, 1990.
4) PatS de Can1alho, A. P:.lentes pa.ra 3 BioJe<nologia. Apresent~ldO à Academia
6r.1silcira de Cit-ncias em 6.12-1993.
IX
,, , ..... ....,. . i
.. 1 ~ -- 1
Fer1lando Accvedo
Profesor
Escuela de lngeniería Bioqu.ín\ica
Universidad Católic-a de Valparaiso
Valparaíso, Chile
XI
VOLUME 3
CUNIF••iíO
VOLUME 4
4 CERVEJA .......................................................................................................................... 91
4.1 lntroduçlío ............................................................................................................ 91
4.2 Lcgishlção brasileira ........................................................................................... 93
4.3 ~1atérias·prin\AS .................................................................................................. 'YJ
4.4 Leveduras e bact~ri3S ....................................................................................... 1'1i
4.5 Pl'OCX'SS<:1nlen10 ................................................................................................... 112
4.6 Clt.i.1lidade da <X'n·cja ....................................................................................... 130
4.7 Tipos de cerveja ................................................................................................. 138
nibliografia ........................................................................................................ 143
5 AGUARDENTES .......................................................................................................... 145
5.1 lntroduç.10 .......................................................................................................... 145
5.2 Clru;siiic.ição d as bebidas alcoóli~s e das agu,1rdentes .............................. 146
5.3 l)efinição ............................................................................................................ 147
5.4 Bebidas (ermeto-d.(':StilAdas e destilo-retificadas .......................................... 147
5.5 Aguarde1\ tCd e cana-de-açucar ....................................................................... 163
5.6 Outrasagua.rdentcs .......................................................................................... 179
5.i Padrões d e identidade ..................................................................................... 179
6ibliografit1 ........................................................................................................ 180
6 VINAGRES..................................................................................................................... 183
6.1 Introdução e hi.stóriro ...................................................................................... 183
6.2 Padroni1..aç.'io e legislaçâo ................................................................................ 184
6.3 icrminologi3 vifl.ll81'eir,1 .................................................................................. 186
6.4 f\1titérias-primas ................................................................................................ 187
6.5 (>.1jcrorganisn1os ................................................................................................ 188
6.6 Rendimento e produti\•idade ...............................~ .......................................... 190
6.7 Fatores qtie afetam a qualid:tde do vinagre .................................................. 191
6.8 Bioquimida d<' fcr1ne111ilÇ"ão acétic.1 ............................................................... 191
6.9 Pr<>CCSS-OS de fabricação .................................................................................... 193
6.10 Compa.rtiçâo t"'llll'C pJ'OCE'S.<;OS .......................................................................... 200
6. 11 npos de vinagn._"S .............................................................................................. 200
6.12 Tr.1ta1ntnto fin;;i l ................................................................................................ 201
6.13 En,·elhecinlento ................................................................................................ 202
6.1-1 Mattriais resis1entes ao ácido acéti<O ............................................................ 202
6.15 Alter.1ções c def('itos ........................................................................................ 200
6.16 Usos e aplicações .............................................................................................. 2Q.l
6. l7 Resumo ............................................................................................................... 206
Bibliogr.1fia ........................................................................................................ 207
7 L EITES FERMENTADOS .........................................................................................209
7.1 lA"g-iSl3('JO .......................................................................................................... 209
7.2 Caractcristi('M de leites fermentados ............................................................ 2 l2
7.3 Too1olog:ia de produ('ào de ;:ilguos leites fernle ntados ............................... 212
Bibliografia ........................................................................................................ 223
8 Q U EIJ OS. ....................................................................................................................... 225
8.1 lnt·rodução .......................................................................................................... 225
8.2 Composição e valor nutricio1,.,.1...................................................................... 226
8.3 Cltissifi('<'('.\o ...................................................................................................... 226
8.4 Matéria-prima e ingredientes ......................................................................... 228
XXVll
'"""""'°"''
Rcikulo
Au~1t Pr~1e
endoplasm.~tico
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Cocobocilos
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Espiroqueto
Espirilo
Estreptooocos
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Télrade
Sarein.a
Estafik>coco
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1.2.2 - Fungos
Os fu1lgos são seres eucarióticos, heterotróficos, que 1lão siri.tetizam clo-
rofila, porta1lto r1ão fazen1 fotossíntese, não ar1nazenam arnido como 1naterial
de reserva e sim glicogê11io e não tên1 celulose na parede celular, com exceção
de alguns f\1ngos aquáticos. São ubíqltos, podendo ser encontrados no ar,
solo, água, ' 'egetais e animais.
Do ponto de vista morfológico, é co11,1enicrlte distingui-los em leveduras
e bolores. Essa distinção não tem valor taxo1lô1nico, pois a1r1bas as formas po-
dem ser encontradas nltm mesmo grupo de fungos.
As leveduras são geralmente unicelulares, de forma esférica, elíptica
ou filamentosa. O tan1anho varia de 1 a 5 µm de diâmetro a 5-30 µm de com·
primento.
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ANIMAL E PROTozoAAIO
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l'JSOIOO-
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t-.iass.a seca • tot.tl 100)) 284))
meio descrito 1\0 ite 1n 1.4.2., por exe mplo,~ seletivo pata foto litottóficos.
~luitas vezéS a seletividade do meio depende da adição de algum composto
inibidor dos indesejáveis. Assi1n, por exen\plo, corar1;tes básicos inibem o cres-
cimento de bactérias g ram positivas, enquanto que a azida sódica inibe as
g_ranl-negativ as.
ti.1eios diferenciais são aqueles que conferem características especiais às
colônias que, en\ condições 1\ormais, serian\ idê1"lticas. Assim, n1icrorganismos
íermentadores de lactose, semeados em meio contendo l ac to~ e um indica-
dor, dão colônias de cor d iferente das dos não ferme11tadores, pois, crescendo,
fermentanl a lactose, origin<:indo ácido lático, que faz ""irar" o i1\dicador.
C=2_=t-t, (1·5)
R 11
Tais equações, etltretanto, somente se aplicam a microrganismos que se di\•i-
dem bi1tari am~\te e em 001\diçôies que garantam 100% de viabilidade. Assim sen·
do, ~ mais conveniente aplicar-se uma equação mais geral, onde se leva em
001\Sidcraçào a variação da massa X d~ protoplasma, em função do tempo:
~ •µX (1·~
dl
lsso significa qtle a velocidade de crescimento é proporcional à concen·
tração de mjcrorganismos nt1n\ instante dado. A fração pela qual a população
c r~e na unidade de tempo é dada porµ, que representa a velocidade t--Sptcfjica
de creSt:i1'11~t1to,
1 dX (1 ·7)
1•=x · d 1
A integração da exprcssâo (1·6) leva a
(1-10)
logX • logX 0 + ~·t
2,3
Projetando-se num gráfico os \•atores do log X contra o tempo, obtém-se
uma reta, característica do crescimento exponencial.
1.5.4 - Fases do crescimento microbia1lo
~óbvio que, numa cultura descont(nua,. as condições não permanecenl
ideais por muito tenlpo. Logo a quantidade de nutrientes con\eça a diminuir e
produtos do metabolismo microbia1\0 vão se acumulando cada ''ez mais.
Essas modificações têm uma considerável influência sobre o crescimento dos
microrganismos. Construind<rsc u1n gráfico global do crescimento microbia-
no em cultura descontínua em nleio lfquido, obser,•a-Sê que a curva represen-
tativa desse crescimento apresenta várias fases (Fig.1.11).
Fase
estaeioll6ria
,..,, ..
Rgvn 1.11 - Fases da curva de ~to micrQOOno,
--
Ih-·--·-
L--....::.-=:;i
,., º""rll
'
'.
1.6.2 - Temperatura
De todos os processos empregados para ntatar 1nicrorg;;inisn1os, o calor
é, seo1 dúvid~l algt1n1a, o ntais eficiente e econôntico. Pode ser emp regado de
duas maneiras: seco e úmido. O cal<>r seco age pron\ove1\do un1a oxidação
'lti-olenta de con'lponentes do protoplasnla. Sua cíiciênci.:1 é comparativamente
baix,1, pois não te1n ntuit.t c,,pacidade de penetração. r\lém d isso, 11ào é todo
tipo de n1ate rial que pode ser s ub1ne tido às t('ntpt:ra turas 11eccss;;irias par,t es-
rerilizaçt\o pe lo calor seco (160 a ISOºC du rar'lte u1n tcntpo n1ínin10 de unia ou
duas ltor;;is). Emprega-se para vidraria_, óleos ou pós; ne n1 todo material me tá·
lico pode ser esterilizado a seco; certos i1lstrunlentos delicados poden' perder
o corte ou a t~nlpt:ra. O processo da f1a111bager11, utilizado nos labor<itórios de
microbiologia par(! esteriliz.ar a lç3s e fios de p latina, consis te em passar-Sê o
material dire tanitnte na clta nla do bico de Btutsen.
O calor \Ín1ido é muito mais eficiente. .i.\ge prOnlovendo a dcs11aturaçâo
de proteínas e d iSS<>ltlÇà<) de lipíd(.•<)S, o que ta nlbé-11\ co11t1·ibui pa ra intensifi·
caro prioteito efeito. Te1ll alta c.apacidadc de penetração e pod ~ ser titilizado
~ l'cl unta grande variedade de n1ateriais, inclusi\'C biológicos. 1\ tc1nperatura
de 60ºC. durante tuna 11ora, ~suficiente para matar as íotnlas ' 'egetativas de
:odos os n1icrorgal\is nlos, cxcctua1\do ·st: os ter1nófilos, natura ln1ente. A tOOºC
as fo rntas vegetativas 111orrcnl en1 po\1cos minutos; se n1antida essa tentpera~
tura d ur.-.1, te 15 n\inutos, n1orre ta n1b6rn a 1naioria dos esporos. Há, contudo,
esporos, pri11cipa hl1C"ntc de saprófitas, que podeni resistir ao aque,-cimento a
tOO;C durante várias hor(ls, s uportando mesmo te1npe raturas t1m pouco 1ttais
.i.ltJs. 1>ara matar qualquer tipo de n1icrorga1-.isn\o, i1lclusive todos os tipos de
esporos, c1nprega·sc vapor d 'água aquecido a 120ºC, sob uma pressão de uma
atmosfera acima da norJnal, durante 20 minutos. O aparelho utilizado para
esse fim é a autcx:laue, que consiste num recipiente de paredes resistentes onde
se coloca o material. O vapor poderá ser produzido pelo aquecimento da âgua
contida na própria autoclave ou ser introduzido por tubulação adequada.
Para que o processo seja eficiente, é indispensável que se evite mistura de ar
ao vapor e que o material esteja acondicionado e distribuído de forma conve-
niente.
A pnsteurizaçho coi'lsiste no aqi1C<"i1ne1\tO a 62ºC por 30 mi1\utos, seguido
de um resfriamento brusco. Não é um processo de esterilização, tendo sido
inicialmente empregado para destruir os 1nicrorga1\ismos patog~n i cos presen-
tes no leite. Além disso, utiliza-se esse método para interromper certos pro-
cessos microbiológicos industriais qua1\do estes atingem u1n certo ponto. É o
qlte sucede na fabricação da cerveja, por exemplo.
De um niodo geral, os microrganismos são mais resistentes ao frio do
que ao calor. Com algumas exceções, a temperatura de geladeira (4ºC) pode
ser c-mpregada para a conservação de culturas. Temperaturas inferiores a OºC
podem ser letais para microrga1\ismos. O co1\gelamento lento promove a for-
n'lação de c-ristais de gelo, que perfuram a membrana e a parede celular. A al-
ternância de congelamento e descongelamento é tim processo bastante eficien-
te para lesar e matar microrganismos. O congelamento br\lSCO a temperaturas
inferiores a -30ºC não leva à formação de cristais, e os microrganismos geral-
1nente sobrevi\•Cm durante mllito tenipo nessas condições prii\c-ipahlientc- se o
processo é seguido de um dessecame1\to a vácuo. ~ é a técnica da liofiliza-
çào, empregada para a conservação de microrganismos e de material biológi-
co em geral.
1.6.3 - Radiações
De- interesse prático pela sua atividade letal sobre microrganismos sãos
as radiações ultravioleta (UV) e as radiaçôêS chamadas io,,i.ututes.
As radiações UV, principalmente as de comprimento de onda entre 240 e
280 nn11 são absonridas pelas pttrinas e pirimidinas dos ácidos nucléicos, pro.-
vocando mutações. An~is aromáticos de aminoácidos também absorvem radia-
ções, levando à inativação de enzinia.s. Ambos os efeitos podc-m levar a célula à
morte. N(l prátic.-., empregam-se lâmpadas de merçúrio como fonte de radia-
ções UV. O seu emprego em lugares públicos, salas de operação, berçários, en-
fermarias e salas asséptiças, tem sido bem sucedido. Os restdta.dos demonstram
que há uma redução apreciável da conta1ninações e das infeções cruzadas. Pre-
caução indispensável é evit.1r a incidência direta da luz ultravioleta sobre as
~soas. pois ela produz, conforme o tcn\po de exposição, queimaduras graves
e lesões severas da córnea.
As radiações ionizantes exercem atividade de forma diferc1\te, pois ati.1\·
ge1n os átomos e são incomparavelmente mais eficientes. Enqi1anto que, para
w matar uma ~lula de Eschni<"J1UJ t0l1 Slo necessários ter
quat1ta, no caso dos
r.110:. UV, apenas 1 quantum é suficiente quando se trata de radiações ioniz.-.n·
h Seringas, agulhas e 0\1tros materiais descartáveis têm sido esterili.tados
por esse processo.
1.6.4 - Filtração
A passagenl de soluções ou gases a tr;iv~s de filtros de poros suficiente-
mente pequenos que retêm microrganismos pode ser empregada 1la rcmoçJlo
Jt> bact~rias e fungos, deixando entretanto passar a maioria dos vírus.
As \'eJas porosas de porcelana foram muito usadas no passado e atual·
mente sJo empregadas membranas filtrantes de nitTQcelulose e acet.1to de ct-
ulose para esse fim.
A filtração tem como principais aplicações a esterilizaç3o de soluções
ttrmossensíveis e na entrada de salas ou ambientes onde qualquer microrg<.l·
~ismo do ar é indesejável. Muito comum é a esterilização do nr que é borbu·
hado cm nleios de cultura, sendo bastante empregados filtros de IA de vidro.
3) 1:echar portas e janc..las dur<1ntc o tr.1balho en1 labora tório de nlic ro-
: c-l<tg ia. para e,·i ta r conta n1i n;içõcs <',rigi na(las pelas correntes d e :'Ir.
4) Limpar é dcsinfctJr a bil1\cada antes e ;ipó:; o Séu t1so. 1\ s p.11·cdes e o
.:-h,\o do lal>orat6rio ta111bé n1 dcvcn1 éSlar sc n,pre be111 lin1po:>.
5) L:ivar as 111ãos con1 s,1b,\o 0\1 deterge11tc, antes e depois de execu tar o
::J.l'Jlho.
6) Nolo coloc<lr n ad.l na boca. ~ão co1ncr. beber ou íun1ar dc:ntro d o lí.'lbo-
..J~Qrio. l' í'l ra pipc1,1 r, usar pipet.1dores de borracha ou ,1uton'lâticos.
7) Prender os cabelos, quando longos, para evitar o contato com a cJla1na
do bico de gás.
8) Descartar todo o n1ateriaJ contaminado cm local apropriado e seguro.
Tr.ltando-se de pipetas,. lâminas, etc., dcixá·las 1nergulhadas em solução de-
sinfeta1lte apropriada por tempo determinado, antes de ser efetuada a Java·
genl e esterilização dos mesmos.
9) Evitar a produção de aerossóis que possam conter n1icrorganismos vi·
vos, pois estes podem ser fontes potenciais de co11tamiJlação e de infecção.
J-\ erossóis são partículas, líquidas ou sólidas medindo apenas a lgu11s nlicrõ-
metros,. que permanecen1, em (unção do seu d iminuto tan1anho, suspe11sas no
ar, podendo ser inaladas pelas pessoas que estão no local. 1>ara evitar os riscos
origi1lados peln for1naçâo de aerossóis, o procedinlento rcco1nendado é o uso
de câmaras espé<:iais para a prática com Lnicrorganismos (Vo1.2, Cap.5).
10) f\1antcr scn1pre a atenção no trabalho q1te está sendo executado, a
fim de evitar acidentes.
11) Ao carregar tubos 110 laboratório, nunca colocá-los 110 bolso mas sin1
acondicioná-los em estantes. O mesmo deve ser feito com placas e outros 1na-
l<?riais, que devem ser transportados e1n ba11dejas apropriadas.
12) Após a quebra de qualquer recipiente contendo microrganismos, co-
brir imediatamente o local com toalhas de pap<?t saturadas com solução desin-
fetante. Deixar at\1ar durante pelo 1ncnos 15 min.
13) A manipulação de (ungos deve ser rápida e eficiente, para evit.lr a
contaminação do antbiente co1n esporos.
Para cuJtivar \tm n1icrorgnnismo como a Escllericltia coli, por exenlplo, re-
corremos a um meio de cultura esterilizado (ise1\to de formas vivas) e adicio·
namos a ele uma pequena quantidade de material contc11do c~lulas vivas
.:ot~1,1 bactéria: ,1 este tnate rial, d.,n,os o ''ºº'e de iuõculc> e à :idiç.'1<> d<> inclculc>
ntl'io csléril cha1nan1os tie i11c>c11/a('rlc> {<l$ instrun1cnt<>S titilizados e procedi·
-~ri tos en\'Ol\'idos com a inoculaç,\<) st~r.\o dcscl'itos postel'it)l'1l1entc). 1\pós ;i
- '(ufaçào, o n1eio de c11lturt1 é incubado (acondicionado) por ten1po delCt'Jlli·
- ·..:it), sob co11diçôcs a pl'Opriadas de oxigcoJçâo. ten1peratura, ~ te. J>ara que as
~..iiçôes de incubação f,\\•or~J111 o crescimento d<1 microrganisn10 inocitla·
o 111icrobiologista d~\·e conhecl'r prc,·ia1l,l'1, lc .,s c.1rJctcrísticas fisiológi·
., . <lo oticrorganisn10 estuc.iado. Durante a incubação ocorre a n1ultiplic.1ç.\o
• n1i<rorg,1nisrno da11dt) origen1 a un1.1 cull11ra.
De OGordo com o tstodo fisico, os meio$ de culturo têm usos específicos e devem
ser acondicionados de fotmo apropriado.
1 (d)
nado n1icrorganis olo. 1-\ principal fu11çâo desse tipo de meio é manter a viabi-
lidade dos possíveis microrganismos presentes, ai1\da q t1e 11ão favoreça a s ua
multiplica,ão, o qt1e muitas \rezes não ê aconsêlhável, considerando os p rodu·
tos 1netabólicos tóxicos que se acun\t1lam no meio.
38 T~WW"MI-~
AfrÍ()i $c!letlvo1:
Ág:ir d1."()i.:icol;,it()citr;1to Exteato de c11.rne e p<:ptona, 10; citrato d..- sódio, 10;
citrato férrico de :imõnio, I; d1.'0i.:icol;1to de sódio, 5;
vermelho neutro, 0,()2; .igar, 15.
Caldo Mac Con.key Peptona, 20; li\ctosc, 10; cloreto d..- sódio, 5; tauroco·
111.10 de sódio, 5; vermelho neutro, 0,03.
/vl(i0$ dife-r.·nrUlis:
Agar Mac Conice)' Caldo ~fac Conkc)' .1crescido de ágtir, 15.
A1rio Je tr.in.sportt:
Asar glicerol Cllrerol. S; ~~xtr:ito de levedura, 2; fosfato dibásiro
de potássio, l;<ig.,r, 15.
ágar nutriente), após pesagem e dissolução em ágt1a~ o meio deve ser aquecido
até a total diSS<>luçJo do ágar. Uma vez aco1ldicionados em frascos apropria·
dos e esterilizados por autoclavação (Cap. 1, item 1.3.) São subseqüentc1nc1ltc
1
(e) 1iror. OOtl"I o dedo mínimo. a tampa do (d) lncx;ular a amostra oom movimentos de
MX>. Flambar a boca do tubo. ziguezague sobre a $Uperfteie dO áS>ar inolinac:lo.
(•) Flambar a boca do tubo antes de fech81. (f) Flambar a alça ou o tio imediatamente
apósOU$0.
~o estéril ou um frasco contendo uma c-ult\1ra p\1ra,, por exemplo), a borda
•tubo deve ser rapidamente passada na chama do bico de Bunsen imediata-
9t'Ote após a S\La abertura e antes de ser fechado (Figs.2.4c e 2.4e). Essa prá-
IKa evita que eventuais orga.n ismos vivos, presentes nes~ região, caiam
*"'tro do frasco, contaminando o meio 0\1 a cultura. Esse procedimento
ctt.ama-sejla,,1bage111· (Cap.l, ítem 1.6.2) e deve ser utilizado durante a reti-
sada de amostras, inoculações ou semeaduras em meios estéreis contidos
cm tubos ou frascos. Lembramos aqui a necessidade de adotar um sistema
wguro para que a tampa 1lão íique exposta à contaminação, por exemplo,
llllWndo a deixamos erradamente sobre a bancada. Para ta1\to, aco1lsclha-se
uso do dedo mínimo para segurar a tampa do tubo durante todo o tempo
• manusc;o (Fig. 2.4c, d e e).
Poro eviror o contaminação de um meio de cultura sólido, contido em placa. exis-
tem técnicos de assepsia apropriados.
Para tanto, a tampa da placa deve ser mantida sobre a bancada com a
kirda para cima, o 1nais próxima possível da chama do bico de Bunscn,
ftt<iUanto a placa contendo o meio de Cltltura ~ segura c:om a mão esquerda
wnbén\ perto da c:hama (Fig. 2.4b). Como alternativa, pode ser utilizado o
rocedimento descrito na Fig. 2.8, onde a ta1npa é aberta sem a separação total
da base da plac:a.
• Atrn(do! A fta,,1b.tg,.,,1 nlo 4i:w HT adotada qunttdQ (1$ lfquidw utili;ados tt111 07rncterlstiots
inJlan1'1.1tis!
(e)
(d)
(o) (b)
..._ ...........--aomo...
~~~Me~ {•)~dcplat>N.. de~<tO'l"IOCU dt ~ (b)lo
FltW'll.S
de~(<) ...... '-'.r.(d)_ .. .._..(... -~(fl
~ fO'd6ea. (~ ppeudor mtdJ KO<Om ~de pliMlcO.
A alça e o fio de platina podem ser \1Sados para retirar pcquen;;is qua1\·
tidades de 1naterial sólido, por exemplo, microrga1\i.Sn\os provenientes de
llll\a colônia cm meio de cultura sólido (Fig. 2.4b.). Para tanto, basta tocar a
.lç:.l ou o fio no material; a quantidade de material ou o número de microrga·
~mos retidos na superfície da alça ou do fio não é mensurável e, conse·
i.tentemcnte, este método de inoct1laçâo só poderá ser usado quando este
Nrâmetro não for importante. A alça ou o fio co1\tcndo os microrganismos
mergulhados no meio líquido e lentanlente agitados para a libcraç~o do
"'6culo.
1
1
~
1. Recirando o~
coma alça
llÍlllll..,.
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llidO
lllli~me
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~ 3.
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Figur~ l.6 - T~clesemeadul'aemestnasparaaobcençk>decolõnias~.A~dertrodoqwdro11'1ô$
vaa~c()tl'$~ ~ dur;v'f.e a ~a. l)Coma alça n?tira·sc oin6wbc» ~. '2) lllC)(l)br«itn a
~ ccwendo os muorgarwnos a ~ do ágM etn estnli (Ot't\ tnc:Mmentos em ZltVt~. c()tlÍOt'n'IC <:$QV'C•
m.1 emA 3} R.epet.- o pnxtdf'ncn:o scgvirdo esquema em 8. 1) ~opnxecltneM> ~ esqJefl'la em C.
2.5.3.1 .). A seguir a p laca é incubad1l por 18-24 horas a 37ºC. As placas de·
vem ser incubadas na (orma invertida, para que as gotas de águ.l geradas
durante a incubação não pinguem :.obre o meio de cultura, prejudicando o
isolamento. Ourante a incubaçJo, a.:. células que estão separadas e que (orem
capa7tt de crescer nesse meio de cultura originarão colônias individuais.
Após 2~ horas em ãgar Mac Conkey. células de E.coli dão origem a colõnías
J'<'dondas, ' 'ermelhas, com apro"imadamente 2-Jmm de diâmetro; 1odavia1
nl"n\ todas as colônias com esta apa..Vncia serão obrigatoriamente de E:.roli. O
próxhno passo é escolher a1gumos dessas colônias para exame mais detalha·
do. Co1no E. coli é bastante con\u1n 1\esse tipo de material, é provável que ai·
gumos destas colô1lias perte1tçan' o bactérias do gênero E. coll. Antes de
eder:. identificação, é necess.irio ctrlificar-se que cada colônia seleciona-
.&. ronlém «lulas de uma mesma ~pécie de organismo. Existe sempre ri pos-
91it',JidJde de uma determinada colônia, mesmo bem separada, poder conter
lul.lb de d\1as espécies diferentes; isto pode acontecer se.. durante a bemea-
cfur.l cnl e~trias, duas células de espécies diferentes permanecernnl muito j\ln-
ll~ n1.1 superíícic do meio. J>nra resolver esse problenll.l, cadn colônio ~
IUhcultivado ôtl repicada; subc11ltivar ou repicar é unl procedimc1ltO ntrav~s do
.pulas relulas de uma cultura pur:. O\I de un11.1 colônia são transferidos pora
mn novo 1neio estéril. Para subcultivar uma colônia basta tocar leveme1ltC
ma al(a a superfície da colônia, de forma a obter a adesão de uma quanti-
4.1..ft mínima de organismos. Esse pectu('no inóculo é então semeado "º"ª-
~te em um n0\'0 meio de ~gar t\·t ac Conkey. Algumas bactérias form1om
'ónia~ muito pequenas e, nesses casos, a «picagem toma-se mais f.icil se for
6r1ui com um fio de platina; o inóculo é enl.lo carregado para o nO\'O meio e
i:t espalhado em estrias com uma alça. Cada placa inoculada com uma
911nples colônia ~ então incubada. Se C.Jdn colônia \'ermclha repicada repre-
wnta uma única espécie, teremos, npós incubaç:\o dessas placas, várias cult\I·
<1:11 purJs. Um1.1 delas poderá ser de E. coli. Outros repiques poderão ser feito~
Cl.'m o objeti vo de aumentar a probabilidade de tcr1nos de fato culturas p\lras.
C.d;i c-ulturJ pura dc\•erá então ser exonlinada pelos procedimentos adequa·
6....., pora a identificação dos microrganis1nos.
PlaeM inoculadas na
posiçOO in~rtkSa
Volt1Ule da aJnostra
Fator de diluição= - - - - - - - - - - - - - -
Volume total (amostra+ dilt1ente)
Exemplo: 1,0 nlL de uma cultt1ra de bactérias é pipetado ent 9,0 Jnl de
tolução salina(NaCI, 8,Sg/L). O fator de diluição, neste <:aso, pode ser identi-
ficado por 1:10, 1/10 ou 10·•. Se 1,0 mL da d iluição lff' for p ipetado em outro
tubo conte1tdo 9,0 ml de solução salina, o novo fator de d iluição a partir da
.amostra inicial será 1:100 ou 1 / 100 ou 10·2 (Fig. 2.12a).
O.t~
(a)
(C)
Fl.gurA 2. 1O lkN dm,ar.\ de con~ lipg. (~) V!St.11 bteral: (~ tu'N UmN ~de \'ldfo ~
com~~W'IU;lldeO.lmmabao!odorWtfdasbterM.AplUJA:)tm;:i<entralf:~cbon"ibrOJIM~~
porl.l'NI c.Md.ldc ele Qda '-k>. (b)'Asta supencw: 1'111 ~ deudlmctaclt dai pWfotrN ~..-~~um cp.11·
d-adc>~em<400~qwó'ados.adaU"ndc 1• .,~. lkN~~Set~e~
tobrt•bonkl~dldtn.n.:pwaets"oCO'ILICO . . . . . . ,~ôM'ser~•epdaleYetndlltP*tu·
pctfl:.e ~~ wndopd$i0~ (f"""' dpOd!dGMO. 8cr.!tnain ÔOICltf. &owc:htlo4:>0'oidMcodo-
,..._ dt PU S- ~ Ed jCfln \Wey & Sons. 4 • cd 1997 l
'
~ _ Bac::1ltr1a
• ., cilfnclrlca
Tabeb 2.l - Pr~dl.C$Gta ele Ml<.f.vl.Wl(Tab& v.lduzicb eadapWa dofwo: 1-haobiology. A lcbo·
ftH>f'/l/qltJdde~ '1.1 td. ~~~Publ.CoMp.. W .. 1996.).
1 0, 1 9.9 JOO
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2.13 - Método dlpa "Milcs t Mii:sta.º, "4 gotas ~de dbções l'l'lel'IOfeS ~cresci·
""C'ltO,potê:'i\No~colõniiisisoladlsCQmQasaprcsenudunugous~tsdt~~.
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(Mar 1 ~)-(b)E$CO!'l'tl"a~de~dt!oacnclll'll. (c)Cobft'a lltronacomuma~~CleiOdo
e ~de pcUwo (L.up). (d) Ot$.corar .a ~l)l'1Çao, vtrttndo~ sobre a L\rNn..1 um ~l'llt como o
$llOl 9S.•. Wc ~<li coloraçãoé~. 1,m11 ~1 que: o tw.ot ~ laviV a. llmn& IPC"ll$ Plt'I cxtr"" o'°'.,_
<f.lt.., ~<ta~·(•) LMtonfrcpçoemJe,A COl"l'efU_ Nts.Sa mpa as «U.ts~ntpllYll pei-.
defiOO(ll)l'ltq ~~.er'IQUlf'tO.t\Vrlfl-po<'-'M~JoattJ(f'Cll(iOUIN~A l"ften-
çlodot01 ......~de~ -ltJ=ll- (f)~. _.... odc:pp.oo:rncdeo::irvdc l'\ainfidl.lidol)
c.,._ JO~ (&'I LMt a ~O)l'l'l ~~ (h)*-«m~ de litl'Ostftl'""S*. pnnloNnW>
. , .O et6'«0- ~ 1 ~ tf'ftftlOOKÓpO«Wft ~ dt l'l'llel'Slo(~de 1 0X>W111K).
Refe~ndas bibliográficas
(1) ~1 EYNELL, C.C. ET ~IEYNELL. l . Thtory ""d Pr,.<ti« ln Exptrimtnt;,I 8.a(;ltrio-
logy. ?' cd. lngl.tttrra, Cambridge Uni\'t!rslty Prt'..?C, 19i0.
(l) C1\RVALHAL, ~1.L.C.; OLIVEIRA, ~1 .S ET ALTERTHU~i. F. "An <'ConomlC'.~ I and
thnei '""h'S alt~rn."llÍ\'e to lhe most·prob.nbh.• • number method for the enumer<lllon oi miC'roor-
ganliun!J.", J. ~li C'robiol. ~1e th., vol.14, p.16S - 170, 1991 .
(3) TAYLOR. J. lhe e-stim.1tion o{ n1.1mbtr-$ o f b.1ctcri01 b)' tem fold dilutions tot'rl~ • J.
Appl. BaC'tt'riol... , .t>L25, p.54 - 61, 1962.
(.. ) NORRlS, J,_R. ET RIBBONS, O.\V (td~.) ~1 t'lhod.s in ~i.icrob i ology, Yol l, AC'adt"m1<'
Pr~•. Londret', 1969.
(S) CERHAROT, P. (EDITOR l" CHIEf). \IURRAY. R.C.E.; COSTILOW, R.
TtR. E \Y.~ \VOOO. \V.; KRl.EC, N.R. ET PHILLIPS, C.B
NfS.
~f.i_nu.il of ~1t'lhodJ for Ct'nc-r-.11 Bac-
'° ;
lc-riology. AtftHK.tn Sodd)· foir ~1acrob~y \\'...,,gton. 1981.
Leitura complementar
10 \'IRY, 0 .11.; ROSEBKOUCH. N.J.; 1AN, A.L. E'r IV\Nl)AL, R.J, "Pro1cln n\t.-~urc-·
l'l\t'nt \\•llh Ih\' Folln phenol rc.igen t~. J.Uiol. Ch~n1 ., vol.193, p .265, l951.
STUKUS. P.E. lnvesti311iting f\.ticroblolog)' - A L~bor:.tory f\1<1nu<1 I for Gcncr•I ~~i
crobiolog)'· Saunders College Publishing. EUA, 1997.
MILES, A.A. ET MISRA, $.$. ·Th~ esthn:.tion of thc ba<t(!ricid:1! põ'"er of th(' blood ~. J.
Hyg. Can1b .. vol.38, p. 732 - 742, 193$.
ti06EN, H.J. ET 50'-iASEGARAN, P. "Comp.irison of lhe pou.r, sprcad ô'lnd dr<>p plate
methods for \'n\lmération of Rhitobi1tn1 spp". Appl. Environ. f\t itroblol. vol.44, p.1246 - 1247,
1982.
ELEMENTOS
,
DE GENETICA
DE MICRORGANISMOS
João Lúcio de Azevedo
3.1 - Introdução
A Genética é tuna das mais recentes áreas das Ciências BiológicJs que,
de uma nla1\eira bem geral, pode ser definida conto o estudo da tra nsmissão
de caracterís ticas de (IScendentes para descéndentes. Essas características cha-
madas de hereditárias, são transmitidas de modo ordenado em todos os seres
nvos. A Genética procura também explicar como ocorre a e1tormc ''ariabilida·
dt que pode ser observada entre e dentro das espécies.
Sendo o material genético, na grande n1aioria dos seres vivos,. constitui-
.:lo pelo ácido desoxirribont1cléico, ou DNA, a Ge11ética possuí stias rcgr.lS
.aplicáveis tanto a plantas e a1l in1ais st1pcriores co1no aos microrganismos. É
!"90 ONA que estão as informações genéticas ne<:essárias pa ra a mantitenção e
~revivência das espécies. As leis fundamenta is da Genética foram descritas
:-ela printeira ' 'CZ, na segunda metade do séctilo passado, e1n ervilhas. E1r1bo·
!'a com a redescoberta dessas leis cm 1900, e as plantas e ani1nais sere1n am·
~amente tisados em pesquisas gc1\éticas, a introdução de microrganismos
Jet1 um"º''º inlpulso à ci~ncia da hereditariedade. Foi a penas em 1941 qt1e
~gos foram efetivamente introduzidos enl estudos genéticos, segt1indo·se
~ctérias e vírus, a lém de algas e protozoários.
3.2 - Mutação
3.2.1 - Mutações espontâneas e induzidas. Agentes mutagênicos
Qualquer alteração no material genético que seja capai de ser transmitida
aos desoondentes, constitui uma mutaç-ão. Existem vários tipos de mutações.
""""" 65
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. •••• •• . ••••••• . ••• • f~
3.22.3 Mutantes-•ag<ntes•-es
Se uma populaçJo de células de linhagem microbiana é colocada em
p rese n ç\l ~dc um agente inibidor e sendo CS.S\l população originariamente scn·
sf\•cl ao agente, son\e1l tc mutantes resistc1\tes poderâo se 1nultiplicar e for·
mar colônias cm presença do mesmo. En\ bactérias_, mutantes resistentes a
antibióticos, quimioterápicos e sais de met.li)o pesados Wo muito empreg;J·
dos. t-.1utantes resistentes .110 antibiótico estreptomidna Slo representado.,
por slrR, O,!, resistentes~ ampicilina são chamados de ampR e assim por dian·
te. Em (u1tgos. mutantes resistentes a cor,1ntcs, fu ngicida:. e otitros agenl(>..
são tanlb~nl basta nte c1nprcgados e1tl gc n ~ t ica. Inibidores nl"io são apena~
antibiótico~, fungicidas ou outras drogas químicas. Agentes físicos e bíológi·
cos também impedem o crescimento de microrganismos e pode ocorrer rõi\·
téncia aos mesmos. ~ o c•so de mutantes resistentes à luz ultra\•ioleta., alta4
temperatur.t:t, vírus, etc.
,·ioleta solar.
3.2.2.8 - ileve•'SÕeS
Assi1n COlllO tim nlic rorga1\ isn10 pode muta r p a ra a 11xotrofia, resistência
a antibióticos, ca rJcteristicas morfológicas e outras. e le pode ta mbém sofrt r
reversão dessa nlutaçào, \'Oltando ao tipo normal ou S{'l\'agcn1. Essa nlutação
re ve r:;a o u rcvel'S<'\o é c hamada de ve rdJdeira, q uando rep a ra exatame nte o
defeito C(l\1sado pela p r i1llC'ira n1u t(lçào. Ela p<>de ser tambén1 supressora
q ua11do ocor re em outro local do genom(I, podendo ser no 1nesmt) g('nc onde
esta va localiz;:ida ;;i p ri1n eira n1utaçào, 111as não no n1esn10 local da primeira
al ter(lçào (r eversãc> in.tragêr1ic.1) o t1 e n1 outro gene (reversão intcrgênica). A
re versão, cspe<ialn1ente a volta da a uxotrofia para a prototrofia, é muito e1n·
pregada para a detecção e determinação da cficil'ncia de tllll agente mtitagêni·
co. l'elo n(Ín1ero de reversões obtidas após o tratamento com um suposto
agente n\utagênico, em con1pa ração com un1 co ntrole, pode·se concluir se ele
é realmer\te mutagênico, e nesse caso, s ua eficácia eo1 causar mutações pode
ser cstinlada ( para maiores dctalht>s cons ultar 1, 2, 4).
lizar pesq uisas sobre a hcrcdit.1 riedade. Não é portanto por acaso que foram e
contiiluan' a ser desenvolvidos 111étodos r~'ipidos e c(icazes 1\0 isolanlClllO de
n1utantes. Esses n1étodos são b(l$tantê d ivers-0s, dependendo do tipo de mu·
-
""""" 71
o
Colõnia resistente
--f.0~~80
i 0o ' ºJ'
sem nunca ter
entrado em contato
com o antibiótico • oo
•
Placa de Petri oom meio Pl<K:a sem Placaoom
de cultura sem antibiótico antibiótico antibiótico
no ({uai estão crescendo bactérias
/Réplica\
- ô Coloola reSlstente
ºººº
9o00°o
º8$º
t-.teiosem Meio com Placa sem
antibiótico antibiólico antibiótico
Bactérias isofadas na
posição oorrespondente
ao crescimento da cotõnia
na placa oom antibl"ót/lco
Placa com
~
J
Réphca ®---
antfbiótioo
8actérias is.oladas na
posição correspondente a
uma ou mais oolõnias na
placa oom antibiótico
Placa sem Pl&ea sem
antibiótfoo antibiótico
©
Figura l.2 · A té<nia ~ rópflQ para transferência de bactéri.l:s. A)A 1r'3nSl'crênoa de e~ da pb(a para o vefudO.
8) /.pie~~ dl tkOO no ~o <!e ~t°"s resisttnt<$ a um antibóico !TIO$~. inc1vstve. qw a mut.lçãô
p.lm te-.;;.16noo ocorre pr~te ao comato com a drop..
- 73
é usado em casos com resistência poligênica1 isto é, ql1an do ' 'ários genes estão
envol\1 idos, cada L1m conferi ndo tima peqL1ena resistência. Nesses casos, utili-
za-se a placa gradien te (Fig. 3.3), q ue faz com ql1e t1m meio de cultura apre-
sent·e um g radiente de concen tr.içõcs de zero até tim lim ite máxin10.
Colónia$ resistentes
o • ••
••
M
éij ••
• •
a) Ptac.a vista de lado
• • •
• •
Gradiente
+
b) Placa vista de cima
Dessa maneira linhagens com gcr1es cro1nossõ1n icos para alta resistên-
cia a penicilinas, cloranfenicol, tetraciclinas e outros antibió ticos p Llderam ser
isoladas (para unia revisão ' 'er 14). O isola111cnto de rnutantes morfológicos é
feito por inspeção v ist1a l, r1ão existindo pratican1ente L1nla'n'ta11e ira de se fazer
urn enriqt1ecin1e11to pré,do. O importante no caso é ter en1 r"11ente qt1c altera-
ções do ambiente poden1 tan1bém alterar a morfologia de colônias n1icrobia-
nas. Assim, o isolamento tcn1 qt1e ser feito ein cond ições bem controladas. Há
necessidade de ' 'ários repiques de colônias corn rnorfologia a lterada para ' 'e-
rificar se a característica é realmente ge11ética e 11ão devido a 1nod ifica\õeS no
ambiente.
Mutantes para maior ou 1nenor produ\ão de SLtbstâncias e li mi11adas das
células microbianas, para o 1neio de culti, 10, são tan1bém isolados em meios
que permitam essa disti11ção. Para o isolamel'1to de mutantes com produção
alterada d e unl a1ltibiótico, por exen1plo, colô11ias podem ser dese1lvolvidas
e m meio sólido e depois colocadas em presença de tim n1icrorganismo sc11sí-
vel. Evidentemente esse microrga1lismo não poderá c rescer ao redor de colô-
nias produtoras e qL1anto n1aior o l1a lo de irtib ição for1nado ao redor da
colô1lia, maior deve ter sido a prodL1ção de a11tibiót ico pela 1ncsnla. De igt1a l
forrna, o isolamento de un1 microrg.i11is11lo con1 n1ais a lta ou mais baixa pro·
dL1ção de u nia c1lzi1na do qt1c a li1lhagem orig inal, pode ser feita em meio
apropriado. Para a n1ilases pode·sc Ltsar n1cio co1n am ido e ,,erificar a prese1l·
ça de halos e set1 diân1etro, usa 11do·se t1n1a solução de iodo q L1e , rai colo rir de
azul as regiões do meio com a mido e pe rnlitir o a pa recinlento de ha lo claro ao
redor de colô1\ ias que produzira1n a milase. l.,rocessos semelhantes são fei tos
para o isolamento de mutantes com prod \1ção alterada de cch.1Jases, lipases,
quitinases e n\uitas outras erlzinlas e produtos. Embo ra o método seja sen\i·
quantita tivo, e le permite uma seleção das colônias mais pronlissoras, que d0-
verão então .ser submetidas a ensaios mais acurados. Foi por meio dessa
nletodologia q ue li1\l\age11s mutantes de valor industrial (oran\ obtidas pa r<'I a
prod ução de antibióticos, enzimas, ácidos orgânicos, entre outros. Mutantes
para locomoção alterada sll.o isolados cm 1neios senli-sólidos; mutantes pa ra
patogenicidade são isolados em p resença de seus llospcdeiros; reversôes de
mutantes a \1xotr6ficos para prototróficos podenl ser isolados semeando -se
grande qua1\tidade de células en1 rneio mínimo, onde só células con\ n\utações
reversas poderão crescer. Eníim,. os processos para o isolamento de nt\1tantes
são variados e essa é u1na área bastante criativa, e sen\pre en\ expa1\Sào den-
tro da ge11étic.;i microbiana.
Linh:lgom Linhage
tte~: ..U'"; llr blo-; mel
•
Meio minimc>
(l\Ao há cr-esdmento)
..
~1tlo mínimo
(Cro&cimttlto 61 1eootnbltlan1os)
Firural.4 .. ~~re<~tfl'lbla~por~com~es~ddoeintes
~.a.a WllN!<le fftQnni(tre-). ltooN(IN~), T..)nW'I.) (ba ), 8lobnl (blo-) e MeOO!'W'll{mec -) ~ un
tubotmU.
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Plasmídlo
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ã· R~n:~ Cf't"
WJ
@ ~ Permul8
desigual (F )
que depois foi generali?.ado para praticanlente todos os seres vivos. O proces-
so de transforntação, ao contrário do qt1e ocorre na conjugação bacteriana,
nlo r:equer um contato ~tre duas células. nem tipos de reação sexu3l di.st1n·
tos. É a.ssim um mecanismo alternativo do sexo, mas que, da mesma forma
que a conjugaç3o, produz recombinantes. Tendo sido descrito em S. p1'tlirt1(JllÍ·
•t, vcriíicou·sc logo em seguidn que outras bactérias tamMm eram capa~es de
,erern tra1\SÍOrmadas para as mais diversas características e não apenas para
virulênci:.i. Atunlinc1l te pode-se dizer que qualquer gênero Ot1espécie baclcri·
.lna, dependendo dns condições de cultivo e certos con\poncntes qufnlicos
adicionados no meio, podem sofrer transfor1naçõo. Também pode ser trans·
formada qualquer característica gen~tica bactcria1la, seja auxotroíin, n\orfolo·
gia de colõnia, resistência a agentes inibidores, etc.
AS FASES DA TRANSFORMAÇÃO BACTERIAt'IA - Assim romo
ocon-e na conjugação, a transformaç.lo pode ser di,ridida em etapas ou fases.
'.':a natur-ei;a, antecedendo ao processo propriamente dito, de,•e ocorrer lise de
células de tal modo que seu DNA fica livre no meio. Em laboratório e~i~tem
diferentes métodos para extração do DNA das células que vão doar esse .icido
nucl~ico, qt1c sJo chamadas de doadoras, parJ as células qt1e ''30 receber o
ONA,. ditas receptoras. O material gcn~tico .issim extraido é chamado de
ON1\ exógeno.Esse DNA deve ter ta1nanho rclotivamente grande pnrn que o
tra1lsfornltiçào seja eficiente e deve estar cn\ seu estado de fi l'a dupla. ·r11nlbC:n1
é 11cccs.sdrio que as células receptorJs estejam ein um estado de aplidt\o para
receber o DNA. Esse estado,. chanlado de NC'ompetência", depende de diferes\·
tes fatores: existência de receptores espec(ficos para o DNA, fase de crcsC"i·
mcnto bacteriano, que por sua ' 'C7 produz modificações na membr.ina e
modific11~ no meio de cultura, que podem propiciar aumento ou diminui·
ç3o da competência. Atualmente, det·e rminadas técnicas como a eletroporolçlo
(abertura de poros da membr-ana por forças el,tricas), ou a utiliução de pr~
toplastos (célul.ls ~m parede) podem aumentar a freqüência de transforma...
çao. F.ltores genéticos também est3o envolvidos, tendo sido inclusive iSOIJdris
linhugen~ cot11 -~ isto é, constituídas por célt1I;•) não competentes e pot'l.lnto in·
capazes de sofrer tr.1nsformaç3o. Umn vci existindo ONA nativo, ou de íit.l
dt1pla disponível, <:existindo (élulas con1pctentcs, o contacto célulll co11lpC·
tente·DNA pode ocorrer. As fases que se desenrolam durante a transforn1oç1lo
são 11s scguintt'S: a) Entrada do DNA c.xógcno nn célula receptora - en1born
ele prC(iSC estar enl seu estado nativo de dupla hélice, com algumas exce~e~
a~nas umn fita do DNA penet·ra na «lula re«ptora. O processo de entrada é
bastJnte complexo e seus detalhes n.Jo são bem conhecidos. b) lncorpor<'~~o
do DNA exógeno no cromossomo da célula receptora: o DNA que penetrou
na celulil receptora vai se parear com a regi3o homóloga do crom~o da
mesma. O mecanismo de permutaç-Jo ou · crossing'"°"er' ocorre como na ron 4
Fragmenios
livres de ONA
Figura l .8 .. T~l»aen.lN.A, 8e( s.lo~dacék.ia.doadora, sendoque o, bec slo~homólo
gos na célill re<:cplora. O gene 8 wt>Muiv o &C'\C I> "- dlt.la reccp«n.
- Novat palticulas
Ot vlrus
ONAdo
VÍN$
-·0,.. ,.,
J~e su ltar\\ llSSim de uma célula lisndn un\ ou poucos fagos que contên\ no
interior de su<'I cc.pa protéica DNA de bact~riri. Isso não impede que eSS<l fago
alterado infecte um nova célula e injete o ONA dentro da mesma. 1\í, cvidcn·
temente nào vai ha,•er lise, mesmo que a célula receptora seja sensível ao fago.
O DNA no interior da bactéria vai se comportar como na transformaçio, isto
é. \•ai haver um pareamento entre esse )Cgment'o adicionado à céluli, com o
cor~pondcnte homólogo do cromossomo bacleriano, •crossing-O\'Cr..e apa·
recimento de recombinantes. Nesse tipo de transdução, qualquer gene bac-le-
riano pode ser carttg.ido da célula doadora p.1ra a receptora e por i))() ela f
chamadll de tr.lnsdu~o genE>ralizada. Con\o s.\o muitos os fagos que infect.tm
diferentes t."Spé<ies de bactérias. o processo é- de ocorrência ampla. tendo sido
dct·ectado cm diferentes géneros de bJct~rins. tanto gram·posit·i vas conlO
grnm-ncgativas.
TRANSDUÇÃO ESPEC(FICA OU RESTRITA - Morse, Lederberg e Le·
derberg (24), procurando novos virus que poderiam servir de vetores para
eíetuar a transdução, verificaram que um determinado íago cha.mado de
lambda (}~)era capaz disso, mas que a grande maioria das bactérias que sofria1n
transdução só o fazia1n para un1 gene, o que condicio1\ava ou não a utilização
~e galactose como única fonte de carbono (gal). Esse fago é do tipo lisogê1\ico,
isto é, pode ser incorporado no cromossomo bacteria1lo. NeSSt!' caso ele não
lisa a c~lula mas se multiplica juntantcntc com o cromossonto da mcsn1a, pro-
tegendo-a do ataque por fagos relacionados. Um fago i1tcorporado ao cron1os-
somo está em um estado designado de profago. Entreta_nto, cspo11taneamente
ou induzido por luz ultravioleta, ele pode sair desse estado, liberando-se do
('romosson\o bactcria1\o. O DNA do fago agora livre se 1nultiplica e <'entenas
de partículas virajs con\ capa protéic:a sâo fo rmadas e liberadas lisando a c~lu
la. Uma pequena fração dos lagos liberados, quando saem do cromossomo,
carregam co1lsigo parte do cro1nossomo, à semelhança do que ocorre co1n o
plasmídeo F quando se modifica em F' (ver conjugação). Como o local de liga-
ção do fago no cromosson10 bacteriano é sen1pre próxin10 ao gene gol, é ele
que vai ser incorporado ao fago. Raramc1\te outro gene, o da deficiência nutri-
cional para biotina (bio), que está um pouco mais distante do que gal no local
de incorporação do fago, é também transferido. Quando esse íago, carregando
o gene gal+, p~r exemplo, vni infectar un\a bact~ri a gnl-, ele pode se incorpo-
rar ao cromossonlo dessa bactéria que vai ficar conl dois genes gal, unl selva·
gcn\ e outro nlutante. Forma-se assim um heterogenoto que pode novanlente
liberar o fago co1n o gene gale nesse caso metade das partículas virais que re-
sullam da lise da célula l'ai carregar esse gene, dando lisados chamados de
Hl-1 (High Frequency of Transduction). A Fig. 3.10 mostra os principais pas-
sos que ocorrem na transdução restrita.
TRANSDUÇÃO 1\BORTJVA - Em certos casos de transdução, o nlateriaJ
genético da bactéria doador,1 ('arregado pelo fago vetor penetra na bactéria re-
ceptora mas, por raZôes não bem clucidndas, não é i1\tegtndo ao cron\osso1no
bacteriano e, não tendo duplicação autônonla, também não se duplica dentro
dela. Exemplificando para o ct1so de u1n ge1le selvagcn\ para \tma auxotrofia,
tr.1nsduzido para uma célula receptora que possui essa auxotrofia, o que vai
ocorrer é que o gc1\e il\troduzido propic-ia a síntese da substá11cia em fa lta.
Entret.1nto,. q\1ando a bactéria se divide em um meio mínimo, apenas uma das
células filhas irá ter o seg1l\ento e só ela poderá dividir-se novanlente. Assim,
en1 lugar de unl crescimento em escala geom~trica, vai ocorrer um crescimen·
to em escala a ritmética. For1nam·sc então en\ ttm n1eio sólido colônias nti1títs-
culas, caractcristicas da lransduc;ão aborliva. A transferência das células de
uma dessas colônias para um novo 1neio tllí1,inlo dá co1no resultado apenas
uma colônia 1niilt'1stula, que é resultante da célula que tem o segmento trans-
duzido (Fig. 3.1 l). En1 geral o número de tra1\Sduçõl"S abortivas, co1nparado
con1 <>de transduções gc1,eri1lizadas, é 20 a 30 vezes maior. Isso indica qlte a
probabilidade de u1n segmento transduzido ser incorporado ao cromossomo
da célula receptora ~ pequena, en\ comparação co1n a probabilidade de sua
ll5o i1,cotpo1•ação.
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lntegraçêo ~
· ~
Normalmente
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l Ror•me•te
q (")
...
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1
' y 'o"'
l q.
1
p-:.::::::::~
Oiplóid'e i>arcial
(~~il'l$hM!iJ _ _ _ e) Sei. normal entta na célula
~ - i.dg e). nwltiplieam·se dando o
~ llsado HFT oom 50% de i.dg e 50% de ).
Figura 3.1 O - Atr~ res1nt.1 em~~ coma~ do gene 00 vtilrl~d.l ~ose <OtnO fonte<k
carbono (gd).
a) Só células oom segnienlo tranS<klVdo b) <Atl\ilas sem fragmento podem sofrçr
sào capazes de se dividir. algumas divisões antes de o JlfQdvto diluir•$0,
- - - C<omouom<>
- PedaQO ttpnsduzklo
• • • Produto formado pelo PQcl;)ÇO tranSduZiOo
ção genética en1 laboratório do que um sistema natural de troca de DNA entre
células.
TRANSPOSONS - O genon1a dos seres vJv0$ sempr e foi considt.~r/Jdó
romo formado por seqüências bastante estáveis, so1lte11te ntodificad.:is por n1u 4
15-1 70$ 23 1 2
IS-4 1 1428 1$ 2
15-5
15-IOR
'
1195
1329
16
22 '
3
bióticos entre outros. Esses genes eram flanqueados por ISs e o conjunto fo i
chamado de transposon (Til). Atualn1ente tanto 15 conlo Tn ton1am a designa·
ção geral de transposons. A Fig . 3.12 n1ostra um d~es transposons. Normal·
mente uma bactéria carrega ' 'ários tra1lSposons. A linhagem de E. coli K12
possuí pelo menos 14 t ransposons em seu cromossomo e três em set.1 plasmí·
deo F.
1 1~ RI TN9
I ~ KI
ONAdo - - - ONAdo
hospe<feiro IS-1 IS·1 hospedeiro
Figuni J.12 O tt~ Tn9t-ncontrado em b.\Ctérias. c.ltl't-gando um &C-'f'lt' quic crirt rew.b'l<ia ao ~1bo6-
bCO (l()rJnfetlic:ol. Os n(aner0$ indicam ~ QIW(~ de parei dt' bases. IS 1é UTI segmento de ·~·
•
- hai
. ~a
·" " '- ~-.....
b e l
g~ i:.
Meiose •
~·
.Meios.
·~
M---:.......
Heterocárlo
(V« 119. 3.• ,,
~
. @:)
..,_
.
(..e) e
~-~ 91
1
Todas as três espécies têm sido amplamente usadas em Genética. NC$ses
fungos e em outros que possuem ciclo ~xual fica fácil estabelecer cruzamen·
tos para esludos genéticos e para programas de melhoramento genélico. Exis-
tindo mulantes, a análise genética pode ser realizada com facilidade e,
dependendo do fungo, as análises podem ser feitas a partir de esporos sexuais
ordenados cnl compa rtimento do corpo de írutiflcac;âo; como ocorre em l..Jeu-
rospora crnssa. Pode ser feita també1t1 por análise de esporos sexuais 1llJO ordc·
na dos COJllO c 111 Snccharo,,1yces c1•rt•uisia1? ot1, ainda, por esporos scxl1a is
coletados no acaso como em Asp~·rg;t/11s nid11Ja11s. A Fig. 3.16 n1ostra nlgL1ns
exemplos dessas análises genéticas.
TiPO de reação sexual A Tipo de reação sexual a
Micronidios Macnlnldios
$( •
••• ...._..... .d .
: --..on1 10S
"
Asoogõnío
Nucleo do a5<:0gõolo A
1
/
_,NUcleodo NUcleodo
o c:onldio. confdío A •••
NUcieodo
ascogOOio a J
Asl:O com núcleo
Hiía ascôgena diplóide
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NPO
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FJsw<t l . 16 ~de~~"""'~ 1• ...,,... f91'1hc.<"IV'p~a(Qf;<0nom~Ol'de
Neb;-wull"WIO"C • ""el90'°'~e ·~brwol ~~fpoW...d~.,.,,...~p.inOdlfl'·
l'l"INÇkl dl ~ Mltt"'" l'f"t: to«io6 1et0. n . Tipoe; de .nco\ <iO'!'I ~ orden.tdm cp.wdl)<llM ~ ~ ~
dol~(l"'lftAeB) • · $ittt!ot$~~.ao ..........deb'l'NNo~dOl 1~~0l'l"lll . r.,•
. -....... _....""'°""(PO).n!o-d1fpoas(NPO)e1-(1).oquc"""',_..,.qucv.\No<1!·
°'
lai;6H fl'ltfe genn ~ po$Ul'n ~ d>t.dli
~-~\-\\
Fusàci de hiras Fudo dt nüdt0$ NUdeo
(helerocário) no lntoriol d., hlfa diplóiclo
Coni<fto${ .... .
diplóides ••,,.
J
~
\;:V
Cofóntasd~
sefeclonadat em
placa com melo Segreg<'lnto$ ~l)lõdes
mínimo e dipk)ilJes a l)<'lrtir
do colônia diplóidc
heterozigo(a em
melo oompleio
Fliwal. 17 oooo~em~
3. ~leios(' rom rerombin,,i;Jo m~1ót 1(ii 3.. Rttomb1n~Jo r.1r,1 por pê'rmut•·
no \'$.t.igin de quatro fiOtl ~· ' 'ólta "º Ç•'º mltótl<.11. O.:orrc h.,1plo1dl1t1ç3o
t'"t.igio hapló ldt'. r.ira por n.ào disjun(ló.
"1. O:s pl'()(h1t05 meióti<c>o- C.'lstóspa-- .i, O:s rtt0mbin.1nt'°' m1tõh~. lM.' uti·
ros) são f.1cllmentí.' '''<Mht·<idos" li:.:iid°' m.1r<<ldOrt'S :1pr(1pn.td~,
i-"Olados. emtr~e1n rorno seu,r('$ oriundos ele
collinw.. diplóick-s
1323 - fusJode~-~
Enlbo ra seja \ lm me<:Jnis mo parJSS('Xu.. I de obtcnç.lo de rccombinanl<."llo
fac:ilit11ndo hetcrocariose, que~ o primeiro pai,so da parnssexualídade, (1 fu-
são de proloplastos, pela sua importinc:ia, ''ªI ~r desc:"rita separ.,damenle do
ciclo p<1rassexual. ~1esmo em fungos que possuem ciclo ~).uai ou parasse~ual
a he tcrocnriose 11cn1 sen1prc é possí\'cl, d evido à i11con1patibilidndc <lc a11:isto·
moses ocasionada pela parede celular. A possibilidade de se produzir células
inteir.,ment<" d<.'Spro,·ida)> ou apcnaii. com re~uici<b de parede celular. ~
protoplastos (con1 total auo;:ência de p.1rede) ou (-S:ft:"roplallotOS (devido ao seu
formato esfé rico c n1 meio rico em cst.ibiliz(ldorcs osn16ticos, po<lcndo conter
ou não restos de parede) abriu a possibilidade de se (u11dir c61u1Js as 1nais
di,·ersa)>, n.ão só de fungos m.ls de pr.tticamente quaisqt•er células ' 'Í\'as. E,•i·
dentemente qu:tnto ma is distantes s.\o as células de e~p~cies fusionadJii.,
1 mais diíicil fi ca s un viabilidade e n\ultip licnção. Protoplas tos podem ser
obtidos de diferentes m41neiras, mas. de modo geral, o tratame1110 de um
fungo com enzim3.s que destroem a patede celular é o preferido. 1.sso é ft."ilo
em 1nc io com altJ conccntr.1ção d e 5,\ÍS o u l'IÇticares (est.1bili2adores osmóti·
ros), p<1r3 C\•itar o rompil'nC1\tO das células. Os d ctaJhes de o bten c;r'lo d e proto·
plastos podem S<?r encontr•dos em \'~rias publi<açóes (1, 2. 27, 33, ~. 35, 36).
Obtidos os pro topl.1stos, a fusão pode ser (eitJ por adi(:to de agentes fusog~
1\ icos :10 ntcio, con\O o polietileno glicol ou 11breviad31ne111c PEG. o u po r cor·
rentes elé-tricas, por um processo conhocido co1110 e letroíusão (Fig. 3. 19).
A$Cocl1y1a ir11perp«ta
Aspi-rgilh1s tu11strlodar11i
A5/h~rgillus flavus
Aspergillus fu111igat11s
Aspt>rgiflus nidulaus
1l spergillus 11iger
Aspergill11s oryznt
1\spergill11s rugulos11s
Aspergill11s wjat
Beauwlia bassianta
Ct·pJialospori111n acrt•111tn1 ii1111
C••pl1alosporiun1 n1ycopllyii1n1
C1Xhliobol11s sati&us
Copril1us fin1etari11s
Copri1111s lagopus
, D.vctyosteli11111 discoilttu1t1 (1t1ixco111ic(toJ
Fusari11111 oxysport11t1 (. sp. cnllistepl1i
Fu$ariu11i oxysr1cr11111 f. sp. cubt11'St'
Fusariulf1 oxysporunt (. sp. pisi
Fus.nriuni rtdolrus
A11:tarhizi11n1 anisopliae
J\1icrospor11111 gypsi11n1
Peuicilli11n1 chrysoge1111n1
Pt11icilliu111 digitat11111
Pt11icilli111ri expa11s11111
Peniciflil1111 ilalic11n1
Phycon1yct"S blflkt"Slt·anus
Phyn1atotrichu111 on111ivor11111
PhytoplitJ1ora i11/t•staus
Piric11laritJ ory:ne
I'11cci11ia gran1i11is tritici
SaccJioro,11yce$ ctrtvisiat
Scliizopl1yll11n1 cllonu1111ne
Ustilago hordt·i
Ustifago ,1111ydis
llstilago violnce"
V erticilli111,1 albo·al111 n1
Vtrticilliu111 dalitiat var. lo1tgispor11n1
_ __,..__
.._
...... ~--.- 97
_..,
- --
...........
,..
--
(mfrlllno • tftlnlmo
·~·
--
s.gi.,.,... ~
pot ~llQio ou
Fi,ur.J.I& - ~tr(reoodo~típl(oea.~~tmll'p
1
QO
00 ------
1
•
-- .............
•
•liJM 1eS
Í'&'A) 19 .. fvtaode~tr'l'l"Pfo-.b-~·~d·~~f1~)
De muitos protoplas1os usados, apenas alguns sofrem fusão. É necessário
enttl o uma seleção dos prod utos de fusão , que ~ facil itada se forem usadas li·
1lhagens con\ nluta ntes apropriados, con\o auxotróficos, resistentes a drogas
etc. Em geral, heterocários são recuperados em meio 1nfnimo, utilizando-se li-
nhagens ni utantes com deficiências conlplementares. Desses produtos de fus.; o,
diplóide e recombinantes podem ser obtidos. As barreiras d(' incompa tibilida-
de, ro1npidas pelo tL.;;() de protoplastos, permitiram que h1sões pudessen\ ser
re,aliz.-idas c1\tre espécies e n\cs1no gêneros distintos de fungos. O prinieiro
exemplo be1n documentado foi a fusão de duas espécies relacionadas, o A. ni·
dulaus e o A . rugulos11s. Os produtos de ft1são pl.'rmiliram u1na compa ração en-
tre n1apas genéticos das d uas espécies, abrindo possibilidades de se estuda r
s imilaridades entre fungos, inclusive aspectos laxonônlicos dos n1es1nos via fu-
são de protoplas1os. Atualmente, são conhecidos nluitos casos de fusões de
protoplas tos en1 leveduras e fungos fila1nentosos. Alg11n1as dessas fusões pro-
d t1zira1n recon\binantcs de grande valor indus trial como em Ct'pllalosporiu11r
acrer11011i11111, produtor do antibiótico cefalosporina (35) e em leveduras para Ji1\S
enológicos (37). Os protoplas tos são tan1Mnt fun danlentais p(lra que outros
processos de rcco1n binaçâo possam ser usados em fungos, con10 a trans íorn1a-
çlío e, conscqllcnten1cntc, a Engenltaria Ct:>nética. Protoplas tos de fungos são
empregados ta1nbC1n para separaçJ.o elctroforética de cromosson1os e1n géis de
campo pulsado (38, 39).
'
"'
(wrva)
º
(lise tépida)
h'r'
(límpida)
(llse normal)
/
, --'
'
1' 'l h"r
O
t {lfMpid;a)
',
--- ,, (liseN)J'.lida} hfº (ll,,IJVi'I}
(i$0 normal}
na)<Otn owoil·r· ~doe lise tl.HV.l e grarde) tesdwn os ll?OS p.ar'etUS (h +1 - e'>'+'-) e os dois bpos recombn.in·
~t$(11-t r. ~ tt.r•). A~ ~pr~.:i os fenóti?OS das plaa.s<lc lscem Esdiendlio<ofr ~~ B e 8J2 ~
~tm~<le?ctn,
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Figurõl. J .ll - AcQl'IJvgaçAo,... alga Chb'nyWmonCI$ reK1~<f11. Céltksdos tiposck'reaç~sexualmt+ emt· SO·
frem ~ngamii. dal'\do i;m zigote> d•plóide. Por mciost. qwvo ci!tJ!is ~ ~ formadas. ~ duM mt .+ e
dulStnt·.
--
.....IYC'lt4'>C:. Oio6"0~""""'"•""
@) 8 8 @)
-- Conldio Protoperitécio
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0 8 8 8
8 8 8 8'
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8 ascósporos normais
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8 ascósporos. "Poky'"
fiiora l .24 Mera1"9 e~. Muurctt •poty" 6e Ntvrosporo (lt&O. Os desctndontes s.k> ~
'f.Ml~qvrbne<cuo~~).r'ldt~cmcn:cdotçiodereaçlõseac:uilouOeie·
"""""'-
Refer~nciu bibliográficas
(1) AZEVEDO. J.L Cenltic.a de mitror3"'nb·mo._ Coilni.i, Ed. Ul'li\•erSid"'d" f'cd~•I d~
eow. 1m
(2) AZEVEDO. J.L (Coord.). CC'nftit.a dC' mltTorg_1.nlsraos em biotttnologl.a ., ""I...,.
nh.ari.a genftlt.a. P.1..nc.tb.t, Ed. FEA.t.Q. 19&).
(3) COSTA. S.O.P. (Coo1d.). C•nf.lit.a molttul.ar e de miNOtg.ani$mOS.. Sào P.aulo. ~1•·
no1~. 1987.
(4) ltl1NRIQUES. J.A.P.; QUEROI., C.IJ. 8~"'l"' mol«ul.ares da mutJi(.•o. ln : COSTA,
S.O.P. (Coord,), C•ni-lita moluular t' d e mitro rg.lnl t mOJ. SAo Paulo, ~1anol t, 1987. p . 117· I 3-4.
(S) 1,Ef\-tEREC. ~t.: ADELBERG, E.A.; 11AR 'r~tAN, P.1·1. A proposal fqr a unifonn no--
Ol('ncl.-tu rc: ln baclerlal genetics. Ctntlics. v .$4.1>.61·76, 1966.
(6) LEOERBE.RC. J.; LEDERBERG, E.1\1. Replica pl.ltlng and indírect stll'Ction of b.icterl·
,11mu1.1nl:), Jou rn.tl of 8.ic:teriology. v.63. p..m·406, 19$2.
(7) SILVEIRA, \V.O.; AZEVEDO. J.L O.:r1v:i11on of au.).otroptuc mut.,ni, from ~tct.lfh1 ·
l.iu.m .an"°Jlh•c by lhe filtr.1tion ttthn1que. Revltt.i ISr.tsllelr.a de Ct'nltit-..i, v.7, p. l-8, 1914
(8) AZEVEDO. JL T6pitos dt g:•n êli<.t mitrobl.an.t t' molttul.ac. Cenftic.a de Prot.ario-
10$.. Plr.ck'.tb.a.. Publ. lnstttutodoe-~. 1m. "li
(9) AZEVEDO. J.L: COSTA. S.O.P. Üt'rt,t10t pr.ititos de gt'n ltic.a. Sio P"•ulo, C.a Ed.
N•clOn.al, 1973.
(10) 8AINBRIDCE, 8.\\f. Centlits of mi<1obet. Clasgo""'. 91aeki.e, 1980.
(11) OURNEIT, J.H. ~1 ycogeneti('S. l.ondrt-t, Jolin \\'ilcy & Sons, 1975.
(12) 1:1NCllA~·1, J,R.S.; DAY, P.R.: RAOl:ORD. 1\, fung.. I geneti<'s. Oxford, Bl.1ckwell,
1979.
(13) S1'RIC KBERCER, W. \V. Cenellcs. N0\''1 York, 1\tac~1ill .1n, 1985.
(14) AZF.VEOO, J.t.. C\"nética de microrg.Anlsmos. ln: 6EÇi\K, \\1,; FROTA-PESSOA, O.
(Coordt.) Ccn fll<;a mldic.a. SJo Paulo. 5.»tvler, 1973 p .4 l "65.
(lS) LURIA. SE.; DELBRUCK.. E.~1. ~lut•Hon o( b.tch?rLa from virus sensi11,·ity to v1rus
ttSi:St.lntt. C•n•tl<1. v.:?8, p .491·511. 1~3.
(16) NE\\'CO~tBE. H. 8. Orig.in of b.att('r1.1l '"'~nts N .. tutt. Londn:s.. ,·.164. p 150-ISl.
l94i9.
(17) AVfRY, 0 .T.; ~IAC LEOO. C.~t.. ~kCARTY, \t, Studies on tht dw-mi<.al ruturt- of
tht :.ubsl•ftC't 1ndu~tng 1r-ansforma1lon of Pnt-umoc'O('t"•I typts.. Joum.al Experiment.111-t rdiri·
nc, , .,79, p JJ.7·158. teu~.
(18) LEDtRBERC, J. & TATU1'1, G.L. C('ntliC r("('Ombination 1n !Nhl'ri('l1ia rolí N•turt ,
Londres, v.158. p.SSS. 19.&6.
(19) ZINl)8R, N .O.; t.EDERBERG. J. (".e*'ctl~ CKCht1nse in 5'l/1mi11rlf1t. Jo urno11 I o/ 11 .. c1crl·
o logy, v.6,1, p.679·699, 1952.
(10' HAYES. \.' /. The mtth.1n•!f.m. o f gtMtK' rtt0mbin.'lt!.on in F""'~richi.:i coll Cold
Spring l'larbor Symposl.a Qu•nlllotlvt> 8iolo3y, v. 18, p.75•9J. 195.)..
(21) SOUZA, E.C. l'l.1$midios bí1-ctc:rin.nos ln: COSTA, S.O.P. (Cc>11n.I.). Ctntllc.. 1nolt·
C'al.ar e de microrg.1nism0$. SJ.o P.auto, ~iano~. 1987. p .213·2-89.
(22) JACOB, f .; ~IONOD, J. ~k tl"gul,.tory mttha~sins in tlw ~ynthtsis oi protcin.
Journ.11of1'-1olttul1r 8iology, v.), p-J.IS-356, 1961.
(23) GR1Fl:i1'1'1, F. The s ig nlílcance of 1>neumorocc.,1 ty pes. Jou rn • I of H)'glene, \>.27,
p.11)·159, 1928.
(2.f) ;\1()RSE, ~1 1,...; LEDER&ER'C. E.~t.; LEOERBERC. J. Tr.a.nsdut110I\ 1n úclttncll• coli
K J?. Ctnctics. v •.at, p.1.az.1.a6. 19S6.
<25) McCLINTOCK, 8. T h«> órigin and bt h,1viour of mu1.1ble loci ln tn.tize. frocedings
of N.tllon•I Ac1dtm)' of $c1ent•, \Yashington, v.36, p .3'1.a·3SS, 1950
(26) AZEVEDO, J.L.: ROl'ER. J.A. ~tit04k non<0n.fonnlty in A•f""'ttUus nr4ul~"'" Sue•
ct"SSi\·~.-nd tr.1ns~blit ~kchangts. Ccnttlc.11 R«n.arth,. C.tmbfidgt. v .16. p.79-9.l. 1910..
(39) AZEVEI)(), J.L...: PIZZIRA N l·KLEINER, A .A . .\tellior.,.mi.'"1" 0 d<: íul'lg os d \!' impo r·
tã.nct.a n• •grict.illt.ir•. ln: MELO; L.S.; VAl.Al)ARES·INCLIS; 1\1.C.; NASS; L.L.; VAI.OIS;
A.C C. (Coord.) Rttwrsos gtnfliC'OS 4' mtlho r•mcnto: m i tro~.1n lsmof. J•g:u•rilln.1. Ed.
E~l6 RAPA, p. 32J..lS6, 2002.
(4 J) HERSt lEY, A.P.; ROTr>,.IA N, R. Cenetlc reto1nbin.11ion bctl\'(•l.'n h ost·r.1nge .ind pia·
q ue 1ype mutants o f bacterlop hase in sing:le bacterial cell:J. CcnctiC-8, l'.34, p.«-·71, 1949.
(42) 1\Zê \'t.00. J.l.. Eng('n.h;11ria g.-nétic;11 no controle biológioo de in....eto$. ln: 1\ LVl!S,
S.S. (Coord.). Ct1ntrole microbia.no de insc-10$. Pir.:iC'ic;iba, FE.i-\ LQ 1996,
(4.)) AZEVEDO. J.L; FUNGARO. 1\i.H.P.; VIEIRA, ~1.1,..C. T r.;insgc'.·nicos e 4.>\'0lu c;.\o diri·
g id,1, Histó ri.:a, ciincia e s.1úde-i\1anguinhos. V.7, p. 45 1·464, 2000.
(44) PERl..JN, M.t l. Plasn1ids other than F. ln: STREJPS, Y.N.; YASBIN. R.E. (Edts.). t\-1~
dcrn microbi:il gcnetic11. ~'º"'1 York. \\'ill.:y· l.iss.., 1991. p. 123-155.
(45) JINKS, J.L. Ex1r11chromosomal lnheritance. Ne'v J ~·™-'y, r>r.:ntic.: J 10111, 1964.
(46) ROS1\TO, Y.6.; AZEVEOO, J.L. A co mp.ict V.1rl,1nt of cytoplasmatiC' o rig in in As;i<r·
gill11$ nid11la11s . Tr;an s;ictio ns of tht British i\1)'Cologic.1I Soeiety, " .iS. p.31)·31S, 1980.
(.Ji) ROSATO. 'i'.8.; 1\ ZEVEDO. J.L ~1itotic instolbility oí a compact 1nutant oí Asf!l'rgil·
l1ts " id11/ans. Rí'vist:a Br.t~ ilei ra dt Ctni ti t :i, ,·. JO, p.425·433. 1987.
(4$) AZE\'EOO, J.L. r\lter<"CI instability dueto genetic ch11ng4.'$ in a (i1)plic.ition $l rain o(
1\~p1·rgill11$11id11!a11s . Ctni:tic.11 Rtst.1rch, C.1mbridge. v.26, p. 55-61, 1975.
(49) BAl.L, C.; 1\ Z l~\IEI)(), j.L. C\•nc:tic inst.1bilit}' in p.1r<11sexu11! funs;i ln:
~tACDONALD. K.D. (Ed.). St<Ond lntc rn11tion ;al S)'mposium of Genetlc oí lndu.st ri.al ~t i cro~
Of'8.'ll'lls1ns, Nova York, AcadC"1nic Press, 1976. p.24J..251
(50) i\1E\\1t.1E\'ER, O.; TAYlOR. C ,\\'. A perirel'ltric in\'t'r$ion in Nr111<Jspo10 ' ' 'ith unsl<11·
blc duplication ~rog.-n}'. Cenetics, v.56, p.771-791. 1967.
ELEMENTOS
DE ENGENHARIA
,
GENETICA
Ana Clara G. Schenber11
4. 1 - Introdução
O surgi me1l to da Engenharia Gc1lética, na década de 70, íoi unln de-
corrência natura l da grande quantidnde de conhecimentos que vinham se
ac-umtllando na área de Biologia Mole<ular, en\•Ol\•endo principalmente as
bactéri~s e seus ' 'irus. Entretanto, em contraste com os dem01is progressos
\1erificados nesta ãrea. o ad,·ento da Engenharia Genética te,1e um impacto
formid~'·el sobre a Biotec-nolog1a. liofe. o homem pode inter\fir diretamen-
te sobre os comandos da \1ida: é possível programar geneticamente o~ orga-
nismos ,,i,•os, não apenas para a superproduç-ão de algum nletabolito, mas,
ainda, de substâncias que só são normalnlente produzidas por outros org:inis-
mo:,. Pclrt facilidade de n\anipuJ.-.ç,l\o que p roporcionam, os microrg1.1nismos
íora1n os primeiros a serem cnlprcgados co11\0 hospedeiros do info rn1aç1'0
gcn~lica hct·c rólog~'· Eir1 princípio, qunlqt1e r proteína pode nssio1 vir a S('r
p roduzida cm fe r1nentaçõcs induslrl<'lis, d('sdc que o gene que" codifica seja
enxer1,1do num microrganisl'no (Ott, cnl oulrt'ls pala\·ras. clonado) e p.'.lsse a
ser por ele expresso.ido. De crucial import.\ncia é a possibilidade que a no\•a
tecnologia trouxe de ampli(icar sequências indi,•iduais de DNA: a clont'lgcm
de um dado fragmento de DNA permite que. partindo-se de apenas uma mo-
lécula. boCjam produzidas quantidades ilimitadas desta mesma molécula. ()e..
pois que um fragmento de DNA 11,·er sido assim isolado e amplificado. as
suas propriedades podem ser caracteri1adas e a sua seqüê1\cia de nuclootfde..
os detcrnlin:lda com preic;i sâo, o que proporcio1\ou um progresso \'Crtiginoso
do C'01\l\Ccimcnto básico. Por outro lado, a relevância bioteicnológi<'a dc<'orre
do falo de que a síntese de pro tcrnas cslrnngciras pelos microrgnnisnlos leva a
unltt in1porta ntc red1..1ção dos custos de p l'oduçl'º· J'arn cita r a penas u111 cxc1n·
p io, para prodt1zir, pe las vi(IS tradicionais, 5 n\g de son\atosta tina, um hormô-
nio de vertebrados, são necessários 500.()(Xl cérebros de carneiro. Qu<'lndo se
conseguiu, por meio da Engenharia Genética, enxertar o gene da somatostati-
na na bactéria E.scl1erichia coli, o O\CS O\O rendimento fo i <llcançado com apenas
7,5 kg de bactérias, o que se obtém de maneira rápida e pouco dispendiosa.
Chama-se de E1\ge1\haria Genética <'10 conju1\to de técnicas que tornam
possfvel a criação de novas combir1ações génicas, inexistentes na natu r~a. A
reco1nbil\<lÇâo genética consiste na form aç~o de novas con\bi nações estáveis
de genes, p rovenientes de d iferentes organismos, pode1\do, cm conseqüC1\cia,
surgir novos fenótipos. Entretanto, na nature-.ta, a recombinação genética so·
mente ocorre entre organismos de uma mes1na esp&:ie ou de espécies nltiito
proxim(lmente relacionadas. J\ E.n genharia Genética, também conhecida sob o
1lome de Tec1lologia do DNA Re<:ombiila1\te, pernlite que contrariemos a na·
tureza no q ue se refere à recombinaç.ão genétic<'l. Tornou-se possível construir
novas espécies de material genCtico, a1ra\ és d(! recombinação re.-.lizada a rtifi·
1
l Silio « diva;çm
ri'til'flrt::====~IUll~I r11~'Rft:====~l~lllll
0.\A l'"fAA
Flg\Jl'a 4.1 - Esqucrna gcralde\ll'n~r«ideE:ngc~ Ccnh;IC.'I. NuM ll.lbode MSaio. oórcVodc DNAcle
dupbfttaquec~11Uoovetoréc"-'adoporuawne!'l(ocom1.1"N~asedcrest~para3q.Ja1a~uM
(nco sí'OOSU$Ct!M!I. ~ ul't'I,\ tr'IOlécula de DNA ll'le.v. Num 2.•tJx>de ensaio. o [)N;'..qvc se óesejl c.lon:aré
fr.tgmcnt&do por meio ele tr.ll;imento com~ mcsml enzim.i de rcstni;âo. para a(f.ial corubn vtinos sltios wscetfJCrs,
Em seguida. asOJ.as preparac;ões de ONAsJo ~ DJm ~o wbo. ao qva! se WC$(cnt.a a ei'lllMl DNA ligas.e, o
qtie' result.lf.S na foi'~ de MO!écú.ls (Ir~ re<ornbt\al'.tes.. coropostM do ONA do \'Ctor e óe vn fr;tgmemo
do ONA.~. Es~pt'l:'paraç.\oé então empregada para~ uma linMgerr'l~!'W\asensNelaoanti
b«M:o tcttaci<fil'\o\. p;ira o~ o vetor corkrc «:Sist~ncia. Ao st-rem scmead.Js em pr~ de tet:r'aôdru. sometite
~!"do .)S c&ilas que concr.-erem o vetor. Aô se nUtipk.V. ess.is cait\s 1r.k>Ol"@IW uma popcJaç$o de cê~·
IM·fihn ~s (dane). toda$ port<idonis do ONAft'<ombnatite.
4.2 - Enzimas de restrição: as tesouras moleculares
que cortam a molécula de DNA em pontos especfficos
A collstrução do DNA recombinante req11er que seja possível cortar as
1noléc-ulas de DN'"\ de 1nodo pre<"iso e reprodutível. J-\ ll!m de ~r necessário
corta r o vetor num iínico ponto específico, onde será inserido o DNA estran-
geiro, é imprescindível que todos as inoléc-ul<'IS do vetor sejam cortadas exata-
mente na mesma posição. Con_seqüentemente, não se pode realizar esse tipo
de co1\strt1çào através d<l clivagem aleatória do ONi\ do vetor. Na verdade, a
Engenharia Gen ~ ti ca só se tor11ou possível após a descoberta de uma classe es-
pecial de enzimas, as endonucleases de restrição, que rendeu o Prên1io Nobel
a 1'V. Arbcr, H. Sn1ith e D. Nathans em 1978.
A observação inicial do fen ô1neno de restrição tinlta sido (cita cerca de
30 anos antes por LURIA e HU~·t ANc:i, que havia1n descrito a capacidade que
algt1mas cepas da bactéria E. toli apresentam de se p roteger da in fecção por
bacteriófagos, ou, nas palavras desses autores, de restringir o crescimento do
bacteriófag<>. Hoje se sabe que tal 1nccanismo de defesa consiste na produç.ão
pela bactéria de uma enzima capaz de degradar o ONA vira i in\rasor. O
DNA próprio da bactéria fic'1 protegido do at'1qtLe pela enzin1a de restrição
porque, ao mcsnto ten1po enl que p l'oduz a e1lzinla de restl'ição. a bactéria
também p rod uz uma enzin1a de mod ificação, pela ação da q t1al são acrescen-
tados grupos ntetila a algumas das bases que contpõent a seqüé1lcia de DNA
que é- reco11l1ecida pela enzima de restrição em questão. Uma vez metilada,
essa seqüência deixa de ser reconhecida pela enzima de restrição. Assim,
para unla deterntinada enzima de restrição, existe"'"'ª enzima de n1odifica·
ção corre-spondcntc e fa la -se ent sistentas de restrição·modific<'lção.
As endo1tucleascs de restrição são sintetizadas por 1nuitas, sertão to ·
das, as espécies de bact~rias, sendo comu1n uma mesma espécie bacteriana
produzir nlais de uma enzin1a de restrição, mas tais enzimas nunca (oram
encontradas {'n\ organisntos cucarióticos. Essa clas...,.c de enzim<'IS compreen-
de três tipos, que d iíc re1n quanto à ge1t6tica e enzimologia . As enzim'1s de
restrição de Tipo 1 e Tipo Ili têm um modo de ação n1ais complexo e não são
de utilidade ent Engenharia G{'nêtica. Ent contrapartida, sem as enzin1as de
restriç.'io de Tipo li? não teria sido possível a Engenharia Genética. Assint,
daqui por d iante, quando falarmos em enzim'1s de restrição, estaremos nos
referindo àquelas de Tipo li.
As enzimas de restrição são endodesoxiribortucleases, ou cndonuclea-
ses, que reconhe-ccnt seq i.iéncias especííicas de nucleotídeos na molécula de
DNA e cortam as duas cadeias de ONA nt1m ponto dentro desta seqü~nc ia .
Uma determinada e1tzima de restri(ão irá catalisar a qu{'bra da dupla fita
apt'.'nas qua1tdo cnco1l tra r aquela seqiiência particular que reconhece. É essa
espéeificidade que faz das enzimas de res trição instr\1mentos tão importantes
em Enge1l1laria Genética. Assim, por exemplo, a enzim(I de restrição chamada
Pvul (produz.ida pel;:i bJctéria f.roteus mlgaris) cort(I o ONA so1r1cntc quando
encontra uma seqüéncia de 6 nucleotídeos CGATCC. l,or sua vez, a enzinla de
restrição J>vu ll, produzida pela mesma bactéria, só corta o DNA qt1ando en-
tontrar tima seqüência hexanuclcotídica CAGCTG. A maioria das enzimas de
rtstriçâo reconheçe seqüências hl'X<inucleotídicas, mas há tanlbém a lgu1nas,
que reconhecen1 seqiiências de 4 a 12 nucleotídeos.
Adn1itindo que os 4 diferentes nucleotídeos ocorran1 com a mesn1a fre-
qüência ao longo da n1olkula de DNA, c..1lcula-se que um(I d(ld(I seqi.lência de
1
4 pares de bases (bp) ocorra en1 n1&:1ia a cada 256 bp (0,25 = 1/256), enquJnto
uma de 6 bp ocorr;:i a cada 4.096 bp da 1nolécula. Entretanto, con10 a d istribui -
ção de sítios de rcconhecirnento não é regular, tuna detern1il'1ada região do
ONA pode ser cortada 1nais, ou n1enos, freqüenten1e1l te do que a m~dia esta·
tística. Os diferentes fragmen tos origi1\Jdos pela digestão com uma enzima de
restrição podem facilmente ser separados uns dos outros, com base no seu ta·
n1anl10, a 1-ravés de eletroforese cm gel de agarosc ou de poliacrilan1ida. A par·
tir di:-sses dados, é pos:siv('I con.struir o que se chan1a de 111apa de restriçifo, o
que envolve a detcrmi1\<.'IÇàO da posição e da orientação de cada íragrnento na
moléc\l}a de DN A original.
As seqíiências de reconhéeimento no DNA apresentanl unta sio1etria ro-
tacional. Enl geral, a sc-qüência de reconhecimento constitui un1 palíndr<>mo,
isto é, as 2 fitas têm._.. mes ma seqíiéncia, se tLnta ~ lida da C's querda para a dire-
ita e a outra, da direita para a esqucrdJ (ou, e1n termos de DNA, se ambas são
lidas na direção 5' para 3' Oll ambas são lidas 1\a direção 3· para 5'). As seqüén·
ci<.'ls de reconhecinlento de Jlguma.s enzimas de restrição estão apresentadas
na Tabela 4.1.
A p ri mei ra enzima de restriç;\o foi ÍS<>lada e n1 19701' ' e hoje já seco-
nhecem mais de 2.500, isoladas a partir de uma vasta gama de espécies bac-
terianas.. con1prec11dcndo 230 diferentes seqüências de reconhecin1e11to. En1
muitos c;;1sos, duas ou mais e nzimas de restrição, provenientes d(' diferen·
tes bactérias, reconhecem a mesn1a seq lí~nc i <l de DNA: ess<is t:-nzimas são
chantadas de isoesquizômeros. Hoje, encontra1n·se d ispt)nÍvl!iS comt:-rcial-
111c11te aproximadan1e11te 170 difere ntes C1\Zi1nas de restrição.
O rest11tado do corte pode ser di(cre11te, segundo a enzin1a de res trição.
Há C1lZimas que cortan1 exata 111e11te no rneio da seqüência de reconhecinlento,
comt) é o caso da Pvull e da Ah1I (ver Tab. 4. 1), originando o q\1e se chama de
extremidade cega ou abrupta nos fra gmentos de DNA resultantes da s ua
ação. Por outro lado, u1n ntímero considerável de enzinlas de rcstriç~o corta a
dupla fita de maneira a gerar t•xtre111idadts cMsiws 11os fragmentos res ultantes.
••• e-.~..--
Seq\1êftcla 1>,1,lindrôrniC;•
5' ...GIA A TTC...3· de 6 nuclootfdt.'0-. O cor-
rcrhrr1'r}1ío roJí l"rcRI
te- se~ C:litr('n\id•d1.--,. r,g..e..
3'. ..CT A AIG...S-
Si\'41S,
'--
5 lCC
' TGC...3'
A
SeQu.mri• No P"'hnd'6-
EcoRfl mk~. O <ort< gtr41 ,,.,._.
A . mid.Adirs '°"'1,...,
3 CGTCCl ...s
Isso ocorre porque tais en.zima.s n.\o cort.am a$ duas fitas da molécula de ONA
topo .1 topo, mas cortam de um modo '"desencontrado'" denlro d01 scqü~ncia
de rl.'(onhcc-imento. o que produi e xtre1nidades de corte dotadas de c urta.$~·
qllêncins de fit,1 s imples, conlplenlental'CS entre s i, como está n\os trado p.iról o
e.aso dr. en7,ilna F.co RI tu\ Fig.4.2.
1~
ONA. l1t1•1hl.1do d•
Sl&ttl'flloffo (lOl'l'I
e..rtr~ COHft'alo
CTTAA G
~dtDNo\~~di!~úoRI Urll~de~Cl"Narde~fllacor.
f;,..wa4.l -
Wldl>~"""'~dt~•o*"Plf*.1~de~ bN. .Ç165~c;o'ne5U
~ 'Se'á ~ n.ma moita.Q ...._ «W"l ~ <OC$1"41$ dei; aipo&.oN
Assim, por 1nenor que seja a semelhança c1l trc ns scqüé-n.cias de 1"1uCl('O·
tfdeos de duas moléculas de DNA, a en1hna de res tri('IO saberá encontr.i·la e
corlar.i amb.1s a~ molécula$ neste ponto. Fragmentos originados a partir de
molttulas de ONA diferentes, porém digeridas pela mesma enzima deres·
trição, quando dotados de extremidades coesivas, ir.,o se nssociar com gran 4
ção entre as suas 2 extre1nidadcs, sc1n que tC1\llJ ocorrido 11c1lhu1na i1lscrç3.o
de DNA estrangeiro. Por outro lado, também irão se formar nloléculas híbri 4
das, co1\ ICl"ldo i1tserçõe-s de vários fra gn1entos do ONA estrangeiro religados
entre elcs atravt:s das suas exlrentidades Ecol~I. Como nlostrado na Fig. 4.3, a
recircularização do plas1nídoo pode ser evita.da, se, <'lntcs da ct.-.pa da DN1\ li·
gase, o plas1nídeo lineariz(ldo for submetido à a('ào da enzima fosfatase alcali-
11a, que ten\ovc os fosf., tos das extrenlidades 5· da nloléc-\1la, impedindo em
conseqüência a ação da DNA lig<is(', cujo substrato é constituído de ('xtrcnli·
dades 5'P e 3'0H. Assim, quando as 2 espéciis de Di\IA a serem recombinadas
íoren1 postas ent presen('a uma da outra e da ONA ligase, as extremid(ldes 5'P
dos fragmentos do DNA estrangeiro serão ligadas às extre111idJdcs 3'0H do
plasmídeo, nltnla das fi t.'.ls. Na outra fita, sobrará urna interrupção, p<>rque
tanlpouco poderá ocorrer a ligação entre as extrenlidades 3'0H do DNA es·
trangciro co1ll o plasmfdeo, nlas a célula l>acteric1na é cJpaz de reparar tais
interrupções de fita simples, de modo que, un\<i vez dc11tro da célula, o plas-
mídeo recuperará a sua integridade conformacional. Outr<'IS a lternativas
existentes para coiltorn;;1r o problenl(l da recirc\ilariz(lçào do vetor serão ex 4
-
Llgase
Nêooootre
HO P
p OH
.._..... _
F"fSUra.'4.l ~dove.o.or_ hfa~~w-~ sem~nsttçio~ON.\~
oONA do l)lnmldeo lirlc.1nucb~ ~~a ~d.l MM'l.l fosf.nase ~ ~ <1t wpoAO
em prnenc;.1 do fr~to de ONA ~e d.l ONA ~tJJf
....
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.... ...--.........
....
...-,...
A.itllt
Mkl 1 Pv\111
_.._..._,,.....,....
Sap 1 TUlffl t
"""'"" • ·• 11\,ll'loideo ~2L l"'dtt~ (lrcvllf de l>'ôA dt o..pa ÍltAI. ((lf'lltnelo""" orcem dt' r~Jo (on)~
~~.Niip•"e1'e!"'.quecorie<tm~b'lclil~nCllc)ticos~e~.~.,_..
li' ['D)lf'(ioc:.IÓQll.i,.n~\t.of.Ü"'ICOSdr~Of'li'~IOl).V•~~l"l'\llSQe~."4.~if'ICtl(Mn
Como sc pode obsen•ar pel.l Fig. 4..&, ~ utiliz.lnnos o sítio Ps/f p.1r,1 a ln·
:;er(lo do ONA estrangeiro, o gene Anip• í1c.lr.1 inJtl\•ado e, conseqüentemente,
.t bactéria tr.ln.sformada por este pl41Snlidt'O r1.'Con1b1nanté ficará resistente ape·
n.1:t à tetr.iciclin.1, porem co11tinuar,i sensível:. tlnlpicilina (fenótipo 1\1np~ Tett).
Como as c~lul;i:t não trans fo r1n.-.das lcni fénó tipo Anlp~ Tets., será possí,1cl d i!'I·
tinguir de iinediató, num teste e1n placA de l>étri (basl<l semear as c~lul as sobre
meio con1pleto adicit)nado do í.\1'\liblótico), as ctlul<ls não transformadas das
ttlula:t tran:,forn1adas pelo plas1nfdoo recombi1'l.lnte e, ainda mais inlportantc,
daquelas tr.11lsfornladas por um plasnlfdeo n~o rt-comblnante, ou sej3, cni que
nlo ocorreu inscrçJo do fragmento ('Str.lng('iro: ~s últimas serão n."':ti)IC1ll~
.tOS dois antibióticos (Amp11 Tet~). A possib1ltd.ide de- 1.tJ inari,•ação in~ion.ll,
acamt.-ndo um Ít'nólipo (acilmentc n~nht.'('{,·cl, qut' resulta da pf'ti.Cn(.l dc-
dois gt'nb de resistência contendo sít1o:i- de clonagem di(erent~. fe., do
p8RJ22 um in.strumento extremamente útil em Engenharia Genética. Po:.teri-
orn1t:nte, for,1m conslt\tídos pla~mídco:. ,1ind.1 m.11s aperft'i('O.ldos par.1 de·
sempenhar o pJpcl de vetores de (. (O/;. A~i 1n, por exe1nplo, o pl~s111fdúo
pUC18 cont~ 1n u1n g rande Jltin,ero de :,ítios tinico:, pilra d iferentt-s enzi n1as de
restri(ÃO, todos reunidos num.l única região. que foi denominada de polylin·
lr:er. Como o polylinke:r est.i situado dt>ntro do gene l11rZ, uma inser(AO de
DNA est rangeiro em qualquer u 1n dos sf1ios d o polylinke r ir.i acarrclnr a ina·
t-iva(AO ins.crcional do ger1e lncZ. ScnlCJndo·se as células em 1neio contendo o
indicndor X-Ga l. a s colônia$ tra ns íorn\adas pelo plasmidco rcconlbinantc po-
dc 1n ser fa ciln,c1, te reconhecid as, unla vez que passam da coloração azul para
brar1c.'1 . Uma vantage m adiciona l. proporcionada pelo polylir\kcr, consiste na
possibilidade de se inserir dire1an1entc um fragmento com exlrenlidodes gera·
dos por d uas d iferentes enz imas de rcstriç.lo (desde que existaol sítios para
eln~ no polylinker), sem ter que recorrer a manipulações adícioMiS.
53·· ----
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S' ---· AA(A>.,AA·~H
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Síntese d•
primeira
...,,..
!lta decONA Transc::riCase
lnvena ..-
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cllNA3' TTm s·
lf\terru.PQOes
M~~bo1
l RN~MH
ICJI MMA 1
TTTTT
OHI\ poti11,......
s....... • dNTPs
seguida fila 0NA li9ê1H
decDNA
°""" ...
.. cONA
MMAI
TTTTT
R<.t tntementc, (01 descobert<1 uma nova técnica de sínlcse de DKA ir1 r 1·
Iro, qut:> permite ~mplificar d ircta1ncnte uma dctcrmil\ada região do geno1na
Tra l.:i·sc dil técnica ele J'CR (Polyuu:ras;,• Cltaiu Rt'"ctio11l'1, que teve um impac10
fornlid.tvcl em Biologia ~1 olecular. P.iara aplic-at a J;>CR, é entretanto necess.ir'°
~ :.~ ('Onheçam áS S<'qlit!nc:ias (-20bp s.lo Sl1fitientes). qu,· ladeiam a seqüên-
.=-i .!.'° ONA de inler~sw. para poder primeiramente procedl'r;, sintese quimi·
.:2 ..:.t>sl~:t o ligonucle-0tídeos. qu e i rão C1"llA0 servir con10 iniciadores do
?'",'\:t>SSO de p ol in1c1·izaç.10 (prin1trs). O p 1•in1er é ncccss.i.rio pc1rque a
~ .-.\·pol hl1c rase rt•qucr um,1 pequena tt>gi.io di' DNA de dupla fit,1 pdr.a inic:i·
r .1 ~intcse da (ila~filha : a grande ''ant~gcm é que. quando se ulili1am dois
;l'!"'.~~rs, só será sinte ti:t<lda pela ONA·polin1cr.,se a regi3o de DNA compre·
e ..::J a ent re eles . En1 o utras pJlavritS, os pri1ncrs ir,,o lin1itnr ,, sí1"ltcsc n unla
~:.lo t•spf..'C'ífic:a do IJNA. o q irc lcv.lrâ à an1pl ificação ape1la!'i dest.J seqüência
:=~ .:. -&.7). O procedimento é b.1stJnte simple~: uma prep.1r.1c;~lo de ONA. que
=-'"\.!e- conSillotir do gcnom.l inteiro do organismo, é prime1rarnente dc&1laturada
~:: tra la 1nc1l to té r1niC'O, cm presc11çil dos d oi~ p rin\crs comp l cn1 én l .i rc~ ,\s se·
: .:J.:\cias q ue ladc ian1 a seqiiênci,1 de interesse, c m an1brt!!t '11' fi tas d('sn,ltura·
.:.JS-. Com a presençJ d°' quatro dNTPs ptecursor~ e dil DNA·pollmcrase
:o.!::t?ri~na no sistct'niti, ocorrerá a 1tíntese da fita simpleit complementar ao
:>7'.J,\·moldc, a part1r da extrem;dade 3'0H de cada prin,cr. Assim , cadrt ciclo
J,, PC R t.'nvolve o seguinte:
l) O\!sn.ltur.i(Jo t~rmica da dupla fita do ONA·alvo.
2) Res(rianwn10, p.lra pernlilir o t>mparelhan1ento do.) primttrs con1
a:, regiões compJcmcntarcs nas dua:; fil JS dcsnatur.1d.1s do DN1-\ .
3) ExtL'nsào d os prin1e rs, por nçAo da ONJ\ ·polin1er.1:,c.
.....
ONA
$4tq&ênd& AIVO originail
$
2 oOpi<as •
3'
°""l 2
••
·- 3'
3'
S'
=
• =
•
•
Ciclo 3
•1
••
3' = •
S' • =
....... 3' =
,.=
•
•
5'
• =
S' • =
-= --- ""'"°'
~ 4..7 -A~'locmQQNdol~(PCR).O~ccntendo;a~•w~(WniókS&lf
~~poo'tlr.~$~~·~-2bdo~"
~irli~ lno. .... (l'.as~~pe'95iectm). lp.WOtacD-.mcbP'll'T'Cl'\(tW
runlotókS.n)•~COTOn'Clldta'cat.~ Oocfodt~6~.tiqutWOO
tcMai a~'°~ do~o de ONA. Of:y(>.s.c l'Qa.' Q.IC'- ~OCCl'l1o l llfY.tSe dt 11~1 fl!Olt·
cubstl'\M b'!f..Mdo Que'•~ M. nw 11"1\o<Mlin'·seaob'Cõdos ôCb ~e ll"lo ~r«i ~
n.ir na~ ~Bhn •Ptl'tMdl ~·Mvo, ou K')l, dl scqOénoa cOflt;oCll et1trc os 2 pin'IM
de doenças genéticas. Além disso. a alta sensibilidade da PCR permitiu o de--
sen"ol\'imento do " DNA lingerprinting· (impr<1>Sào digital do DNA). uma
técnica de alio poder de resoluçào, que possíbilita a identificação de indivfdu~
os (detcrininação de palemidade. determínaçlo de s uspeitos e-m casos policia·
is), a partir de amostras diminutas do seu DNi\ . A S(!nsibilidade da 1>CR é tnl
que jó pcr1nitiu a ampliíicaç.õo e clonage1n de DNA obtido de nltí1n ias llt11na·
nas e de pla ntas e animais já cxth,tos. A ti nica cxigênc;ia da PCR é n disponibi·
Udnde dos p rimers adequados: é preciso saber quais são as scqilt!ucins
vtzinhns à região de interesse que se deseja <11nplific-ar. Entretanto, qu<lndo se
dispõe de ttm fragmento de DNA qualqt1er.. inserido num vetor conhecido, é
óbvio que essa dificuldade desaparece, j.;\ que se podem u tilizar como primers
as sequências contíguas do próprio ' 'etor.
Pro!eina
Figura 4 .8 - Vetor de exprC$SSo de é. co~. O OC'lA. do v«or <0016-n os~~~ nece$~ p.lra a
tta"ISCl'iç.10 (ptomo:or e tetmlOi,\Clor) e p.'l~ a tr'ad~ (rbs, <~ ~ scq(Jêno;1S.ô ~ o c6don de 1~)
do gene to'$1f.vigt1ro.A setaincfiaa d~emque OCOl"l'trá a tranKl'il;k>do6'Cnc pell RNA.po'lmerase dabactMt
Ql)IC~~ste~f~C
Para que ocorra a trau~riçào, é nccessârio que o gene clonado esteja in-
tercalado entre un\ pronlotor e un1 ternlinador de tra1lSCl'ição - seqüências
de Of\IA q\1e são rcct)1lhctidas pela RNA·polimerase da célula llospcdcira.
Hoje, já foram isolado~ d iferc1\ tes pron1otores bacterianos, que varian\ quanto
à sua intensidade e seu modo dC! a~.\o. Os pronlotores fortes são aqueles que
sustcnt,1n1 un1a a lta taxa de tra11scrição, e foram isolados de gc1tcs cujos pro-
dutos são requeridos em alta s co1tcentrações par<i o funcionanlcnto 1\orn'lal da
célula. Pol' sua vez, os promotores fracoss que são relativan1ente ineficientes,
foram iwlados de genes cujos produtos sào s uficientes enl pequenas q\1anti·
dades pa r<i o fu ncionan\cnto norm(I) da célula. Depc1\dendo da fi nalidade da
clonagen\, às vezes pode ser i1, tercss..1Jlte utilizar um promotor fraco como,
por exénlplo, no caso de proteínas tóxicas para a célula hospedei r(I. Entretan·
to, <i situação ideal é poder cultiv<ir a bactéria portadora do gene clor1ado até a
cultura a tingir a máxinta densidade de células, para só e1tt5o provocar a ex·
pressão tl'laciça do gene clonado. l.,ara ess(I fin(llidade, são n1uito utifi;r...idos
vetores co1ttcndo un\ pro111otor r c:g11ltivel, que perntite un\ controle m(lis estrito
da expressão. En' E. coli, a regulação da tran.scriç.io pode ocorrer, seja por in·
dução, seja por repressão. Um gene induzível é aquele cuja transcrição sõ
t)COrre c1\\ presença do indutor: gcralotente, o indutor consistirá do subs trato
da énzi1na codificada pelo gene em c1uest.'\o. Enl co1\trapartida, um gene re·
pressível é aquele cuja transcrição deixa de ocorrer em presença da substâ1'l cia
repressora. Um dos pro1notores 11\ais freqüentemente \ltiliz(ldos para a ex·
pressão eot E. coli é o promotor lac, qt1e controla a transcrição do gene lacZ,
codificador ela e1lZi1na tl·galactosidase. Esse promo tor~ i1\duzido por lactose
ou outros l}-g,alaçtosídcos. co1no o isopropil-tiogalactosídeo (IPTG)s de ntodo
que, ao se adicio1tar fPTC ao n\cio de cultura, o pronlotor lnc entrará e1n ação
e haver.i trans.crição do gene que ti,rer sido clon(ldo sob o seu controle. Outro
pron\otor bastante u tilizado é o pro1notor trp, que é teprimido por triptofa1lo,
podendo ta n1bé m sct induzido p-Or ácido 3-indolilacético. Um p romotor cxtrc·
mamente fo rte é o p romotor 1,1>4 , um dos pron1otores responsáveis pe lil trans-
crição dos genes do bactcr-ióíago lambdJ , Esse- promotor é re<onhecido pela
RNA-polimerase de E. c()fi, qt1ando o fago está desenvolve1\do o ciclo lítico.
Quando o fago está no ciclo lisogênico, esse p romotor é reprimido pe lo pro-
duto do gen(' },e/. Os vetores de expressão qu(' co1l tê n' o pro1notor J.I't s...'lo uti·
lizados com tima linhagem de E. coli, portadora de uma versão 1n uta nte do
ge11e cl (no próprio ,retorou então n~1 m profago), que sinte tiza uma forma tér·
mosserl.sível dJ proteínJ repressora cl. t\ ssi1n, co\ tc1np('ta turas até 30ºC, essa
proteína mutante mantén1 (l capacidade de reprimir o promotor l.Pv em tem-
pcratur.ls nta is elevadas, a proteína é inativada e, conseqüentemente, ocorre a
tra nS<:riç~o do gene clonado sob este pro1tlotor. Um outro sistenta dt> expres·
são nlt1ito eficie1l te, qt1e utiliza tlm pron1otor do fago T7 e a RNA·polimeras.c
do próptio T7, foi dcse1lvolvido 1\lJ is rccenten1c1lte . Quando o fago T7 infecta
E. toli, a bactéria passa a p roduiir a RNA-polirtlerase de T7, que rccor1;llecc
npenas os promotores de T7, de 1nodo que a bactéria pass(lrá a transcrever
prcferenciahtlC1\te os ge11es de T7. l "ira11do proveito desse fato, for(lnl constru-
ídos vetores onde o ge1te clonado fica sob o controle do pronlotor de T7 e que
co1l ténl ao n1esmo tempo o gene qt1e codific;;i a RNA-polin1erase do filg;O, sob
o controle de um pro1notor regt1lável de E. coli conlo, po1· excntplo, o pronto·
tor lac. Quando se tr.lnsforma a bactéria com esse vetor, a expressão do gc1\e
clonado ocorre logo npós se izlduzir a tra nscrição da l~NA-polin1erase de T7.
Como essa RNA-polirnerasc reconhece apenas o pronlotor do (ago, ocorrerá
transcrição apenas do ge1le clonado e não dos demais genes da hospedeira.
Por otitro lado, como as bactérias 1tâo stío capazes de realizar o processa-
mento do RN1\ pa ra se obter expressão de genes contendo introns (a grande
maioria dos genes de orga11isnlos et1c(lrióticos), será necessário primeiranlcn·
te remover estes introns. O ca minho 1nais d irêto ~ sc1n dúvida realizar a clo-
nagem docDNA.
Para que ocorra ., tradução, é necess.irio que o 1nRNt\ conte1l lla unl sítio
de ligação ao ribosso1no (rbs), que inclui o códo11 de iniciação da tradução
(AUG ou CUG) e tutla seqliéncia complcn1entar ao t·ern1inal 3' do RNA ribos-
sôn1ico t6s (seqüência Shine-Oalgarno, ou S.D). Co!lseqiientenle11tc, vetores
de expressão devent conter tinla seqüéncia rbs logo em seguida ao pro1il otor.
A seqüência S-D pode variar e n1 co1nprin\C1lto (3·9 bp) e precede o códon de
iniciação ent 3·12 bp. Essa d istância deve ser respeitada para se obter boa cíi·
ciência da lradt1ção. O processo da tradt1ção termina qt1ando for e11contrado
um códOI\ stop (UAA, UAG ou UCA) no lllRN1\.
No que di.z respeito ao processa n1ento p6s-trad11cio11nl, JS bactétias s...'lo
incapazes de realizar a maioria das modiíicaçõcs cJ racteristicas das proteínas
cuc.lrióticas. Tal é o c.'lso, por exenlplo, d(l insulina h11mana, qu e~ siiltc tizJda
na forma de um precursor, a pró·instilina, contendo, <l1én' das c.a deias A e B,
unla seqüência adicional de 35 an1inoáci.dos (a cadeia C), in\portante p<lra que
a nlolécula de insulina adquira a si1a confo rmação tridimensiona l final, mas
que deve ser removida antes que a insulina se torne biologicamente funcional.
A bactéria não é c.cipaz de rcn\over a cadeia C da pró-insulina, de modo que,
p;:ira obter a insi1lina humana a partir de bactéria, foi necessário clonar e ex·
pressar separadame1\te genes sinteticamente const-ruídos das cadeias A e B,
pt1rificá-las e só entào ligá·las 1\t1n\ passo;,, vitro'91• Assinl, quando se deseja
obter t1n1a proteína euca riótica que prccis.1 soírer esse tipo de modificações,
dcve·sc usar como hospedeira uma c~ l ula ei1cariót-ica como, por cxe1llplo u1l1a
levedura.
Em certos casos, con10 por exen,plo o da expressão da somatostatina e
interferon hun\a11os e n1 E. coli, a prote ína sofre degradação pelas pro teases
da célula J\ospedeira. Para con tornar esse problema, pode·sc realizar a cio·
nagem de forma a rcsultJr 1\uma pro teína de fusão com a lguma p roteína
natural da hospedeira, o que protege a proteína estrangeira da ação d;:is pro-
teases. Assin\, foi possível obte r somatosta tina produzida por E. coli, sob a
fornla de uma fusão com a íl·galactosidase bacteriana. P(lra libe rar a soma·
tosta tina biologicJnlente a tiva, a p roteína de fusão precisou ser clivada, o
que se conseguiu num passo subseqlic-nte, realiz;:ido in vitro, co11sis tindo de
tratamento con' brometo de cianogênio<='• . Entretanto, nem semp re é possível
realizar satisfatorianlente esse ti l timo passo: como o brometo de cia1\ogê1l io
cliva a cadeia pept,dica a cada resíduo de metioniJta, esta abordagen\ cxperi·
n1ental só func iona para peptídcos que não conte1\J\an\ metioninas inte rnas,
como é o caso da son1atostatina. Unla otitra maneira de atenuar o problema
da degrc'ldação protéica consiste em se utilizar co1no hospcd('iras li1lllage11s
mutantes, que apresentam um complemento reduzido de proteases intrare·
lulares. ·rambénl a localização celular da proteüla l1eteróloga pode influir na
sua estabilidade na célula hospedeira. Assim, no caso da pró-insulina de
rato expressada en\ é . coli, foi verificado que a meia-vida da proteína hcteró·
Ioga era de -2 n1inutos no citoplasma, mas de -20 ntinutos no pe riplasma da
bactéria hospedeirai1º'.
Quando se deseja obter a secrcçtlo da proteí1ta codificada pelo gene cio·
nado, é ainda necessário que ela seja sintetizada sob a fo rma de um pre<:ursor,
tendo no seu ter1niilal amino um peptfdeo·sinal. O pcptídecrsinal consiste de
unla curta seqüê1tcia de antillo-ácidos hidrofóbicos, q ué ~ responsávél pela
passagem da proteína atrav~ da n1en1bra11a celular. O peptídeo·sinal é natu •
ralmente renlovido por ação de tulla peptidase, à nledida em que a proteína
vai sendo secretada. Pode·se portanto anexar ao vetor de expressão a seqüên·
eia de DNA que codifica o peptíde<>·sinal de algu1na proteí1la 11ornlalmente
secretada p('la célula hospedeira, de ta l modo que a clo11agcn1 resulte numa
fus;.lo gl'oica, 11a quJ I deve ser observada a fase de leitura correta, para origi·
nar o precursor protéico contendo o peptídeo-sinal.
4.6 - Isolament o do gene clonado
Em última análise, o sucesso de um experimento de clonagem depende
da possibilidade de se distinguir e isolJ r o clone que conténl o gene de inte-
resse. Entretanto, essa tarefa é muitas " ezes comparável a se achar uma agu-
lha no palheiro. Considerando que o tamanho do genoma de uma c~lul a de
mamífero~ de aproximadanlente 10~ bp, unl genc(-5.000 bp) representa ape-
nets 0,0005% do ONA total. Mesmo 11m organismo tão s imples q ua1\to o E. coli
contém milhares de genes, de modo qite unla digestão por e nzima de réStrição
do DNA total irá p roduzir não apenas o fr:igmento portador do gene qtte nos
interessa, mas uma população de fragmentos contendo outros genes. Durante
a etapa da DN1\ ligase, todos CSSl..""S diferentes frag.me1ltos estarão s ujeitos a se
inserir separadamente numa das moléculas do vetor, e, conseqüe1\IC'mcnte, SC'·
r~ o produzidas diferc1ltes 1noléculas de DNA recombinante, e.ada uma con-
tendo um pedaço diferente do genoma do orga1l ismo. Após a transformação
da célula hospedeira conl essa coleção de p lasmídeos híbridos, será obtida
tamMm uma coleção dé c l o1\~ rí>Combintantes. Qua1\do essa coleção fo r repre-
sentativa do genoma inteiro do o rganismo, teremos en\ n\ãos unla bibliot'ec.l
gc1\ômica, como descrito acima. E: portanto necessário poder identificar no
meio dessa coleção aquele clone específico que nos intcrc-ssa. Diferentes estra-
tégias poden\ ser utilizadas para essa finalid(lde.
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f~'l .9 - kb"C"*'"St.u&i(CllÕrQ~ a,)~pot~clelf'lbCOr?O~O>odoncn:·
(~et idenlif<;ldo por~r ptoô.luw:lo~pnxeínl<C<ld<~pelogcnc clon.\dO. b)~porrneio de
SOl'dl ~ o (lone f't<Qmbnan:e E detltk.kfo Por (()ll«r o ONo\ c~tar à sonda.
4dNTPs
+ ddTTp
ATTGCAAGGCGATTC I 1 fita-molde
•
ddT AAG ( 1
ddT CCGCTAAG J 1 rita.S·fllh3$
ddT TCCGCTAAG 1 1
CldTAACGT T CCGCTAAG 1 1
5'
3'
/
o4r ddC ddG ddA
o -
-
T
A
3'
-
- A
e
- G
- T Leitw a da seqüência
- T da fita sintetitada
--
e
e
- G
- e
- -
T
A
- A
o - G
1
5·
Eletroforese + Auto-radiografia
-
seja controlado através da induçolo progr01mada de uma proteína letal: o de--
sempenho da linhagem é portanto nor·mal. até o momento em que ela comete
suicidio. Esse n1eC.lnismo de auto-destruiçAo pode, en\ principio, ser introdl1-
zido enl qualquer linhagem sadia, que pass..irit1 então a carregar o gene capt1t
de dcscncJdear a s ua própria morte1 ~ 11 •
Os genes as.sassi1'os~ que vcn' scnd(> utili ztidos ptlra o cstabcle<imcnto
de tais sistt•,,tns·suicidas, são principaln1cntc genes que interferem conl a ÍlllC·
gridade da tnc1nbr.lna celular, tais como os genes que codilican1 as proteínas
da família Cc(u1• Entretanto, foi vcri(icado que o DNA liberado pelas « ll1las
mortas pcr~i.stc no meio ambiente por períodos de tempo sufic:ientcs para a
sua ITansfer.:ncia p.lra outros mic:rorgani"mos. En1bora a transformaçJo gené-
tica rutitural entre bactérias da mesma c-spécte Mia conhecida h.i quase 70 õlnos,
s6 r~cn1cmcn1c foi comprovada a ocorrência de transformaçdo genélica no
ambiente entre diferentes espécies bac1erlan.1s' . Na ' 'erdade trata·se do mes·
mo fenônlcno, onde ocorre a entrada. na célul.l bacteriana,. de fragmentos de
ONA li,•re (cromossômico ou plasnlidi.11), que podenl se incorporar no cro-
1nossomo da célula, de maneira que a iníormaç3o gcrlética acaba sendo trA•lS•
1nitida às ger.,~õe-s s ubseqüentes. Fr.,gn\cntos de DNA livre-s 1\0 anlbientc silo
contint1n11,enl<! prodltzidos por lise cclulnr, forn1<lndo agregados de l)NA, que
se distribuenl en1 superfícies de 1nincr;iis e outros se-dimentos. conlo t;i1nbén1
en\ pnrtfculas ~u~pcnsa.s nos habit;its \lquosos. Esse DNA extr.lcelular pode
transfornl<l.r células compí'lê1ltes ou ser degradado ~la. atividade de DN1\ses
el{tra e intracelulares. sendo os produtos desta degradação então utilizados
como nu1rien1cs 1' . Em conseqüência de:..s.as descobertas.. ultimamente vem
sendo dado1 preferência a genes que codificam nucleases a construção de sis-
temas suicidas. No que se refere .i funç..\o suicida,. as nucleases apresentam
vantagens M>bre a.s proteínas da família Ccf. um.i vez que são c:apazes de d~
gradar dire1anlente o material genético. além de destruir a fonte de todo~ os
elementos celulares.
Evidentemente. o ponto critico parJ a conslrl1Ç~O de u1n siste1t1a suicida
reside 1111 rcguh1(Jo da expressão do gene assassino. Prinleiramentc. é inlpôr-
ta.nte que nJo ltaja "\1az.amento" da cxprcss!\o do gene, Oll seja, que só ocorra
cxpress"o após a indução. Em ~gundo lugar, é 1\é<C.Ss.ário conhecer as co11dl·
ções an1bic.•ntais às qt1a.is fica rá sujeito o CEM. par<l proceder-se à escolhtl do
promotor rcgul.ivel mais adequado. Entre diferentes altemali\1as. prOn\Otores
que s.ão induL1dos por carência nutric:ional vênl n1erecendo especial .,,tenç3o,
~que, fora do laboratório. esta W.lvez stja •condição mais: comumente en<c>n·
trada pelo mkrorganismo.
Referl!ndas bibliográficas
l . JACKSON, IJ.A.; SY~lONS, R_H.; BERC, P. lh(l(tlemic.il mc.othod lC>r in:.t•rting nt:\V SC!'-
netlc lnformoi1ion into ONA of S1mloin .,.irus 40: Circular SV40 ONA molccul('$ ((lnl.iínintc
lambda pl'IA~~~ t;er'Mlt 11nd lhe galactose opeton of ['#'rrr1( iti.il coli. l'roc.N.,tl.1\ cad.Scl.USA 69
2904·09, 1972.
~ , , .... 149
3 $;\IKI, K.K..; SCHARF. S.J.; FALOO.'IA. f : ~tUl..l..IS, K.8.; HORN, C.T ; ( Kl.ICt-1.
ti.A.; ARNHEl~ I . N. En:tym.itit amplific;11ion of bet•·globin Stqui!'n('tS- olnd rc-strk11on 'li~
an.-lytl" for tli.1gnos,l.s of sickle <ell ,1ncmi3, S<lenct' 230:1350·54, 1985.
9. COEODEL. D.V.; KLEIO, o.e.; IJO l l\'1\~, F.; ..IEVNEKER. t-1.L.; YANSUR1\, o.e.;
CRli1\, lt ; ..llROSE, ·r.; KRASZE\VSKI, A.; l fAKU RA. K.; RICCS. A.O. E"'ptfsslon of chc1nl·
cAll)' to)'nlht<Jitcd g<:nt'1- far hun1.1n insulin. rrO('.N.&tl.Ac.&d .ScLUSA 76:106·10, 1979.
lO. TAl~1AOGE. K.; CILBERT, W . C t•llular IOC'<ltion 3ffl"(tS ptotein st~bility 1n tJel1t1i•
rltM ro11, l)rO<'.N.atl.A<.ad.Sci.USA 19:183().), 1982.
11 RATZKIN, B.; CARBO~. J. FuMtion;1I ''"-Prt:!isJon of c:lon('d )'NSI ONA 1n fKl1t'ril'llht
(Of1, l'roc. N.11J.Ac.1d.Sci.USA 7-l~S7s91, 19n
12 ROOCEO~. F...; KOURJlSKY. P.; \tACl-1. B lnwrtton of tht- rabbit ,_g_k)bu' gmt H-
quf'fltt ~nto C OJl.1 pl.tsmMI. Nuclt'iC Aridl' Rt-t.2 2J6.S.78. 1975.
ll l'\G, R..: ABELSOJ', J. lsol.at10n .and ~ of tht' gttte fcw '11Clin '" $11.'t"'-"'"')'tf"'
ttrt'M~tllt. Prot.N.atl.Ac.td.Sc:i.fJSA 77:)912·16, 1980.
l-1 ~IONTCO~I ERY, 0 .L; HALL. 6.0; CILl..A~I. $.; $~11TH, ~I. Jd('ntific;11ion ond lllO'"
l.111on o( tlw )'C'.1\I eytothrolnf." <g('ne. Ctll lol 67)..80, 1973.
lS. SANGER, F.; NICKlEN, S.: COUl.SON. A.R,, ONA seque1,tlng •vltli ch:i·
tn·ter111ln,..llng lnhibi1ors. Pr(K.N.111.Atad.Scl.USA 74:5·163-67. 1977.
16. SlllGEK;\\.\'A, K.: 00\\'ER, \V,J, €1cctropor.llion o( o!ukaryotes nnd p1okar)'olí'!1:
A .j;('n~r.tl o.1pproo1c-h to the introductie>n o( n'•cron1olt-cules into ttlls, 6IC1Ttchnlq1.1c:•
6 7-12·51, 19.SS.
17. \ ' ALENZUELA. r.: ~1EDJNA. A ; RUTTlR. \\l,J,; At..1t..1ERER, e. ltAl.L 8 .0 .
S)-nl~I" .lnd .a.ssembly oi ~hli$ 8 \·1ru" •Ut'ÍoW't' .tntigm p.artitJ.es in )""'"'t N•lt.1te
,,, l47·50. 1982.
IS SCllENBERC. A.C.C .; VICE!'-'Tf.. E 1 ; AST0Lfl·f1LHO. S. E~t0n oi hnnok>-
gou~.aN)lil"C""' "' tht )'"eolSt 5«tú1.,.~tt"1mu. Ci•nti• & Cultuni t&5:181·191, 1993-
19 8ERC, P.; 6ALTl~10RE, O.; BRE~~ER. S.~ R061..IN III, R.O.; SJNGER. ~t f AJ1.lo-
m<1r Confoerc-nce on RecQmbinant DNA ~tol«ull""' S<lt'nct 188:991·4, 1915.
20. CURTISS. R. 111; INOUE. R.~t : PEREIRr\. O.; ..ISU, J.C.; ALEXANDER, L.; ROCK, L
Con...tructlo" tu\d u~ of $.i(er bactcri11I ho!it .;;tr11ln<l fur l'('OOlnbin,,nt DNA rese-11r<h ln· SCOTT,
W.A., \\1ERNER, R~. ~tolt'cul•r Cloning of llccon1bi11.1nt ONA, Ac.,dcnul" Preu, Nt•"' York,
1977, p 243·69.
2 1. MOLIN, S.: K l.E~tt-.t, 1>.; POUlSEN, L. K.; BIEHL, H .; CEl<OES. K.; ANDEl<SSON. 1•.
Condition.ll suicide systcm (or cont.1inmcnt of b.ictcri:. :.nd p1'1:s-m ids. 6io/T~chnology
5: 1315-18, 1987.
22. POUl..SEN, l..K.; l,.1\R$EN, N.\.V.; ~10LIN, S.; ANOF.RSSON, r. 1\ f.,mil}' q( g"'n <::s- -.•n·
coding <1 C('li•killing function "'ªY ~ cons.cr"cd irt all gratn·1,eg.n1h·e bacttria. l\.1 o l. ~1 icrobi ·
o l.3 :1463·72. 1939.
23. l,OR€NZ, ~11.C.; \\' ACKERNACEL, \.\1. B.'lctcri nl gene trlln$fer by nlltur.il gcnelic
t ransfornlatio n in the-.•n\•iro nm('nt. l\.ticr<tbio l. Rcvs.58:563·602, 1994.
Leitura recomendada
- \\IATSQN, J.0.; C ILl\.1A!\', ~1.; \ \llT KO\.\ISKJ, J.; ZOLLER, r>.t, 1t ecómbin11nt l)NA,
2nd Edition. Sci<·ntific 1\ in,..rican Hooks, W.H. Frctm.tln :u'd Comp11ny, Nev.· )'Ork, 1992.
- 01.1), R.\.\' .; l'Rll\.IROSE, S.B., Pri11c-iples o f Cene 1\ 111ni p ulalion, 11n Jntrodu<"t ion to
Ccn etic Eng.in ccring , 4th J.:ditiqn, Blat'k,\·ell S<-icntific Pu blic-ntions. Oxford, 19$9.
ELEMENTOS
DE ENZIMOLOGIA
Bayardo B. Torres
5.1 - Introdução
Unla reação qufn'tica pode ser ar'tal isada quanto à sua ter,,todiná1rrica ou
quanto à s ua cinética. A Ternlodinântica est1.1da a viabilidade e a reversibili-
dade das reações, a pa rtir da análise do conteúdo energético dos ~tados inici-
a l e fina l de uma tra1lsíorntaçào - ''ºcaso das reJçõcs quimicas, o conteúdo
energético dos p rod utos e reagentl"S. Nada e'S<'larece, porém, sobre a velocida-
de com que a tr'1nsformação ocorre. Essa in formação é d<lda pela Cinética.
Uitla reação quí1n ica pode ser te rmodina micamente viável (isto~. se ocorrer, o
conteúdo energético dos produtos será ntenor do que o dos reagc1l tes) mas
não se efetivar em determinadas condições (0\1 sej(l, ter velocidade igual a
zcto ou n1uito ptóxima de zero). Nos parâmetros termodi1tâ1nicos, os organis·
mos não podcn1 interferir. Como setá visto ad iante, sua i1l tcrvenção i1tcidc ex-
clusivan1e1\te sobre o aspecto cinético, isto é, sobre a velocidade das reações.
Tomando o exemplo simples da conversão irreversível de uma s ubs tân-
cia A em 8 (A ~ 8), a velocidade da reação (V) será:
V = d(B) ou V =-d )A)
dt dt
A unidade de V é nloles por litro por segundo, se IBJ e (AJ representa-
rcnt as concentrações ntolarcs de 8 e de A.
A últinla equação mostra que a velocidade da reação dimi1lui à n1cd ida
qt1c a rcaç.'io prossegue e a concentração de A din1inui. 1\ velocidade é, por-
tanto, proporcional à concentração de A :
V=-d (A) =k (AI
dt
A const.tnte k é chamada co11stantt dt tvlocida4t da reaçJ.o, com unídndc
de s·•. Ess.1 é uma reaç.io de pri111~ira ordtrtt, j.1 que sua \'elocidade depende da
concentraç.\o do reagente com expoente 1.
A mriior parte das reações qu ínlicas procC'SSndas nos organis rnos sJ.o
n1ais co1nplcxas, por envolverem pelo menos três mol~c-u las di(ere1\tes e 1>or
serc1n, gcrahncntc, rcversíveis. S~o reações de segunda ordetu, represcn1ridns,
por exc1nplo, por
2A++B +C ou A+B++C+D
para as quais, pode-se demonstrar, as vclocid<tdes de reação serão, respccti\la-
mente
V e k(A(' e V • k(A((B(
...
J
firwa s . 1 ... E~c11dcrrCuçlode~~·~cOll'1C>O"reusd!U"ft~.abat-'a~ ..
º'"* dli W'OJil dt oaçloe •.na hiduacli ~ 1 poi.,~de trd!0*5 con eieJll ~
SN'il
~~ (a)~dt~cm~<SW~_,.a T 11J)~dt~t'l'l"IW..lel•'9f"111A
·""'°'
_
T doo..e T (<)Dsll"o.M;lode ~dc\n\'*""'fll~ T. ~ICba~ ~no
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..··-••
l
""""" •
• •
Fl1ur.a S.2
- •
Cooroentdl óe fe&ÇàO
o
li O-R1
R~ 1
H
F;,ura S.3 - Me<ancsmodl hidrólise ele um ts~C'f cdUI~ pot' H ' .A presença do iona":tf•11 d!J1n~kl<kcAr·
iªs cltv.c:;iis do ~ter, m 1ndo um çimnho óc rcaç.\O Q11t llC«t.iol'la cnetg<a ~ wvaç.\o menor do que o dõt f'elÇlo
n.\o C.ltillis.)(l.1
Praticamente todas as reações quln1icas que se processam nos organi::i-
mos são cat.1lisadas. Os C"1talisadore-s biológicos são proteinas chamadas euzi-
'"as. A catálise d<ls r~açõe-s biológic<ts é iinprcscindível pt\ri'l a con sent<l(~O e
reprodução dos seres vivos, uma ve7. que a maioria das reações químicas q ul'
ocorrem nos organismos têm, na ausênci" de catalisadores, velocidades mui-
to bai.x.<ts. É <'Ot\\um Ct\Cóntrarmos nas cé\ulas reações que, na ausência de
catalisadores, demoram várias horas, d ias ou anos para completarem-se ou
têm velocidades iguais a (':e ro, quando medidas em tempo fin ito. 1>or exem-
plo, a oxidação de gli~ose a C01 te''' velocidade ptati<'<tO\C1lte 1\ula: pode-se
conservar un\"1 soltu;ào de glicose em contato com o oxigênio do ar por mui-
to tempo, s.cm q ue sua concentração seja perceptivelmente alterada . Nas cé-
lulas, entretanto, graças ã presença de enzin1as, a reação con\pleta-se e n\
min\1 tos. O fato de n1uitos microrganisn1os multiplicaren\·Sí.' co1n vclocida·
desde divisão menores do q ue uma hora, só 6 possível pela catálise de suas
reaçôt!'S. Oé fato, as reações catalisadas por enzin1as têm velocidadt:s 11111ito
altas, entre 1 0~ a IOi: vezes m."liorcs que as reações 11âo C<ltalisadas e <l1gu•
mas ordens de gr<lndeza 1naiores que as rea\ões catalisadas por catalisado-
res inorgânicos.
1-\l61n disso, as enzimas apresentan1 sobre os catalisadores inorgânicos
outras vant"1gens. Conto será visto ao longo deste capítulo, gr<lÇ<lS à s ua estru•
tura complexa, podem apresentar un\ alto grau de especificidade, propriedade
ausente nos cat"11isadores inorgâ11icos e, portanto, sua prcse1\Ça pct1nite a sele·
çâtl das reaçôes que poderão ocorrer en1 um organismo, ainda que milhares
de conlposlos d iferentes cs teja1n presentes 1\0 i11tcrior das célul<ls. É tarnb~m
devido às propriedades estruturais d(IS proteínas q\u,_• a reg11laçilo da atividadi
e11::i111ática se processa, pcr1n itindo tun ajuste contínuo da vel<>cidadc da rea·
çiio catalisada às ('Ond ições cel\dares vigentes. Alén\ disso, as enzin\"1S são,
geralmente, si,,tetizadas nas próprias cê/11/as 011dc <ltua1n e sua conceotraçào Cê•
lular também está sob rígido ('Ontrole.
Res\11nindo, as en:.:in1as (l) din1in\len1 a energia de ativ.1ção, levando a
altas velocidades de reação, (2) são muito específicas, (3) são sintetizadas
pelas próprias cél\1las onde at\1an1, (4) têm concen lr(lçào cel\ilar variável,
de acordo co1n <'IS condiçt>es fisiol6gic.1s e (5) pode1n ter s ua atividade 1no·
dulada, permitindo um ajuste fin o do n1ctabol isnlo ao meio a n\bientc. O
conjunto desses aspectos favoráveis justifica o a lto investimento energético
necessário para a síntese de eozin1ns e possibil it<t a 1l1a11ute1tção da vida
c<>mo a conheceinos.
,_
uma lo11ga cadeia.
APOlARES
!Hkir<lfObOI)
,.,,,.,.
r -°'(:,
"""
">N~C-H
1
AJ'anin."I
1
(Ala)
Y"-C-H
coo
(I..>
coo
1
"1N._C- H tyt°"-C-H
Leuôna
("°")
coo·
1
.,_..,.
(Met)
coo
1
Hyi°-C-H
(\'OI)
coo
"'1''• Ç-H
l
1 1 1 1 1 1
H H-C .04.,
°" a., ,~
'i"> 'i">
'i">
~
H.,C CH,
H,C 0., s
°"• 1
T'1Mo!llAO
fT'l')
Fenllal81'1i,.,.
(""')
......
(Pfo)
CH,
{"•
~~-H
1
H1.A"fH2
I
b
Ç•~
ó H,(:-CH,
_J
1
No1e-sc que essa ligação é sempre ftit,\ com os grupos Q; grupos Ct\rbo-
:c:ila e grupos amino p resentes no radical R (como no glutamato. aspartato e li·
sina) jamais participam da ligaç-3o pcptídica. Portanto, uma cadei<i protéica
con,posta por, por exemplo, 150 aminojcidos, terá uma. cxtrenlidadc C•ll que o
grupo a -amino do primeiro an\ irloácido estará livre e outra em qttC a et·carbo-
xila do últiino <i mii,oácido ta mb~m estará livre . Por convenção, n cndcia de
a1ninoácidos é sc1nprc escrita inicinndo·se con1 o aminoácido que 1cn1 o grupo
a-nmino livre.
O que c.tracteriza cada enzima é o nútttero de aminoácidos componentes
de sua adeia e a ordem em que eles se: t-ncontram. ou seja. a sua Ntr11lura pri-
m6rio. Assim, apesar de constituídas por apenas 20 aminoácidos diferentes. as
possibilidades de estruturas di\'Cf'S.l.S p.11ra as proteínas são muito grandes.
Como se ver~ cm seguida. a estrutura primoir1a é responsâ\•el pelas estrutur.1s
de ordem superior que a proteína exibe em sua íorma celular, ou nat1w.
POLARES
(HidrOfilOI)
coo·
...coo·
Klt lidlN
( )
Aspa.IUto
{l'SP)
coo·
GMamato
(Ga>)
coo·
..,,.. 1
·C- H
1
0
tyf -C-H ..,,..-e-H 1 • 1
tyf -C-H
• 1
H~-~H
~
1 1
~ '/"> CH,
1
~
~:; ~ !-} coo· coo·
?-NM2
°'•
1
•NH
H H
3
NH,
Polartt tom e-1rg1
A1p119fln•
l""'l
Cb tt'ina
(Cys)
Glutamln.
C""l
......
(S.)
Treonlna
(Th<)
Tiro.ln•
.....
( )
l
CH, OH OH
1
M1N O
,e~
M2N 0 OH
J
Con1~ da Fc. S.<t
Ligação poptídica
H O
1 11
l
Ha.N·-c-c-- N-C-c-o- + H20
H O
Ili
1
1 1
R H R
'
Figurt. s.s - ~ ~ ~ <» I.~ pcp'lidca. tt~ p.eio vaço n\!is klngo. êss.l re~ iamM
3COl'lte<e nas e~: o proc~so que lc-4 à M form.~ ~ MullO ~o. MYOo'.-erdo 100!. a tnaquf'la!'\l ce!Wrde
$inlC$C pr«éia. ~ irdJi óíetel'l'I~ q:>osdc RN-\. nl.lo$wmos. e~. O esqi.«na tt~t.\ llpton..U o t-tSul'.ado p..vci·
ai do ptOCC»O.
'
1 1 1 1
oH H H o HO
• 1 li 1 li 1 li 1 li
H,N-y- C N- C - C , - 'f-C N
1
• N•C-C· O ·
1 1
1 1
R, H R2 H Rl H H R,,
Am"'°""'°
•
Fipni 5.6 - PQnlC de hld~ ~ (Qm Q$ ~!ementai di lig.~ pcptíbc.a. A ponte de h.<lrogb'»o é U'nl li·
~ln!J!l.Ofl';K;lcm<ompar,}ÇJoàligaçâo<ovt~lemas.oomoexis~~gnnden(mcro,IM'lp.'IP!lll'Tl(lOtUr'l~Nl
twV:Ur'a p<Oté<a.
o
'' .."' '.'
"•
~
''
.....
C'.l"",
''
p , ••
'
____,'''
coo ·r··
•-~ .,,."(_e-•
O = C/
" N-H ••• O = C/
"
"
N- H
/
"
C- R R- C
"
H-N / C =O
"
C • O ••• H- N/
/.
"
R- C C- R
/
N - H ••• O -C /
......._
O=C N- H
oom grupos R com carga negativa (aspart.ito e glutamato). Esse tipo de liga·
(lo, também eh.amada sol1no ou iõni<'1, é encontrada m.1is frequi"ntcmente
n;i $upcrfícic dJ molécula en.cimática, po r formar-se entre radicail!i hidrofi-
licos; pode, por~m. estar localizada no seu interior, porque g rupos con\ car-
gn e létrica s ituados em unl s egmento prcdominanlcn1cntc hidro(óblco da
cadeia polipeptfdica são sequestrados para a regilio l1\térna da n1olécula
pela interiorl,.1ç.30 da ...egilo apoiar. Outr.1 fo rça importante de dobramen-
to da a-hélice slo pontt'l dt lridrqgê1rio, forma das entre grupos R. Notc--se
que essas pontes, ao contr6rio das po11tcs de hidrogênio da estrutur.1 se-
cu11dária, nlio apresentam qun lquer p(ldrAo regular, pois a locali za(iló dos
grupos R cap•tcs de oferecer os elementos para a fornt.lç-ào da ponte de hi-
drogênio estlo distribuídos irregularmente ao longo da cadeift peptídica
segundo a estrutura primáriJ da enzima.
As interoçõcs referid'1S ,1Lé aqui corno responsáveis pela estru1ur,1 tridi·
nlc11sional das cnz.imas s;'io todas íorç;lS fracas. rvf;lS podc s er CJ\COntrada
t;lmbém uma lig.1çâo covalente fazendo parle das liga(ôes que mantêm a
estrutura terciária das proteínds: são as ponlN di$$111frto, ou pontes S.S. Essas
ligações slio formadas por oxldaçJ.o de dois g rupos ~St-1, c.;ida um dos quais
presente ll(l cadeia later;ll de u1n resíduo de cist~hla , o único amh1oácido a
nprcsentar -SI 1 no grupo R. Dcsig1ta-se fé'Sfduo de anlinodcido à fraç.\o da mo-
lécula de aminoácido efetivan1ente inserida na cadeia protéica. Ne1n toda a
molécula do aminoácido est.i presente, porq,1e .llguns átomos foram elimina·
dm na íorma(.10 da liga(:.'io peptídica.
É in1portl1nte ressaltnr que a forn10 espacial d a cnzin\a, responsável
pela sua fun çAo, é result11do indireto de s ua estrutura primária. Unln muta-
(Ao que levasse à troca d<-' un1 único a minoácido da longa cadeia polipeptí·
dica de uma cn1ima poderia aca rretar sua comple ta ini.lli\1aç.io, se o grupo
R do "'no''º .. aminoácido nJo puder l"Stabele<er uma lig.1ção d e hlrutura
terciá ria essencial par;;i a conformação correta da cnzin1a. De fato, ~ fácil
prever,. por cxantplo, as conseqliências par.la cstl'uturo terciária da s ubsti-
tuição de unl resíduo de glutan1ato (con1 grupo R negritivo) por un\ resíduo
de lisina (com grupo R positi\•o) ..<\Fig. S.10 ilusr-ra a:i. prine:ipais ligações
da e~ t rutura tcr(i.iria.
rcm uma funç3o, são, é claro, consideradas proteínas. Outras e nzimas são
lormadas pol' duas ou mais cndc ias polipcptfd icas, iguais ou diícre11tcs,
que isolada11lc11tc não têm capacidade catalítica; nestes casos, o termo pro-
teína só pode ser aplicado ao conjunto funcional, e não às subunidades
(Fig. 5.11). Estrutura quate rn4ria é a organi7a(30 presente nas proteínas
compostas por mais d e uma cadeia polipeptídica e descre\re quantos e qua-
is monômeros co1npõem a mo1 ~cu loil e como estes monômeros cstdo associa-
dos. 1\s íor(as que 111antêm u1lidos os monôn1cros co1nporlC1ltcs de cnzin1as
co1n estrutura quaterná ria são as n1esmas que mantêm a estrutura te rc iária,
ou seja, interações hidrofóbicas, pontes de hidrogénio e ligações salinas,
íormadas entretanto, entre grupos R de aminoácidos pertencentes a cadci·
1
H
1
H3C- c - . r (•)
l
1
CH0
(b)
<e>
l•>
(•)
164 ,__._.~
+ o +
o
Flaura S. 1:.Z - Esqutma de ut'l\'I tt'.lyiO do llpô A+ !)-) C + 0, QJt e~ tia varderb-6! de IA'I WIJ,PO <JJÍ'l'KO
do~10A p.v-.to<Ot'l'ÇOS1o 8 . Arcav'c> dopcndc d.1 c~So cn~ ~ molêaJlas de A~ B l\l pioso(J!()f.lYOf.i-,-d.
Com :i lig~çio dos $1Jb$!r.itos <lO $bo :tb'YO W~ ~ ~ t f~l-uda.
A rclaç.ào espacial entre substrato e en.zinla nào deve ser v istrt segundo
um n1odelo rígido de chave-fechadura. A aproxin1a~ão e a ligação do subs tra-
to à enzima a ltera o delicado balanço de forças responsá\•eis pela n1anutenção
da estrutura tridimensiona l da enzima, amoldando s ua forma à fo rma do
s ubstrato e fa zendo-a adquirir unta nova c:onformação, ideal pa ra a catálise.
Assim como a ('nzima, os s ubstratos têm s ua conf<>r1naçào tcnsio1\ada e distor·
cida, aproxi1nando·S(' da conformação do estado de transição. Além disso, o
substrato, corretao1cnte posicionado no sítio a tivo, está próxinlo de g rupos R
decisivos p:ira a catálise. Retomando o exemplo mostrado na Fig. 5.3, o grupo
positivo H . da catálise não-enz inlática poderia ser substituído por um radical
I~ positivo de um aminoácido do sítio ativo na catálise enzi1nática, passa1ldo,
portanto, a reação a independer dos choque:s casuai!t êll lrê as nlol&-ulas dos
reagentes. É esse conjunto de mecanismos q ue torní.'I í.'I catá lise C1lzinlâtica tão
eficiente.
coo·
1
C• O
1
CH 2
1
coo-
r
j>-
-
<•> (b)
r-auraS.14
- - - - - -- ---
E1q.Jef"'.ióeU'l"ll~~ New~. alieaçk)do~~,.oaow.
alo5tb'lco ..-. a tw\.Cln dt f'!"illtl\l. ~•~do tubwar.o aocemo at.w ~- porurco. a~
o + ATP +
S.6.1 - pH
A maioria das erlzimas apresenta unl \1alor de pH para o qual a sua a ti·
\ridade é máxima - a velocidade da reação dimin\1i à med ida que o pH se
afasta desse ' 'a lor ótimo, que é característico para cada enzima mas, com fre-
qüência, está próximo do p H neutro. ;\ influência do pH sobre a catálise enzi-
mática só pode ser compreendida a partir da análise dos grupos dissociáveis
presentes nos g rLtpos R d os anlinoácidos. De fato, histidina, arginina, lisina,
g lutamato, asparta to, cistcína e tirosina (Fig. 5.4) têm grupos R que podem ser
considerados ácidos fracos de Brõnsted. Pela definição de Brõnsted, ácidos
são compostos capazes de d issociar-se, liberando H*. Ácidos fracos são aqlte-
les em que a dissociação não é completa, restanto em solltção também uma
porcentagem do ácido não dissociado; existe, portanto, um equilíbrio químico
que pode ser escrito:
HAf-+A + H"
Como a equação acima s ugere, as concentrações relativas de HA e de A
dependem do pH. Quando o valor do pH é baixo (alta concentração de pró·
tons), o equilíbrio rearranja-se pelo aumento da concentração de HA e diminui·
ção da concentração de A. Quando o valor do pH é alto (baixa concentração de
prótons), ocorre o inverso. Os grupos R dissociá,reis d os aminoácidos con1-
portam-sc de maneira análoga, como está exemplificado na Fig. 5.16. Portan-
to, cada g rupo apresenta-se ligad o ou não ao próton, dependendo do pH .
H' (b)
5.6.2 - Temperatura
A infl11ência da tentperatura sobre a cinética da reação e nzimática deve
ser entend ida en\ d11as fases distintas: em princípio, a u mentos de temperatu-
ra levam a aumentos de velocidade de reação, por a11me1ltar a c1\erg ia cinéti-
ca das moléculas conl p01\C1\tes do sistc1na, a u1nen tando a p robabilidade d e
choques efetivos entre elas. Esse efeito é observado em url\ intervalo de tem-
peratura compatível com a manutenção da estru tura espacial da crtz ima.
Tempera tu ras ma is altas levam à des11aturnçlf<J da enzima, ou seja, à perda de
sua estrutura nativa, catalítica, por a ltera rem as ligaçõe-s q uímicas que nlan-
têm sua estru t11ra trid imension'11. Rompidas as pon tes de h id rogênio, que
são ligações bastante ternlolábeis, dcserlcadeia-se uma cascata de alterações
estru turais, levando a enzima a 11nta nova coilformação 011"' um estado scnl
estr11tura definida; a enzima é d ita, então, desnaturada. A temperatu ra q ue
provoca desnatt1ração natu raln\ente varia pa ra cada enzirna mas, geralmen-
te, está pouco acima d<? sua ten1peratura ótima.
5.6.3 - Desnaturação
A desnaturaçiio p rotéica é entendida como a perda da estrutura que p ro-
piciá a ft1nçifo da prote;nn. H t1bitualn1e11re, os agentt..">S desnaturantes preser-
~ .. (. _ 171
COENZJM1\ CRUPOTRANSPORTADO
ictr.lidrofoli.ltO Carbono
Nem semp re~ i1ncdiata a diferença entre s ubs trato e cocn.zii:r1a. No en·
tanto, un\ crité rio dife rencial é o fato de o s ubs tr<lto sofrer novas a lterações
rias reações metabólicas subseqiientes, enquanto a coenzi1na, através de outra
reação, volta à sua forma original. i-\ rcaç-ão que n1odifica a coeni ima e a rea-
ção que restau1a stia forma original s.ão cata lisadas por enziolas diferentes e
específicas, que tê m e 1n coinun\ apenas o fato de utilizarem a mesma cocnz.i-
ma. AJ~m disso, 1\a nlaior parte das reações, a ligação da coenzima à enz ima
precede a ligação do s ubs tra to à e1lzinla .
Em algu1ls casos, a coenzin\a c11contra-se covalentemente ligada à molé-
cula enzimátic.a, co11stilt1indo, portanto, um grupo prostético da proteína; em
outros casos? a coe1'lzima é t1Dla 1nolécula ''livre", reunindo·se à enzima a pe--
nas ''º 1non1e1lto da catálise. Duas coenzi1tlas tra1,sportadoras de hidrogênio
podem servir como exe1nplo das d uas possibiUdiides: a fla vina adenina dinu-
cleotldio (FAD) aparece sempre como g rupo prostético de enzin1as, enquanto
a nicotinan1ida adenioa di1lucleotidio (NAD') é gcralntentc livre, podendo
a tuar co1no coeni in1a de d iversas t'JlZii11as (Figs. 5.17 e 5. lS).
A cs1-rt1tt1ra qtiímica das coenzimas é bastante variável. Alg\1mas coenzi·
mas, como o 1\ TP e o CTP (guanosi1la trifosfa to), são integralmente sintetizadas
pelas células. Outras apresentam e1n s ua 111olécula um conlponente orgânico
que não pode Sêr sii1tctiz.ado pelos animais superiores. Esse co1npo11c11te, ou
t1n1 precursor in1ediato, deve e1'ltão ser obtido atra\•és da d ieta, constituindo
uma v ito111i11a. As vita nlinas são, portanto, compostos orgânicos indispensáveis
;:io crescimento e f\1nções normais dos anin\Jis superiores e q11e, ao contrário dt-
carboidratos. protcí1\as e lipidios, são requeridos na dieta em peque11J.s quanü--
dades (microgramas ou 1niligranlas d iários), já que são prec11rsores de coe.nzi-
OlJ.S, cujas concentrações celulares são O\uito pcquc1las. Na rvticrobiologia as
vitan1inas incluem-se entre os co1tl postos qtle, generican1ente, são chamados
JatorN 1/u crtscinte,,tt.>, assinalJndo a nttcssidade de sua presença no meio de
cultu ra para o clcsc1\volvin1cnto do "'lcrorganl!'\ n10. A 11ecc.ssidade dcssés
eompost·o.s ,raria com a espé<ie. Esthrr;c~t;o coli, uma bacté-ria ronltlm no trato
intestinal humano. f capaz de multiplic11r·se em uma solu(Ao rontendo a~
nas uma fonte de cJrbono (glicose. por exemplo). uma fonte de nitrogênio
(Nl-1~·· por exemplo) e alguns sais miner.1is; é, portanto, capaz de s intctiiar IO·
dos os compostos necessários à sua manutenção e reprodução, inclusi\'e aque-
les que, pa.ra os animais superiores. constituem \'Ílaminas. Outras t"Spkies
bacterianas nect-ssitJnl vitaminas, amino.icidos, bases nitrogenó'lda:s, etc.
~~:Ú~b~o
'
0
O-f>-
HH H
0 -C ·C-C-
' ' C-CH2
"• ldHI
1
1 -
OH OH
o 0 NH2
0-P-0-C><~
H~N>
t...;-.N - I W
1-0-CH, 1
~
O
1 H
O H H
OH OH OH
NAO• FAO
FipraS. 17 - ~dtAias<OCl"IM\l.._.~~dil'ludtotido(NAD")e~adMnldt'lucleo
tao(FA.()t e.d.~ f ~por U'l'\I bM ~ ..-N ~e lnl&!'CJO to.Wo..
•
MAO• • SH, ~ HAOH • H• -+ S
FAO • $Kz - FAL>H, • S
9iN"2 •H'
A
NAOH
(..O.-)
g, H 0
CH31""".(N y v NH • 2H' + 2e ..- CH3"'f""Ynyc_~H
c"·~.....,.c-o º"'"""""'"'e-o
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FAD
CoxkS&do}
F.,.,.... S. 18 - ~6n deo~~PQl"CN.llNSQUC tCmWJ>' o.i FK>corno<oenrimas:osubf-
nio ~(SHJf~. ~dt+ctododc~de~'IOe•QX'N.""*~-~~ oNAO·
l"Kebe~~~""~k.wiooo~~"°~·OFKJ~°'dols.,,,.d!hd~
(tio~~ aptNS n par!!"S mc.v» ~(õe'IZIT'l6. o~ d.l l'flClltcl.lcsd ~por ll
S .9 - Classificação e nomenclatura
Pelas regras oficiais de classificaçAo e nomencla1ur.11, as enzimas sào di-
\lididas em ~is grupos, de acordo com o tipo de rea(ÃO que ca1alisam (Qua-
dro 5.2). Cada um d esses grupos é aind3 ~ubdividido em classes e subclasses.
11umeradas d e tal fo rn1a que cada enzintil possa ser identificada scnl an1bigüi·
dadc. Assim, por exen1plo, a cozima que Cillalisa a re 1110(ào de e l~ tron ~ do
etano) (port,.nto, uma oxidorredutase) é designada d/('O()/: NAD":oxidorrcd11ta~
e rttcl>e o ndmero de classificação EC 1.1.1.1. (EC, de Enzyme Comission).
Essa nomenclatura oficial é. na prática, muitas "'eies de-sobedecida, em favor
d e nomes mais simpJcs o u que se tornaram clássicos. Assim, por excn1plo, a
enzima cit<idri q t1e catalisa a oxidação do eta nol ~ COll\t1111c11te referida como
lflcool dtS;drogru11sc; a enz.i1na que cataJisa a síntese de gllcogé1lio (oficialn1ente
designada UDPglicos<:glirogboio 4-a·D·gli<o>1/tr11nsjtr11s.) é chamada glirogboio
si1rta.S<. Como se \'é nesses e>..emplos, na nomenclatur.1 usual, o nome é dado
indica1\do o s ubstrato, seguido de uma o utra palavra tcrn1inada em ase que
especifica o clpo d e rcaçJio que a cnzima catalisa. r..4esn10 essa formfi simplifi·
cada de 1tomenclatura apresC'nta cxct"(Õ<'S, ronto é o caso das enzinlaS digesti-
' '.as: pqsin•. tripsina etc, c-ujos nomes triviais tornar1im·se clássicos antes que
M regras sistemoiticas de classificação e nomenclatur.1 fossem estabelecidas.
Apesar disso, não é neccss.ário memorizar os nomes das en2in\as pois, com
um pouco de prótica, é possível pre\rer o non1e da en zin1n conhttC'ndo·se a r~·
ação que ela cala lisa, ou vice-versa.
CLASSE T IPO OE REAÇÃO
Oxidorr('duç.\o
- Oxidorrcdullll)(!$
A. + B '-+ A + e·
Tr.1nsferên<'i11 de grupos
A·X + B ... 1\ + B·X
Hidró lise
3 - Hldrola~
A·B + H~O ~ A·H + U· Ol-1
Rearr.tnjos intramoletulari.'$
X Y Y X
1 1 +-+ 1 1
A-B A-8
Leituras complementares
MARZZOCO, A.; TORRES, 8.B. 8 i0>quími<a 8 ~$i<.a .21 ~-d iç,\o Rio d <' )ilneiro, Guan.tb.a·
' "· 1999.
LEl•INli'\GER, A.L..: NELSOl\~. O.L.; COX. M .~i. Ptlnclpltt o( 8iochc mis try. Ne"' Yorl:,
1
\\o rth Publis h<'rs, 1995.
S'rRYF.R, L. Biochcmistry . 4 .' ed. NC\\' Yo rk,. \V, H . Fr~man and Compan)', 1995.
VOET. O.; VOET. J.G. 6 iochcrnist1y. 2 .' ed. New Yo rk, John \Vilcy & Son s, 1995.
1-IO RTON_. l'l.R.; MOR.AN l..A.; OCl-IS R.S.; RA\'ll\1 J.D.; SCR l ~tC EOU R K.C. J>rinci·
p lt:s of Bic.>che mistry. EngJ<'h·ood C li(fs, NJ, Neil P,1ttcrson Publishet$·Prcntice H:ill, 199.l.
ZUBAY, C .L.; P1\R$0N, \\1.\V.; V1\ NCE, O.e. rrin ciplC's of Bloch emJstry. Oubuque,
Wn\. C. 6 r()\\"n Cé.>rnmunicatiOn$-, lnc .. 1995.
GARRET, R.H.; GRISHA~l . C .?--1. Biochemlstry. Fo rt \\10 rth, Saun dc:rs College Publis·
h ing. 1995.
K11iER, P. BiC)chemi.Stry•>\ Found;ition . P.icilic Cro,·e. C.tlifornia, Brook$/Cole l)u·
bli$-h ing Comp.iny, 1996.
CAMINHOS
,
METABOLICOS
Otto Jesu Crocomo e Luiz Eduardo Gutierrez
6. 1 - Introdução
Tod:is as rcaçõ<>s quínlicas que acontecem no contexto d<'I célula e, por·
tanto, são reações bioquímicas, são import(lntes para o aparecin1ento e conti·
1,uaç~o da ' 'ida sobre a Terra; nlas J\á algun1as qtte historican1ente (lpresentanl
maior i1nportância. É o caso das reações da fermentaçiio d<! carboidratos, n\ais
especificamente de hexoses, qtie Gay Lussac em 1815 representou pela seguin·
te equação ger.ll:
Glicose-1-fosfato + fosfoenzima H
glicose-1,6-difosfato + defosfoenzi nta (6.2)
CH 20H
l __.OH
Hll1 o
"lº"_j
HC
1
Fn.itose--6-P
(éster de Neuberg)
o o o
"'9l • Ad'9f'lin<i
' ''
o- /
/
' o-
i1
O- P-0- P-0 - Rlbose
lio lio
Frutose-1,6-difosfato ~
diidroxiacetona fosfato+ gliceraldeído-3-fosfato (6.8)
Ess..i reação é a. eis.ão da molécula original de hexose que foi fosforiJada
nos C· t e 6, e então cUvada para íormar as 2 moléc\llas de triosefosfato, as quais
na realidade são 1nohkulas de gliceraldeído·3-fosfato, uma vez que as reações
posteriores dependem de GA·3P e, portanto, esta moléctda é q\te será desassi·
milada, dando formação a ácido 3-fosfoglicérico.
3.~ fase - Oxidação de tr-iose-fosfalo
.,,,
1
• O '- P
SH ..,
1
s1
1 1 1 1
CHOH • CHOP CHOP
• CHOP
1 1 1
COOH COOH COOH COOH
õ .,..,
.,_
t <D
Glucose • 6 · P
M©
-~
ATP+-.._J @
COOH
1--ADP
lJlL• •._ .•.p C-O•P
•
CH2
PEP
®Mg'·
2.f'GA
2,3 · 0PGA
®
@
0A·3P
~NADli•H" ATP
NADl,3 - Df'GA ~
AOP
fiswa6,6 ~fec*.co &iMw I}~ l)fodotitc ti~l)~-1) ,.._
aD<e.S)~6)~"netW.7)~delr'Clidosúoo:8J~ 9)........,0'IV-
ta.W 1O) tr'ICl.l.W: 11) ~ pt\Mc:a
COOH
1
co e~ + CHO (6.13)
1 1
CH3 CH3
PiN\•ato Ac«taldoldo
•
-.Old...SO
~
ETAl\'OL
Alguns subprodutos da ícrmcnt-açâo lática, como acétttldcfdo, acetona,
acetoína e diõl«til 530 importantes para o aroma cm alimentos produzidos com
essas bactéri;1S. Acelaldeido origina-se do piruvato e dos ami.no.kidos aspátti·
ro. metionina e treonina; diacetil e acetoína são produzidos a p.art1r de cilrato.
Dois métodos podem ser utilizados pair,,i detectar qual processo a céluJa
está utilizando para a degradaç3o de açúcares:
Método 1: coletor as c~lula s crescidas c1n glicose; extrair as enzimas e
detectar as atividades. Se níveis ele,•ados de 6P·gluconato desidratase e
2-<eto-3-deoxi-6P·gluconato aldolase e bai>.os "'''eis de fosfofru toquinase fo.
rem encontrados, trata-se de um organismo realizando o processo EO.
Métod o 2: comparando-se o processo glicolítico (Fig. 6.6) com o pro·
cesso EO (Fig. 6.7) nota-se que o carbono corboxílico do ácido pirllvlco na
glicólise origina··s e dos carbonos 3 e 4 da glicose. enquanto no prOCí'SSo ED
origina-se dos carbonos 1 e 3 d1 glicose. Assim o método de radiorrespiro·
metria. utilizando glicose com os carbonos 1,.3 e 4 radioativos. pode ser uti·
lii;:ado para essa diferenciação.
.._
CHOH CHôH CHOH
1 1
CH,oP
1
CH20P CH,oP
GicoM.eP &P-o 2-cet<>-3-dtoxi•
COOH
1
""°1
e'/' COOH
1
CtlO
1
CHOH C=O + CHOH
- --
1 1 1
CHOH CH, CH,oP
1
CH,c>P
2-oeto-3-dtoid·
6Pi1lucon&10
Lactona-'W 6P·Gluc:6nieo
NAOPH:r ,,,,.___,J_
~./ ... C02
_____.
Xllulose..sP
Ribulose-SP
"'...
Ribose--SP
TPP transcetof.:lse
. Ácido lipóico
Piruvato + NAO + J-IS.CoA > Acetll·CoA + NADH + 1r (6.19)
Tl''I> Mg+2
FH
Ç-0 • ~· NAO
~J
= C.01• NADH,• ~
_ ....
Ctt3
FADH; o i )
--+
"--...Coe<>2'ma a
FN> . , - /
Antimicitla A - - - - _...
/
Clloitoan.,Mm~oo b
!
C..Oouroc
ATP
i
QloaOl'llO ata.)
Cianeto - - - - - - - _ .,
~o - ------• ATP
o
6 2.8. 8oc:tênas ~
As bactl!rias acéticas do gênero Acetobacter são organismos e~trilamen
tc acr6bios, que obtêm ATP a partir da oxidaçJo do etanol até ácido ac~tico:
CH3 CH3
I + Cocnzilna ox. - > 1 + Coenzima n."'CI. (6.20)
Cll20I 1 CllO
etanol ncct.11dcfdo
HiQ CH3
... Coertzi.ma ox. - > 1 + Coenzima n!d. (6.21)
COOH
kido acet.lld<ído
6.3 - Biossíntese
6.3.1 Carboidratos
Bactérias e leveduras em meio ausc1lte de carboidratos como ncct;ito1
glicerol1 hidrocJrbonetos e ácidos graxo~ :,Jo capazes de produzir carboidra-
tos, utilizando-se do Ciclo do glioxilnto pnrn íorn\açtio de S\1ccinato, e ntividndc
de gllcol\cogêncse com as enzimas rcvcrs rvcis da glicólise, conlo pode St'r ob-
servado nti~ Figs.6.11e6.12.
ACIOOSGAAXOS -
9"'
COSCoA
- · CoA
~--\
())c11oect1.aeo CH2 - CC>Oti
HO· ? · CC>Oti
/ e;..,.+
CH2 ·COOH
CH2 - COOH
1
CH·COOH
1
Gk»dlalo 1
CH,
1
COOH
~3 SYo:IMeo!
COSCoA •
Aeebl - CoA AÇUCARES
(6.23)
gli<Ooc·6P--+ glic:coe· IP
A(JO da pirofosforilase
(6.24)
glicose· IP+ UTP--+ UDP·glicose +PPi
A(âO da s intetase de tralose-P
(6.25)
UDP·glicose +glicose-6P--+ trealose-P+ UDP
Ação da trealOS<>-P fosfotase
(6.26)
Trealose-P --+ trealose +Pi
6.3.3 - Poli·OH-alcanoatos
São polímeros produz.idos principalmente por bactérias com a funçAo de
reserva de Cõ'rbono ou de energia. A produ(3o é estimulada em determinadas
condi(ÕeS. como por exemplo a defici~c-ia de nitrogênio, e pode alingir alé
~do mater-ial celular seco.
Bactérias do gfnero Alc.aligt11n s.Jo capazes de produ7ir po-
li·OH·.butir.lto a partir de glicose e sacar~. o género 8urkholdtr1d a partir
de glicose. frutose, sacarose e gliconato e RJrodococcus ru~r prodl1Z um copo-
límcro de poliidroxibutirato com 3·0H·v.llcrato, otediante a adiçlo de .icido
propiônico ao substrato constituído por glicose ou sacarose, segundo o se-
guinte csquénta:
Propionnto + liS.CoA --+ Pr<>pionil.SCoA + AMP + Ppi (6.32)
Entner-Doudoroff
Glicose - > --> --> --> Acetil-SCoA (6.33)
v NADPH +- H•
0(-)-WH·\•aleril-SCoA
! Polimerase
l'QL.fMERO
Poli-OH butir:ito é um polí11lero do 0(-)-beta-OH butirato com peso mo-
lecular entre 60.000 e 250.000. É co1\siderado como resen1a de energia caracte·
rtstica de procariotos como: Alcnlige11i-s tutrcphus, Azot()bacter vi11eln11dii,
Bt1cill11s ,11tgateriut11, Pseudo"'º""s 11111ltivora11s. RJ1odospirill11111 rubr11111; Schaeroti-
lus 11ata11s. bacilos de modo ger:il e bactérias fototrópicas. Acumula-se nas cé·
lulas, como granulos cercados por membranas. e1n condições de d('ficiência
de nitrogênio. As reações de síntese estão apresentadas na seqüência:
+ NAOH
2 CHyCO-SCoA-> CHyCO-CH1 -C0-5CoA > CH3-CHOH-CH,-CO-SCoA
AcetiJ.·CoA Aceto.1cetil-CoA bctn-OH~buritil.CoA
i
POU-OH-BUTIRAlD
Referências bibliográficas
Citadas
(1) K0$1il,.ANI), 1).€.JR.; \VEST1 1El1'.tER, F.l l. Jo urn.al Amtrit'an Chemical Society,
... 12. p.3383-338$. 19$0.
(2) NORDSTROM, K. \'e.tsl gro\vlh and gl)'tttol form.:itiQn. Acta Chtm.it'.t S<andinavl-
ca, v. 10, n.4, p.1016-102S, 1966.
(3) OURA, E. Rcaçti()n producl~ of yl-.i$l fcrmentations. Pr0<e.ss Bi0<hemistry, v. 12,
p. 19-35, 1977.
(4} WESB, A .O.; INGRAHAJ.1, J.L. fusel Oi!. Adv:i.nct".s in A ppl icd ~1 icrobiology, v. S,
p.317·53. 1963.
(5) GOTTSCHALK, C. 8.1c-tcrial mctaboli$0t. 2.cd. No\'a Yotk, Springtr·Vcrlag, 1986.
Recomendadas
C ROC0~10, O.J., Tr.-nsfom'laçOes metabólicas em microrg.inismos. lnst. Biol. Pcsq.
Tccn.E.Par<tná, Curi1íb.l, PR, 1967
LStlNINCER, A.I..., Principies o f Biochem.islry. N0\'3 York, \\1()rth Publi$hers, 1982.
::..:__=:==--=====---,
-~CINETICA_
DE_REA-çOES_
,
-
==-- -ENZIMATICAS=-- 1
Walter Borzani
7.1 - 1ntrodução
A Cinética de Reações Enzimáticas ~. a rigor, um caso particular da Ci-
1\ética QuSmica. Seus objetivos são:
a) medir as \•clocidade:s das transfor mações que se processam;
b) estudar a iJ'f1u~1lcia de condições de trabalho (como, por exem-
plo, concentrações dos reagentes e das enzimas, temperatura, pH,
concentrações de ati\•adores e de inibidores) naquelas velocidades;
e) correlacionar (qt1er por meio de equações empíricas, quer por
nleio de nlodclos n1atcmáticos) as velocidades das transformações
com alguns dos fatores que as afetam;
d) colaborar na otimização do processo considerado;
e) estabelecer critérios para o controle do processo;
f) projetar o reator mais adequado.
Esses objetivos, resumidamente apo1\tados, dispensan1 co1nentá rios adi·
cionais relativos à importância prática desse estt1do.
Em um curso de g raduação não cabe um estt1do aprofundado,. com vis·
tas ao exame de todos os casos conhecidos e de todos os i1nporta1\t{'S pormc·
1\ores inere1\tes a s istemas complexos. Visa-se, tão somente, estud<:'lr alguus
casos s i1nples, com o p rincipal objetivo de adquirir e consolidar conhecimen·
tos fundamenta is indispensá\leis a futuros dc-sc-nvol\limcntos. Os interessa·
dos em um estudo mais comp leto poderão constiltar a literatura indicada no
fi nal deste capítulo.
7.2 - Medida da velocidade
Consideremos o e-aso em que, em solução aquosa, um dado substrato, de
fórmula moJcc-ular $,é tra1lsf?rinado em produtos de fórmulas molectLlares P,
Q, etc., e~ uma reação catalisada por uma en7.imJ de fórmuJa molecular E.
Esquematicamente:
s.....i.....r+Q+...
Como ~xe~plo, poderíamos citar a de<:omposição da água oxigenada
e1n água e oxigênio, na presença da enzima catalase:
H 10i c.i.&o..r >H 10 +f0 :
O primel°ro prob/cn1a que se nos apréSenta, ao pretendennos estudar a cinéti-
ca d<1 reação, é a medida de sua velocidade em o:>ttdições experimentais conhocjdas.
SuponJt.a1nos que stja possível, no sistema que nos interessa, nledir a con 4
l ''
'
'
,,
,
'' Subs:tra\O
/
o
o Tempo
Figur-a 7. 1 - ~~K'..i.dMv~ões~<onctntrai;õesdosvbstratoedo~o.~W.S
~ nol!'l$Wlte 1 edn ..'<'IQOO.)deS lt'ICr.llS (t=O).
~--·...· - ·· ....... u.·~·,..,_ 199
Muitas s~o ílS reações cn zhn~ ti cas cujas vclO<'idades iniclAis podem ser
determinadas, desde que se tomem os devidos cuidados experimentais. Além
da já citada decomposição da !gua oxigenada, poderíamos citar, a tituJo de
exemplos; a hidrólise da sacarose catalisada pela in,·ertase e a hidrólise da
uréia,. catalis01da pela urease.
Há,. poré nl, casos ma is complexos,. cm que a velocidade inicial n~ o pode
~r medida, ot1 porque não existe uma técnica experimenta l que permita
acompanhar as variações das concentrações no sistema em estudo, ou porque
• transforma(ÃO nJo pode ser representada por uma equaçJo qufmica com
reagentes e produtos bem definidos. A velocidade da reação, nesses casos, é
freqüe ntemente representada por uma velocidndt ,,,fdia de consumo, ou de
p rodt1ção, de s ubstâ ncias conveniente mente escolhidas (' •er Fig. 7.2) ou, a in·
da, de \1a riaç3o de uma propriedade do sistema (viscosidade, textura, absor·
b.ãncia,. etc.) em um inter·valo de tempo preíi:-.ado. O amolecimento de carnes
pela ação da papafna é um exemplo de proctsso enzimático em que não há
condiçõeS de medir uma velocidade inic-ial.
"----- - ~
•
o •
o Conoenuaçêo da enzSna
Agu...a. 7.3 - ~ ~bad\ ~ dl concentraçloda CtlUl'ai navelooclldc oo ~·
o
O Coneenlf8Çào do wb$.trato
!,+.! :~ f§-f;-""tE +P
• •l • • • •
sendo:
k 1 =constante de velocidade de formação do complexo
k : = ronslante de velocidade de di~sociaçAo do complexo
k, 2constante de velocidade de dec:omposiçJo do complexo
fornlando o produto
t'"= velocidade de rormaçlo do produto
(7.2)
Supondo, a iilda, que após tim regime transiente inicial muito curto
(da ordem de alguns microssegundos), a concentração do conlplexo se
mantém consta nte (hipótese de Briggs e Ha ldane), isto é, d•/dt=O, a eq.
(7.2) fo rnece:
(7.3)
sendo:
(7.4)
v=V '
K. + s
(7.6)
.,
V
\
(7.7)
isto é, K,. será, neste caso, praticamerlte igttal à constante de equilibrio de dis-
sociação do complexo ES.
Quanto menor for o ' 'alor de K~ maior será a afinidade da enzima
pelo s\1bstrato.
A determinação de K,.. e V a partir de valores experimentais de s e v,
pode ser efetuada linearizand°'"sc a cq. (7.6).
Para tanto, um método mt1ito utilizado, chamado n\étodo de T~inev.·ea
ver-Burk, consiste em inverter ambos os membros da eq. (7.6):
1 1 K.,. 1 (7.8)
-=-+ - ·-
V V V s
Essa 1,.lltima equação nos diz que 1/v varia linearmente com 1/s. Os coe-
ficientes linear e angtLlar dessa reta são iguais a 1/Ve K.,/V, respectivamente.
- .'
Tendo-se os ,.3 Jores experimentais de se os correspondentes valores de tJ de-
rcrmina·se, por regress3o linear, os valores de l/V e K,./V e, consequente·
mente, V e K. (ver Fi~. 7.6).
l/v
,'
, ,'
1
v-.......... ,
,,
,'
,' '
'
-'-
Km
o
s K 1
(7.9)
-=---!t.+-· S
V V V
2.s2 2,19
•.33 2,35
7.2S 2,S7
1 -
o ' -.
o 2 • 6 8
• (gll.}
\
(f . 0,9995}
o L--~--.---~-~-~--,----~-
0 1 2 3 4
+ (l / g)
+ =0.2417 •0,3595.s
g
>
'•
V=2.78g f l ·h
K,..,=0.672g/ L
l
o
o
'(gil)
• 6 6
Figun 7,9 - Otterm.~ ót V e K,.. pdo método de Hat'le$ ~plicado .10S valore$ da. Tabdl 7.2
(r• coet'1Cierne 6e <OtT~}
E, + / • El~
, E + P'
-
f-1.-, -
,_, t) -y •
onde v., velocidade de fom"tação do produto P, é obviameilte menor que v (ver ite1n
7.3), \Ul\a vez que parte da enzima está "bloqueada" na reação co1n o inibidor 1.
Teremos então, unla vez que, na prática, s>>X e i>>y:
E+I •''ET
e, conseqüentenlentc, k.:=O
"
Sendo dx/ dt=dy/ dt=O (ver item 7.3: hipótese de Briggs e Haldane), as
eqs. (7.10) e (7.11) nos darão:
X= ---' =-·=·- -
Kfl'l (l + i/ K; ) + s
(7.12)
(7.13)
ondeV • kJ ·t.
Aplic-ando-se, na equação (7.13), o método de Linea,ver-Burk, tere1nos:
1 1 K. (1 +i,K1 ) J (7.14)
- • -+ ·-
V, V V s
representada esqt1enlaticamente na fig. 7.JO.
A eq. (7.14) pode ainda ser graficamente representada colocando-se,
em abcissas, a concentração do inibidor em vez de 1/s, como nos mostra a
Fig. 7 .11. Pode-se aqui demonstrar que as retas obtidas para diíere1ltes con-
centrações d~ substrato cruzanl -se 1lo ponto de abcissa -Ki e ordenada,
l / V.
1-\s eqs. (7.6) e (7.13) JlOS pcrnlitem calcular a relação entre as velocida-
des da reação sem inibidor e co1n inibidor:
•
••
1 . .'·~:~..
....:.....
.
v-........_ :.:~··
.....
J..11+.&.)
V s
•'
•
...,
•
• " ,
s • ••
·K;j(HK;) ••/." /
. ..
••····
. .
.. •. .
. ...
, ...• ····
.
V
-K, O
• . ~-=-~-- ·
"""'·''
na~ ../w
___..............._ .._...__
o
Essa liltima equação, representad.i n.i Fig. 7.12, nos mostrti., influência
das concentrações do substrato e do inibidor na relação v/v1• Em pílrticular, se
íor possível trabalhar com conce1\traçõcs de substrato relativnmcntc riltas
(m<itcm<itican1ente, s - . «>),a influência do inibidor pode se tornar dcsprczS·
vel. Essn tendência pode ser também observada no exemplo num~rico repre-
sentodo no Fig. 7.13, no qual V• 6,10 mg/ L·min, K. =2,50 mg/ L e K,• l,60
mg/ L.
K,,. . 2.50 mg / l
l<,• 1.eDmg/ l
50
'
• (mg / l)
Um exentplo de inibiçAo contpctitiva é o observado no efeito inibidor da
glicose na hidrólise da sacarose, catalisada pela invertase. A inibiç3.o, pro,•o·
c.11da pela alfadtxlrina na hidrólise de amido catalisada pela alfaamila.se, é ou·
tro exemplo de inibição competitiva.
Uma vez exnminados os pontos ft1ndamcntais da infl uência de um inibi-
dor competitivo na velocidade dn reação enziinática, passen1os ao exame de
um caso simples de inibição não competitiva.
Nesse tipo de inibição,. o inibidor não compete com o substrato pelo sitio
ati\•o,. mas v.11i ocupar outro sftio da enzima (sftio regulativo ou de inibiç-Ao)
como indicado, esquematicamente, a seguir:
E +S E:S~ E+/'
E+/ E/
ES+I EIS
EI +S EIS
v•V-~ · 5 (7.16)
K, +i K. +s
(7.19)
oO Conoenttaçào do Súbs:trato
'
Figura 7. 14 - R.epresentai;Jo ~ dl itllluência d.l concentt~ do subw.lto na vcloodbáe dl ~ na
presença de um "'IÕ!dOt' nio~. que reage im:versivcmMte com a MZ>Ml.
1• \
.•
.
.•
.• ../
..• ....
. .. ...
. •
...
. .: ...· .•
: .·· .. ··
....
.:.·:..____,___________ u.
_ ....,:......
·,/;
As eqs. (7.13) e (7. 16) nos mostram ainda que, enquanto na ínibição com·
petitiva a velocidnde nldxima niio é n(ctílda e n cons tante de Michaelis é multi·
plicada por um fator nlaior que 1, na inlbiç.\o não-competitiva a constante de
Michaelis não é afetada e a velocidade máxima é menor do que V.
E +S ES...!...., E +P
(7.23)
1/T
~7. 17
......... (•}
_ . . _ _......................... -...(T) ... -dt...._...
7.6 - lnflu~ncia do pH
P.irtindo-sc do fato. bem conhe<ido, de que o pH do meio aquoso em
que se desenvolve uma reaçAo enzimática afeta trtnto o cst11do de ioni1açJo da
enzima quanto a vclocidodc da reaçõo, pode-se s upor q\1C l.'l lltividade cataliti-
ca da enzima depende de seu estado de ionização.
Imaginemos, então, o seguinte sistema relativamente simples:
1) A enzilna se encontra em tr'1-s estados de ionizaçilo, representa-
dos por E.'°1• E'''' e E'-t•:
2) Somente lt 1 apresenta ativid~e catalític.l;
3) Os seguintes equilfbrios coexistem no sistema
K , •h·~.
-
e,
(7.24)
h ·~:
K,•- (7.25)
••
(7.26)
qut" nos permi1em e.ileu lar'• (concentraçJo da fração da enzima que apresentõ1i
atividade catalítica) em fl1nç3o de e (concentração total da enzima no sistema)
e de Ir (e, conscqücnte mc1\tc, do pH). O vnlor de e, vai determi1lnt a velocida-
de v na eq. (7.5).
7. 7 - Comentários finais
No início deste capítulo tivemos o cuidado de informar que não seriam
exanlinados, aqui, todos os tcmó'ls que intC'grnn1 o vasto campo da cinétic-a dos
prOC'~ enzim~ticos.
Literatura recomendada
(1) BAILEY, J. ~ & OLLIS, O. F. Blochitmlc.tl li-nginterlng Fundam•nl•l.f, McGr.. ~··
Hill, N Yorlt.. (1986).
(2) OIXON. ~t lc \\'E88, E- C Cruym~• .)..• EdJ('Jo. Ac.aditmk PttSS, N Y0tlt.. (1979).
(3) ILLANES, A Blott('nologl.a dt Enzim.lj Ed1.ciones Un1\trs1târias de V;alpar.tUo d~
la Unlvc.•r11idad Católl<'1I dl~ \'alpar•fso, Y.1l~rai:so, (199-4).
(4) l.;\101.F.R, 1(, J. & BU1'.'TINC, I'. $. The Chtn1lt'.al Klntll<'f of Enayn1e A('lion, 2.'
Ediç.lo, Clar-tnd~n Pl'f"», ());ford (1913).
(5) SEGEL..1 li En&ymt KintUn.. \\'il<ty·lnlt~. N. Y0tl (1975).
TERMODINÂMICA
DE REAÇOES
,
-
ENZIMATICAS
Otto J. Crocomo e Luiz Carlos Basso
8.1 - Introdução
lofoje, 1nais do q\1e nunca, est.1mos conS>cicntes de que a e1u.•rgia, n capa·
cidl\de de realiiar trabalho, é vital para umo civiliz.ação modcr1la. Nas suas
diversas formas {elétrica, mecânica, química, calorifica, luminosa etc.) é uti-
li1.ada para a manufatura de produtos, transporte, aquecimento, refrigeração
e demais trabalhos.
A dlula '\•iva igualmente necessita de energia para a realiiaçlo dos di-
versos trab.alhos fisiológicos que ela t'.\ttut.:1: biossinteses (trabalho químico),
tran)porte ativo (trabalho osm6tiro), contraçJo muscular (trabalho mecãnico),
bioluminescência etc.
A bioct1trgélica é o campo da bioquímica que trata das transformr1ções e
uso da cncrgí.i pelas células vivas, estando s\1jcilJ aos mesmos princípios du
tcrnlodiilft1nica, nlas as peculiaridadetS dos sistemas biológicos cxigc1n umu
abordagcnl diícrcnciada, como será apresentado llO presente capítulo.
Enl sentido amplo. as células íotossintctizadoras e as heterotróficns ali-
mentam-se nlutuamente. As primeiras ;iproveitam-se do C01 atmosférico
para produzir carboidratos e devolver 0 1 ao nleio ambiente. As heterotróíicas,
por sua \rtz, utilizam os carboidratos assim produzidos e o 0 1 e liberam CO,
para a atmosíer<.1. A Fig. 8.1 moslrt11 essa interdependência nutricional (sintro-
fia) R."SS<lltotndo-se o acoplamento dQ) cicl~ do carbono e do oxigénio na bios--
fera: durante a íol0$$íntese, a energia sol.1r é transíonnada em energia química
sob a forma de ATP, NADPH e carboidr.1tos (glirose).. os quais s.'io utilí.to.ldos
pelas células heterotróficas na realizaç:.o de atividades que consomem energia.
A luz solar é, cm última análise, a prhneir.l fonte de energia tanto ptlra células
autotróíicas conlo hetcrotróíicas.
•
•
sendo t.E a variação na energia quando o slstcnla vai do estado inicil'll paro o
final.
Um sistema fechado pode rcali1ar vArios tipos de trabalho sobre ~cu
meio, <uj•s quantidades podem S<>r somadas sob o termo W (tTa~lho), quan·
do ent.lo • energia total gasta pelo sistenl• para fazer o trabalho é - \\1'. Ao
me5mo tempo em que o sistema isot~rmtco, sob prêSSão (P) constante, perde
energia intrínse<:a para seu meio (-~V). ele tJmbém adquire energi.t sob• for·
ma de calor (+Q) a partir de seu meio. Nes!'J.C taso, a ,·ariaç3o em sua '"ncrgid
intrínseca )erá o resultado da soma da 01quisiç3o de energia Q e perda de ener-
gia -W:
t.C Q - W (8.2)
01'1dc W é o ttí.'lball\o feito pelo sistema c Q o calor absorvido pelo sistcmo. O ~i
ní.'11 - indica que o trabalho feito pelo sistema envolve gasto de energia, en-
quanto o sinal + indica que o calor absorvido pelo sistema representa ganho
de energia.
A tntrgia pode ser transferida de um sistema para outro. stja por meio
de nu~o de c-.ilor ou por meio de trabalho. ~ importante ter em mente que a
energia (E) é uma propriedade caracteristic01 de um sistema. Fluxo de tr.'lb.ilho
e calor nlo :,..\o propriedades de um sistema,. mas constituem mtios pelos quJis
a encrgií.'I ~ tr.1nsferida quando ocorre a tr()(.l.
1\pesar da existência de muitos tipos de trabalho, em Química os mí.'liS
signiíicativos s.âo o trabalho elétrico e o retilitado pelos gases cm expnns:lo.
Trabnlho clét-rico pode ser prodtiziclo por células el<!t-roqufmicas, cnqun1\lO
que trabí.'llho e1n expansão resulta de tuna varií.'l çJo no volume dos sistemas
envolvidos e é usualmente chamado dl' lrabalho prcssào-volun'e (trilbí.'llho
PV).
Para qualquer sistema isotérmko f(.'r(hado que não realiza outro trabalho
sobre seu meio senão aquele que deriv:. de sua expansão, temos:
a) volume constante,
Eó =Q, (nllo pode se expandir;) (8.3)
b) pres.:,3o constante,
(8.4)
Q é o calor absorvido sob volume consti'lnte, quando nenhum trabalho
é reali~do; Qp o c.llor absor\rido sob pressJo constante, quan~o nenhum
trabalho é realizado além do trab.ilho press.'\0--\10lume de expansao; P ·óV o
trabalho p res,sâQoovolume realizndo pelo sistema sobre seu meio como consc·
qilé1,cii'I da expans,lo; e ô.E o aun\Cl\lo 1\a energia intrínseca .
Considerando-~ também todas as outras formas de trabalho (W'), a pri·
meira lei pode ser assim escrita:
L\E •Q- P ·L\V-W' (8.5)
Entrctant·o , se W'= O,
(8.6)
8.2.2 - Entalpia
A energia intrínseca (E) de um sistema é um atributo que depende does-
tado presente do sistema; é uma fun~3o de estildo. N3o se pode medir o valor
de E de um sistema fechado em um estado qualquer, mas é pos.sí\•el medir-se
a diíercnça entre os \1alores que E adqttire cnl dois estados, obtendo-se á(.
Isso porque, sob Te P constantes, L\E ~ Q - W. As vias pelas quais essa varia-
ção tem lugar podem ser \•árias e, cm cada uma delas, Q e l\f têm valores \lni·
cos.
Sob press.io constante, o valor de Q pode ser calculado a partir da equa·
ção
Q,=AE+W (8.7)
e, ent3o,
Como • <nergia "ªi de um estado 1 para um estado 2, a Eq. (8.8) pode ser as-
sim rttSCTita:
que nos dá
Q, =(E 2 +PV,) -(E, +PV1 ) (8.10)
Desse modo. o calor Jssociado con\ urn processo que ocorre sob pressão cons·
tantc pode ser obtido pela diferen(.l entre dois l<'rmos E + PV.
~fiel~ 223
8.2.4. Entropia
Ul'nn reação l'xergônica nl1o ~ 1lcccssarianlente exotérnlica•. 1n~s é cspon·
15nen sob Te p constantes. Logo, a quantidade de calor absorv1dn ou geroda
por umn reação, quando nJo está realizando trabalho ú ti l (ou S<.'ja, ôli), geral·
mcn1e difere do valor AC. Essa diferença freqüentemente é tJo grande que
tom09 óJ1 sem vaJor como um índice de espontaneidade da rea(Jo. Ainda
ma•~. de\'e ocorrer uma outra \•ariaçJo na distribuição da energia a qual não
est~ impli(.tda na \•ariaç-Jo da energia livre. A diferença entre os valores de H
~ C, de f<1tO, pode ser atriblJúJd '1 UmJJ YaT.iafJO simuJtãnea no \'a for de uma
outrJ funçJo de estado do sjstema, a t1tlrop1n.
A terceira lei da Termodini\mic., estabelece que "no zero absoluto, os
cri~toi:. perfeitos de todos os conlpostos têm entropia nttla". Ou seja, quanto
mnis orde1~ado for o sistema, nlcnor será st1a e1ltropia (S). Aliás, entropia é
ttnlu nlcdida da desorgo1liznçllo de unl sisten1a. É um va lor que determina
qual a porçõo da energia de uni s is tcm.i que é incapaz de produ1ir trabalho
útil.
Sob urna dada Te P, d ''.JriaçJo na entropia Sé igual à soma das cntropi·
as dos produtos menos a soma das entropias dos reagentes. Numa re.açlo iscr
térmica, ó1I difere de âG por uma quantidade relacionada a AS:
(8.13)
(8.14)
AE=AC+T·AS (8.15)
onde &Cº é a variação-padrão de c11ergia livre. Seu vaJ01 é obtido quar1do a rea-
ção se processa à temperatura de 25ºC, e todos os componentes da reação es-
tão em seu estado-padrão. O estado-padrão é uma cond ição de refer~ncia
conveniente na qual as atividades são arbitraria1nente definidas conlo uni-
dade para líquidos e sólidos puros, gases a 1 atm e conlpostos em solução
em concenitração aproximadamente lM. Segue-se, portanto, que óGº é u.n1a
constante para uma dada reação.
Oeve--se ter em mente que é o valor de óG e não o de bCº que indicará se
t1ma reaçtio é espontânea ot1 não. Entreta nto, as tabelas que se encontram nos
textos sempre incluenl os valores de ACº, porque são quantidades definjdas,
enquanto que &G pode ter qualquer valor, dependendo das condições i.mpli·
cadas na Eq. (8.17) que, obviamente, reílete-se na Eq. (8.18).
Qttando uma reação atinge o equilfbrio, óG = O. Nesse ponto, a energia
livre é míni1tla e ni'io Jlá possibilidade de posteriores transformações.
Obtén1-sc então
.\e• (cal)
• 4089 0.001
1.
• 2126 O.OI
• 1363 0,1
o
- 1:16}
2126
'º
too
401><) tOOO
Os \•.1lorec;; d:a Tab. 8.1 for.1m obtidos con ...iderando··st" que. enl uma c;f .
lu la vivll, o eqo1líbrio ~a ti ngido, por~nl rcage1ltes e produtos são 1nantido~
dtntro de l>Str('itos limites, en1 níveil> dl> regi1nc estacionário, que podem ser
bastante diferentes dos n{veis de equilíbrio. Entretanto a energia liberada ou
utilitada em uma reação depende da magnitude com que o sistema se desvia
do equilíbrio.Na realidade, uma cxpressao matemática de AC de uma reação
deve, cnt.lo,conter dois termos: \lm indicando as concentrações atuais dos rea-
gentes e produtos e outro indicando as concentrações no equilíbrio. Assim,
para a rcaç:io
ai\ +b8 ... cC +dD
t·cmos
Logo:
gli<ose- • '°z
Pahnll•to • 2302
llidr61ite
~ 6CO.z • 6H10
~ t6CO~ + 16H10
e -686
-2l38
1
1
anidrido Att1icc • H,:0 ... 2 .11«"1.1110 1 - 21.8
pirolot/.tto • ~o -+ 2 fosf;1110
frutose--6·fosf;110 -. glic~f06f.110
' -º·"
...
Eliminll(.iO
1-
m•l•to ..,. !1.11nar•to • H,0 • 0.75
-- --
E,=E-E 11
onde EH é o potencial de eletrodo do hidrogênio que, por definição, é zero.
Portanto a equação geral para o cálculo do potencial de um s ist·e nla OR é
Note-se que s:~ refere-se a medidas feittlS no valor pH zero. o que fre--
qüentemenle é impossí"el. Usa-se o termo E. para indic.ir que o polcncial de
eletrodo-padrão foi estabelecido J u1n dndo v.-.lordo pi 1.
s uccinato ++ íu1naralo + H 2
A~1 + H 2 +-+ AMl>f2 (8.25)
O/J06=0/J3.log (lumoroto)IAMH2 1
(SU«in.ltO) (AM)
REAÇÃO (escrita na form.a de redu ção E' pH 7,0(V)
M02 ... 2H' . ic _,, 1·120 + 0,816
1 (fu.marato) • O,IO
og l•uccinato)
e ent.lo:
X
..,.,,--• l,26
100 - x
X • 55,8%
L\E: • RT ln K'
11F
de onde se segue que
(8.26)
Ora, a partir dos conceitos de Termodinâmica, sabf!...se que 11G• est! rela-
ciorud1 rom K':
(8.28)
Isso significa que a variação-padrão de energia livre de un\a reação e1\·
tre dois sistemas OR pode ser calculada a partir da diferença entre os \ alores
1
Na Eq. (8.28) o valor de .6.E~ deve ser positivo, a fim de se obter AC nega-
tivo, ou seja, um valor âE~ positivo indica uma reação espontânea.
O potencial de redução de ti ma meia-re(lção, na qual as formas oxidada
e reduzida da substância estão presentes e1n concentrações não-padrão, pode
ser calculado a partir da equação de Nernst:
• 2,3RT !oxidada)
E IS E• + 108
11F !reduzida)
log !oxidada)
lreduzidal
o
H 1
HN - C- N - POH
1 1
H1C - N OH
1
CHzCOOH
Fot.fó\IO de eteatilf
F!cur.a8.1 - Fod'atode~efodatodt~IJl'\,l
o o o
1 1 1
HOP- O - P - o - p-OCH,
1 I 1
OH OH OH
o
•
creatina +ATP +-+ AOP+íosfocreatina (8.29)
O valor ó.G'° dessa reação é pequeno, unla vez que K aproxima-se da uni·
dade. Isso tem dois s ignificados:
• a energia passa facilmente de ATP para a creatina;
• a reação se dá nos dois sentidos, dependendo da concentração dos rea·
gentes.
Há outros compostos que, como o ATP, possuem também fósfo ro lábil:
os fosfatos de uridina, de citidina e de guanosina. Esses conlpostos, por hidró-
lise de seus grupos íosfato, libcra1n energia Jivrc. Se be1n que ATP seja o rea-
gente mais comum dentre os fosfonucleosídeos.. UTP, CTP e GTP (Figs. 8.4;
8.5; 8.6) são tambénl importantes respectivamente no nletabolisnto de aç(Lca-
rcs, 1la biossíntese de lipfdeos e 1la oxidação de ácido et-<etoglutárico.
o o o
1 i i
HOP .,.,.. OP .,.,.. OPOC!i,
1 1 1
OH OH OH O
""'
"'- N
o o o ),
1 1 1 H 0
ttOP - OP - OPO Cf'2
1 1 1
OH OH OH o
o
o o o
HOP
1
-
1
OP -
1
OPOCK, (N
1 1 1 N
OH OH OH
Note-se que, nas fórmulas estruturais indicadas, o sinal (-) ind ica liga·
ção rica de energia.Essa Jigaçii.o ~ t-a1nbém encontrada em Olltros compostos,
fosfatados Otl não. A Tab. 8.4 mostra os valores de energia livre-padrão de hi-
drólise de algtLns co1npostos fos forilados.
Atttllfosfato - 10, 10
F~foc-rc:itina - 10.30
1,3-difosfogl iecr., to
-Fosfoe1,olpiru,•ato - 11.80
- 14.$0
-
(K'•l71;4Ci • 3,30kcal)
Por sua vez, o grupo fosfato de AMP tem baixa energia livre de J1idrólis.c:
AMP+H,0--+odeoosina +Pi (dC~. -3,40kcal) (8.34)
No caso presente, a reação (b) somente guiaroi a reação (a) se for COnJU·
gada a \1m intermediário comum, como no seguinte C<'ISO hipotético:
e) R·COOH + ATP++R-COO- AMP+ l'Pí (<~G" • O)
o o
li t
R- e - o _.. P- 0 - CH
1 '
o
o
ATP +glicose++ ADP +glicosc • 6 · losfoto (LIC' ' s-4500cal e K' =4000)
De acordo com Lipman, a importância da formação de és.teres fosfóricos
reside no fato de o fosfato conferir estabilidade cinética "' moléculas termodi·
namicamente Jábeis. Assim, quanto maior a <."Stabilidadc cm água de um éstcr
fosfórico, maior será a sua \ltilidade bioquímica. Apesar de o L\Cº de hidrólise
de anidrido acético, acctilíosfa to e piroíos fato inorgânico ser du mesma gran·
dez.a para os três, a estabilidade dos m('SmOS é de poucos scgu1ldos, algumas
horas e .-lguns anos, respecti\•amente. O ATP é está\·el em 4igua. o que é de
considerâ\•el \•arttagem para a economia da célula.
O sistcm.1 ATP / ADP é n ligação obrigatória que une, como uma ponte,
os compostos fosfatados ricos de energia livre co1n os de baixo energia. Fosfo~
transferases cspec-ílicas atua1n nessa lransfcrência, tomo é o caso de q\1inasc
pirúvica(Eq. 8.38).
FOSfOELPU:tUVATO
16
14
~
~ro
DOADORES OE FOSFATO
RICOS OE ENERGIA
12 ~ •P
RESERVATÓRIO OE
10 .-,p , / ' FOSFOCREATINA
8 ~ Jt'•P
ATP'-.
~•P-· .............
6
• ACEPTORES OE FOSFATO
OE BAIXO NNEL OE ENERGIA
"'-...... - GLICOSE-6-FOSFATO
...........
4
GLICEROL~OSFATO
01..L~~~~~~~~~~~~~
'"""ª·ª - """""~""""<-•>
8.3.S - Acoplamento de reações
Às ve-zcs uma reação endergônica, que não se processa por si mesma de·
vido a um aumento na energia livre, pode ser acoplada co1n un\a reação exer-
gônica e,. asshn,. o sistema todo se proc~rá. Para que isso ocorra, deve h(lvcr
um infennedi'íirio comum a ambas as rea~s. Assim..
C02 +2NH,
Ea =24,6kcal /mol
En • 6,8kcal / nlol
Estado de
transição
EnerQia livre de Energia Hwe de ativação
311v;)Cto da da reaç.ão reversa
tt~não nào<.atallsada
eatal~
-1--·
_
Enorgia livre de
_;~a reação
variação tõt31 d3
energia livre da
reaçao
- ---- ,,.,_,.
....
;:,.,
_
ES1\!lclo
Sentido da reaçêo
Figura 8.9 ... ~dienzima.no~do~di ~de'~de t.rna reaç.10~
246 ,~ .. l'frl(Õlf'I~
_,, .• :::1
(",..
Upldooe 1
~--~ .~
-·
Fip<tt.10 - ~ccmo••~esde~ "*°'ncosdeet'llfllil
...
8.4 - Energética dos sistemas abertos
A .ln"11ise dos sistemas fechJdos é «!lativamente simples, porque s.lo
ronsider.ldos somente os estados inicial e íin..11 de um sistema após alcanç.lr o
e
equilíbrio. o caso das reações enzi1náticas individuais. Entretanto, quando
se tenta aplicar esses conhecimentos às cf.11ulns intactas, as dificuldades tor-
na1n-st grandes, pois as células vivas sl'io sislt'11ns alh!rtos. Como tais, e las tro·
cn 1n 1nfltérla co1n seu 1neio e, a lén' dis:,o, nu1\ca entram totalnlcntc c 1n
equilíbrio. Ot1 seja. em nenhum 1non\Cnto, unla célula vi\•a existe c1n regi·
me estacionário, no qual a intensidade de entrada de matéria é igual à in-
tensidade de saída de matéria.
O., sistemas abertos em n.:l~uilfbrio slo estudados através da trrmodt-
n6"1i€• dM proa:ssos i"etYTSí~is 011 di'-nAo-niutlfbrio, que não di5cutircmos
~qu1. De\'emos lembrar, entretanto, que um sístema aberto em regime estttc10-
nário é C.lp.iz de produzir trab;Jlho ju~t;imcntc porque está longe do cquilí·
brio. Jd s;.1bemos que sistemas no ponto de equilíbrio são íncapa ..cs de
produ1ir tr.lb<'llho. E, por e:st<'lrcm longe do equilíbrio, os sistemas abertos po·
dcm :,.er controlados e regulados. Alt1111do1nais, conlo bem lembra Lchningcr,
Nno forn1rtl isn10 da Termodinâmica do 11l1o·cquilíbrio, a condiçtl.o de reginle
estaciondrlo, que é característica de toda nldquina que está fu1lcionando bem.
pode ser considerada como o tstado ordt'undo de u111 sistema aberto, ou seja, o
estado no qual há um mínimo de produçAo de entropia". Ainda mais: todo o
pr0ttsso de biossíntese de macromoléculas e do d~vol\•imcnto celular é
uma poder0So1 força antientrópica. Como ress.ilta Katchalsky, *desde que n~o
~ podt escapar do destino cntr6pito de todos os fenômenos, O!> organismos vi·
\•os. mantendo um regime estacionário. produzem entropia com um mínimo
de intensidade ...
Uteratura recomendada
Kl..O'rZ, 1. Encrg.y change$ in biochemica.I ~ at'tions. Nova Y<:>rk, ,\cademic Press, 1%7.
KREBS, H.A. & KORNBERC, H.L. Energy tran.sformation.s in living m atter. Berlim,
Sprin.g·Vtr-Jas OHG, 1957.
LEHNlNCER, A.L. The m itochondr-ion , Nov<1 York. W.A. Benjamin, 1964.
LEHNlNCER, A.L. Sioentrgtlic.s. Nov.1 Y<:>rk, W.A. &enjamin, lnc. 1965.
UHNlNCE~ A.L.. Prln ciples o( 8iochemistr-y. Nova. York, Worth 1>ubls., lnc., 1982
1,.1Pt-.1ANN, F. Met.1bolic gener:atio n and utilit.ation oí phosphiilt bo n d cn ergy.
Adv:inccs in J.:nzymology. v.I, 99p, 1941.
~iORRIS, J.C. A blologist's physica.I chemislry. Londres. Edh·ard Arnold (Publs.) Ltd.,
1968.
Pl~fENTEL, G.C. & SPRATLEY, R.O. Underst.1nding chemic.11 thermodyn.1mlcs. S.10
Francisco. Holden-0.iy, Lnc., 1969.
RACKER, E. ~iechoa ni sm.s in bioenergetics. Nov., York. Acaden,ic Press, 1965.
SECEL, J.E. Bioch emic:il coalculoation s. Nov.i York. John \.\li.ll'Y & Sons, lnc., 1968.
PROCESSO ,
BIO~ECNOLOGICO,
INDUSTRIAL GENERICO
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Tratamento
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Cultura
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Literatura recomendada