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TESE DE DOUTORADO
RECIFE
2012
TESE DE DOUTORADO
RECIFE
2012
Thiago Henrique Napoleão
Aprovado por:
______________________________________________
Profa. Dra. Patrícia Maria Guedes Paiva
Presidenta
______________________________________________
Profa. Dra. Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho
______________________________________________
Profa. Dra. Maria Tereza dos Santos Correia
______________________________________________
Profa. Dra. Daniela Maria do Amaral Ferraz Navarro
______________________________________________
Prof. Dr. Roberto Araújo Sá
Data: 27 / 06 / 2012
Dedico esta Tese aos meus pais,
aos meus irmãos,
a toda minha família
e a todos os meus amigos,
por serem a minha razão e inspiração.
para seguir sempre em frente.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me presentear com mais esta oportunidade de evolução neste planeta, pela
família a qual me confiou, pelos amigos maravilhosos que recruta para acompanharem minha
jornada, pela inspiração de serenidade nos momentos necessários, pelos caminhos que me são
apresentados, pelas “dificuldades” encontradas, pelos desafios, pelos sonhos realizados, pela
Aos meus pais, Rosângela e Luiz Carlos, pelo amor, carinho, paciência, apoio e
ensinados; pelo desafio diário e por toda dedicação com que cuidaram e cuidam de mim. Aos
meus irmãos Daniella e Guilherme, pelo amor e convívio; pelos desafios enfrentados juntos;
pelas tantas emoções divididas; pelo companheirisimo e pela presença e apoio sempre; por
fazerem a minha vida mais alegre, divertida e preciosa; enfim, por tudo.
A toda minha família pelo amor, incentivo e confiança; à minha avó Irani e meu avô
Alcides, pelos ensinamentos e por todo amor, cuidado, carinho e incentivo transmitidos; à
minha bisavó, Maria de Lourdes (in memorian), pelo exemplo, pelo carinho e por todo o
tempo em que iluminou nossas vidas e que hoje continua iluminando a todos lá de cima; às
minhas tias Anita, Elisabete, Raquel e Sandra e ao meu tio Roberto por sempre acreditarem
em mim e por todo carinho, apoio e incentivo constantes; aos meus primos Ilka, Talys e
À minha amiga Nataly, pela amizade inabalável e sincera; por toda consideração e
toda confiança; pela sua imensa alegria que, infalivelmente, contagia e coloca pra cima em
qualquer momento; pela sua garra, energia e força, que são exemplos para todos nós; por ser
uma das mulheres mais admiráveis que conheço; por toda sua participação ao longo desses
anos de trabalho; pelo olhar vibrante e lindo sorriso; pela cumplicidade; por me honrar com
Ao meu amigo Francis, pelo companheirismo, pela confiança, e pela amizade; por
toda sua dedicação e competência nos experimentos dessa Tese e ao longo de toda a jornada
Ao meu amigão Emmanuel, por ser uma luz em minha vida; pela sua compreensão,
gentileza, lealdade e generosidade; pela enorme paciência, por sua sinceridade e honestidade;
por me ajudar a crescer e ser a cada dia uma pessoa melhor; pelo seu ombro e amigo e seu
sorriso com os quais posso sempre contar; por acreditar em minhas idéias e meus sonhos, me
estimular e me ajudar a executá-los; pelo seu apoio inestimável nos experimentos realizados
para essa Tese e em tantos outros mais; enfim, por presentear meu coração com sua amizade.
À minha amiga Lidiane, pelo carinho e pela compreensão tão preciosos; pelo apoio e
pela mão amiga e gentil; pela paciência; pela doce companhia em tantos momentos
entusiasmo de sempre e pela força em momentos difíceis; pela sua imensa dedicação, pela sua
compreensão e por embarcar comigo e a professora Patrícia em nossas aventuras pelo mundo
da Bioquímica.
Às queridas amigas Luciana, Tati, Thamara, Maiara, Kézia e Belany, pelo carinho,
apoio e incentivo, por embelezarem, suavizarem e alegrarem meu dia-a-dia. Ao meu amigo
Afonso, pela amizade extremamente agradável, pelo companheirismo, por sua gentileza e por
todo apoio. Aos amigos e alunos Bernardo e Lívia, por todo apoio e pela confiança e
durante esses sete anos de convivência, em especial: Giselly, Fernando, Michele, Igor,
Priscila, Dalila, Kaleen, Erika, Andréa Sales, Chrisjacele, Idila, Léo, Carlos Bob, Felipe,
Regina, Rodrigo, Adriana, Lucíola, Ana Luiza, Juliene, Cris, Vanessa, Mariana, Andréa
Santos, Raiana, Mary, Cássia, Mychely, Larissa, Amanda, Cynarha, Marília, Mércia, Carina e
A todos os demais amigos, de todos os lugares e épocas: Lígia, Inabelle, João, Edson,
Carla, Carol, Paulo, Syllas, Breno, Thiago Buonafina, Artur, Sheila, Meyriene, e todos os
demais.
UFPE pelo apoio, incentivo, confiança e consideração. À professora Márcia Vanusa, também
professor Roberto Sá, do Centro Acadêmico do Agreste da UFPE, pela amizade, incentivo e
confiança, por me introduzir na vida científica e por tudo que proporcionou para o meu
Química Fundamental da UFPE, pela disponibilidade, simpatia, exemplo e por sempre abrir
com tanta alegria as portas de seu laboratório e de sua sala para nos receber e nos orientar.
especial Maria Reis, João Virgínio, Neide, Miron, Djalma e professor Ranilson. À professora
(Autor desconhecido)
“Aprende – humildemente
Ensina – praticando
Administra – educando
Obedece – prestativo
Ama – edificando
Teme – a ti mesmo
Sofre – aproveitando
Fala – construindo
Ouve – sem malícia
Ajuda – elevando
Ampara – levantando
Passa – servindo
Ora – serenamente
Pede – com juízo
Espera – trabalhando
Crê – agindo
Confia – vigiando
Recebe – distribuindo
Atende – com gentileza
Coopera – sem apego
Socorre – melhorando
Examina – salvando
Esclarece – respeitoso
Semeia – sem aflição
Estuda – aperfeiçoando
Caminha – com todos
Avança – auxiliando
Age – no bem geral
Corrige – com bondade
Perdoa – sempre”.
Lectins, proteins that bind specifically and reversibly to carbohydrates, isolated from bark
(MuBL) and heartwood (MuLL) of the “aroeira-do-sertão” (Myracrodruon urundeuva) were
insecticidal agents against workers and soldiers of Nasutitermes corniger (MuHL) and Aedes
aegypti larvae (MuBL and MuHL). This Thesis describes the purification of M. urundeuva
leaf lectin (MuLL), the termiticidal activity of MuBL and MuLL against N. corniger, the
larvicidal activity of MuLL on A. aegypti larvae in the fourth stage (L4), the effect of MuLL
on the maize weevil (Sitophilus zeamais), and the study of the potential mechanisms of
insecticidal action. The MuLL isolation procedure included extraction of leaf proteins with
0.15 M NaCl, precipitation with ammonium sulphate and chromatography on chitin column.
MuLL was characterized for electrophoresis profile on native and denaturing conditions, as
well as for the effect of carbohydrates, temperature and pH in hemagglutinating activity.
Assay for determination of termiticidal activity of MuBL and MuLL was performed on Petri
dishs containing filter paper disks impregnated with different amounts of lectin. Regarding
the mechanisms of action on termites, it was investigated the resistance of lectins to
proteolytic degradation and their effects on symbiotic bacteria from intestinal tract. To
determine the larvicidal activity against A. aegypti, L4 larvae were incubated for 24 h in
solutions containing different concentrations of leaf extract or isolated MuLL. The MuLL
resistance to proteolysis and its effect on the activity of digestive enzymes (proteases, trypsin
and α-amylase) of larvae were investigated. For determination of insecticidal activity against
S. zeamais, the extract or MuLL was incorporated to wheat flour disks that served as diet for
the insects during 7 days. The parameters evaluated were survival, feeding-deterrence index,
relative consumption rate, relative growth rate, efficiency in conversion of ingested food, and
activities of digestive enzymes (proteases, trypsin, cellulases, phosphatases and α-amylase).
MuLL, a chitin-binding lectin, is a cationic and glycosylated polypeptide with molecular mass
14.2 kDa, which hemagglutinating activity is inhibited by glycoproteins and stable towards
heating at 100 °C and broad pH range. Termiticidal activity was detected for MuBL (LC50 of
0.974 mg/mL on workers and 0.787 mg/mL on soldiers) and MuLL (LC50 of 0.374 mg/mL on
workers and 0.432 mg/mL on soldiers). The hemagglutinating activities of MuBL, MuHL and
MuLL were resistant to N. corniger gut extracts containing trypsin-like activity and the three
lectins showed bacteriostatic action (minimal inhibitory concentrations of 62.5 µg/mL on
worker’s bacteria and 125 µg/mL on soldier’s bacteria). MuBL and MuHL were bactericide
agents more effective on worker’s symbionts (minimal bactericide concentration of 125
µg/mL) than MuLL (250 µg/mL) while the three lectins showed similar bactericide activity on
bacteria from soldier gut (minimal bactericide concentration of 250 µg/mL). M. urundeuva
leaf extract and MuLL were larvicidal against A. aegypti with LC50 of 10.9 and 0.202 mg/mL,
respectively. These results indicate MuLL as active principle of leaf extract. MuLL was
resistant to hydrolysis by larval gut enzymes, inhibited total protease and trypsin (Ki: 2.8 µM)
activities and stimulated α-amilase activity. Leaf extract killed S. zeamais (LC50 of 72.4 mg of
proteins per g of wheat flour) and showed moderate feeding-deterrent effect while MuLL only
exerted strong deterrent effect (feeding-deterrence indices from 82% to 91% in concentrations
of 45 to 150 mg/g). The extract toxicity and MuLL feeding-deterrent effect resulted in loss of
biomass by insects, which was reflected in the negative values for relative growth rates and
effciencies in conversion of ingested food. The protease, trypsin-like, acid phosphatase and
amylase activities in gut extracts from adults fed on diet containing extract or lectin were
significantly (p<0.05) lower than those detected in gut extract from insects of control group.
The ingestion of diet containing MuLL also resulted in decrease of endoglucanase and
alkaline phosphatase activities. In conclusion, the results obtained reveal (1) MuHL, MuBL
and MuLL as potential candidates to biodegradable insecticides for control of N. corniger, A.
aegypti and S. zeamais; (2) resistance of lectins to the proteolytic environment of N. corniger
and A. aegypti gut; (3) modulation of digestive enzyme activities at insect gut by lectins; (4)
antibacterial activity of MuHL, MuBL and MuLL on gut symbiont microorganisms of N.
corniger; (5) insecticidal activity against N. corniger and A. aegypti by lectin ingestion and
against S. zeamais by rejection of diet containing MuLL. The thesis contributes to the “state-
of-art” in the study of insecticidal activity of lectins, yielding the first data for the
comprehension of the mechanisms involved in the deleterious effects exerted by these
proteins on N. corniger, A. aegypti and S. zeamais.
Pág.
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
ARTIGO 1
ARTIGO 2
Fig. 1. Effect of M. urundeuva leaf extract and lectin (MuLL) on feeding of S. 117
zeamais adults by determination of feeding-deterrence indices. The insects
were reared on artificial diet consisting on wheat flour disks containing leaf
extract at 10 to 150 mg of protein per g of wheat flour (A) and MuLL at 3 to
150 mg per g of wheat flour (B). Each bar correponds to the mean ± SD of
four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05) differences
between treatments.
Pág.
ARTIGO 1
ARTIGO 2
ARTIGO 3
Table 1. Survival rates of S. zeamais adults reared for 7 days on diets 115
containing M. urundeuva leaf extract or MuLL.
BApNA: N-α-benzoil-DL-arginil-ρ-nitroanilida
CL50 (LC50): concentração letal necessária para matar 50% dos insetos
ρNP: ρ-nitrofenol
Tris: Trishidroximetilaminometano
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 20
3. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 50
3.1. GERAL........................................................................................................................... 50
3.2.4. Estudo da atividade inseticida do extrato de folhas e MuLL contra S. zeamais ...... 51
4. REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 53
5. ARTIGO 1 ............................................................................................................................ 71
Termiticidal activity of lectins from Myracrodruon urundeuva against Nasutitermes
6. ARTIGO 2 ............................................................................................................................ 80
Effect of Myracrodruon urundeuva leaf lectin on survival and digestive enzymes of Aedes
7. ARTIGO 3 ............................................................................................................................ 89
Deleterious effects of Myracrodruon urundeuva leaf extract and lectin on maize weevil,
1. INTRODUÇÃO
podem ser benéficos para ambos ou para apenas um deles. Dentre estas interações, estão
exemplo) e absorção de nutrientes da célula vegetal para seu próprio crescimento. Ainda,
diversos insetos e outros animais se alimentam das partes não-reprodutivas e reprodutivas das
herbívoros e patógenos (EDWARDS & WRATTEN, 1981; AGRIOS, 1997; DEL-CLARO &
SILINGARDI, 2001).
fatores físicos, tais como tricomas e espinhos. Em paralelo, grande parte da evolução das
interações entre insetos e plantas tem ocorrido ao nível químico. A defesa química é
origem vegetal podem ser compostos do metabolismo primário, como algumas proteínas de
insetos (PEUMANS & VAN DAMME, 1995; PAIVA et al., 2010, 2011a).
principais agentes biodeterioradores, tais como os cupins, insetos que degradam a celulose
lectin) e entrecasca (MuBL: M. urundeuva bark lectin) desta planta (SÁ et al., 2008; SÁ et al.,
corniger, espécie de cupim considerada praga urbana (SÁ et al., 2008). MuHL e MuBL
apresentaram atividade inseticida sobre o quarto estágio larval de Aedes aegypti, mosquito
exercer seus efeitos deletérios quando ingeridas pelos insetos. Essa resistência pode ser
considerada como um fator defensivo conservado por algumas plantas (MACEDO et al.,
2007). Uma vez presentes no trato digestivo do inseto, as lectinas podem interagir com
alvos para lectinas ligadoras de quitina. Lectinas também podem interferir na atividade de
GATEHOUSE, 1998; FITCHES et al., 2008; PAIVA et al., 2012). Ainda, as lectinas podem
exercer uma ação deterrente sobre a alimentação dos insetos por um efeito pré-ingestão,
(SAUVION et al., 2004; MICHIELS et al., 2010; SPRAWKA & GOŁAWSKA, 2010).
capaz de atacar grãos armazenados, bem como antes da coleta, ainda no campo. Os grãos
valor de mercado consideravelmente reduzido (YUYA et al., 2009; TEFERA et al., 2011).
Não são encontrados na literatura estudos concernentes à atividade inseticida de lectinas sobre
S. zeamais.
investigação reporta o isolamento de uma nova lectina ligadora de quitina extraída das folhas
sobre operários e soldados de N. corniger e possíveis mecanismos da ação termiticida das três
lectinas isoladas da aroeira. O segundo trabalho descreve a atividade larvicida de MuLL sobre
o quarto-estágio larval de A. aegypti e seu efeito sobre a atividade de enzimas digestivas das
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
defesa a agressões de predadores e infecções por microrganismos. Dessa forma, elas sempre
dimensão dos danos causados por fitopatógenos e pestes de insetos depende do hábito e do
(KOGAN, 1994).
por exemplo, espinhos, acúleos, tricomas, caules rígidos e superfícies foliares mais espessas
ou mais lisas (KENNEDY & BARBOUR, 1992; RAVEN et al., 2004). A defesa química das
proteínas de defesa podem ser de natureza constitutiva ou sua expressão pode ser induzida em
desenvolvimento das plantas, mas estão associados com a adaptação, transporte de íons
secundários com papel de defesa pode ser induzida por estresse hídrico, variações sazonais de
2000; BULBOVAS et al., 2005). Após ingestão por herbívoros, os metabólitos secundários
defesa contra herbívoros e patógenos pode ser explorada na busca por produtos naturais que
Uma substância que seja letal, repelente, deterrente ou inibidora para insetos é
classificada como inseticida (ADDOR, 1994). Os inseticidas são amplamente utilizados para
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 25
espécies que transmitem agentes etiológicos de doenças que acometem humanos e podem
Guerra Mundial para controlar insetos. Em seguida, vários compostos orgânicos passaram a
ser sintetizados, muitos a partir de produtos que ocorrem naturalmente em algumas plantas
a principal estratégia para controlar insetos. Entretanto, o uso contínuo em larga escala desses
persistentes, efeitos deletérios sobre organismos não-alvo, bem como distúrbios graves à
RODRIGUES, 2001; VIEGAS JÚNIOR, 2003; BARROS et al., 2006; LEITE et al., 2007;
alternativa ecológica promissora e tem sido estimulada visando identificar novos compostos
BERNARDI et al., 2010). Embora os inseticidas naturais (ou bioinseticidas) muitas vezes não
sejam tão efetivos quanto os inseticidas químicos sintéticos, sua utilização minimiza os riscos
de efeitos deletérios sobre espécies não-alvo e reduz os riscos de danos à saúde humana
diferentes princípios ativos pode dificultar a seleção de insetos resistentes, pois a variedade de
2004). O uso direto de extratos é também considerado viável quando aplicados de forma
planta em estudo tem ampla utilização popular e/ou é encontrada em abundância (ISMAN,
2006).
inseticida de lectinas de plantas tem sido descrita contra insetos de diversas ordens, como
Homoptera (cigarras, pulgões e cochonilhas) e Isoptera (cupins), dentre outras (PAIVA et al.,
2011a).
2.3. Lectinas
superfície celular (PAIVA et al., 2010). A detecção de lectinas em uma amostra é feita através
eritrócitos, promovendo a formação de uma rede entre eles (Figura 1A). O ensaio de inibição
de aglutinação.
bactérias (IMBERT et al., 2004), algas (HAN et al., 2010), fungos (KHAN et al., 2007),
liquens (SILVA et al., 2009), invertebrados – esponjas (MOURA et al., 2006), cnidários
(FENTON-NAVARRO et al., 2003), moluscos (KONG et al., 2011), crustáceos (XU et al.,
2010) e insetos (OURTH et al., 2005) – e vertebrados – peixes (TERADA et al., 2007),
répteis (NUNES et al., 2011), aves (HOGENKAMP et al., 2006) e mamíferos (OLA et al.,
2007). Em plantas, as lectinas têm sido detectadas em cascas (NASCIMENTO et al., 2008;
SÁ et al., 2009b; VAZ et al., 2010; ARAÚJO et al., 2012), cerne (SÁ et al., 2008), cladônias
(SANTANA et al., 2009), flores (SANTOS et al., 2009), folhas (COELHO & SILVA, 2000;
COSTA et al., 2010), raízes (SOUZA et al., 2011), rizomas (BAINS et al., 2005; SANTANA
Nas plantas, vários papéis fisiológicos têm sido atribuídos às lectinas, dentre os quais
1995; HIRSCH, 1999; ISIDRO et al., 2001; CARLINI & GROSSI-DE-SÁ, 2002; LIMPENS
& BISSELING, 2003). Além disso, as lectinas têm se mostrado importantes na ativação de
2012) ou desnaturação pelo calor (SANTANA et al., 2008), por exemplo. Em seguida, as
frações obtidas são submetidas à diálise exaustiva, para eliminar pequenas moléculas, como
carboidratos e sal.
utilizados para a caracterização estrutural das lectinas, assim como para estabelecer o grau de
pureza das mesmas. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para proteínas nativas
revela a natureza de carga líquida da proteína purificada e PAGE sob condições desnaturantes
massa molecular das mesmas. Além disso, coloração específica com o reativo de Schiff no gel
(estruturas terciária e quaternária) podem ser realizados através de técnicas como dicroísmo
presença de enzimas e outras substâncias que podem alterar a atividade da proteína. Ainda,
podem apresentar uma afinidade maior por células de determinado animal (KENNEDY et al.,
área conhecida como lectinômica, técnicas de microarrays utilizando lectinas têm sido
desenvolvidas como ferramentas eficientes para decifrar o glicocódigo que reflete o estado
(HAYUNGA et al., 1986; MONZO et al., 2007; XIE et al., 2009). Colunas das lectinas
imobilizadas de Canavalia ensiformis (QIU et al., 2007) e de Cratylia mollis (LIMA et al.,
1997) foram eficientes na separação de glicoproteínas de soro humano. Uma proteína de soja
(Glycine max) com ação anti-agregante sobre plaquetas foi isolada utilizando matriz de
linfócitos (MELO et al., 2010), atividade antiinflamatória (MELO et al., 2010), antitumoral
(FANG et al., 2010; NUNES et al., 2012), antifúngica (SÁ et al.; 2009a; SANTANA et al.,
2009; SOUZA et al., 2011) antibacteriana (OLIVEIRA et al., 2008; SÁ et al., 2009a; NUNES
et al., 2011), antiviral (SATO et al., 2011), hipotensiva (WANG et al., 1996), antinociceptiva
Os mecanismos pelos quais as lectinas exercem seus efeitos inseticidas são pouco
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 31
conhecidos e tem ganhado interesse nos últimos anos. Lectinas entomotóxicas são geralmente
ligação de lectinas a moléculas glicosiladas do trato intestinal dos insetos pode interferir nas
Quando ingeridas, as lectinas podem interferir nas atividades enzimáticas por: (1)
ligação à porção glicídica de enzimas glicosiladas; (2) ligação às enzimas através de sítios
diferentes do sítio de ligação ao substrato; (3) ligação ao substrato; (4) ligação tanto à enzima
quanto ao substrato, aumentando a afinidade entre eles (MACEDO et al., 2007). A lectina de
Callosobruchus maculatus (MACEDO et al., 2007). Fitches & Gatehouse (1998) reportaram
que, em curto prazo, a lectina de Galanthus nivalis apresentou efeito estimulatório sobre
DAMASCENO-SÁ & SILVA, 2007), que separa o conteúdo do lúmen intestinal das células
epiteliais digestivas. A matriz contém uma rede composta por quitina (polímero de N-
bem como atua na proteção contra infecções por microorganismos e danos mecânicos
provocados por partículas alimentares abrasivas (HEGEDUS et al., 2009). Lectinas de plantas
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 32
com afinidade por N-acetilglicosamina e propriedade de ligação à quitina são inseticidas para
CARLINI & GROSSI-DE-SÁ, 2002; MACEDO et al., 2004; MACEDO et al., 2007).
insetos alimentados com a lectina ligadora de quitina de Triticum vulgaris (WGA), tais como
(FITCHES et al., 2001). Lectinas podem também ser internalizadas em vesículas nas células
No caso de afídeos (Homoptera), que não possuem matriz peritrófica, foi demonstrado
específicas presentes nas vesículas da membrana em borda escovada, o que pode resultar na
sugeriram que o alvo da lectina de A. sativum sobre o afídeo da mustarda (Lipaphis erysimi)
não é uma molécula produzida pelo próprio inseto, mas uma chaperonina conhecida como
dos afídeos.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 33
Myracrodruon urundeuva (Figura 2), descrita por Francisco Allemão & Cysneiro em
1862, é uma anacardiácea que pode ser encontrada desde o México até a Argentina
(BARKLEY, 1968; GARRIDO & POGGIANI, 1979). No Brasil, é conhecida como aroeira,
incluindo florestas pluviais com até 2000 mm de precipitação anual. Distribui-se em ampla
faixa do território brasileiro, desde o Maranhão até o Paraná, sendo mais freqüente nos
estados de Minas Gerais, Bahia, São Paulo, Mato Grosso e Goiás (LORENZI, 2000). A
aroeira-do-sertão não é encontrada na Floresta Amazônica (RECORD & HESS apud LEITE,
2002).
em solos ricos e sobrevive a longos períodos de baixa umidade (GARRIDO & POGGIANI,
A aroeira-do-sertão é uma árvore decídua (Figura 2B) com um tronco reto e cilíndrico
em racemos (Figura 2D), formando cachos nas pontas de ramos sem folhas. As flores (Figura
permanecem ao redor do fruto, uma drupa esférica com 3 a 4 mm de diâmetro (LEITE, 2002).
A B
C D E
Figura 2. Myracrodruon urundeuva. (A) Aspecto geral; (B) indivíduo do Cerrado que já
perdeu parte de suas folhas; (C) folhas; (D) inflorescência; (E) flores.
A, C e D: retirado de Lorenzi (2000). B e E: ©Fernando Tatagiba.
A floração ocorre geralmente após a queda das folhas, entre os meses de Novembro e
Janeiro, no Brasil. Abelhas da espécie Trigona spinips foram descritas como agentes
polinizadores e as sementes são dispersas pelo vento. O tempo de dormência pode variar entre
as variedades encontradas (M. urundeuva var. urundeuva e M. urundeuva var. candollei), com
velhos, sendo mais lisa nos mais jovens (RIZZINI, 1978). A infusão da entrecasca é um dos
(densidade de 1,19 g/cm3) e com elevada resistência mecânica, sendo incluída entre as
mesmo quando caída no solo, sendo uma das mais tradicionalmente escolhidas na indústria de
A B C
Figura 3. Myracrodruon urundeuva. (A) Casca; (B) madeira; (C) toras de aroeira.
A e B: retirado de Lorenzi (2000). C: ©Porto Seguro Madeiras.
cercas, estacas e postes, a aroeira-do-sertão se tornou uma das espécies de plantas lenhosas
têm sofrido com a devastação e o uso excessivo e/ou inadequado da terra) e a superexploração
aroeira-do-sertão relacionado à produção de fármacos e à sua madeira faz dela uma das
espécies que mais precisam de medidas de conservação. Nesse sentido, estudos visando à
que sejam relevantes para sua conservação genética e valorização como um recurso
sustentável têm se tornado cada vez mais necessários (OLIVEIRA et al., 2007).
sertão não tem sido considerado a principal estratégia de conservação, ainda que existam
atividade hemaglutinante. Apenas o extrato de alburno não foi capaz de aglutinar eritrócitos
(SÁ et al., 2009c). Sá et al. (2009b) isolaram as lectinas de casca (MuBL) e cerne (MuHL) de
seus padrões eletroforéticos (Figura 4). As lectinas se apresentaram como proteínas básicas
formadas por subunidades de massas moleculares 14,4 (MuHL) e 14,0 (MuBL) kDa. MuBL e
Figura 4. Cromatografia em coluna de quitina para isolamento de MuBL (A) e MuHL (B).
Eletroforeses de MuBL (a) e MuHL (b) em gel de poliacrilamida em condições nativas para
proteínas básicas (1) e em condições desnaturantes (2).
Fonte: SÁ et al. (2009b).
MuHL apresentou elevada toxicidade para cupins da espécie N. corniger (com maior
efeito nos soldados), mas não promoveu efeito repelente (SÁ et al., 2008). A atividade
MuBL e MuHL apresentaram potente atividade inseticida sobre o quarto estágio larval
de A. aegypti com CL50 de 0,125 e 0,04 mg/mL, respectivamente (SÁ et al., 2009b), mosquito
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 38
de grande importância na saúde pública por ser o vetor de vírus causadores de doenças como
2.5. Cupins
eusociais que vivem em colônias compostas por várias castas e indivíduos em diferentes
e as tarefas relacionadas à reprodução, defesa e limpeza estão divididas entre as castas, que
A cabeça é livre, de forma e tamanho variáveis. Olhos compostos estão presentes nas
formas aladas e, nos cupins superiores, em lugar dos ocelos, há uma depressão chamada
fontanela, que possui um poro central no qual se abre uma glândula cefálica que secreta um
líquido com função de defesa. O aparelho bucal é mastigador e bem desenvolvido e o tórax
achatado, com o protórax destacado. O órgão auditivo está situado na tíbia anterior. O abdome
chão, livram-se de suas asas e então realizam a primeira cópula, ao encontrarem um parceiro.
Formado o casal real, eles encontram um local adequado e iniciam a instalação do ninho, que
inicialmente consiste em poucas galerias e uma câmara nupcial, onde a fêmea realiza as
posturas e o casal copula outras vezes. Os novos indivíduos constituirão as demais castas e o
cupinzeiro cresce rapidamente, podendo atingir milhões de indivíduos. A rainha, que quando
completamente desenvolvida pode apresentar uma relação entre o abdome e o resto do corpo
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 39
de 200:1 em algumas espécies, pode viver de 6 a 10 anos, ovipositando até cerca de 50 mil
As formas ápteras são permanentes e podem ser férteis ou estéreis. Dentre as férteis,
estão o casal real após o vôo e as rainhas e os reis de substituição, que substituem o casal
quando esse morre ou uma colônia é fragmentada. Dentre os indivíduos gerados, encontram-
se algumas ninfas que se desenvolverão em formas aladas, as quais, por sua vez, formarão
defendem a colônia. São cegos e apresentam mandíbulas bem desenvolvidas, que são
utilizadas para defesa e não para mastigação. Os operários são também, normalmente, cegos e
cuidam da prole, forrageiam alimento e constroem o ninho. Por serem fototrópicos negativos,
desenvolvem suas atividades na escuridão (PFDAT, 1985; GALLO et al., 1988; BERTI
microrganismos encontrada no trato intestinal dos cupins (FRÖHLICH et al., 2007). Essa
produtos a ácidos graxos de cadeia curta, que são absorvidos pelo hospedeiro, e fixar
2000). Os cupins das seis primeiras famílias são chamados “cupins inferiores”, enquanto que
celulose no trato digestivo de térmitas inferiores, enquanto nos térmitas superiores, apenas
O papel ecológico dos térmitas é dos mais importantes. Juntamente com as formigas,
(VASCONCELLOS et al., 2005). Por outro lado, cerca de 10% das espécies conhecidas de
isópteros estão registradas como pragas. Os cupins estão entre os mais severos agentes
destruidores da madeira (PAES & VITAL, 2000) e também danificam uma variedade de
materiais que variam de telas de papel a materiais não-celulósicos tais como o betume do
duas rotas principais: a casca e as raízes. Alguns cupins são capazes de penetrar pelas raízes
das árvores e construir galerias no interior do tronco, destruindo o cerne e deixando as árvores
ocas. Quando mortas, essas madeiras se tornam ainda mais suscetíveis ao ataque. Estimou-se
que os prejuízos causados pela ação de cupins sobre madeiras e outros materiais contendo
organofosforados e piretróides, que podem ser tóxicos para outros seres vivos e apresentam
da síntese de quitina são tidos como potenciais componentes de produtos alternativos para
combater espécies-praga de cupins, sem oferecer grande perigo ao meio ambiente (SOGABE
chamados porque a cabeça dos soldados se estreita na parte anterior, em uma projeção
semelhante a um nariz, que é utilizada para defesa, emitindo substâncias adesivas ou tóxicas
maioria dos cupins pelo aspecto bem característico da cabeça nos soldados (Figura 5C), mas a
classificação ao nível de espécie não é uma tarefa fácil (CONSTANTINO, 1992; MIURA et
A B C D
Figura 5. Cupins do gênero Nasutitermes. Ninho (A), operário (B) e soldado (C) de
Nasutitermes corniger. (D) Rainha de Nasutitermes euphratae.
Fontes: A: © Reginaldo Constantino. B e C: Thiago H. Napoleão. D: Michele D.C. Silva.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 42
acentuados sinais de nocividade. Por isso, têm sido considerados como uma nova ameaça aos
centros urbanos. Buscam preferencialmente as partes altas das edificações, sendo visíveis em
(PAES et al., 2002). Colônias de N. corniger também foram encontradas atacando estruturas
Atividade inseticida sobre operários e soldados de N. corniger tem sido descrita para a
lectina do cerne de M. urundeuva (MuHL), bem como para as lectinas isoladas do líquen
fícus indica (SÁ et al., 2008; SILVA et al., 2009; PAIVA et al., 2011c; SOUZA et al., 2011).
Nos testes, os cupins soldados e operários são colocados em contato com discos de papel
impregnados com a solução líquida das lectinas em diferentes concentrações (Figura 6).
O desenvolvimento do A. aegypti ocorre através dos estágios de ovo, larva (quatro estágios:
L1, L2, L3 e L4), pupa e adulto (Figura 7A). Em condições favoráveis de temperatura,
Figura 7. (A) Ciclo de vida do A. aegypti. (B). Larva de A. aegypti no estágio L4.
Fontes: A: Secretaria de Saúde e Defesa Civil do Estado do Rio de Janeiro. B: Nataly D.L. Santos & Thiago H.
Napoleão.
O corpo da larva é composto de cabeça, tórax e abdômen (Figura 7B). O abdômen das
larvas L4 é dividido em oito segmentos, com brânquias anais presentes no último segmento.
Um sifão ou tubo de sucção ou de ar é utilizado para a respiração. Para respirar, a larva vem
Após a fase larvária, surgem as pupas, que não se alimentam. A pupa tem um par de
tubos respiratórios ou trompetas, que atravessam a água e permitem a respiração. Logo após
emergir do estágio pupal, o inseto adulto procura pousar sobre as paredes do recipiente, assim
asas. O macho se distingue essencialmente da fêmea por possuir antenas plumosas e palpos
sangüíneo). A maior parte dos animais vertebrados constitui fonte de repasto, mas há uma
grande afinidade pelo homem. O repasto sangüíneo das fêmeas fornece proteínas para o
febre amarela é uma arbovirose caracterizada por hepatite grave, insuficiência renal,
arbovírus DEN (Flavivirus), que se manifesta em diferentes formas clínicas (TAUIL, 2002;
(MELTZER & SCHWARTZ, 2009). A dengue é uma importante questão de saúde pública
organização do espaço urbano estão envolvidos na expansão da doença (BRAGA & VALLE,
2007).
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 45
proliferação desse inseto (CONSOLI & OLIVEIRA, 1994; HEMME et al., 2009). A
exposição à luz solar, com conseqüente aumento na temperatura da água afeta negativamente
o ciclo de vida do inseto e esta estratégia pode ser adotada como uma medida adicional para
especificidade a insetos vetores que, quando ingeridas, provocam mortalidade das larvas. As
duas espécies mais utilizadas como larvicidas são o Bacillus sphaericus (Bs) e Bacillus
uso contínuo desses inseticidas tem selecionado larvas resistentes e efeito genotóxico do
controle de larvas (AIUB et al., 2002; POUPARDIN et al., 2008; MELO-SANTOS et al.,
2010). Dessa forma, a busca por inseticidas naturais, biodegradáveis e isentos de toxicidade
para organismos não-alvo tem crescido. Extratos vegetais, óleos essenciais, saponinas,
insetos cosmopolitas ao longo das regiões tropicais e infestam alguns dos grãos de maior
(Figura 8B). A cabeça se projeta para frente na forma de um rostro curvado (Figuras 8A e
8B), o qual é mais curto e grosso nos machos e mais longo e fino nas fêmeas. São capazes de
avermelhadas mais claramente definidas e pelo tamanho maior, além de diversos outros
desenvolvem dentro dos grãos, os quais funcionam como fonte de nutrientes e abrigo (Figura
8D). As fêmeas abrem orifícios nos grãos com a mandíbula e, em seguida, depositam seus
ovos e selam as perfurações com uma secreção produzida por glândulas associadas ao sistema
ovipositor (Figura 8D). As fêmeas podem viver até 140 dias, 104 destes correspondendo ao
período de oviposição, e o número médio de ovos por fêmea é de 282 (BOTTON et al.,
2005). Após a eclosão dos ovos, as larvas se desenvolvem, passando por quatro estágios, e
alcançando o estágio de pupa (Figura 8D). Apenas uma larva conseguirá se desenvolver por
grão, mesmo que mais de um ovo tenha sido depositado. Após completado o desenvolvimento
do adulto dentro do grão, ele emerge e cresce até atingir a maturidade, reiniciando o ciclo
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 47
biológico (ANTUNES & DIONELLO, 2010). Tendo o milho como hospedeiro, o ciclo
biológico do ovo até a emergência do adulto dura em média 34 dias (BOTTON et al., 2005).
S. zeamais, juntamente com outras pragas de grãos estocados, causam uma perda
por S. zeamais no armazenamento de grãos são muitas vezes mais graves do que as que
ocorrem na cultura em campo, pois são definitivas e irrecuperáveis. Miranda et al. (1995)
afirmam que a infestação desta praga pode gerar perdas em até 30% de grãos armazenados em
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 48
fazendas. S. zeamais também tem sido encontrado atacando frutos de macieira, pessegueiro e
aumento devido ao uso massivo de inseticidas como o fenithorion (PEREIRA et al., 2009;
de grãos armazenados tem sido realizado a partir da limpeza e secagem dos grãos,
KEHINDE & ANGELA, 2004; ILELEJI et al., 2007; NOOMHORM et al., 2009; UKEH et
al., 2009; YUYA et al., 2009; BETANCUR et al., 2010; NUKENINE et al., 2010;
Procópio et al. (2003) observaram uma repelência de 96% sobre S. zeamais causada
óleos essenciais de Piper hispidinervum e Piper aduncum, bem como após exposição tópica a
estes mesmo óleos (ESTRELA et al., 2006). Apesar de constituírem inseticidas alternativos
(tais como lectinas, inibidores de protease, inibidores de amilase, arcelinas, quitinases, entre
3. OBJETIVOS
3.1. GERAL
3.2. ESPECÍFICOS
em coluna de quitina.
carboidratos.
agarose.
soldados.
de N. corniger.
de larvas L4.
tripsina e de α-amilase.
de MuLL.
MuLL.
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5. ARTIGO 1
6. ARTIGO 2
7. ARTIGO 3
Curculionidae)
Deleterious effects of Myracrodruon urundeuva leaf extract and lectin on maize weevil,
Lidiane Pereira de Albuquerquea, Roberto Araújo Sáb, Laura Mesquita Paivac, Luana
a
Departamento de Bioquímica-CCB, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade
ABSTRACT
This work reports the effects of diets containing Myracrodruon urundeuva leaf extract (10–
150 mg/g) and lectin (MuLL; 3–150 mg/g) on survival, feeding, and nutrition of storage pest
Sitophilus zeamais. Digestive enzyme activities of gut extracts from insects reared on extract
(25 mg/g) or MuLL (15 mg/g) diets were also evaluated. Leaf extract induced mortality
(LC50: 72.4 mg/g) while MuLL (30 to 150 mg/g) exerted strong feeding-deterrence. Extract
and MuLL promoted loss of biomass, as reflected in the negative values for relative growth
rates and efficiencies in conversion of ingested food. Protease, trypsin-like, acid phosphatase
and amylase activities from insects reared on extract or MuLL diet were significantly
(p<0.05) lower than in control insects. Ingestion of MuLL also reduced significantly (p<0.05)
endoglucanase and alkaline phosphatase activities. In conclusion, leaf extract and MuLL have
potential for S. zeamais control by killing adults and preventing the use of a food source,
respectively. Deleterious effects of extract and lectin on S. zeamais may be linked to enzyme
1. Introduction
Protection of food crops against attack of storage insect pests and pathogens is a major
concern for the food industry, farmers, landowners, subsistence smallholders, public health
insects and fungi during storage lead to loss of several billion dollars, affect food security and
have a great ecological impact since energy, land, water and non-renewable resources were
used for production of grains that will never be consumed (FAO, 2009).
cosmopolitan insect pest of maize (Zea mays) being also able to attack sorghum, rice and
wheat as well as processed food products like pasta and biscuits (Fazolin et al., 2010). S.
zeamais, together with other storage insect pests, cause an estimated 20–30% loss of maize
and the damaged grains have reduced nutritional value and weight, low percentage
germination and low market value (Yuya et al., 2009; Tefera et al., 2011). The maize weevil
is able to infest the maize already in the field (Giles and Ashman, 1971).
1999) although it is considered that the resistance levels to organophosphates in Brazil are
still low (Pereira et al., 2009). However, an increase in the levels of resistance is expected due
to the massive use of insecticides mainly fenitrothion (Braga et al., 2011). Enhanced activities
of α-amylase, cellulase as well as serine and cysteine proteinase have been associated with
strains (Araújo et al., 2008; Lopes et al., 2010; Silva et al., 2010a,b). Alternative strategies for
control of S. zeamais populations include the use of entomopathogenic fungi, plant extracts,
essential oils, seed oils, leaf powders as well as pressurized carbon dioxide and temperature
management techniques (Adane et al., 1996; Kehinde and Angela, 2004; Ileleji et al., 2007;
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 93
Noomhorm et al., 2009; Ukeh et al., 2009; Yuya et al., 2009; Betancur et al., 2010; Nukenine
against insects from several orders with socio-economic importance (Lam and Ng, 2011;
Paiva et al., 2011). Plant lectins promoted deleterious effects on survival, growth, oviposition
and reproduction of insect storage pests such as the moths Anagasta kuehniella and Corcyra
cephalonica and the weevils Callosobruchus maculatus and Zabrotes subfasciatus (Zhu-
Salzman et al., 1998; Macedo et al., 2002; Sadeghi et al., 2006; Coelho et al., 2007; Macedo
et al., 2007; Oliveira et al., 2011). The mechanisms by which lectins kill insects have been
studied and can involve the interaction with glycoconjugates along the digestive tract,
resistance to proteolysis, and binding to digestive enzymes. These effects may result in
morphological damages at digestive tract, disruption of gut epithelium and peritrophic matrix,
impairing nutrition and feeding behavior (Zhu-Salzman et al., 1998; Carlini and Grossi-de-Sá,
2002; Sauvion et al., 2004; Macedo et al., 2007; Coelho et al., 2009; Napoleão et al., 2012).
M. urundeuva leaf (MuLL) showed insecticidal activity against termite Nasutitermes corniger
(Isoptera) and larvae of Aedes aegypti (Diptera), the dengue mosquito vector. The insecticidal
mechanisms of MuLL were investigated and the authors reported that the lectin was resistant
to degradation by proteases from gut of N. corniger and A. aegypti, were able to kill
symbiotic bacteria found at N. corniger gut and was able to stimulate α-amylase activity and
inhibit protease and trypsin-like enzymes from gut of A. aegypti larvae. In addition, it was
suggested that chitin-binding property of MuLL allows its interaction with the peritrophic
This work evaluated the potential of M. urundeuva leaf extract and lectin (MuLL) in
affect the survival and feeding of S. zeamais adults when incorporated into an artificial diet.
Also, their effects on nutritional (relative consumption rate, relative growth rate, and
Leaves of M. urundeuva (Engl.) Fr. All. (Family Anacardiaceae) were collected in the
Mendes da Conceição) is deposited under number 054 at the Herbarium Aluisio Bittencourt,
leaves were dried for 7 days (27 ± 2 °C; relative humidity of 70 ± 5%), powdered, passed
2.2. Insects
Micologia from Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brazil, and reared in the
TNT-type tissue to permit aeration. The diet consisted of maize grains (100 g per container),
selected according to integrity, sanity, size, and absence of contamination with other insects.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 95
2.3. Chemicals
bovine serum albumin, carboxymethylcellulose, chitin powder from shrimp shells, 3,5-
Louis, MO, USA). Acetic acid, ammonium sulphate, chloridric acid, dibasic sodium
phosphate, monobasic sodium phosphate, and sodium chloride were purchased from Vetec
(Rio de Janeiro, Brazil). Calcium chloride, sodium acetate, sodium hydroxide, soluble starch,
and Triton X-100 were purchased from Merck (Darmstadt, Germany). All reagents were of
analytical grade.
MuLL was isolated according to the procedure described by Napoleão et al. (2011).
Powdered leaves (10 g) were suspended in 0.15 M NaCl (100 mL) and the mixture was
homogenized in a magnetic stirrer (16 h at 4 ºC), filtered through gauze (Cremer, Blumenau,
Brazil) and centrifuged (3,000 g, 15 min). Next, the supernatant (leaf extract) was treated with
ammonium sulphate (60-80% saturation) and the precipitated protein fraction was
chromatographed on chitin column. MuLL was eluted with 1.0 M acetic acid and dialyzed
(10-kDa cut-off membrane; Sigma-Aldrich, USA) against four changes of distilled water
Protein concentration was determined according to Lowry et al. (1951) using bovine
Products, Trasadingen, Switzerland) according to Paiva and Coelho (1992) by incubating 50-
µl samples with 2.5% (v/v) suspension of human O-type erythrocytes treated with
glutaraldehyde for 30 min (Bing et al., 1967). One hemagglutinating unit (titer-1) was defined
as the reciprocal of the highest dilution of the sample promoting full agglutination of
erythrocytes. Specific hemagglutinating activity (unit mg-1) was defined as the ratio titer to
protein concentration (mg/mL). HA inhibitory assay was performed by incubation (45 min) of
lectin sample with 0.5 mg/mL asialofetuin solution before erythrocyte suspension addition
An adaptation of the method described by Xie et al. (1996) was used to evaluate
insecticidal activity. For each assay, it was prepared a suspension of 2.0 g of autoclaved wheat
flour (Dona Benta®, Bunge Alimentos S.A., Benevides, PA, Brazil) stirred in 5 mL of a
solution containing the sample diluted in sterile distilled water. Aliquots of 200 µL of the
suspension were measured using a micropipette fitted with a disposable tip that was cut at the
narrow end to produce an internal diameter of 2 mm. Five aliquots of 200 µL were placed on
a Petri dish (90 mm x 100 mm; PETRIQ®, Boeco, Germany) with known weight to form flour
disks and left in incubator overnight at 56 °C to dry. Next, the dish was weighed again and the
mass of the flour disks was determined. Twelve S. zeamais adults with known weight were
then transferred to the dish. Each assay was performed in quadruplicate and the tested
concentrations of sample in flour disks ranged from 10 to 150 (leaf extract) and 3 to 150
(MuLL) mg/g (mg of protein/g of wheat flour). In controls, only sterile distilled water was
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 97
used. The assays were maintained at 28 ± 2 ºC in darkness during 7 days. After this period,
the mortality rate as well as the weights of broken flour disks and insects were recorded.
The feeding-deterrence index (FDI) was calculated as: FDI (%) = 100 x (A – B)/(A),
where A is the mass of food ingested by insects in control assay and B is the mass of food
ingested by insects in sample assay (Isman et al., 1990). According to the FDI, the sample
was classified as having promoted: no feeding deterrence (FDI < 20%), weak feeding
deterrence (50% > FDI ≥ 20%), moderate feeding deterrence (70% > FDI ≥ 50%) or strong
The data recorded at the end of the insecticidal assay were also used to calculate the
following nutritional indices (Xie et al., 1996): (a) Relative consumption rate = C/(D × days),
where C is mass of ingested food in mg and D corresponds to the initial insect biomass in mg;
(b) Relative growth rate = E/(D × days), where E corresponds to the biomass gained in mg;
Groups of fifty S. zeamais adults reared for 7 days on artificial diet containing leaf
extract (25 mg/g), MuLL (15 mg/g) or distilled water (control) were collected and
immobilized by placing them at -20 ºC for 10 min. The gut of each insect was hand-dissected
and immediately homogenized with 1 mL of Tris buffer (0.1 M Tris-HCl pH 8.0 containing
0.02 M CaCl2 and 0.15 M NaCl), acetate buffer (0.1 M sodium acetate pH 5.5 containing 0.02
M CaCl2 and 0.15 M NaCl) or sodium phosphate buffer (0.02 M sodium phosphate pH 7.0
containing 0.15 M NaCl) using a 3 mL tissue grinder (Pyrex®, Corning Inc., NY, USA). The
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 98
extracts) were collected and evaluated for protein concentration and enzyme activities.
Total protease activity of gut extract in Tris buffer was determined using azocasein as
substrate according to Azeez et al. (2007). Gut extract (50 µL; 350 µg of protein) was mixed
with 300 µL of 0.1 M sodium phosphate pH 7.5 containing 50 µL of 0.6% (w/v) azocasein.
The mixture was supplemented with 100 µL of 0.1% (v/v) Triton X-100 and incubated at 37
ºC for 3 h. The reaction was stopped by adding 200 µL of 10% (v/v) trichloroacetic acid and
the assay was incubated at 4 ºC for 30 min. Next, it was centrifuged at 9,000 g for 10 min and
(GeneQuantTM 1300, GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, USA). One unit of
protease activity was defined as the amount of enzyme that gave an increase of 0.01 in
absorbance.
The presence of trypsin activity in gut extract in Tris buffer was determined in 96-well
microtiter plates (TPP-Techno Plastic Products, Trasadingen, Switzerland) using the synthetic
substrate BApNA as described by Kakade et al. (1969). Gut extract (30 µL, 220 µg of protein)
was incubated (30 min, 37 ºC) with 8 mM BApNA (15 µL) in Tris buffer (55 µL). Enzyme
(µQuant MX200, BioTek Instruments, Inc., VT, USA). One unit of trypsin-like activity was
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 99
defined as the amount of enzyme that hydrolyzes 1 µmol of BApNA per minute under the
developed by Asakura (1978) described by Koodalingam et al. (2011). Gut extract in sodium
phosphate buffer (50 µL; 300 µg of protein) was mixed with 450 µL of 0.05 M sodium
acetate buffer pH 4.0 (for determination of acid phosphatase activity) or 0.05 M Tris-HCl pH
8.0 (for alkaline phosphatase activity). Next, 500 µL of 12.5 mM ρ-nitrophenyl phosphate
prepared in acetate or Tris buffer was added to the mixtures. After incubation for 15 min at 37
°C in water bath apparatus (500/1D model, Nova Ética, SP, Brazil), the enzyme reaction was
stopped by adding 100 µL of 0.5 M sodium hydroxide and centrifugation (4000 g; 5 min)
ensued. The absorbance at 410 nm of the supernatants was then recorded using
was determined using the standard curve Y=0.0013X+0.0648, where Y is the absorbance at
410 nm and X is the ρNP concentration in mg/mL. One unit of acid or alkaline phosphatase
activity was defined as the amount of enzyme required to generate 1 µmol of ρ-nitrophenol
Assays for endoglucanase and exoglucanase were carried out according to adaptations
of the methods described by Li et al. (2009) and Wood and Bhat (1988), respectively. The
reactions started by incubating (50 °C, 10 min) gut extract in acetate buffer (100 µL; 600 µg
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 100
1% (w/v) Avicel (for exoglucanase activity) solutions in sodium acetate pH 5.5 containing
0.15 M NaCl. After incubation, 500 µL of DNS were added to stop the reaction and the
mixtures were heated (100 ºC) for 6 min and immediately cooled on ice (15 min). Then, the
absorbance at 540 nm was measured using spectrophotometer. The amount of reducing sugars
nm; X is the glucose concentration in mg/mL). One unit of enzyme activity was defined as the
amount of enzyme required to generate 1 µmol of glucose per minute. Blanks were performed
An adaptation of the method described by Tan et al. (1987) was used to assess β-
glucosidase activity. Gut extract in acetate buffer (50 µL; 400 µg of protein) was incubated
sodium acetate pH 5.5 containing 0.15 M NaCl. After incubation, 500 µL of 10% (w/v)
sodium bicarbonate were added to stop the reaction and the absorbance at 410 nm from 200
µL-aliquots of each reaction was measured using a microplate reader. The amount of ρNP
released by hydrolysis of the substrate was determined using the standard curve described in
section 2.10.3. One unit of activity was defined as the amount of enzyme required to generate
1 µmol of ρNP per minute. Reaction blanks were performed without substrate.
The assay was carried out based on the method described by Bernfeld (1955). Gut
extract in acetate buffer (100 µL; 600 µg of protein) was incubated at 50 °C for 10 min with
400 µL of a 1% (w/v) soluble starch solution in 0.1 M sodium acetate pH 5.5 containing 0.02
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 101
M CaCl2 and 0.15 M NaCl. The reaction was stopped by adding 500 µL of DNS. Next, the
assays were heated at 100 ºC in boiling water for 6 min and immediately cooled on ice for 15
min. The absorbance was measured at 540 nm using spectrophotometer and the amount of
reducing sugars was determined calculated using the standard curve of the reaction between
glucose and DNS presented in section 2.10.4.1. One unit of α-amylase activity was defined as
the amount of enzyme required to generate 1 µmol of glucose per minute. Reaction blanks
Standard deviations (SD) were calculated using GraphPad Prism version 4.0 for
Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA) and data were expressed as a
mean of replicates ± SD. Significant differences between treatment groups were analyzed by
Student’s t-test (significance at p<0.05) using the Origin 6.0 program. The lethal
concentration required to kill 50% (LC50) of insects in 7 days was calculated by probit
analysis with a reliability interval of 95% using the computer software StatPlus® 2006
(AnalystSoft, Canada).
dependent manner (Table 1) and the LC50 was 72.4 mg/g for 7 days. Leaf extract at 10 mg/g
promoted 14.3% mortality rate, being more active than a cinnamaldehyde from Cinnamomum
aromaticum bark, which promoted 12% mortality of S. zeamais adults at 13.6 mg/g (Huang
and Ho, 1998). Triterpenes and derivatives from Junellia aspera promoted slight mortality
(1.8–9.5%) of S. oryzae adults after 5 days when incorporated into wheat flour disks at 400
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 102
µg/disk (which corresponded to approximately 5.2 mg/g) but after 10 days the mortality rates
Leaf extract also exerted feeding-deterrent activity (Figure 1A), with the effects
varying from weak (10 mg/g) to moderate (25, 50, 100, and 150 mg/g). However, although
the feeding-deterrent activities of the extract from 25 to 150 mg/g were similar, the mortality
rates in 100 and 150 mg/g treatments were significantly (p<0.05) higher (Table 1). These
results indicate that death of insects was not only a consequence of a moderate starvation
condition but was also linked to ingestion of toxic component(s) present in extract.
Aiming to determine if MuLL would be the component of leaf extract which promotes
deleterious effects on S. zeamais, the lectin (specific hemagglutinating activity of 16,384) was
incorporated into artificial diet offered to the insects during 7 days. Unlike the leaf extract,
MuLL did not induce significantly (p>0.05) the mortality of S. zeamais in this period (Table
1). On the other hand, antifeedant effect of MuLL was greater than that of leaf extract. The
data in Figure 1B show that MuLL had moderate feeding-deterrent activity at the lowest
concentrations evaluated (3 and 15 mg/g) and strong at all others (30–150 mg/g). Insects
which had contact with highest content of MuLL (150 mg/g) ingested a small amount of food,
with a FDI of 91%. Since no mortality was detected after 7 days, the high FDI values are
linked to rejection of diet containing the isolated lectin and cannot be also due to decreasing
in the number of live insects. In this way, an acute toxicity of MuLL cannot be observed
because the insects avoided ingesting it. The feeding-deterrent activity of leaf extract may be
To our knowledge, this is the first report of lectin effect on S. zeamais but feeding-
deterrent activity of lectins has been documented. The Galanthus nivalis and wheat germ
agglutinins exerted strong feeding-deterrent effects on adults of Nilaparvata lugens and larvae
of Lucilia cuprina, respectively (Powell et al., 1995; Felton and Gatehouse, 1996). The lectin
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 103
from Canavalia ensiformis (Con A) also caused a rejection effect on Acyrthosiphon pisum
insect digestive tract and involves different aspects of digestion and absorption (Sauvion et
Death of all insects in MuLL treatments was observed after 10-11 days. A 100%
mortality rate of insects mantained in absence of diet was detected after 10 days, which was
close to the period that insects reared on MuLL diet were able to withstand. In controls,
mortality rate after 11 days was only 23 ± 5.7%. Indeed, it is described that S. zeamais adults
are able to survive for a long starvation period of 11 days (Maceljski and Korunić, 1973). The
insects reared on diet containing MuLL did not die after 7 days even if they had eaten little.
According to Park et al. (2009), ingestion of a minimal food amount or no feeding activity
The physiological costs of starvation are usually associated with alterations in the rates
of lipid, protein and carbohydrate metabolism, leading to decrease in the efficiency with
which food is converted to biomass. It has been reported that the ingestion of plant extracts
and lectins can disturb digestion and absorption of nutrients by insects (Paiva et al., 2012). In
this sense, nutritional and biochemical parameters of S. zeamais adults reared on artificial
diets were determined aiming to evaluate whether the ingestion of leaf extract and MuLL
The deleterious effects of leaf extract on S. zeamais were also reflected on nutritional
(p<0.05) decreasing in the relative consumption rate (Figure 2A). In the control treatment, the
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 104
insects consumed an average of 0.63 mg of diet per mg of body weight every day. In
treatment with leaf extract at 150 mg/g, this value was only 0.05 mg/mg/day. The values of
relative comsuption rates of insects reared on diet containing MuLL were on average 4.75
times lower than that determined in control (Figure 3A), which was probably a result of the
strong feeding-deterrent activity of lectin. The decrease in consumption by insects in the leaf
extract and MuLL treatments was probably due to the feeding-deterrent activity of lectin.
Also, the death of insects promoted by leaf extract during the assay certainly led to decrease
The relative growth rate in treatments with the extract at 25 mg/g was significantly
(p<0.05) lower than in control treatment (Figure 2B). However, negative values were detected
in treatments at highest concentrations (Figure 2B), revealing that the insects presented not
only decrease in weight gain but that they lost biomass. In treatments with MuLL, the mean
relative growth rates were also negative, probably as a consequence of the absence of
adequate feeding activity of insects (Figure 3B). A possible explanation for these results is
that leaf extract and MuLL impaired digestion and absorption process at a high level so that
the insects started to metabolize their body reserves to survive at all cost.
The efficiency in conversion of ingested food in control was 2.15%, similar to that
detected in treatment with leaf extract at 10 mg/g (Figure 2C). This parameter decreased to
0.38% in treatment with 25 mg/g, evidencing an initial difficult of insects to incorporate the
diet nutrients. At treatments with extract from 50 to 150 mg/g, the values were negative
ranging from -2% to -44%, revealing that the insects have failed to incorporate the diet and
that the amount of food ingested was not sufficient to compensate deleterious effects of
treatments with MuLL was also negative, reaching values of -23% and -32% in treatements at
75 and 150 mg/g, respectively (Figure 3C), demonstrating that incorporation of MuLL into
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 105
insect diet led to imbalance of insect physiology and growth. Lectins have been reported to
disturb the incorporation of food when added to the diet of other storage insect pests.
Decreases by 16.8% and 31.2% in the efficiency in conversion of ingested food were detected
when A. kuehniella larvae were reared on diets containing lectins from seeds of Annona
coriacea and Moringa oleifera, respectively (Coelho et al., 2007; Oliveira et al., 2011).
Aiming to evaluate the effects of leaf extract and MuLL in S. zeamais metabolism,
enzyme activities were determined in gut extracts from insects fed or not on diets that
promoted moderate antifeedant effect. Table 2 shows that extracts from control group
presented protease, trypsin-like, α-amylase activities higher than those in gut extracts from
insect reared on diet containing leaf extract. The study also demonstrated that cellulase
(endoglucanase, exoglucanase and β-glucosidase) activities were not affected by leaf extract
while acid and alkaline phosphatases were not detected (Table 2).
endoglucanase and α-amylase activities (Table 2). Exoglucanase and β-glucosidase activities
were not significantly (p>0.05) different from those determined in gut extracts from control
group while acid phosphatase activity was not detected in insects that fed on MuLL diet
(Table 2). The results reveal that enzymes involved in protein metabolism were more
sensitive than those related to carbohydrate digestion. Previous study showed that MuLL was
able to inhibit the trypsin-like activity from gut of A. aegypti larvae (Napoleão et al., 2012).
The inhibitory effects of leaf extract and MuLL on digestive enzymes probably
disturbances detected. Also, the inhibition of digestive enzyme activities may be a mechanism
by which MuLL causes an intoxication resulting in feeding deterrence. Ishaaya et al. (1974)
on Spodoptera littoralis larvae was correlated with inhibitory effect on amylase and protease
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 106
activities. Zhou et al. (2011) suggested that inhibition of digestive enzyme activities is
involved in feeding-deterrent effect of the Xanthium sibiricum sterols against Pieris rapae
(Lepidoptera) larvae. In seeds, it has been reported the presence of protease and amylase
inhibitors active against enzymes from insect midgut naturally act as feeding deterrents
MuLL has potential for use in maize weevil control by preventing that these insects enjoy a
food source and by leading the insects to starve until death. This work opens windows to new
studies focusing on identification of toxic components of leaf extract, toxicity of extract and
Acknowledgments
Científico e Tecnológico (CNPq) for research grants and fellowship (LCBBC and PMGP).
Pernambuco (FACEPE) for financial support (PMGP). T.H. Napoleão and E.V. Pontual
would like to thank CAPES and FACEPE for graduate scholarships, respectively. L.P.
Albuquerque would like to CAPES and the Brazilian Ministry of Education (Programa de
B.R. Belmonte would like to thank FACEPE and CNPq for Scientific Initiation scholarship.
The authors are also deeply grateful to Maria Barbosa Reis da Silva for the technical
assistance.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 107
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3 6.3 ± 2.1 A
15 5.1 ± 2.0 A
30 7.0 ± 2.4 A
45 4.1 ± 2.7 A
75 6.0 ± 2.8 A
150 6.0 ± 2.1 A
Control 5.0 ± 2.0 A
Control treatments contained only wheat flour. Different letters indicate significant (p<0.05)
differences between treatments.
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Table 2. Digestive enzyme activities in gut extracts from S. zeamais adults reared on diets
Fig. 1. Effect of M. urundeuva leaf extract and lectin (MuLL) on feeding of S. zeamais adults
by determination of feeding-deterrence indices. The insects were reared on artificial diet
consisting on wheat flour disks containing leaf extract at 10 to 150 mg of protein per g of
wheat flour (A) and MuLL at 3 to 150 mg per g of wheat flour (B). Each bar correponds to the
mean ± SD of four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05) differences
between treatments.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 118
8. CONCLUSÕES
Uma nova lectina ligadora de quitina, denominada MuLL, foi isolada da folha de M.
kDa.
MuLL é uma lectina resistente a amplas variações de temperatura e pH, cuja atividade
corniger.
zeamais, constituindo uma potencial fonte de agentes inseticidas para controle deste
inseto. A toxicidade do extrato de folhas pode estar ligados a efeitos inibitórios sobre a
desses insetos.
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9. ANEXO
ISBN: 978-953-307-780-2
doi:10.5772/2447
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