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HISTOLOGIA 2016
Arlindo Ugulino Netto.

NOÇÕES BÁSICAS DE MICROSCOPIA

No estudo da histologia, tradicionalmente definida como “anatomia microscópica”, é de fundamental importância

o uso do microscópio. Para adquirir conhecimento histofisiológico sobre tecidos, órgãos e sistemas é necessário que o
aluno conheça os fundamentos da microscopia, uma vez que, o procedimento mais utilizado no estudo histológico é a
preparação de cortes teciduais analisados em microscópio.

MICROSCÓPIO ÓPTICO
Através do microscópio óptico (MO), também chamado de microscópio de luz, preparações coradas podem ser
examinadas porque um feixe de luz é transmitido através do corte histológico.
Um microscópio óptico pode ser simples ou composto: o microscópio simples possui uma única lente e só
fornece uma imagem moderadamente aumentada do objeto que se está estudando; o microscópio composto consiste
em uma série de lentes e fornece um aumento muito maior. Na disciplina de histologia, geralmente se utiliza
microscópios ópticos compostos, podendo ser monocular ou binocular.
O MO é tradicionalmente composto por partes mecânicas e ópticas:

 Base ou Pé: estabiliza o MO sobre a bancada.

 Braço ou Coluna: se estende da base para cima (suporte).
 Mesa ou Platina: local onde se coloca a lâmina para observação.
 Parafuso macrométrico: botão para macrofocalização.
Partes mecânicas  Parafuso micrométrico: botão para microfocalização.
 Carriot: movimenta a lâmina sobre a platina.
 Revolver: onde se encontram as lentes objetivas.
 Canhão ou Tubo: suporte para oculares.
 Lâmpada: fonte de luz.
 Oculares: conjunto de lentes de aumento. Ampliam a imagem formada pela
objetiva. O aumento final da imagem é dado pela multiplicação do aumento da
ocular pelo amento da objetiva.
 Objetivas: captam a luz oriunda do condensador e formam uma imagem ampliada
do objeto, sendo fundamentais para a distinção de detalhes durante a observação.
São em número de quatro: panorâmica, pequeno aumento, médio aumento e maior
Partes ópticas aumento ou imersão. Os aumentos são indicados por anéis coloridos:
o Vermelho: 4x
o Laranja: 10x
o Amarelo-verde: 40x
o Azul claro 100x
 Condensador: combinação de lentes que projeta a luz sobre o objeto.
 Diafragma ou Íris: controla a passagem de raios luminosos.
 Espelho: reflete os raios emanados da fonte de luz.
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Um microscópio óptico composto é um sistema de aumento em dois estágios: primeiro o objeto é aumentado
pelas lentes da objetiva e depois novamente pelo segundo conjunto de lentes da ocular. O aumento total, como foi visto,
é o produto dos aumentos de objetiva pelo da ocular. O valor gravado numa objetiva (4x, 10x, 40x, 100x) indica o
aumento da objetiva; sendo assim, uma objetiva de 40x usada em combinação com uma ocular de 10x dá um aumento
total de 400x. É interessante observar que a imagem projetada na retina está invertida da direta para a esquerda e de
cima para baixo.
A qualidade de uma imagem depende não somente da capacidade da lente de aumentar, mas também de sua
resolução (capacidade de lente de mostrar que dois objetos distintos estão separados por uma distância). A qualidade
da lente depende de quão próximo sua resolução se aproxima do poder de resolução máximo do MO, isto é, 0,2µm
(restrição esta determinada pelo comprimento de onda de luz visível); esta resolução permite a obtenção de boas
imagens aumentadas de 1000 a 1500 vezes.

OUTROS TIPOS DE MICROSCÓPIO

 Microscópio de Contraste de Fase e de Contraste Diferencial de Interferência: espécimes biológicas não
corados são geralmente transparentes e difíceis de serem observados com detalhes. A microscopia de contraste
de fase baseia-se no princípio de que a luz muda sua velocidade ao atravessar estruturas celulares e
extracelulares que tenham índices de refração diferentes, tornando possível a observação de células vivas e
cortes não corados produzindo imagens visíveis de objetos quase transparentes.
 Microscópio de polarização: “polarização” é um fenômeno que ocorre quando a luz passa através de certas
substâncias, tais como os cristais, e é dividida de modo que emergem dos raios luminosos derivados de um só.
A capacidade que estruturas têm de girar o plano de vibração da luz polarizada é chamada de birrefringência. No
microscópio de polarização, a luz é polarizada embaixo da platina do microscópio por um prisma de quartzo
Nicol chamado polarizador. Um segundo prisma, chamado analisador e polarizador, é ajustado de modo que os
feixes luminosos tenham um trajeto paralelo e uma imagem normal pode ser vista através da ocular.
 Microscópio de Fluorescência: “fluorescência” é o fenômeno que certas substâncias possuem de quando
irradiadas por luz de um certo comprimento de onda (invisível) passam a emitir luz com comprimento de onda
mais longo (visível). Neste tipo de microscópio, a luz ultravioleta é utilizada para iluminar as secreções de tecidos
que passam a emitir luz na porção visível do espectro, fazendo com que substâncias fluorescentes apareçam
brilhantes sobre um fundo escuro. O microscópio de fluorescência possui uma fonte de luz ultravioleta muito
intensa e filtros especiais que selecionam o comprimento de onda dos raios luminosos que atingem o espécime
e também dos raios que são emitidos pelo espécime.
 Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET): este difere do MO pelo fato de usar feixes de elétrons em vez
de feixe de luz. O funcionamento do MET se baseia no princípio que elétrons podem ser desviados por campos
eletromagnéticos de uma maneira semelhante à refração produzida pela luz por lentes de vidro. Elétrons são
liberados pelo aquecimento deum delicado filamento metálico (geralmente tungstênio) em vácuo. Os elétrons
liberados por este filamento (chamado de catodo) são então submetidos a uma diferença de voltagem de 60 –
120 kV existente entre o catodo e o anodo. Desta maneira, os elétrons são atraídos pelo anodo e acelerados,
atingindo altas velocidades, formam feixes e percorrem o tubo do microscópio. Alguns elétrons interagem com
átomos do corte ao atravessá-lo e continuam seus trajetos em direção às outras lentes, enquanto outros
simplesmente cruzam o espécime sem interagir com ele. Pelo fato de a retina não ser sensível a elétrons, para
se observar uma imagem, eles necessitam ser projetados sobre um detector – uma placa fluorescente, um
negativo fotográfico o uma câmera CCD. Como a imagem no MET é produzida pelo balanço da quantidade de
elétrons que atingiram o detector e elétrons que foram retidos no tubo do microscópio, a imagem resultante é
sempre em preto-e-branco. As áreas escuras de uma micrografia eletrônica costumam ser denominadas de
elétron-densas, enquanto as áreas claras são chamadas de elétron-lucentes ou elétron-transparentes.
 Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV): diferentemente do MET, no MEV os elétrons não atravessam o
espécime, proporcionando apenas uma visão de superfície. Um feixe muito pequeno de elétrons é movido
sequencialmente de modo a varrer a secção de tecido. Os elétrons interagem com uma camada muito delgada
do metal previamente aplicada ao espécime e são refletidos pelos átomos do metal. Estes elétrons são
capturados por um detector que os transmite a amplificadores e outros dispositivos de forma que o sinal é
finalmente projetado em um tubo de raios catódicos (um monitor), resultando em uma imagem e preto-e-branco.
As fotografias resultantes são de fácil interpretação, pois apresentam imagens que parecem ser iluminadas e
possuem locais claros e outros sombreados. A microscopia eletrônica de varredura fornece imagens
tridimensionais das superfícies de células, tecidos e órgãos.

PREPARAÇÃO DE UMA LÂMINA HISTOLÓGICA

Para estudar tecidos, órgãos e sistemas em histologia, foram desenvolvidas várias técnicas para manter um
aspecto muito próximo do natural vivo, de tal forma que, estrutura e composição molecular seriam as mesmas
apresentadas no corpo, porém, o método mais utilizado é o preparado histológico permanente (lâmina histológica
permanente) para análise em microscópio óptico.

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 1ª etapa: Coleta da amostra.

 A coleta da amostra é realizada através de: Biópsia cirúrgica; Biópsia endoscópica; Biópsia por agulha;
Cirurgias amplas; Necropsia; Cobaias (animais de laboratório).
 Deve ser processada: imediatamente; sem choque osmótico; sem “congelamento”; sem compressão;
sem trações; sem dessecamento.

 2ª etapa: Fixação do material histológico.

 Objetivos da fixação: Evitar a autólise; Inativar enzimas; Coagular proteínas; Endurecer a peça; Impedir
contaminação; Facilitar a coloração.
 Agentes fixadores:
 Físicos: calor; radiação.
 Químicos:
a) Orgânicos: ácidos (acético, pícrico, cítrico, etc.); aldeídos (formaldeído, acetaldeído,
glutaraldeído).
b) Inorgânicos: cromatos e bicromatos; sais e óxidos de mercúrio.

 3ª etapa: Desidratação do material histológico.

 Objetivo: substituir a água ou o solvente aquoso do fixador por um solvente não polar como primeira
etapa para a inclusão de parafina ou em resina.
 Agentes desidratantes: álcool etílico; acetona; álcool butírico; álcool isopropílico; álcool metílico; éter.
 Sequência:
 Álcool 70%  1 hora
 Álcool 80%  1 hora
 Álcool 90%  1 hora
 Álcool 100%  2 horas.

 4ª etapa: Clarificação ou Diafanização.

 Objetivo: remover o álcool, que substituíra a água no interior dos tecidos, por um solvente que seja, ao
mesmo tempo, miscível com álcool e com a parafina.
 Consequências: o tecido torna-se transparente; há remoção da gorduras; há o risco de tornar os tecidos
duros e friáveis.
 Clarificadores: xilol; benzol; tolueno; ciclo-hexanona.
 Sequência:
 Álcool – xiolol  2 horas
 Xilol  1 hora
 Xilol  ½ hora

 5ª etapa: Inclusão.
 A inclusão é o processo pelo qual a parafina embebe os tecidos, ocupando todos os locais onde in vivo
havia água e solidifica o material em um bloco semirrígido de parafina, do qual podem ser tiradas fatias
delgadas, de cerca de 5µm. O processo de inclusão é dividido em: embebição e inclusão definitiva.
 Embebição ou impregnação: etapa na qual os tecidos, impregnados de xilol, são imersos em parafina
o
fundida a 56 C e mantidos em estufa a este temperatura até que se complete e substituição do xilol pela
parafina.
 Inclusão definitiva: etapa na qual os tecidos já impregnados de parafina são postos numa fôrma cheia de
parafina fundida, que se deixa solidificar a frio para formação de um bloco. A esta parafina geralmente
são acrescentadas ceras. Obs.: A inclusão é uma fase crítica pois, se muito rápida, poderá não retirar
totalmente o xilol e o calor em demasia torrará os tecidos, introduzindo artefatos.

 6ª etapa: Microtomia.
 Objetivo: obtenção de um corte de parafina contendo no interior as partes não aquosas dos tecidos,
posto que a água foi substituída pela parafina como a menor distorção possível.
 Resultado: cortes agrupados que se põe a distender flutuando em água quente e da qual os cortes são
individualizados e recolhidos por meio de pinça e fixados sobre lâminas de vidro.
 Uma das capacidades mais difíceis, frustrantes e demoradas, necessárias na histologia, é aprender a
visualizar um corte de tecido em lâmina, que pode ser longitudinal, oblíquo e transversal.

 7ª etapa: Coloração.
 Na microscopia óptica usam-se principalmente corantes solúveis em água, por isso, a parafina precisa
primeiramente ser removida dos cortes, depois, o tecido é reidratado e corado. Os vários tipos de
corantes desenvolvidos para a visualização dos muitos componentes das células e dos tecidos podem
ser agrupados em três classes:
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 Corantes que diferenciam os componentes ácidos e básicos das células;

 Corantes especializados que diferenciam os componentes fibrosos da matriz extracelular;
 Sais metálicos que precipitam nos tecidos formando depósitos de metal.
 Corantes mais utilizados em histologia e estruturas coradas:
 Hematoxilina: núcleo; regiões ácidas do citoplasma; matriz da cartilagem.
 Eosina: regiões básicas do citoplasma; fibras de colágeno.
 Tricrômio de Masson: núcleos; músculo; queratina; citoplasma; mucinógeno; colágeno.
 Tricrômico de Mallory: núcleo; citoplasma; colágeno; músculo.
 Orceína: fibras elásticas.
 Coloração com prata: fibras reticulares.
 Ácido periódico-Schiff: glicogênio e moléculas ricas em carboidratos.
 Wright e Giemsa: células do sangue.
 Picro-sirius + Luz polarizada: colágeno.

 8ª etapa: Montagem.
 Após a coloração, o corte é novamente desidratado para possibilitar que uma lamínula seja afixada de
modo permanente usando um meio de montagem adequado (Bálsamo de Canadá).
 A lamínula não somente protege o tecido de danos como é necessária para a observação do corte ao
microscópio.

Baseado no Roteiro para Aulas Práticas da Professora Giciane Carvalho Vieira.