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Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung von

Tramadol-Analoga und deren industrielle Anwendbarkeit

Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Rheinisch-
Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Diplom-Chemiker

Carsten Griebel

aus
Niebüll

Berichter: Universitätsprofessor Dr. H.-J. Gais


Universitätsprofessor Dr. D. Enders

Tag der mündlichen Prüfung: 13. Dezember 2002

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.
Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum vom 01.04.1998 bis zum 28.02.2002 am
Institut für Organische Chemie der Rheinisch Westfälischen Technischen
Hochschule Aachen unter Anleitung von Prof. Dr. H.-J. Gais angefertigt.
„Wenn wir wüßten, was wir tun,
würden wir das nicht Forschung nennen.“

(Albert Einstein)
Danksagung

Ich möchte mich an dieser Stelle bei allen Mitarbeitern des Instituts für Organische Chemie
der RWTH Aachen bedanken. Besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. H.-J. Gais für die
engagierte Unterstützung und Betreuung dieser Arbeit, die interessanten und anregenden
Diskussionen sowie für die Bereitstellung der ausgezeichneten Arbeitsbedingungen. Allen
Arbeitskreismitgliedern danke ich für die angenehme und freundschaftliche
Arbeitsatmosphäre, die stete Diskussionsbereitschaft sowie für die gute Zusammenarbeit.
Für die hilfreichen Anregungen bei der Fertigstellung der vorliegenden Arbeit danke ich
Herrn Dipl.-Chem. Stefan Koep.

Bei Frau Ing. Cornelia Vermeeren möchte ich mich besonders für die Lösung einer Vielzahl
von Trennproblemen und für ihre stete Hilfsbereitschaft bedanken. Besonderer Dank gebührt
auch Frau Magdalena Grosch und Frau Ursula Ripkens für die durchgeführten HPLC-
Trennungen.

Für die Ausführung von analytischen Aufgaben möchte ich mich bei Frau Dittrich, Frau
Glensk, Frau Kuyper, Frau Müller, und Herrn Dr. Runsink bedanken und für die Abwicklung
organisatorischer Aufgaben bei Frau Bertrand, Frau Renardy, Herrn Dr. Bettray und Herrn
Dr. Geibel.

Meiner Forschungspraktikantin Frau Dipl.-Chem. Martina Mennicken danke ich für ihre
präparative Unterstützung und engagierte Mitarbeit.

Ein großer Dank gebührt auch den Mitarbeitern der Grünenthal GmbH, die mich hilfsbereit
unterstützt haben. Im besonderen möchte ich Herrn Dr. Helmut Buschmann für seine
engagierte Unterstützung dieser Arbeit danken, ebenso Herrn Heinz-Günter Döteberg, Herrn
Dr. Michael Finkam, Herrn Dr. Bernd Sundermann, Herrn Dr. Oswald Zimmer und nicht
zuletzt denjenigen Mitarbeitern, die es ermöglicht haben, daß mir die benötigten Substanzen
zur Verfügung gestellt werden konnten.

Ganz besonders möchte ich mich herzlich bei meiner Familie und meinen Freunden
bedanken, die mich während meiner Promotionszeit unterstützt haben.
Teile dieser Arbeit wurden auszugsweise publiziert in:

Enzymatic resolution of analgesics: δ-hydroxytramadol, ε-hydroxytramadol and


O-desmethyltramadol. H.-J. Gais, C. Griebel, H. Buschmann, Tetrahedron:
Asymmetry 2000, 11, 917-928.

Verfahren zur enzymatischen Racematspaltung von Aminomethyl-Aryl-


Cyclohexanol-Derivaten. H. Buschmann, D. Kaulartz, C. Griebel, H.-J. Gais,
DE 10004926 A1, 04.02.2000 und WO 01/57232 A1, 09.08.2001; Chem. Abstr.
2001, 135, 179820.
Inhaltsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VIII

1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 1


1.1 Opioide Analgetika 3
1.2 Tramadol und analgetisch aktive Analoga 7
1.3 Zielsetzung 11

2 THEORETISCHER TEIL 13
2.1 Darstellung und Charakterisierung der MPEG/PLE-Katalysator Präparation 13
2.2 Darstellung der racemischen Tramadol-Analoga 16
2.2.1 Synthesewege der von GRÜNENTHAL bereitgestellten Substanzen 24
2.3 Vorbemerkungen zu Enzym-Katalyse 26
2.3.1 Kinetische Racematspaltungen 26
2.3.1.1 Der E-Wert 29
2.3.2 Auswahl geeigneter Enzyme und Reaktionsmedien 35
2.3.2.1 Auswahl der verwendeten Substrate und Reaktionsbedingungen in der
enzymatischen Hydrolyse 38
2.3.2.2 Auswahl der verwendeten Acyldonoren und Reaktionsbedingungen in der
enzymatischen Transacylierung 39
2.4 Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von Tramadol-Analoga 42
2.4.1 Substrate auf Basis aromatischer Hydroxylfunktionen 42
2.4.1.1 Enzym-katalysierte Hydrolysen des (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylamino-
methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) 49
2.4.1.2 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylamino-
methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 59
2.4.1.3 Enzym-katalysierte Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) 63
2.4.1.4 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-
1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 73
2.4.1.5 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethyl-
amino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) 75
2.4.2 Substrate auf Basis sekundärer Hydroxylfunktionen 77
2.4.2.1 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino-
methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 82
2.4.2.2 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-
1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 93
2.4.2.3 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-
4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 104
VERZEICHNISSE II

2.4.2.4 Versuche zur enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-


6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 108
2.4.2.5 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino-
methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 113
2.4.2.6 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethyl-
aminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 120
2.4.2.7 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylamino-
methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 138
2.4.2.8 Darstellung von (+)-14 durch enzymatische Racematspaltung im präparativen
Maßstab 140
2.4.2.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-
1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 144
2.4.3 Substrate auf der Basis tertiärer Hydroxylfunktionen 154
2.4.3.1 Versuche zur Enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-
3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 155
2.5 Zusammenfassung 158
2.6 Ausblick 163

3 EXPERIMENTELLER TEIL 164


3.1 Allgemeine Vorbemerkungen 165
3.1.1 Eingesetzte Computerprogramme 165
3.1.2 Analytische Methoden und Geräte 165
3.1.3 Lösungsmittel und Reagenzien 170
3.1.4 Verwendete Proteine 170
3.1.5 Besondere Arbeitstechniken 173
3.2 Darstellung und Analytik der MPEG/PLE Präparationen 174
3.2.1 Darstellung von MPEG/PLE 174
3.2.2 Standardtest zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE 174
3.3 Darstellung der Substrate zur enzymatischen Racematspaltung 176
3.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 176
3.3.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Freisetzung der racemischen Basen (AAV 1) 176
3.3.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von Phenolen
(AAV 2) 176
3.3.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von
Hydroxysubstituierten-Tramadolen (AAV 3) 177
3.3.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung von Hydrochloriden aus den
racemischen Basen (AAV 4) 177
3.3.2 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung 178
3.3.2.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexanol (rac-7) 178
III VERZEICHNISSE

3.3.2.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-


phenol (rac-8) 179
3.3.2.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-
phenol (rac-11) 180
3.3.2.4 Darstellung von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 181
3.3.2.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 183
3.3.2.6 Darstellung von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 184
3.3.3 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse 185
3.3.3.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-
cyclohexyl)-phenylester (rac-15) 185
3.3.3.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-
cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 186
3.3.3.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy-
1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 187
3.3.3.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-
3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 189
3.3.3.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-
3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 190
3.3.3.6 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-3-(6-Dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy-
cyclohexyl)-phenol (rac-20) 191
3.3.3.7 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl-
1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 193
3.3.3.8 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 194
3.3.3.9 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 195
3.3.3.10 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24) 197
3.3.3.11 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylamino-
methyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 198
3.3.4 Darstellung der racemischen Ester zur Bestimmung des Umsatzes in der
enzymatischen Transacylierung 199
3.3.4.1 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Essigsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-
3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-47) 199
3.3.4.2 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-
3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-46) 200
VERZEICHNISSE IV

3.3.4.3 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-


4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24) 201
3.3.4.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-
3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-45) 203
3.3.5 Versuche zur Darstellung von (±)-(1RS,5RS,8RS)-8-Dimethylaminomethyl-1-
(3-methoxy-phenyl)-2,4-dioxa-bicyclo-[3.3.1]-nonan-3-on (rac-48) 204
3.3.5.1 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit Bis-(trichlormethyl)-carbonat 204
3.3.5.2 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit 1,1´-Carbonyldiimidazol 205
3.4 Überprüfung der Hydrolysestabilität der Estersubstrate 207
3.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Überprüfung der Hydrolysestabilität der racemischen
Substrat Ester (AAV 5) 207
3.4.2 Hydrolysestabilität des Esters rac-15 207
3.4.3 Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25 207
3.4.4 Hydrolysestabilität des Esters rac-23 208
3.4.5 Hydrolysestabilität des Esters rac-16 208
3.4.6 Hydrolysestabilität des Esters rac-24 209
3.5 Bestimmung von Umsätzen und Enantiomerenverhältnissen 210
3.6 Enzym-katalysierte Racematspaltungen im wäßrigen und organischen
Medium 214
3.6.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 214
3.6.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrigen Einphasen
System (AAV 6) 214
3.6.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrig-organischen
Zweiphasen System (AAV 7) 214
3.6.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Transacylierung in organischen
Lösungsmitteln (AAV 8) 215
3.6.2 Berechnung des E-Werts 216
3.6.3 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15) 217
3.6.3.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem unter
Zusatz von Aceton als Cosolvens 217
3.6.3.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 217
3.6.3.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem zur
Darstellung von (+)-15 218
3.6.3.4 Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen
Einphasensystem 219
3.6.3.5 CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 219
3.6.3.6 Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen
Einphasensystem 220
3.6.3.7 HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 220
3.6.3.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 221
V VERZEICHNISSE

3.6.3.9 PPL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 221


3.6.3.10 BCL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 222
3.6.3.11 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem mit
roher CRL 222
3.6.3.12 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasen-
system mit roher CRL 223
3.6.3.13 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasen-
system mit aufgereinigter CRL 224
3.6.4 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 224
3.6.4.1 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem mir
roher CRL 224
3.6.4.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei
pH 7.0 225
3.6.4.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei
pH 8.0 225
3.6.5 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) 226
3.6.5.1 Versuche zur enzymatischen Transacylierung des Phenols rac-8 unter Verwendung
verschiedener Lipasen 226
3.6.5.2 Versuch zur PPL-katalysierten Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 227
3.6.5.3 BCL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 228
3.6.5.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 229
3.6.5.5 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylbutyrat 230
3.6.5.6 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 230
3.6.6 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-
1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 231
3.6.6.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen Einphasensystem 231
3.6.6.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen Einphasensystem mit
roher CRL 232
3.6.7 Versuche zur Enzymatischen Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethyl-
amino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) unter Verwendung
verschiedener Lipasen 232
3.6.8 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino-
methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 233
3.6.8.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem 233
3.6.8.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem 234
3.6.8.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasen-
system 235
3.6.8.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasen-
system mit extraktiver Aufarbeitung 236
VERZEICHNISSE VI

3.6.8.5 Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen
Einphasensystem 237
3.6.8.6 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasen-
system 237
3.6.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-
1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 238
3.6.9.1 Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit
Isopropenylacetat 238
3.6.9.2 BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 238
3.6.9.3 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 239
3.6.9.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat 241
3.6.9.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 242
3.6.9.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 243
3.6.10 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-
4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 244
3.6.10.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter Verwendung
verschiedener Lipasen im wäßrigen Einphasensystem 244
3.6.10.2 Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrig-organischen
Zweiphasensystem 245
3.6.10.3 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrigen Einphasen-
system 246
3.6.11 Versuche zur Enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethyl-
aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 246
3.6.11.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter
Verwendung verschiedener Lipasen 246
3.6.11.2 Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 247
3.6.11.3 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Zusatz
von Triethylamin 248
3.6.12 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino-
methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 249
3.6.12.1 CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 249
3.6.12.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 249
3.6.12.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 250
3.6.12.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrig-organischen Zweiphasen-
system 250
3.6.13 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylamino-
methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 251
3.6.13.1 Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen
Einphasensystem 251
3.6.13.2 Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen-
system 252
VII VERZEICHNISSE

3.6.13.3 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen-


system 252
3.6.13.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 253
3.6.13.5 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrig-organischen Zweiphasen-
system 253
3.6.13.6 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 254
3.6.13.7 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem mit
extraktiver Aufarbeitung 255

3.6.13.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl im wäßrigen Einphasensystem 256

3.6.13.9 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 256


3.6.13.10 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen-
system unter Zusatz von Aceton als Cosolvens 257
3.6.13.11 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22

(rac-22⋅HCl) im wäßrigen Einphasensystem 258

3.6.14 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylamino-


methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 261
3.6.14.1 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23 im wäßrigen Einphasen-
system mit Aufarbeitung durch kontinuierliche Extraktion 261
3.6.15 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-
1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 262
3.6.15.1 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 262
3.6.15.2 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat 263
3.6.15.3 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat 264
3.6.15.4 Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat 267
3.6.15.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 267
3.6.15.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 268
3.6.15.7 Versuch zur Chirazyme E1-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 268
3.6.16 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-
3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 269
3.6.16.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 im wäßrigen
Einphasensystem 269
3.6.16.2 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 269
3.7 Anhang zum experimentellen Teil 271
3.7.1 Programm zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE durch Verseifung von
Buttersäureethylester 271

4 LITERATUR 272
VERZEICHNISSE VIII

Abkürzungsverzeichnis
AAV Allgemeine Arbeitsvorschrift
Abb. Abbildung
AChE Acetylcholinesterase
abs. absolut
APT attached proton test
Äq. Äquivalent
BSA Rinderserum-Albumin (bovine serum albumin)
BCL Burkholderia cepacia Lipase
c Umsatz (conversion)
d Duplett
d Tag
dest. Wasser vollentmineralisiertes Wasser
CAL-B Candida antarctica Lipase, Typ B
CE Cholesterolesterase
CRL Candida rugosa Lipase
CVL Chromobacterium viscosum Lipase
Da Dalton
DC Dünnschichtchromatographie
DCM Dichlormethan
DiBAl-H Diisobutylaluminiumhydrid
E-Wert Selektivitätsparameter nach Chen und Sih
(Enantiomeric Ratio)
ee Enantiomerenüberschuß (enantiomeric excess)
EE Essigsäureethylester
Et Ethyl
EtOH Ethanol
GC Gaschromatographie
ges. gesättigt
h Stunde
HLE Pferdeleber-Esterase (horse liver esterase)
HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie
HV Hochvakuum
J Kopplungskonstante
IX VERZEICHNISSE

KOtBu Kalium-tert-butylat
log P-Wert Logarithmus des Verteilungskoeffizienten eines
Lösungsmittels zwischen Oktanol und Wasser
m Multiplett
MeOH Methanol
Min. Minuten
MPEG Polyethylenglykolmonomethylether
MPEG/PLE Colyophilisat aus Schweineleber-Esterase und Poly-
ethylenglykolmonomethylether
MTBE tert-Butyl-methylether
MW Molekulargewicht
n. b. nicht bestimmt
NMR Kernmagnetische Resonanzspektroskopie (nuclear
magnetic resonance)
PLE Schweineleber-Esterase (porcine liver esterase)
PLE/BSA/MPEG Colyophilisat aus Schweineleber-Esterase, Poly-
ethylenglykolmonomethylether und Rinderserum-
Albumin
PPL Schweinepankreaslipase (porcine pancreatic lipase)
ppm parts per million
Pr Propyl
PrOH Propanol
Rf Retentionsfaktor (ratio of fronts)
Rfl. Rückfluß
RT Raumtemperatur
s Singulett
Smp. Schmelzpunkt
TEA Triethylamin
TMS Tetramethylsilan
t Triplett
tR Retentionszeit
U Aktivitätseinheit (Units)
wfr. Wasserfrei
1 Einleitung und Zielsetzung

Enzymatische Transformationen gehören mittlerweile zu den Grundoperationen der


präparativen organischen Chemie. Es sind bis heute zahlreiche industrielle Prozesse
mit enzymatischen Schlüsselschritten etabliert, die weit über die enzymatische
Racematspaltung von Aminosäurederivaten hinausgehen.1,2 Die Vorteile von
Biokatalysatoren liegen vor allem in den milden Reaktionsbedingungen, dem damit
verbundenen geringeren Sicherheitsrisiko3 und der geringen Neigung zur Bildung
von Nebenprodukten, da sie Prozesse mit hoher Chemo-, Regio- und
Stereoselektivität katalysieren.

Enzyme aus der Klasse der Hydrolasen (Lipasen, Proteasen u. a.) sind für
technische Anwendungen besonders interessant, da sie in großer Zahl kommerziell
erhältlich sind4, zur Entfaltung ihrer katalytischen Aktivität keine teuren und eventuell
zu regenerierenden Cofaktoren benötigen und ein breites Substratspektrum
akzeptieren.5,6,7,8 Lipasen werden zur Modifizierung von Fetten, zur Synthese von
Estern und zur kinetischen Racematspaltung eingesetzt.9,10,11 Hierbei ist die
Stabilisierung und effektive Immobilisierung der Enzyme zur Erhöhung der
Betriebsstabilität, zur leichten Abtrennung und zur Wiederverwendung bei der
absatzweisen Reaktionsführung von besonderer Bedeutung.9 Als aktuelle Methoden
zur Stabilisierung von Enzymen sind vor allem die von der Firma ALTUS entwickelte
Quervernetzung von Enzymkristallen (CLECs)12,13 und das von REETZ et al.
entwickelte Verfahren zum Einschluß von Enzymen in hydrophobe Sol-Gele14,15 zu
nennen. Alternativen zur Immobilisierung von Enzymen auf unlöslichen Trägern
stellen Systeme zur Enzymrückhaltung wie Enzym-Membran-Reaktoren (EMR)16,17
oder die von der Firma SEPRACORE entwickelten Hohlfasermodule18,19 dar.
Der Einsatz von nicht-wäßrigen Reaktionsmedien eröffnet der Enzymkatalyse den
Zugang zu einer Vielzahl von neuartigen Anwendungen.20,21 In Zukunft wird auch der
Einsatz von Enzymen, die durch Mutationen optimiert wurden, eine wichtige Rolle
spielen. Solche Mutationen können zufällig eingeführt werden, so daß in einem
anschließenden Selektionsverfahren dann Enzyme mit verbesserten Eigenschaften
identifiziert werden können (directed evolution).22 Mutationen können auch gezielt
vorgenommen werden, nachdem anhand der Proteinstruktur Aminosäuren
identifiziert wurden, deren Austausch verbesserte Eigenschaften erwarten läßt.23
2 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Die Wirkstoffsynthese in der medizinischen Chemie ist ein ideales Einsatzgebiet für
biokatalytische Methoden.10,24 Viele Wirkstoffe sind chiral, und es muß mit
unterschiedlicher biologischer Aktivität der Enantiomeren gerechnet werden.25 Ein
Racemat wird daher als Gemisch zweier Wirkstoffe behandelt. Nur wenn beide
Enantiomere annähernd identische Wirkung aufweisen oder synergistische Effekte
zwischen den beiden Wirkstoffe bestehen, kann ein Racemat als Medikament
zugelassen werden. Ausnahmen sind Substanzen, die unter physiologischen
Bedingungen racemisieren oder Substanzen die metabolisch deracemisiert werden,
wie beispielsweise das Ibuprofen: (R)-Ibuprofen wird unter physiologischen
Bedingungen in das ungefähr viermal wirksamere (S)-Ibuprofen umgewandelt.26

1522 Wirkstoffe

426 (28 %) 1096 (72 %)


Naturstoffe Synthetika

422 (99 %) 4 (1 %) 422 (38 %) 674 (62 %)


enantiomerenrein achiral oder racemisch chiral achiral

52 (12 %) 370 (88 %)


enantiomerenrein racemisch

Abb. 1.1: Statistik über die Aufteilung von Wirkstoffen (1982).27

KLEEMANN und ENGEL haben 1982 eine repräsentative Auswahl an Arzneistoffen


untersucht und festgestellt, daß darunter fast alle eingesetzten Naturstoffe und deren
Derivate chiral sind und in enantiomerenreiner Form vorliegen. In der Mehrheit
werden synthetisch gewonnene Arzneistoffe eingesetzt, von denen hingegen nur
38 % chiral sind. Der überwiegende Teil davon (88 %) wurde 1982 noch als Racemat
eingesetzt (s. Abb. 1.1).27 Für die Neueinführungen der letzten Jahre hat sich dieses
Verhältnis deutlich in Richtung zu enantiomerenreinen Substanzen verschoben. 1985
betrug der Anteil enantiomerenreiner Wirkstoffe am pharmazeutischen Weltmarkt
noch ca. 2 %. Dieser Anteil ist bis ins Jahr 1995 auf 20 % angestiegen und weiter auf
32 % im Jahr 2000.28,29 Für die folgenden Jahre wird auch weiterhin ein wachsender
Anteil vorhergesagt.29

Auch vor dem Hintergrund der Auflagen nationaler und internationaler


30
Gesundheitsbehörden , welche die Erforschung der Wirkung jedes einzelnen
3

Stereoisomers als Notwendigkeit verlangen, wird enantiomerenreinen Substanzen


(enantiomerically pure compounds, EPC)31 von der pharmazeutischen Industrie ein
vermehrtes Interesse entgegengebracht.10,32 Daneben können auch patentrechtliche
Überlegungen von Unternehmen eine Rolle spielen, da nach Ablauf einer Schutzfrist
eines Racemats anschließend das aktiviere Enantiomer geschützt werden kann
(chiral switch). So können verlängerte Schutzfristen für Wirkstoffe erzielt werden.33

Die vermehrte Bedeutung enantiomerenreiner Verbindungen erfordert die Suche


nach neuen Zugängen zu diastereo- und enantiomerenreinen Produkten bei der
Entwicklung neuer Pharmaka. In den letzten Jahren sind zur Synthese
enantiomerenreiner Wirkstoffe viele Methoden eingesetzt worden: asymmetrische
Synthese, katalytische kinetische Racematspaltung und Racematspaltungen durch
Chromatographie an chiraler stationärer Phase (CSP) oder durch stereoselektive
Kristallisation.34,35 Trotz der Fortschritte auf dem Gebiet der asymmetrischen
Synthese, basieren die Synthesen vieler chiraler Wirkstoffe noch auf der Trennung
der racemisch synthetisierten Verbindung.36 Unter den genannten Methoden spielen
biokatalytische Verfahren als Schlüsselschritt eine wichtige Rolle.35 Extracelluläre
Lipasen sind hierbei besonders attraktive Katalysatoren für synthetische
Verfahren.9,37

1.1 Opioide Analgetika

Die Behandlung von Schmerzen hat in der Medizin eine große Bedeutung. Es
besteht zur Zeit noch ein weltweiter Bedarf an gut wirksamen Schmerztherapien für
eine patientengerechte und zielorientierte Behandlung. Zentralwirksame Opioide38,
die auch als stark wirksame (morphinartige) Analgetikaa bezeichnet werden, werden
seit langem in der Schmerztherapie eingesetzt, obwohl sie ein dem Morphin
ähnliches Wirkungsprofil haben. Sie rufen eine Reihe von Nebenwirkungen wie
Sucht, Abhängigkeit, Atemdepression, gastro-intestinale Hemmwirkung und
39
Obstipation in unterschiedlicher Stärke hervor. Die moderne Analgesieforschung ist

a
algos (griech.) = Schmerz
4 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

daher bemüht Medikamente zu entwickeln, die eine schmerzstillende Wirkung, nicht


aber die für Opioide typischen Nebenwirkungen, zeigen.40
Die hohe Spezifität der Wirkung stark zentralwirksamer Analgetika hat ihre Erklärung
gefunden, nachdem es gelang, Opioid-Rezeptoren im Organismus nachzuweisen.41
Diese Rezeptoren werden normalerweise mit körpereigenen, morphinartig wirkenden
Peptiden, den Endorphinenb und Enkephalinen, die endogene Agonisten dieser
Rezeptoren sind, aktiviert.26,42,43,44 Das endogene schmerzhemmende System hat die
Funktion die lähmende Schmerzreaktion zu unterdrücken, so daß dem Organismus
seine Handlungsfähigkeit erhalten bleibt.
Opioid-Rezeptoren kommen in unterschiedlicher Dichte sowohl prä- als auch
postsynaptisch im Zentralnervensystem vor.44 Außerhalb des Zentralnervensystems
findet man Opioid-Rezeptoren vor allem im Dünndarm. 41 Wie bei anderen
Neurotransmitter-Rezeptoren werden auch bei den Opioid-Rezeptoren verschiedene
Subtypen unterschieden, die man als µ-, κ- und δ-Rezeptoren bezeichnet45. Seit
kurzem kennt man einen weiteren neuen Rezeptor, den ORL1-Subtyp (Opioid-
Receptor-Like 1), und dessen endogenen Liganden, das Peptid Nociceptin.46 Dabei
ist je nach Rezeptorsubtyp eine bestimmte pharmakologische Wirkung möglich. Bei
der supraspinal analgesierenden Wirkung spielt beispielsweise der µ-Rezeptor eine
dominante Rolle.47 Jeder Subtyp ist jedoch auch für ganz bestimmte
Nebenwirkungen verantwortlich. µ-Rezeptoren sind vor allem für die durch Opiate
ausgelöste Atemdepression und Abhängigkeit verantwortlich.44 Durch eine
unterschiedliche Affinität zu den verschiedenen Rezeptoren kann das variable
Wirkungsprofil verschiedener Opioide erklärt werden.

Morphinc (1, s. Abb. 1.2) ist eines der wenigen Beispiele eines Naturstoffs, der auch
heute noch in seiner ursprünglichen Form in der Therapie eingesetzt wird.48
SERTÜRNER isolierte 1806 das Morphin erstmals aus Opium. Die Klärung der Struktur
des Morphins, an der viele Forscher beteiligt waren, hat über 120 Jahre gedauert.
Die 1925 von ROBINSON und GULLAND angegebene Strukturformel wurde 1952 von
GATES und TSCHUDI bestätigt, denen die Totalsynthese des Morphins und damit auch
die Klärung der Stereochemie gelang. Diese vielstufige Synthese hat allerdings keine
praktische Bedeutung erlangt, da Morphin bis heute aus Opium gewonnen wird.49

b
Endo-Morphine
c
Morpheus = griech. Gott des Schlafs
OPIOIDE ANALGETIKA 5

R1O
OH

O H O
N CH3 Me
N
R2O OH
Morphin (1): R1 = R2 = H 1
Codein (2): R1 = Me, R2 = H
Heroin (3): R1 = R2 = Acetyl
Abb. 1.2: Morphin in einer konventionellen Darstellung nach Robinson (links) und
in einer Stereoformel (rechts).

Morphin stellt den Prototyp und auch den Standard der stark wirksamen Analgetika
zur Behandlung heftiger akuter und chronischer Schmerzen dar.50 Auf der Suche
nach analgetisch wirksamen Verbindungen ist die Struktur des Morphins vielfältig
variiert worden. Dabei zeigte sich, daß auch sehr weit abgewandelte Derivate typisch
morphinartige Eigenschaften besitzen können.51 Die Forschung auf dem
Morphingebiet zeigt weiter, wie aus einem komplexen Naturstoff durch systematische
Strukturvariation leichter herzustellende, strukturell einfache Analoga mit identischer
Wirkung, zum Teil sogar mit höherer Spezifität der Wirkung, gewonnen werden.26
Erste Abwandlungsprodukte wie Codein, der Methylether von 1, oder Heroin, das
Diacetylderivat von 1, waren ebenfalls Naturstoffe. Codein ist zwar schwächer
wirksam als Morphin, weist aber auch ein geringeres Suchtpotential auf. Für Heroin
trifft das Gegenteil zu, es weist ein sehr großes Suchtpotential auf.26

CH3
O O
CH3 N O
O CH3

CH3
N H 3C N
N
CH3 CH3
4 (-)-5 6
Pethidin Levomethadon Fentanyl
Abb. 1.3: Verschiedene opioide Wirkstoffe.

Pethidin52 (4, s. Abb. 1.3), das erste vollsynthetische Schmerzmittel vom Morphintyp,
wurde 1939 von EISLEB bei der Suche nach krampflösenden Wirkstoffen durch
6 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Variation der Struktur des Atropins entdeckt.26,41,46 Das ebenfalls vollsynthetische


Methadon (rac-5) wurde 1941 von BOCKMÜHL und EHRHART gefunden. Als sich
herausstellte, daß nur das (−)-(R)-Enantiomer des Methadons für die analgetische
Wirkung verantwortlich ist, wurde es als Levomethadon53 ((−)-5, s. Abb. 1.2)
eingeführt. Es wird durch Racematspaltung mit (+)-(2R,3R)-Weinsäure aus
Methadon erhalten.41,47 Levomethadon wird hauptsächlich in der Schmerztherapie
eingesetzt, wohingegen racemisches Methadon, oral verabreicht, in der
Ersatztherapie bei Opioid-Abhängigkeit verwendet wird.54 Pethidin und Methadon
besitzen nur etwa ein fünftel bis ein viertel der analgetischen Wirkung des Morphins.
Zwar sind auch die Nebenwirkungen entsprechend schwächer ausgeprägt26,41,44,
jedoch ist ein entscheidender Fortschritt mit diesen Substanzen nicht erreicht
worden.

Fentanyl (6, s. Abb. 1.3), das ebenfalls synthetisch hergestellt wird, ist eines der am
stärksten wirksamen Analgetika, das etwa 100mal stärker wirksam ist als Morphin.
Es wirkt hauptsächlich über den µ-Rezeptorsubtyp.47 Fentanyl wird wegen seiner
relativ kurzen Wirkungsdauer von etwa 30 Minuten ebenfalls in der
Neuroleptanalgesie eingesetzt. Darunter versteht man ein Verfahren bei dem ein
Neuroleptikum gleichzeitig mit einem stark wirksamen Analgetikum injiziert und
dadurch ein Zustand induziert wird, bei dem der Patient sediert und angstfrei ist. So
können kleinere Eingriffe (wie beispielsweise Endoskopien) vorgenommen werden,
bei denen das Erwachen ohne Desorientierung vor sich geht und eine postoperative
Analgesie gewährleistet ist.41,44,55 Fentanyl und dessen Derivate mit einem hohen
Mißbrauchspotential („Designer Drogen“)56 zeigen die typischen Nebenwirkungen
starker µ-Opioide und führen zu einer physischen Abhängigkeit, ähnlich wie beim
Morphin.

Neben Molekülen mit einer agonistischen Wirkung gibt es auch Morphin-


Antagonisten (s. Abb. 1.6, S. 9), die eingesetzt werden, um die Wirkung von opioiden
Analgetika aufzuheben, im besonderen zur Aufhebung der Atemlähmung bei akuter
Vergiftung.41,47
TRAMADOL UND ANALGETISCH AKTIVE ANALOGA 7

1.2 Tramadol und analgetisch aktive Analoga

Tramadol57 (rac-7, s. Abb. 1.4) nimmt unter den stark wirksamen Analgetika eine
Sonderstellung ein, da dieser Wirkstoff eine starke Schmerzhemmung ohne die für
Opioide typischen Nebenwirkungen hervorruft.58 Das Suchtpotential ist so gering43,
das dieser Wirkstoff nicht unter Kontrollmaßnahmen von Narkotika fällt, in
Deutschland das Betäubungsmittelgesetz. Tramadol, das 1976 von der GRÜNENTHAL
GmbH in die Schmerztherapie eingeführt wurde, wird von der WORLD HEALTH
ORGANISATION (WHO) auf Stufe zwei der Schmerztherapie krebskranker Patienten
empfohlen.59 Tramadol wird weltweit vermarktet und ist eines der wichtigsten
zentralwirksamen Schmerzmittel.59

OH OH
(S)
(R)
OCH3 H3CO
(R) (S)

H3C N N CH3
CH3 H3C
(+)-(1R,2R)-Tramadol (−)-(1S,2S)-Tramadol
Abb. 1.4: Die Enantiomere des Tramadols ((+)-7, (−)-7).

Tramadol ist ein Racemat aus (+)-(1R,2R)- und (−)-(1S,2S)-2-Dimethylaminomethyl-


1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexanol. Das in der Therapie eingesetzte Tramadol
hydrochlorid ist ein partieller Opiat-Agonist, dessen Wirkstärke etwa 1/10 bis 1/5 der
des Morphins entspricht, jedoch mit stark reduzierter Opioidwirkung.44 Tramadol zeigt
eine µ-opioide und eine nicht-opioide Wirkung. Die nicht-opioide Wirkung ist eine
Inhibierung der spinalen Schmerzleitung durch Inhibierung der Wiederaufnahme der
Neurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5HT).
Dieses wird durch das (−)-(1S,2S)-Enantiomer bewirkt, wohingegen das (+)-(1R,2R)-
Enantiomer ein starker µ-Agonist ist und für die opioide Wirkung verantwortlich ist.
Die analgetische Wirksamkeit des Tramadols resultiert aus einer synergistischen
Kombination beider Enantiomere auf die die beiden Wirkmechanismen verteilt
sind.38,47,60,61,62 Zusätzlich trägt auch der in vivo durch oxidative Dealkylierung
gebildete Hauptmetabolit O-Desmethyltramadol (8, M1), der eine wesentlich höhere
µ-Opioidrezeptor-Affinität besitzt, zur komplexen Gesamtwirkung bei.46,47,61,63,
8 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

OH
OH

O
H3C HO
CH3
N N
OH
CH3
(−)-1 (+)-8
Abb. 1.5: Strukturelle Ähnlichkeit zwischen Morphin und (+)-O-Desmethyltramadol.

Das (+)-(1R,2R)-Enantiomer des Tramadols und insbesondere das (+)-(1R,2R)-


Enantiomer des O-Desmethyltramadols lassen sich als stark vereinfachte Derivate
des physiologisch aktiven (−)-Morphins auffassen, deren Struktur durch Wegfall von
Ringanteilen flexibler wird (s. Abb. 1.5).

Sowohl für Opioide als auch für Endorphine und Enkephaline, die an diesen
Rezeptoren eine analgetische Wirkung auslösen, sind intensive Untersuchungen zur
Struktur-Aktivitäts-Beziehung durchgeführt worden.26,57,64 Demnach ist für ein aktives
Molekül ein in 1-Stellung arylsubstituiertes Cycloalkangrundgerüst, welches in 2-
Stellung aminoalkyliert ist, essentiell. Bei systematischen Variationen des Tramadol-
grundgerüsts stellte die GRÜNENTHAL GmbH fest, daß eine meta-Hydroxyfunktion am
Phenylring zur stärksten analgetischen Wirkung führt und daß die agonistische
Wirkung an die Dimethylaminogruppe gebunden ist. Bei Variationen der Ringgröße
hat sich der Sechsring als optimal herausgestellt.57 Eine freie Hydroxyfunktion am
quarternären Zentrum erweist sich außerdem als günstig, da die analgetische
Wirkung durch Substitution mit Chlor oder Wasserstoff verringert wird, bei
Veresterung geht sie völlig verloren.57
Daß sich das Agonist/Antagonist-Verhältnis eines Moleküls über die Stickstoff-
substitution beeinflussen läßt, zeigt sich im Naloxon (9) und Naltrexon (10) (s. Abb.
1.6, S. 9). Hier ist unter anderem ein N-Methylrest gegen einen Allyl- oder einen
Methylencyclopropyl-Rest ersetzt worden: beide Verbindungen sind dadurch Opioid-
Antagonisten. Des weiteren ist die räumliche Anordnung dieser Gruppen für die
Analgesiewirkung entscheidend. Allerdings kann eine vollständige Struktur-Aktivitäts-
Beziehung immer noch nicht aufgestellt werden.38
TRAMADOL UND ANALGETISCH AKTIVE ANALOGA 9

HO HO

O OH O OH
N N
CH2
O O
Naloxon (9) Naltrexon (10)
Abb. 1.6: Opioid-Antagonisten.

Die Synthese des racemischen Tramadol hydrochlorids erfolgt durch Grignard-


Reaktion von 2-(Dimethylaminomethyl)-cyclohexanon, welches durch Mannich-
Reaktion65 von Cyclohexanon, Formaldehyd und Dimethylamin hydrochlorid erhalten
wird, und dem Grignardreagenz des 3-Bromanisols. Aus dieser Reaktion wird eine
cis /trans (cis : trans = 85 : 15) Mischung erhalten. Das gewünschte cis-Isomer wird
durch Kristallisation des diastereomerenreinen Hydrochlorids erhalten. Das trans-
Isomer kann unter Verwendung starker Säuren epimerisiert werden.47,57,66

Präparative Verfahren zur Racematspaltung von Tramadol sind seit langem


dokumentiert. Die wichtigsten basieren auf der „klassischen“ diastereomeren
Salzbildung unter Verwendung von Weinsäure67, O,O´-Dibenzoyl-weinsäure66,68,
Mandelsäure69 und seit neustem auch O,O´-Di-para-toluoyl-weinsäure70. Die
Anwendbarkeit von chromatographischen Trennverfahren in einem präparativen
Maßstab ist ebenfalls demonstriert worden (unter Verwendung der simulated moving
bed Technologie, SMB).71 Analytisch lassen sich die Enantiomere chromato-
graphisch durch HPLC an chiraler stationärer Phase (s. Kap. 3.5, S. 210), durch
Kapillarelektrophorese (CE)72 oder spektroskopisch durch 1H-NMR-Spektroskopie in
Gegenwart von paramagnetischen Verschiebungsreagenzien73 identifizieren.

GRIGG et al. gelang die erste Festphasensynthese racemischen Tramadols mittels


eines „Linker“-Systems74, welches auf Hydroxylamin basiert.75 Das in der Mannich-
Reaktion eingesetzte Iminiumsalz wurde nach einer modifizierten Variante von
SCHROTH et al.76 aus einem N-Trimethylsilylamin mit einem Chlormethylether
hergestellt (s. Abb. 1.7).
10 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

1) TMSCl, TEA
O
O CH3 2) ClCH2OEt O
N N
H OTMS CH3

57 % RMgBr

H3CO
OH
H3CO
(H3C)2N 1) MeOTf OH
2) TEA O
N
rac-7, de = 92 % CH3
Abb. 1.7: Festphasensynthese von Tramadol nach GRIGG et al.

Einen ersten Ansatz zur asymmetrischen Festphasensynthese von Tramadol


verfolgten ENDERS et al., die einen „Linker“ auf Basis der THP-Schutzgruppe von
ELLMAN77 mit einem Derivat des Auxiliars (S)-2-Methoxy-methyl-pyrrolidin (SMP)
funktionalisierten. In dieser Syntheseroute wurde die chirale Mannich-Base vom
polymeren Träger abgespalten und dann in flüssiger Phase mit dem
Grignardreagenz des 3-Bromanisols umgesetzt. Das Produkt (+)-7 konnte hierbei nur
mit einem Enantiomerenüberschuß von 38 % erhalten werden (s. Abb. 1.8).78 Da
nach dieser Methodik andere Mannich-Basen mit hoher Enantioselektivität
dargestellt wurden79, ist zu vermuten, daß enantiomerenangereicherte Mannich-
Basen unter Grignardbedingungen partiell racemisieren.

O
O O O O
O O
OCH3 OCH3
N N
H
OCH3
67 % (H3C)2N CH2I

OH 1) THF / verd. HCl O O


O
OCH3
N(CH3)2 2) Extraktion +
N
3) 3 Äq. RMgBr
N(CH3)2
(+)-7, 78 % de
38 % ee

Abb. 1.8: Asymmetrische Festphasensynthese von Tramadol nach ENDERS et al.


11

1.3 Zielsetzung

In einem Tramadol-Nachfolgeprojekt der GRÜNENTHAL GmbH sind ca. 2000


Strukturanaloga synthetisiert worden. Ziel dieses Projekts ist es, die Opioid-Wirkung
als auch die Wiederaufnahmehemmung in einem enantiomerenreinen oder achiralen
Molekül zu vereinigen. Die vorgenommenen Strukturvariationen lassen sich wie in
Abb. 1.9 dargestellt zusammenfassen.

Einführung zusätzlicher Eliminierung oder Substitution


sekundärer OH-Gruppen der tertiären OH-Gruppe
OH
O
CH3 Aromaten-
N substitution
offenkettige Strukturen H3C CH3 oder -variation

Abb. 1.9: Zusammenfassung der relevanten Strukturvariationen im Tramadol-


Nachfolgeprojekt der GRÜNENTHAL GmbH.

Für die pharmakologische und toxikologische Evaluierung dieser neuen Tramadol-


Analoga müssen, sowohl für die Entwicklung eines einzelnen Enantiomers als auch
für die eines Racemats, beide Enantiomere dargestellt werden.
Tramadol-Analoga sind als Racemate auf der Basis der Tramadol-Syntheseroute
sehr gut darzustellen. Eine alternative asymmetrische Synthese dieser Verbindungen
ist wegen der partiellen Racemisierung der Mannich-Basen bei ihrer Umsetzung mit
Grignard-Verbindungen noch nicht durchführbar. Dies macht eine Racematspaltung
notwendig, die gerade die Bereitstellung beider Enantiomere zu leisten vermag.

Bei der Racematspaltung von Tramadol und seinen Derivaten durch Kristallisation
diastereomerer Salze konnten bisher noch keine allgemeinen Richtlinien zur
Prädiktivität entwickelt werden, da schon geringe strukturelle Variationen häufig zu
einem nicht vorhersagbaren Verhalten in der Umsetzung mit den
Kristallisationsreagenzien führen. Präparative chromatographische HPLC an chiraler
stationärer Phase ist nur bedingt zur Bereitstellung kleiner Substanzmengen (1 bis
10 g) geeignet.
12 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, in Zusammenarbeit mit der GRÜNENTHAL
GmbH beide Enantiomere von Tramadol-Analoga durch eine Hydrolasen-katalysierte
kinetische Racematspaltung enantiomerenrein darzustellen. Mögliche
Funktionalitäten von Substraten auf Tramadol-Basis, die als Angriffspunkt für eine
Hydrolasen-katalysierte Reaktion dienen können, sind in Abb. 1.10 dargestellt.

Zusätzliche sekundäre tertiäre OH-Funtion


OH-Funktionen
OH phenolische OH-Funktion
O
CH3
N
offenkettige Strukturen H3C CH3
Abb. 1.10: Mögliche Angriffspunkte für eine Hydrolasen-katalysierte kinetische
Racematspaltung von Tramadol-Analoga.

Das solche Tramadol-Analoga Substrate für Hydrolasen sind, konnte bereits in


eigenen Vorarbeiten am Beispiel eines Phenylesters des O-Desmethyltramadols
(rac-15) gezeigt werden.80 Dieses Ergebnis soll als Ausgangspunkt für eine mögliche
Optimierung der Racematspaltung von Phenylestern des O-Desmethyltramadols
dienen. Es sollen ebenfalls Substrate eingesetzt werden, bei denen eine zusätzliche
Hydroxyfunktion in den Cyclohexylring eingefügt ist. Eine Vielzahl unterschiedlich
substituierter, racemischer Cyclohexanole sind bereits als Substrate in der Lipasen-
katalysierten Hydrolyse oder Acylierung untersucht worden.5-8 Diese Gruppe
cyclohexanolischer Substrate sollte somit ideal für eine Hydrolasen-katalysierte
kinetische Racematspaltung sein.

In dieser Arbeit sollen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung beide möglichen


Verfahrensweisen eingesetzt werden: die Acylierung von racemischen Alkoholen
oder Phenolen im organischen Medium und die Hydrolyse der entsprechenden Ester.
Im Hinblick auf eine Optimierung der Reaktionsführung sollte der Einfluß
verschiedener Reaktionsparameter untersucht werden. Mögliche Variablen sind:
Lösungsmittel, Acyldonoren, verschieden Additive sowie pH-Wert, Cosolventien und
die Art der Estergruppe. Im Hinblick auf eine mögliche synthetische Anwendung soll
weitergehend untersucht werden, ob sich eine solche Enzym-katalysierte Reaktion in
größeren Maßstäben realisieren läßt.
2 Theoretischer Teil

2.1 Darstellung und Charakterisierung der MPEG/PLE-


Katalysator Präparation

Es ist bekannt, das native PLE im Gegensatz zu Lipasen nur eine sehr geringe
Aktivität im organischen Medium aufweist. Für einige Lipasen ist gezeigt worden, daß
durch Zusatz von Proteinen oder amphiphilen Verbindungen wie Polyethylenglycol
sie vor Änderung ihrer Konformation und somit Verminderung ihrer katalytischen
Aktivität geschützt werden können. GAIS et al. konnten dieses Konzept auf die PLE
erweitern und zeigen, daß eine Aktivierung durch Methoxypolyethylenglycol (MPEG)
möglich ist.81,82,83 Die besten Erfolge wurden hier durch Colyophilisierung von PLE
mit MPEG erzielt, wobei eine aufwendige kovalente Modifizierung des Enzyms nicht
notwendig ist.84 Durch die gemeinsame Gefriertrocknung von PLE und MPEG
werden vermutlich nicht-kovalente Komplexe zwischen Enzym und Polymer gebildet,
die, sofern sie nicht durch Lösungsmitteleinflüsse zerstört werden, zu einer
Aktivitätssteigerung führen. Das MPEG kann weiterhin geringe Mengen Wasser, die
für die katalytische Aktivität des Enzyms benötigt werden und auf der Oberfläche des
Enzyms gebunden sind, bereitstellen.

Das Colyophilisat aus MPEG/PLE wurde nach einer bekannten Methode


dargestellt.84,85 Hierzu wurde die PLE unter Eiskühlung entsalzt und die
zurückbleibende wäßrige Enzymlösung anschließend mit MPEG5000 versetzt. Nach
vollständiger Auflösung wurde die Lösung in flüssigem Stickstoff eingefroren und
danach gefriergetrocknet. Es entstand ein weißes, flockiges und gut handhabbares
Pulver in quantitativer Ausbeute.

Die Standardaktivität von PLE wird im Rahmen dieser Arbeit durch Hydrolyse von
0.25 M Buttersäureethylester fein emulgiert in 0.1 M Phosphatpufferlösung pH 8.0
bei Raumtemperatur bestimmt.86 Um eine direkte Vergleichbarkeit von Standard-
aktivitäten der PLE oder anderen Enzymen zu erhalten, muß gewährleistet sein, daß
diese unter einheitlichen Bedingungen gemessen werden. Häufig variieren aber die
Reaktionsbedingungen bei verschiedenen Quellen. HORGAN et al. berichten
14 THEORETISCHER TEIL

beispielsweise so von einem Aktivitätstest zur Bestimmung der PLE-Aktivität, der


durch Hydrolyse von 0.0125 M Buttersäureethylester bei pH 7.5 und 38 ºC
durchgeführt wird.87

Die beobachtete spezifische Aktivität der colyophilisierten PLE/MPEG war verglichen


mit der Aktivität der PLE-Ammoniumsulfat Suspension ca. 15 % geringer. Bei der
Lyophilisierung nativer PLE wurden im Vergleich dazu Aktivitätsverluste von 30 -
50 % beobachtet.85 In dieser Arbeit wurde auch ein Colyophilisat aus
PLE/BSA/MPEG eingesetzt. Die spezifische Aktivität dieses Katalysators entsprach
der des MPEG/PLE-Colyophilisats.

Eine Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit und auch der Selektivität der


MPEG/PLE-katalysierten Transacylierung vom Wassergehalt der Reaktionslösung ist
bekannt.21,81,82 Hier zeigte sich, daß ein zu großer Wassergehalt in enzymatischen
Transacylierungen zu hydrolytischen Nebenreaktionen führen kann, in denen das
Acylierungsmittel bevorzugt verseift wird.88 Dies führt zu Aktivitätsverlusten, da bei
der enzymatischen Hydrolyse des Vinylesters die entsprechende Carbonsäure
entsteht, die den pH-Wert in der Umgebung des Enzyms drastisch reduziert und so
zur Deaktivierung des Enzyms führt. Weiterhin kann der in der Transacylierung
gebildete Ester vom Enzym hydrolysiert werden. Da in diesem Fall das bevorzugt
gebildete Enantiomer auch bevorzugt hydrolysiert werden würde, würde dies zu einer
Selektivitätserniedrigung führen. Daher ist es notwendig eingesetzte Reagentien
unter dem Aspekt Wassergehalt zu charakterisieren, um Bedingungen, die zu
hydrolytischen Nebenreaktionen in der Transacylierung führen können, zu
vermeiden.

Der Wassergehalt von MPEG/PLE ist bereits durch zwei Methoden bestimmt
worden. Nach der ersten Methode wird MPEG/PLE bei 2.5·10-4 mbar und 120 ºC für
12 Stunden getrocknet und anschließend der Wassergehalt durch den
Gewichtsverlust ermittelt. Hiernach wurde ein Wassergehalt der MPEG/PLE
(colyophilisiert bei 0.009 mbar, RT für 48 h) von 1 – 2 % bestimmt.84 Die zweite
Methode stellt die Karl-Fischer-Titration der MPEG/PLE dar. Bei der Karl-Fischer-
Titration besteht die Möglichkeit von Fehlern in der Wassergehaltsbestimmung
dadurch, daß fest gebundenes Wasser teilweise zu langsam abgegeben wird und
DARSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER MPEG/PLE-KATALYSATOR PRÄPARATION 15

daß es zu Reaktionen von funktionellen Gruppen des Proteins mit dem Reagenz
kommen kann.89 Nach dieser Methode wurde der Wassergehalt einer vergleichbaren
MPEG/PLE Probe (colyophilisiert bei 0.009 mbar, RT für 48 h) zu 1.2 % bestimmt.
Bei einer Verlängerung der Trocknungsdauer auf 72 h sank der Wassergehalt auf
0.6 %.85 Aufgrund der unterschiedlichen Temperaturen, die bei der Gefriertrocknung
unterschiedlicher Chargen herrschen, können die so erhaltenen Werte aber nur ein
grober Anhaltspunkt sein.90

Diese Ergebnisse zeigen, daß durch den MPEG/PLE Katalysator keine erheblichen
Wassermengen in die Reaktionslösung eingebracht werden. Der in dem Katalysator
vorhandene Wassergehalt wird wahrscheinlich sogar vom Protein benötigt.
16 THEORETISCHER TEIL

2.2 Darstellung der racemischen Tramadol-Analoga

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche enzymatische


Reaktionswege untersucht: die Enzym-katalysierte Transacylierung racemischer
Alkohole (s. Tabelle 2.1) und die Hydrolyse der entsprechenden racemischen Ester
(s. Tabelle 2.2). Die eingesetzten Substrate lassen sich in zwei Gruppen einteilen.
Die Erste besteht aus Substraten mit einer phenolischen OH-Gruppe und den
entsprechenden Estern, die sich durch O-Demethylierung von Tramadol und
Analogen ableiten lassen. Die zweite Gruppe besteht aus Substraten mit einer
zusätzlichen sekundären Hydroxylgruppe im Cyclohexylgerüst des Tramadols und
den dazugehörigen Estern. Aufgrund der unterschiedlichen Reaktivität der
phenolischen und der sekundären Hydroxylgruppe werden beide Substratgruppen in
den folgenden Abschnitten dieser Arbeit dementsprechend getrennt diskutiert.

Innerhalb der Zusammenarbeit mit der GRÜNENTHAL GmbH wurden Vorstufen zu den
Substraten zur Verfügung gestellt, so daß alle in dieser Arbeit eingesetzten
Verbindungen durch Standardreaktionen aus den zur Verfügung stehenden
Verbindungen zugänglich waren. Auf die einzelnen bei GRÜNENTHAL durchgeführten
Syntheseschritte zur Darstellung der bereitgestellten Substanzen wird in Kapitel 2.2.1
näher eingegangen.

Die racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung wurden in der Regel


in Form ihrer Hydrochloride, die einfach zu handhaben sind, zur Verfügung gestellt.
Lediglich das Phenol rac-8 wurde in Form des Hydrochlorids der entsprechenden
O-methylierten Verbindung Tramadol (rac-7) bereitgestellt (Tabelle 2.1). Alle
bereitgestellten Hydrochloride waren über Monate bei Raumtemperatur lagerstabil.

Zur Freisetzung der racemischen Basen aus ihren Hydrochloriden werden diese in
einer Emulsion aus dest. Wasser und Dichlormethan suspendiert. Nach Zugabe von
äquivalenten Mengen Natronlauge können die freien Basen nahezu quantitativ (97 -
98 % Ausbeute) extrahiert werden (s. AAV 1, S. 176).91
DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 17

Tabelle 2.1: Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen


Transacylierung

Substrat zur enzymatische Transacylierung Darstellung


(±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
1. Freisetzen der Base rac-7
cyclohexanol (rac-8):
aus dem Hydrochlorid.
OH
2. O-Demethylierung von rac-7
OH
mit DiBAl-H.
Me2N

(±)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-
propyl)-phenol (rac-11):
Freisetzen der Base aus
OH
dem Hydrochlorid.
OH

Me2N

(±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexan-1,3-diol (rac-12):
Freisetzen der Base aus
OH
dem Hydrochlorid.
OMe
HO
Me2N

(±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexan-1,3-diol (rac-13):
Freisetzen der Base aus
OH OH
dem Hydrochlorid.
OMe

Me2N

(±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexan-1,4-diol (rac-14):
Freisetzen der Base aus
OH
dem Hydrochlorid.
OMe
HO
Me2N

Das phenolische Substrat rac-8 und das zur Synthese des Esters rac-21 benötigte
3-(6-Dimethylamino-methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-20) wurden aus
rac-7 und rac-13 dargestellt, in denen die phenolische Hydroxylgruppe noch als
Methylether vorliegt. Eine bekannte Methode zur Etherspaltung bei Verbindungen
18 THEORETISCHER TEIL

des Tramadoltyps, die starke Basen wie Natrium- oder Kaliumhydrid in Gegenwart
von Thiophenol und Diethylenglycol verwendet92, ergibt jedoch O-Desmethyltramadol
(rac-8) aus rac-7 nur in unbefriedigenden Ausbeuten.91 Zur Etablierung der
phenolischen Hydroxylgruppe wurden daher die Methylether rac-7 und rac-13 durch
Reaktion mit Diisobutylaluminiumhydrid (DiBAl-H) in Toluol unter Rückfluß in guten
bis sehr guten Ausbeuten (88 - 93 %) demethyliert.91 Eine Dealkylierung am
Stickstoff war in keinem Fall zu beobachten.

Die Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse erfolgte


durch Acylierung der entsprechenden Phenole und Alkohole unter den angegeben
Reaktionsbedingungen (Tabelle 2.2).

Tabelle 2.2: Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse

Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung

(±)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15): Pyridin katalysierte

OH Veresterung von 8 mit


O Pr Buttersäureanhydrid.
Me2N O

(±)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16): Pyridin katalysierte

OH Veresterung von 8 mit


O Me Essigsäureanhydrid.
Me2N O

(±)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy-
1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17): Pyridin katalysierte

OH Veresterung von 11 mit


O Pr Buttersäureanhydrid.
Me2N O
DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 19

Fortsetzung Tabelle 2.2:

Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung

(±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-
Darstellung des Alkoholats
3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18):
aus 12⋅HCl mit KOtBu und
O OH
OMe Acylierung mit Buttersäure-
Pr O
chlorid bei RT.
Me2N

(±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-
3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19): Darstellung des Alkoholats
O aus 13 mit KOtBu und
Acylierung mit Buttersäure-
Pr O OH
OMe chlorid bei –10 ºC.

Me2N

(±)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl- 1. O-Demethylierung von 13


1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21): mit DiBAl-H zum Phenol 20.
2. Darstellung des Phenolats
OH OH
O Pr aus 20 mit NaHCO3-Lsg.
und Veresterung mit Butter-
Me2N O
säureanhydrid.

(±)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
Darstellung des Alkoholats
4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22):
aus 14⋅HCl mit KOtBu und
OH
OMe Acylierung mit Buttersäure-
Pr O chlorid bei RT.
Me2N
O
(±)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
Darstellung des Alkoholats
4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23):
aus 14⋅HCl mit KOtBu und
OH
OMe Acylierung mit Hexansäure-
C5H11 O chlorid bei RT.
Me2N
O
20 THEORETISCHER TEIL

Fortsetzung Tabelle 2.2:

Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung

(±)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
Darstellung des Alkoholats
4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24):
aus 14⋅HCl mit KOtBu und
OH
OMe Acylierung mit Essigsäure-
Me O chlorid bei RT.
Me2N
O
(±)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylamino-
methyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester
Pyridin katalysierte
(rac-25):
O O Veresterung von 13 mit
Pr O O Pr Buttersäureanhydrid.
OMe

Me2N

Allgemein verliefen die Veresterungen mit guten Ausbeuten. Als Nebenreaktion trat
in manchen Fällen in einem geringen Ausmaß eine unerwünschte Acylierung der
tertiären Hydroxylgruppe auf. Lediglich bei der Veresterung von rac-13 mit
Buttersäurechlorid in Gegenwart von Kalium-tert-butylat bei Raumtemperatur ist
diese Nebenreaktion so groß, daß als Hauptprodukt der Diester rac-25 nahezu
quantitativ (96 % Ausbeute) anfällt. Ein Absenken der Reaktionstemperatur auf
-10 ºC liefert aber neben nicht umgesetztem Edukt schon bevorzugt den Monoester
der sekundären Hydroxylgruppe, rac-19, in 58 %iger Ausbeute. Ebenfalls nicht zu
vernachlässigen war die Bildung eines Diesters bei der Darstellung von rac-24. In
diesem Fall ist nach chromatographischer Aufreinigung eine Mischung von
Monoacetat und Diacetat im Verhältnis 4 : 1 (Verhältnis der Signale der Protonen der
Methoxygruppe im 1H-NMR) erhalten worden, die sich nicht weiter auftrennen ließ
und somit in weiteren Reaktionen als Mischung eingesetzt worden ist. Bei einer
erneuten Synthese von rac-24, sollte daher versucht werden die
Reaktionstemperatur herabzusenken, um einer Bildung des Diesters entgegen-
zuwirken.
DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 21

Zur Synthese des Phenylesters rac-21, wurde eine Methode zur selektiven
Acylierung der phenolischen OH-Gruppe in Anwesenheit einer sekundären benötigt.
Bei einer zunächst versuchten Acylierung von rac-20 mit einem Säurechlorid unter
Phasentransferkatalyse mit Tetrabutylammoniumbromid, wie von ILLI beschrieben93,
konnte lediglich das eingesetzte Edukt zurückgewonnen werden. RICE et al. gelang
bei Untersuchungen zu substituierten 3,14-Dihydroxy-17-methyl-4,5α-epoxy-
morphinanen die selektive Acylierung einer phenolischen OH-Gruppe in Anwesenheit
sekundärer Hydroxylgruppen nach einer modifizierten Methode von WELSH94 et al.95
Analog zu der von RICE beschriebenen Prozedur wurde rac-20 mit 10 Äquivalenten
Buttersäureanhydrid in Gegenwart eines Überschusses an wäßriger NaHCO3-
Lösung in sehr guter Ausbeute (93 %) zu rac-21 umgesetzt.

Bevor die in Tabelle 2.2 vorgestellten Substrate in eine Enzym-katalysierte Hydrolyse


eingesetzt wurden, wurde ihre Hydrolyse-Stabilität unter den verwendeten
Reaktionsbedingungen ohne Zugabe des Katalysators überprüft, um eventuelle nicht
Enzym-katalysierte Reaktionen auszuschließen. Eine nicht-enzymatische
Autohydrolyse würde zu racemischen Produkten führen, die, sollten sie während der
Enzym-katalysierten Reaktion ebenfalls entstehen, einen niedrigeren ee-Wert des
Produkts und damit eine niedrigere Selektivität der enzymatischen Katalyse
vortäuschen würden. Eine Autohydrolyse-Stabilität ist daher eine wichtige
Voraussetzung der zu verwendenden Substrate. Alle in Tabelle 2.2 gezeigten Ester
der Buttersäure waren unter den Reaktionsbedingungen im Bereich von pH 7.0 bis
pH 8.0 stabil gegen eine nicht Enzym-katalysierte Hydrolyse.
Dahingegen zeigten rac-16 und rac-24, beides Ester der Essigsäure, nur eine
unbefriedigende Autohydrolysestabilität. Die Stabilität von rac-16 ist bei
verschiedenen pH-Werten überprüft worden (Tabelle 2.3).

Tabelle 2.3: Überprüfung der Hydrolysestabilität von rac-16 in Phosphatpuffer-


Lösung in Anwesenheit von 10 % tert-Butanol.

pH-Wert Reaktionszeit Hydrolyseprodukt (GC)

7.0 2h 0.1 % rac-8


8.0 2h 1.2 % rac-8
8.0 16 h 15.0 % rac-8
22 THEORETISCHER TEIL

Es zeigte sich, daß bei pH 7.0 innerhalb von 2 Stunden noch tolerierbare Mengen an
Hydrolyseprodukt detektiert worden sind. Bei pH 8.0 wurde allerdings eine merkliche
Autohydrolyse von bereits 1 % nach 2 Stunden und 15 % nach 16 Stunden
beobachtet. Eine Enzym-katalysierte Reaktion erscheint bei diesem pH-Wert wenig
sinnvoll.
Die Hydrolysestabilität des Esters rac-24 wurde in wäßriger Phosphatpufferlösung
(pH 7.5) mit Aceton (16 %Vol) als Cosolvens überprüft. Nach vier Tagen bei
Raumtemperatur konnten 2 % Hydrolyseprodukt detektiert werden. Da der ein-
gesetzte Ester rac-24 noch das Diacetat rac-14 als nicht zu entfernende
Verunreinigung enthält, wurde auf eine detaillierte Untersuchung zur Hydrolyse-
beständigkeit, wie beispielsweise bei verschiedenen pH-Werten verzichtet.

Um die Ansatzgrößen der enzymatischen Transacylierungen möglichst klein halten


zu können und um schnell zuverlässige Daten auch in der enzymatischen Hydrolyse
zu erhalten, wurde die gesamte Analytik der Reaktionsgemische auf gas- und
flüssigchromatographische Analyse aufgebaut. Zur Validierung von Analyse-
bedingungen wurden zunächst separat die reinen racemischen Substrate und
Produkte und danach dieselben als Mischung untersucht. Auf diese Art war eine
eindeutige Zuordnung der Verbindungen in den Chromatogrammen möglich (Abb.
2.1). Um ebenfalls eine zuverlässige, schnelle sowie möglichst einfache Bestimmung
der Enantiomerenverhältnisse von Edukten und Produkten bei den enzymatischen
Reaktionen zu gewährleisten, wurden Mischungen der racemischen Edukte mit den
jeweiligen racemischen Produkten durch Gas- oder Flüssigchromatographie an
chiralen stationären Phasen getrennt. Anschließend wurden unter den erhaltenen
Bedingungen zur eindeutigen Identifizierung der Verbindungen nochmals die
racemische Edukte und Produkte separat analysiert. Bis auf wenige, an
entsprechender Stelle explizit genannte Verbindungen, konnten sowohl die Signale
beider Enantiomere des Substrats als auch des Produkts in einem Chromatogramm
basisliniengetrennt erhalten werden (Abb. 2.2).
DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 23

OH
OMe
Pr O
Me2N
O
rac-22

OH
OMe
HO
Me2N

rac-14

Abb. 2.1: Gaschromatographische Trennung von (±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-


methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) und (±)-Buttersäure-3-
dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl Ester
(rac-22) an einer CP-Sil-8-Säule.

Me2N OH
OMe
O
O
Pr (−)-22
OH
OMe
Pr O
Me2N
Me2N OH
O
(+)-22 OMe

HO
(−)-14
OH
OMe
HO
Me2N
(+)-14

Abb. 2.2: HPLC Trennung von (−)- und (+)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-


hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl Ester ((−)-22, (+)-22) sowie von
(+)- und (−)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-
1,4-diol ((+)-14, (−)-14) an einer OD-H-Säule mit chiraler stationärer
Phase.

Dies ermöglichte es, daß Proben direkt aus der Reaktionsmischung, nach
Abtrennung der hochmolekularen Proteine durch Filtration, ohne weitere
24 THEORETISCHER TEIL

Aufarbeitung analysiert werden konnten. Mittels dieser effektiven Analytik ließen sich
detaillierte Informationen über den gesamten Reaktionsverlauf einer enzymatischen
Reaktion unter Einsatz geringer Substanz- und vor allem Enzymmengen gewinnen.

2.2.1 Synthesewege der von GRÜNENTHAL bereitgestellten Substanzen96

Die von der GRÜNENTHAL GmbH verwendeten Synthesewege zur Darstellung der
cyclohexanoiden Ausgangsmaterialien rac-14⋅HCl97, rac-12⋅HCl98 und rac-13⋅HCl
basieren auf der in Kap. 1.2 beschriebenen Tramadol-Syntheseroute, so daß viele
Erfahrungen aus diesem Produktionsprozeß in die Reaktionen eingebracht werden
konnten.

O CH3 1) BrMg OMe


O
N Cl
H 3C N(Me)2
O THF
O O H 3C Cl O O 2) Trennung der
Diastereomeren
MeCN 3) H

OH OH
OMe NaBH4 OMe
HO
O Me2N Me2N
rac-27 rac-14
Abb. 2.3: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-14.

Zur Einführung der neuen sekundären Hydroxylgruppe wurde anstelle von


Cyclohexanon ein als Monoketal geschütztes 1,4- bzw. 1,3-Diketon in die Mannich-
Reaktion eingesetzt (Abb. 2.3 und Abb. 2.4). Aus der Mannich-Reaktion des
3,3-Dimethyl-1,5-dioxa-spiro[5.5]undecan-8-on (26, Abb. 2.4) wurde nur das
gewünschte 9-Alkylierungsprodukt erhalten. Das unerwünschte 7-Alkylierungs-
produkt wurde wahrscheinlich aufgrund von sterischer Hinderung nicht gebildet. Die
erhaltenen jeweiligen Mannich-Basen wurden danach in einer Grignard-Reaktion mit
dem Grignard-Reagenz des 3-Bromanisols umgesetzt. Es wurden in beiden Fällen
cis /trans Mischungen erhalten, aus denen die gewünschten cis-Isomere abgetrennt
wurden und nach Abspaltung der Ketal-Schutzgruppen mit Mineralsäure die Ketone
DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 25

rac-27 und rac-28 erhalten wurden. Die Ketone rac-27 und rac-28 wurden
anschließend mit Natriumborhydrid zu den gewünschten Alkoholen reduziert. Im
Falle der Reduktion des Ketons rac-27 konnte unter optimierten Bedingungen das
gewünschte (1RS,2RS,4SR)-konfigurierte 1,4-Diol rac-14 erhalten werden. Eine
Bildung des (1RS,2RS,4RS)-konfigurierten Epimers konnte nicht beobachtet werden.
Im Falle der Reduktion des Ketons rac-28 wurde eine Epimerenmischung aus
(1RS,3SR,6RS)-konfigurierten 1,3-Diol rac-12 und dem (1RS,3RS,6RS)-

konfigurierten Diol rac-13 erhalten, die anschließend getrennt worden sind. Auf
diesem Weg war es möglich beide in dieser Arbeit eingesetzte Epimere aus einer
Reaktion zu erhalten (Abb. 2.4).

1) CH3
O
H 2C N Cl 1) Trennung der
O OH
CH3 Diastereomeren
O OMe
2) 2) H Me2N
O
BrMg OMe
26 rac-28

OH OH OH
NaBH4 OMe OMe
HO +
Me2N Me2N
32 % 45 %
rac-12 rac-13
Abb. 2.4: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-12 und
rac-13.
26 THEORETISCHER TEIL

2.3 Vorbemerkungen zu Enzym-Katalyse

2.3.1 Kinetische Racematspaltungen

Der Reaktionsmechanismus von Lipasen und Esterasen entspricht weitgehend dem


von Serinproteasen.99 Typisch für diese Enzyme ist eine katalytische Triade im
aktiven Zentrum, die aus in dichter räumlicher Nähe stehendem Serin (Ser), Histidin
(His), Asparaginsäure (Asp) beziehungsweise Glutaminsäure (Glu) und verschieden
stabilisierenden Aminosäureresten gebildet wird. Darüberhinausgehend zeigen alle
bisher untersuchten Lipasen eine ähnliche dreidimensionale Struktur, das
α/β-Hydrolasen Faltungsmotiv100,101 dessen zentrales Element acht nahezu parallele
β-Faltblätter sind, die von α-Helices an beiden Seiten umgeben werden (Abb. 2.5).102

Abb. 2.5: α/β-Hydrolasen Faltungsmotiv aus


β-Faltblättern (Pfeile 1 bis 8) und α-Helices
(Zylinder A bis F) mit katalytischer Triade
und einem Bereich zur Stabilisierung von
Oxyanionen.

Im Katalysezyklus (Abb. 2.6) wird der primär gebildete Enzym-Substrat-Komplex (A)


nukleophil vom aktiven Serinrest der katalytischen Triade angegriffen. Im
entscheidenden Katalyseschritt bildet sich über einen tetraedrischen
Übergangszustand (B) eine kovalente Bindung zwischen dem Serinrest und dem
Acylrest des Substrates zum Acylenzym (C). Der negativ geladene
Übergangszustand (B) wird durch das Enzym stabilisiert (Oxyanion-Bereich in Abb.
VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 27

2.5). Die Bildung des Acylenzyms ist eine Gleichgewichtsreaktion und stellt eine
Umesterung zwischen dem Enzym und dem eingesetzten Ester dar.

(A) (B) (C)


Ser Ser Ser

O O O O
H R1 OR2
R1 OR2 R1 O + R2OH

O
Ser Ser Ser

O O O O
R1 OR3 H
R1 O + R3OH R1 OR3

O
(D) (E) (F)
Abb. 2.6: Katalysemechanismus bei Hydrolasen (ping-pong Mechanismus).

Entsprechend reagiert das Acylenzym in einer weiten Umesterung mit einem


Nukleophil, wie einem Alkohol (Transacylierung) oder Wasser (Hydrolyse), zu dem
freien Enzym und dem Produkt einem Ester (Transacylierung) oder Säure
(Hydrolyse) weiter (F). Kinetisch wird diese Reaktionsfolge als ping-pong
Mechanismus bezeichnet.103 In den meisten Reaktionen ist die Deacylierung des
Acylenzyms der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Katalyse.6

Die Hydrolasen-katalysierten Reaktionen lassen sich in zwei prinzipielle


Reaktionstypen unter Beteiligung chiraler Moleküle einteilen: Desymmetrisierung und
kinetische Racematspaltung (s. Abb. 2.7).
28 THEORETISCHER TEIL

Kinetische Dynamische-kinetische
Racematspaltung Racematspaltung Desymmetrisierung
schnell schnell
R P R P schnell P
kR kR

+ + krac + A +

langsam langsam
S Q S Q langsam Q
kS kS
Produkt: 50 % P + 50 % S Produkt: 100 % P Produkt: 100 % P

R, S: Enantiomere des Substrats


P, Q: Enantiomere des Produkts
kR, kS: individuelle Geschwindigkeitskonstanten (kR >> kS)
krac: Geschwindigkeitskonstante der Racemisierung (krac ≥ kR)

Abb. 2.7: Prinzipien der Racematspaltung und Desymmetrisierung.

In Desymmetrisierungs-Reaktionen104 (s. Abb. 2.7) werden prochirale Substrate


eingesetzt, wie beispielsweise meso-konfigurierte Diester. Diese können entweder
zum Produkt P oder seinem Enantiomer Q umgesetzt werden. Das Verhältnis der
Produkte wird durch die Reaktionsgeschwindigkeiten beider Reaktionen bestimmt.
Es ist somit unabhängig vom Umsatz und wird nur durch den Grad der enantiotopen-
Differenzierung des Enzyms beeinflußt. Daher ist es möglich, Produkte sowohl in
hohen Ausbeuten als auch mit hohen Enantiomerenüberschüssen zu isolieren.
In kinetischen Racematspaltungen (s. Abb. 2.7) dagegen wird ein racemisches
Substrat eingesetzt und in einer Enantiomer-differenzierenden Reaktion vom Enzym
umgesetzt. In dem Idealfall einer hohen Selektivität wird das eine Enantiomer R des
Substrats vollständig umgesetzt und das andere Enantiomer S nicht. In diesem Fall
kann sowohl das nicht-reagierende Enantiomer des Substrats (S) und das
Enantiomer des Produkts (P) mit Ausbeuten bis zu 50 % isoliert werden. Der
entscheidende Nachteil einer kinetischen Racematspaltung ist, daß die theoretisch
mögliche Ausbeute jedes Enantiomers 50 % nicht überschreitet. Zudem ist eine
Trennung des Reaktionsprodukts von dem nicht umgesetzten Substrat notwendig. In
der Mehrzahl der Prozesse ist nur eines der Reaktionsprodukte gewünscht, so daß
das andere racemisiert oder in einer enantiokonvergenten Weise umgesetzt werden
muß, was einen Mehraufwand bedeutet. Wenn möglich wird daher in solchen Fällen
die kinetische Racematspaltung um einen Schritt, eine schnelle in-situ
VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 29

Racemisierung des Substrates, erweitert.105 In einer solchen dynamischen-


kinetischen Racematspaltung (s. Abb. 2.7, S. 28) kann das Produkt P ebenfalls
enantiomerenrein mit 100 % Ausbeute erhalten werden. In der Aufgabenstellung
dieser Arbeit ist aber gerade die Darstellung beider Enantiomere gewünscht, so daß
das Anfallen beider enantiomerer Reaktionsprodukte, wenn auch in Form eines
Esters und eines Alkohols, als ein Vorteil der kinetischen Racematspaltung für diese
Arbeit gewertet werden kann.

2.3.1.1 Der E-Wert

In einer kinetischen Racematspaltung ist der Grad der Enantiomerenanreicherung


von Substrat und Produkt abhängig vom Umsatz. Daher ist ein Vergleich von
kinetischen Racematspaltungen hinsichtlicht ihrer Selektivität nur bei gleichem
Umsatz sinnvoll. Um eine allgemeinere Vergleichbarkeit zu erreichen, ist von CHEN
106,107
und SIH der dimensionslose Selektivitätsparameter E eingeführt worden. Der
E-Wert einer Reaktion entspricht dem Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten
der Reaktionen der beiden Enantiomere (E = kR / kS) und ist unabhängig von
Substratkonzentration und Umsatz. Auf die Voraussetzungen bei der Definition des
E-Werts und deren Gültigkeit wird auf Seite 31 näher eingegangen. Bei bekanntem
E-Wert lassen sich somit die ee-Werte von Substrat und Produkt in Abhängigkeit
vom Umsatz bestimmen und graphisch auftragen (s. Abb. 2.8).

Abb. 2.8: Abhängigkeit der ee-Werte von Substraten (S) und Produkten (P) bei drei
kinetischen Racematspaltungen mit verschieden Selektivitäten.
30 THEORETISCHER TEIL

Aus Abb. 2.8 geht hervor, daß das Substrat (S) bei einer kinetischen Racemat-
spaltung prinzipiell immer bei hinreichend großen Umsätzen auf Kosten der
Ausbeute enantiomerenrein erhalten werden kann. Das Produkt (P) hingegen kann
nur bei sehr selektiven Reaktionen mit E-Werten größer als 100 nahezu
enantiomerenrein erhalten werden.
Zur Bestimmung von E müssen zwei der drei Variablen: Umsatz, ee-Wert des
Substrates und ee-Wert des Produkts bekannt sein und in eine der aufgeführten
Formeln eingesetzt werden6,107,108:

ln [1− c(1+ eeP )]


Formel 2.1: E= , für c < 50 %
ln [1 − c(1− eeP )]

ln [(1− c)(1− ee S )]
Formel 2.2: E= , für c > 50 %
ln [(1− c)(1+ ee S )]

 1− ee S   ee P (1− ee S ) 
ln   ln  (ee + ee ) 
1 + (eeS /ee P )   S 
E=  =
P
Formel 2.3:
 1 + ee S   ee P (1+ ee S ) 
ln   ln  
1 + (eeS /ee P )   ee P + ee S ) 

(mit: c = Umsatz, ee P = ee-Wert des Produkts, ee S = ee-Wert des Substrats)

KAZLAUSKAS et al. haben eine schnelle photospektroskopische Methode zur


Bestimmung des E-Werts entwickelt, die auf der Umsetzung der einzelnen
Enantiomeren basiert (“Quick E-Wert“).109 Häufig stehen gerade diese aber nicht zur
Verfügung.
E-Werte sind für sehr kleine und sehr große Umsätze mit einem großen Fehler
behaftet. Entweder läßt sich c nur mit beschränkter Genauigkeit bestimmen oder die
gefundenen ee-Werte sind sehr groß, so daß relativ kleine Fehler bei Bestimmungen
von c, eeS oder eeP einen großen Einfluß auf den berechneten E-Wert haben, da sie
logarithmisch in die Berechnung eingehen.6,21,108,110 Die Angabe von E-Werten
größer als 100 ist aus demselben Grund wenig sinnvoll, da hier ebenfalls der Einfluß
kleiner Meßfehler sehr groß ist.6,108,110,111 In einigen Fällen können sogar E-Werte um
die 50 nur mit einer Genauigkeit von ± 10 angegeben werden (Angabe als E ≈ 50).6

Häufig ist in der Praxis die Bestimmung von Enantiomerenüberschüssen genauer als
die Bestimmung des Umsatzes, bei der das Verhältnis zweier verschiedener Stoffe
VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 31

wie Ester und Alkohol bestimmt werden muß, in diesen Fällen ist zur Berechnung
von E Formel 2.3 die geeignetste.6 Im Rahmen dieser Arbeit wurde generell darauf
verzichtet E-Werte basierend auf Umsatzbestimmungen zu berechnen. Vielmehr
wurden alle E-Werte mittels Enantiomerenüberschüssen des Substrats und des
Produkts nach Formel 2.3 berechnet.

Bei der Definition von E wird vorausgesetzt, daß eine Michaelis-Menten Kinetik als
Reaktionsmechanismus vorliegt, daß die Reaktion irreversibel ist, daß keine
Produktinhibierung vorliegt, daß nur eine Katalysatorspezies vorliegt und daß die
Reaktionslösung homogen ist.6,106,106,112 Auf diese Voraussetzungen soll im
folgenden näher eingegangen werden:

a) Reaktionsmechanismus nach Michaelis-Menten:


Es konnte gezeigt werden, daß Lipasen katalysierte Reaktionen nach einem ping-
pong-bi-bi-Mechanismus verlaufen.113 Kinetische Racematspaltungen nach einem bi-
bi-Mechanismus verlaufen allgemein unter Involvierung eines nicht-chiralen und
eines chiralen Substrates sowie Produktes.103 CHEN et al. setzen aber für ihre
Herleitung des E-Werts eine Michaelis-Menten Kinetik nach einem uni-uni-
Mechanismus voraus und betrachten formal nicht die Involvierung mehrerer
Substrate und Produkte. Von STRAATHOF et al. werden unter Berücksichtigung
mehrerer möglicher bi-bi-Meachanismen bis zu acht verschiedene Formeln zur
Berechung von E vorgeschlagen.103 Diese haben sich jedoch nicht durchgesetzt, da
sich vielfach die häufig nur geringen Abweichungen von einem uni-uni-Mechanismus
erst bei hohen Umsätzen beobachten lassen.103 Für Esterhydrolysen im wäßrigen
Medium ist zudem die Näherung einer Michaelis-Menten Kinetik meist gut erfüllt.114

b) Reversibilität:
Allgemein wird davon ausgegangen, daß enzymatische Hydrolysen aufgrund der
hohen Konzentration des Lösungsmittels Wasser (55.5 M) irreversibel verlaufen. Bei
enzymatischen Transacylierungen unter Einsatz von Enolestern mit hinreichend
hohem Überschuß des Acyldonors und geringen Wassergehalten spielt eine
Rückreaktion des gebildeten Esters ebenfalls keine Rolle.107 Der gebildete Ester
kann prinzipiell allerdings als Acyldondor fungieren, wodurch der zweite Teilschritt
der Transacylierung reversibel wird.115 Ebenfalls können geringe Mengen Wasser zu
32 THEORETISCHER TEIL

Hydrolysereaktionen führen.116 Für Gleichgewichtsreaktionen wurde von CHEN und


SIH ebenfalls eine Methode zur Bestimmung von E unter Kenntnis der
Gleichgewichtskonstanten K entwickelt (Formel 2.4).107 Wie aus Abb. 2.9 hervorgeht,
fallen bei reversiblen, kinetischen Racematspaltungen die ee-Werte des Substrats
bei Umsätzen über 50 % deutlich ab. Nicht umgesetztes Substrat kann also im Falle
einer reversiblen Reaktion nicht mehr enantiomerenrein erhalten werden. Hohe
ee-Werte des Substrats bei großen Umsätzen deuten hingegen auf eine extreme
Gleichgewichtslage (K ≈ 0, Fall a in Abb. 2.9) hin.

ln [1 − (1 + K)(c + ee S (1 − c))] ln [1 - (1 + K) c (1 + eeP )]


Formel 2.4: E= =
ln [1 − (1 + K)(c − ee S (1 − c))] ln [1 - (1 + K) c (1 - eeP )]

(mit: c = Umsatz, ee P = ee-Wert des Produkts, ee S = ee-Wert des Substrats)

Abb. 2.9: Abhängigkeit der ee-Werte a) des Produkts und b) des Substrats bei
reversiblen kinetischen Racematspaltungen mit E = 100 für verschiedene
Gleichgewichtskonstanten K (K = a: 0, b: 0.1, c: 0.5, d: 1, e: 5).

ANTHONSEN et al. haben einen einfachen Weg zur Bestimmung E und K entwickelt,
indem sie in einem regressiven mathematischen Verfahren über eine Serie von eeS-
und eeP-Werten eine Fit E-Wert Funktion berechnen.117

c) Substrat- oder Produktinhibierung


Bei dem Vorliegen von Produktinhibierung kann sich der E-Wert über den
Reaktionsverlauf ändern.118,119 Um den E-Wert zu beeinflussen, muß allerdings eine
enantioselektive Inhibierung vorliegen118, die sogar eine Rückreaktion des Produkts
VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 33

begünstigen kann119. In verdünnten Lösungen sind diese Effekte jedoch als gering
einzuschätzen.112b)

d) Reinheit des Biokatalysators:


Besteht ein Enzym aus verschieden Isoenzymen oder enthält ein Enzym
Verunreinigungen anderer Enzyme, wie häufig in kommerziellen nur roh
aufgereinigten Präparationen, so stellt der E-Wert ein gewichtetes Mittel aller
Biokatalysatoren, die mit dem Substrat reagieren, dar. KARNERVA et al. haben
beispielsweise unterschiedliche Selektivitäten für Isoenzyme der Candida rugosa
Lipase in Hydrolysereaktionen beobachtet.120 Auch für die Schweineleber-Esterase
werden in verschiedenen Publikationen unterschiedliche Selektivitäten der einzelnen
Isoenzyme postuliert.130,131 Im Falle der Candida antarctica Lipase sind zwei
Isoenzyme bekannt, die signifikante unterschiedliche katalytische Eigenschaften auf-
weisen. Ausgewählte physikalische Eigenschaften der Isoenzyme CAL-A und CAL-B,
welche die Unterschiedlichkeit beider Katalysatoren verdeutlichen, sind in Tabelle 2.4
aufgeführt.121

Tabelle 2.4: Charakteristika der Isoenzyme der Candida antarctica Lipase

CAL-A CAL-B

Molekulargewicht122 45 kD 33 kD

Isoelektrischer Punkt (pI)122 7.5 6.0

pH-Optimum123 7 7

spezifische Aktivität123 420 LU/mg 435 LU/mg

pH-Stabilität122 6-9 7-10

Grenzflächenaktivierung123 schwach nein


34 THEORETISCHER TEIL

Ein allgemein deutliches Anzeichen für ein Abweichen der angenommenen


Voraussetzungen ist eine Änderung des E-Werts über den Verlauf der Reaktion.124
Auch liefert ein Vergleich des experimentell bestimmten Umsatzes mit dem nach
Formel 2.5 berechneten Umsatz114 Hinweise auf die Konsistenz der durchgeführten
Berechnungen.

ee S
Formel 2.5: Umsatz ber =
ee S + ee P

Im allgemeinen werden für enzymatische Reaktionen E-Werte nach CHEN und SIH
zur übergreifenden Vergleichbarkeit angegeben, ohne explizit anzugeben, ob die
kinetischen Voraussetzungen erfüllt sind. Von STRAATHOF et al. wird sogar generell
die Gültigkeit der Formel 2.1 und Formel 2.2 für Reaktionen nach einem bi-bi-
Mechanismus bestritten.103 Vor diesem Hintergrund sollen im Rahmen dieser Arbeit
verschiedene enzymatische Hydrolysen und Transacylierungen möglichst einfach
untereinander verglichen werden. Obwohl nicht alle Voraussetzung für die formale
Gültigkeit der Formeln zur Berechnung von E erfüllt sind, werden in dieser Arbeit
E-Werte nach CHEN und SIH zu einer einfachen und übersichtlichen Vergleichbarkeit
angegeben, da eine Angabe von ee-Werten über den Umsatz wenig sinnvoll
erscheint und außerdem keine Untersuchungen zur Kinetik durchgeführt werden
sollen.

Für präparative Zwecke interessant und somit das angestrebte Ziel in dieser Arbeit
sind kinetische Racematspaltungen mit einem E-Wert größer 20, denn sie können in
der Synthese genutzt werden (Abb. 2.10).6,110 Aus den Kurven für die Abhängigkeit
der ee-Werte vom Umsatz kann man bestimmen, bei welchem Umsatz eine Reaktion
abzubrechen ist, um Produkt oder Substrat mit möglichst hohem Enanantiomeren-
überschuß und möglichst großer Ausbeute zu erhalten (Abb. 2.10).
VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 35

Abb. 2.10: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (S) und Produkt (P) in einer
kinetischen Racematspaltung bei einer Selektivität von E = 21.
Eingezeichnet ist ein Umsatz von 63 %, ab dem das Substrat (S)
enantiomerenrein vorliegt.

2.3.2 Auswahl geeigneter Enzyme und Reaktionsmedien

Hydrolasen sind in großer Anzahl kommerziell erhältlich.4 Allerdings werden in der


organische Synthese davon vorwiegend nur einige wenige, empirisch ausgewählte
eingesetzt.5,6,21 Diese Enzyme sind besonders gut untersucht und über einen langen
Zeitraum in ähnlicher Präparation und Qualität kommerziell verfügbar. Im einzelnen
sind diese Enzyme in Tabelle 2.5 aufgeführt.
36 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.5: Wichtige Hydrolasen mit ausgewählten Eigenschaften

Schweinepankreas- Molekulargewicht: 50 kDa


lipase (PPL) Substrate: sekundäre Alkohole, primäre Alkohole

Burkholderia ehemals: Pseudomonas cepacia Lipase (PCL)


cepacia Lipase Molekulargewicht: 33 kDa
(BCL) Substrate: sekundäre Alkohole, primäre Amine
Protein kann rekombinant aus Pseudomonas Spezien
gewonnen werden.

Candida rugosa Molekulargewicht: 63 kDa


Lipase (CRL) Substrate: große cyclische, sekundäre Alkohole
Präparationen können ein bis fünf Isoenzyme 120,125, die in
Reaktivität und Selektivität variieren, aber die gleiche
Enantiopräferenz120 zeigen, enthalten.

Lipase B aus Molekulargewicht: 33 kDa


Candida antarctica Substrate: kleine sekundäre Alkohole, primäre Amine
(CAL-B) Protein wird rekombinant aus Aspergillus oryzae
produziert.126,127

Schweineleber- Molekulargewicht: 165 kDa (Trimer)128


Esterase (PLE) Substrate: Carbonsäuren, sterisch gehinderte Alkohole
PLE ist eine Mischung mehrerer Isoenzyme mit komplexer
Mikroheterogenität.128,129 Die Isoenzyme können signifikante
Unterschiede in Aktivität und Selektivität, sowie in ihrer
Enantiopräferenz zeigen.130,131 Die Gewinnung einer
rekombinanten, isoenzymeinheitlichen PLE ist seit kurzem
bekannt.131a),b)

Angabe der bevorzugten Substrate nach NAEMURA et al.132,6


6
Angabe des Molekulargewichts, außer für PLE, nach BORNSCHEUER und KAZLAUSKAS.

An das Enzym eines möglichen technischen Prozesses zur Darstellung eines


Tramadol-Analogons, der einen enzymatischen Zwischenschritt beinhaltet, werden
folgende Ansprüche gestellt: es katalysiert die gegebene Reaktion mit hoher Aktivität
und Selektivität, es ist unter den Reaktionsbedingungen stabil und es ist möglichst
VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 37

lange in gleicher Qualität und Präparation zu einem annehmbaren Preis kommerziell


verfügbar. Dies trifft im besonderen auf die obengenannten Enzyme zu, die daher in
dieser Arbeit besondere Beachtung finden.

Es ist wohlbekannt, daß Lipasen sowohl in wässrigen als auch in unpolaren Medien
katalytisch aktiv sind und eine breite Palette auch nicht natürlicher Substrate
akzeptieren. Dies liegt an der Flexibilität der Proteinkette, die eine Vielzahl von
Konformationen annehmen kann, um Substrate aufzunehmen, weshalb Lipasen
auch als „induced fit“ Enzyme bezeichnet werden. Jedoch macht diese Eigenschaft
eine Vorhersage der stereochemischen Wechselwirkung von Enzym und Substrat
schwierig. Viele Enzyme zeigen im wäßrigen Ein- oder Zweiphasensystem ihre
größte katalytische Aktivität, da sie im wässerigen Medium ihrem optimalen
pH-Bereich und ihrer optimale Solvatation ausgesetzt sind.133 Aufgrund der erhöhten
Flexibilität von Enzymen im wässerigen Medium können Substrate akzeptiert
werden, die im organischen Medium nur unzureichend umgesetzt werden. Verlaufen
Hydrolysen jedoch mit schlechter Enantioselektivität, so sollte die Enzymkatalyse auf
die entsprechende Transacylierung im organischen Medium erweitert werden. Im
organischen Medium haben hydrophobe Verbindungen eine erhöhte Löslichkeit, so
daß hier Substrate eingesetzt werden können, die nicht im wässerigen Milieu
umgesetzt werden können. Eine Umsetzung hydrolyselabiler Verbindungen ist ein
weiterer Vorteil.
Zusätzlich verhalten sich Hydrolyse und Transacylierung unter dem Blickpunkt der
asymmetrischen Synthese enantiokomplementär, so daß durch einen Wechsel des
Reaktionsmediums ebenfalls beide Enantiomere dargestellt werden können.
Im Rahmen dieser Arbeit sollen daher beide Möglichkeiten des Reaktionsmediums
der enzymatischen Racematspaltung untersucht werden, um eine möglichst breite
Grundlage zur Gewinnung von enantiomeren Tramadol-Analoga zu schaffen.
38 THEORETISCHER TEIL

2.3.2.1 Auswahl der verwendeten Substrate und Reaktionsbedingungen in


der enzymatischen Hydrolyse

Bei den in die enzymatische Hydrolyse einzusetzenden Verbindungen handelt es


sich um Tramadol-Analoga mit einer phenolischen oder sekundären Hydroxylgruppe,
die durch eine geeignete Wahl des Acylrestes in Ester überführt werden und so als
Substrate eingesetzt werden können.
Üblicherweise werden für Lipasen-katalysierte Hydrolysen langkettige Ester von
Fettsäuren bevorzugt, die dem Vorbild der Triglyceride entsprechen. Dagegen
werden Esterase-katalysierte Hydrolysen am besten mit Estern kurzkettiger
Carbonsäuren durchgeführt.6,110,101 Um bei der Wahl der Acylgruppe sowohl den
Lipasen als auch den Esterasen ein Substrat zu bieten, daß umgesetzt werden kann,
wurde die Butyratgruppe als Standard gewählt, da Buttersäureester sowohl von
Lipasen als auch Esterasen als Substrate akzeptiert werden.
So gelang COOPE et al. beispielsweise die PLE-katalysierte Hydrolyse eines tertiären
Quinclidinol Esters nur im Falle eines Butyrats als Acylgruppe mit ausreichender
Aktivität.134 In anderen Beispielen konnten KAZLAUSKAS135 et al. sowie WHITESIDES136
et al. für einige Fälle Lipasen-katalysierter Hydrolysen zeigen, daß bei einem
Wechsel der Acylgruppe vom Acetat zum Butyrat ein Anstieg der Selektivität zu
beobachten war. In der Umkehrreaktion zu Hydrolyse, der PLE-katalysierten
Transacylierung racemischer sekundärer Alkohole mit Vinylacetat, -propionat und
-butyrat, konnten GAIS et al. ebenfalls beobachten, daß bei größerer Kettenlänge des
Acyldonors eine Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität auftritt.81,84
Zur Verbesserung der Löslichkeit von Substraten im wäßrigen Medium ist die
Zugabe von Cosolventien wie Aceton, Methanol, tert-Butanol oder DMSO möglich,
diese werden dabei in Konzentrationen bis zu 20 % toleriert.5,6,8,137,138 Bei
Untersuchungen zum Einfluß des Cosolvens auf die PLE-katalysierten Hydrolyse von
meso-Diestern konnten GUANTI et al. zeigten, daß die besten Ergebnisse hinsichtlich
Ausbeute und Selektivität durch einen Zusatz von 10 % tert-Butanol als Cosolvens
erreicht wurden.138 Aufgrund dieser Ergebnisse wurde für die im Rahmen dieser
Arbeit durchgeführten enzymatische Hydrolysen im wäßrigen Einphasensystem
standardmäßig ein Zusatz von 10 % tert-Butanol als Cosolvens gewählt. Eine
mögliche Nebenreaktionen der Alkoholyse des Cosolvens, also der enzymatischen
Acylierung des Cosolvens statt des Wassers, ist aufgrund der tertiären Hydroxyl-
gruppe am tert-Butanol nicht möglich.
VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 39

2.3.2.2 Auswahl der verwendeten Acyldonoren und Reaktionsbedingungen


in der enzymatischen Transacylierung

Lipasen katalysierte Transacylierungen mit aktivierten Acyldonoren (Abb. 2.11)


verlaufen im allgemeinen schnell und das Gleichgewicht der Transacylierung liegt auf
der Seite der Produkte.

Aktivierte Ester: Anhydride:

O O O O O O
N
C3H7 O CF3 C7H15 S O O
29 30 31
Enolester:

O O O O OEt

O O O O
32 33 34 35
Abb. 2.11: Beispiele für gebräuchliche Klassen von aktivierten Acyldonoren zur
irreversiblen enzymatischen Transacylierung.

Die bedeutensten aktivierten Acyldonoren sind Enolester, wie Vinylacetat (32) oder
Isopropenylacetat (34). Der aus Enolestern entstehende Alkohol tautomerisiert zur
Carbonylverbindung, wodurch das Gleichgewicht der Transacylierung auf der Seite
der Produkte liegt. Die meisten Lipasen tolerieren die Anwesenheit von Acetaldehyd.
CRL bildet hier eine bekannte Ausnahme 139,140,141. Neuere Untersuchungen gehen
von einer Reaktion des Acetaldehyds mit Lysin-Resten des Proteins unter Bildung
einer Schiff´schen Base aus, wodurch eine positive Ladung von der
Proteinoberfläche entfernet wird und zur Deaktivierung des Enzyms führt (Abb.
2.12).140,142,143,144,145 Als Alternative bieten sich hier die Acylierungsmittel
Isopropenylacetat (34) und 1-Ethoxyvinylacetat142,146 (35) an, da die aus diesen
Reagentien gebildeten Alkohole zu den weniger reaktiven Verbindungen Aceton bzw.
Essigsäureethylester tautomerisieren. 1-Ethoxyvinylester sind allerdings schwer
zugänglich.
40 THEORETISCHER TEIL

O
Lys NH3 Lys N
- H3O
Abb. 2.12: Deaktivierung von Proteinen durch Acetaldehyd.

Im Falle der Enolester und Anhydride verläuft die Transacylierung praktisch


irreversibel. Eine möglichst extreme Gleichgewichtslage ist in kinetischen
Racematspaltungen von entscheidender Bedeutung, da eine mögliche Rückreaktion
den Enantiomerenüberschuß des verbleibenden Substrats und somit den E-Wert der
Reaktion herabsetzt (s. Kap. 2.3.1.1).165 Es wurden daher in den im Rahmen dieser
Arbeit durchgeführten Transacylierungen nur Enolester als Acylierungsmittel
eingesetzt. Alle Acylierungsmittel sind vor ihrer Verwendung über Na2CO3 destilliert
worden, um die Anwesenheit von Säurespuren, die eine nicht-enzymatische
Reaktion katalysieren könnten, auszuschließen.

In einer großen Zahl an Veröffentlichungen wird beschrieben, daß


Proteineigenschaften, wie die Enantioselektivität von Enzymen, durch die Art des
Lösungsmittels, das als Reaktionsmedium eingesetzt wird, beeinflußt werden
können.147,148 Im allgemeinen wird davon ausgegangen, daß unpolare Lösungsmittel
besser für eine Enzymkatalyse geeignet sind, da das an das Enzym gebundene und
zur Entfaltung der Aktivität notwendige Wasser nicht entfernt wird.149 Stark
hydrophile Lösungsmittel können das aktive Zentrum dehydratisieren und sind daher
zur Enzymkatalyse nur bedingt geeignet. Neben der Aktivität wird auch die
Selektivität von Enzymen stark durch die Eigenschaften des Lösungsmittels
beeinflußt. Mehrere Hypothesen zur Erklärung dieses Phänomens wurden bereits
formuliert. So kann nach KLIBANOV et al. die Enzymkonformation durch die Polarität
des Lösungsmittels modifiziert werden und so den molekularen Erkennungsprozeß
zwischen Enzym und Substrat beeinflussen.150 Nach einer weiteren Hypothese hängt
die Selektivität von der Energetik der Substratsolvatisierung ab.151 Eine andere
Theorie beruht auf der Vorstellung, daß Lösungsmittelmoleküle im aktiven Zentrum
binden und bei der Assoziierung des Substrats interferieren.152 Allerdings sind diese
Hypothesen hinsichtlich ihres Vorhersagewertes unbefriedigend. Sie scheinen
entweder nur für das jeweils betrachtete Enzym und Substrat gültig zu sein, oder es
VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 41

ist, wie im Falle von Lösungsmittel-Enzym-Komplexen, überhaupt keine


Verallgemeinerung möglich.

Zusammenfassend scheint weiterhin gegenwärtig keine Gemeinsamkeit zwischen


den verschiedenen Hypothesen zu existieren, obgleich es wahrscheinlich ist, daß
das Lösungsmittel die enzymatische Selektivität über mehr als einen Mechanismus
beeinflußt. Eine allgemeingültige Aussage über das optimale Medium für eine
Enzymkatalyse unter bestimmten Bedingungen ist daher nicht möglich. Daraus läßt
sich folgern, daß für jede Reaktion eine Optimierung der Lösungsmitteleigenschaften
durchzuführen ist.153
Um diese Möglichkeit der Veränderung von Enzymeigenschaften durch den
Lösungsmitteleinfluß zu beschreiben, wird der Ausdruck „Medium-Engineering“
verwendet, um damit eine Alternative zum oder auch eine Vervollständigung des
„Protein-Engineering“ zu bezeichnen.147 Die bislang publizierten Ergebnisse haben
gezeigt, daß für eine Modifizierung oder Verbesserung der Enzymselektivität das
Medium-Engineering eine gute Alternative zum Protein-Engineering und zur
zeitaufwendigen Suche nach neuen Katalysatoren ist.
42 THEORETISCHER TEIL

2.4 Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von


Tramadol-Analoga

2.4.1 Substrate auf Basis aromatischer Hydroxylfunktionen

Da nur ein kleiner Teil der bekannten Wirkstoffe eine sekundären Hydroxyfunktion
enthält, ist der weitaus größere Anteil kein klassisches Substrat für die bisher
etablierten enzymatischen Racematspaltungen. Viele Wirkstoffe haben zwar eine
Aminofunktion mittels derer eine Aminoacylasen-katalysierte Racematspaltung
durchgeführt werden könnte154, die Aminogruppe kann aber wie im Beispiel von
rac-7 einer solchen Reaktion unzugänglich sein. Ein neuerer Ansatz, der bereits in
eigenen Vorarbeiten verfolgt wurde80, ist die in Wirkstoffen weitaus häufigere
phenolische Hydroxylgruppe in einer Hydrolasen-katalysierten Racematspaltung zu
nutzen. Dieser Ansatz bietet neue Herausforderungen, da die Distanz zu
vorhandenen Chiralitätszentren beträchtlich erhöht ist.

Hydrolasen-katalysierte Umsetzungen von phenolischen Estern sind in der


Schutzgruppentechnik bereits etabliert.155 Enzyme ermöglichen eine gezielte
Entfernung enzymlabiler Schutzfunktionen unter milden Reaktionsbedingungen, wie
beispielhaft an der enzymatischen Hydrolyse des phenolischen Acetats an einem
4-Acetoxybenzyloxycarbonyl Urethan mit anschließender Fragmentierung gezeigt ist
(Abb. 2.13)156.

O Acetyl- O
R esterase R
N O O N O R NH2
H pH 7.0, H
O 45 ºC O
R = Lipoprotein

Abb. 2.13: Enzymatische Spaltung der 4-Acetoxybenzyloxycarbonyl-Schutzgruppe.

In mehreren Untersuchungen konnte bereits auch gezeigt werden, daß Hydrolasen in


der Lage sind, Reaktionen von Phenolen oder Phenylestern sowohl mit hoher
Regio-157,158 als auch Chemoselektivität157,159 zu katalysieren. Aufgrund dessen
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 43

empfehlen sich Enzym-katalysierte Hydrolysen von Phenylestern nicht nur für


Schutzgruppenoperationen, sondern auch allgemein für die organische Synthese.
Um den Ansprüchen der modernen organischen Synthese voll gerecht zu werden,
sollte die Methodik der Enzym-katalysierten Transformation der Phenolgruppe
allerdings auch in einer enantioselektive Art möglich sein.
Für enzymatische Enantiomeren-differenzierende Racematspaltungen von Phenol-
derivaten sind jedoch bis heute nur wenige Beispiele bekannt.

Ein gut untersuchtes Substrat mit axialer Chiralität ist das 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diol
(rac-36) bzw. dessen Ester. MIYANO et al. beschrieben 1987 die Schweinepankreas-
lipase katalysierte Hydrolyse eines Divaleriansäureesters (rac-37a) mit sehr guter
Selektivität (Abb. 2.14).160 Die Hydrolyse eines solchen Diesters bezieht zwei Stufen
enzymatischer Racematspaltungen ein. Solche zweistufigen Hydrolysen lassen in
der Theorie einen höheren ee-Wert der Produkte als einstufige Reaktionen
erwarten161. Der als primäres Produkt entstehende Monoester konnte nur in geringen
Mengen nachgewiesen werden, da er umgehend vom Enzym weiter umgesetzt wird.
Wird ein Monoester direkt als Substrat eingesetzt, verläuft eine Lipasen-katalysierte
Hydrolyse ebenfalls mit hoher Selektivität (E > 100).162,163 Einer Schweineleber-
Esterasen-katalysierten Hydrolyse ist das entsprechende Butyrat rac-37b nicht
zugänglich164. Des weiteren konnte von INAGAKI et al. demonstriert werden, daß das
1,1´-Binaphthalin-2,2´-diol (rac-36) auch direkt als Substrat in eine Lipasen-
katalysierte Transacylierung eingesetzt werden kann, die mit guter Selektivität
verläuft (E > 60) und auf der Stufe des monoacylierten Produkts stehen bleibt.162
Allerdings zeigte die von INAGAKI et al. eingesetzte Lipase aus Pseudomonas sp. eine
zu den bisherigen eingesetzten Lipasen entgegengesetzte Enantiopräferenz. WANG
et al. war es zuvor nicht gelungen rac-36 mit verschiedenen Lipasen sowie der
Cholesterolesterase zu acylieren.165

O O

O R Enzym OH O R
+
O R H2O OH O R

O O
rac-37 a = nBu (−)-(aS)-36 (+)-(aR)-37 a
b = nPr b
Abb. 2.14: Enzymatische Hydrolyse von Estern des 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diols.
44 THEORETISCHER TEIL

KAZLAUSKAS konnte weiterhin unter Verwendung des Enzyms Cholesterolesterase


zeigen, daß nicht nur substituierte 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diole, sondern auch
entfernte Derivate mit sehr guten Selektivitäten hydrolysiert werden und somit ein
allgemeiner Zugang zu enantiomerenreinen Verbindungen diesen Typs existiert.166

In systematischen Untersuchungen zur Lipasen-katalysierten Hydrolyse von


verschiedenen substituierten racemischen Essigsäure-1-(3,4-dimethoxyphenyl)-
tetrahydroisoquinolinylestern konnten HOSHINO et al. zeigen, daß Ester von
Phenolen, bei denen das Chiralitätszentrum mehrere C-Atome von der Phenolgruppe
entfernt ist, Substrate für eine enzymatische kinetische Racematspaltung sind. Unter
anderem zeigte sich hierbei die Lipase aus Candida rugosa als geeigneter
Katalysator. Somit stellt die Hydrolasen-katalysierte Racematspaltung von
phenolischen Substraten eine Möglichkeit zur Gewinnung von enantiomerenreinen
Verbindungen dar. Die erzielten Selektivitäten in den Lipasen-katalysierten
Reaktionen waren allerdings niedrig, es konnten E-Werte im Bereich von 2 bis
maximal 11 erreicht werden.167

AcO HO AcO
MeO Lipase MeO MeO
NMe NMe NMe
H2O gesättigtes H + H
n organisches n n
Lösungsmittel
MeO MeO MeO
OMe OMe OMe
(S) (R)
Abb. 2.15: Enzymatische Hydrolyse von racemischen Essigsäure-1-(3,4-dimethoxy-
phenyl)-tetrahydroisoquinolinylestern.

ACHIWA et al. stellten einen neuen Zugang zu (R)-α-Tocopherol vor, indem sie eine
am aromatischen Ring demethylierte Vorstufe in eine Lipasen-katalysierte kinetische
Racematspaltung einsetzten (Abb. 2.16). Auch hier war die Selektivität der Hydrolyse
des phenolischen Esters, wahrscheinlich ebenfalls aufgrund des entfernten
stereogenen Zentrums, gering (E ≤ 10).168 Eine enzymatische Hydrolyse der am
aromatischen Ring permethylierten Verbindung, dem α-Tocopherol, war aufgrund
von sterischen Hinderungen nicht möglich. Von ZAMMATTIO et al. wird die Lipasen-
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 45

katalysierte Hydrolyse eines ähnlich aufgebauten phenolischen Substrats, mit einem


2H-Benzopyrangerüst, ebenfalls mit geringer Selektivität beschrieben (Abb. 2.17
links).169

AcO HO AcO
CRL R
+
O R H 2O O O R
(S) (R)

R=
Abb. 2.16: Lipase-katalysierte kinetische Racematspaltung von Tocolacetat.

Höhere Selektivitäten mit E-Werten von 24 bis 60 beobachten HUTCHINSON et al. bei
der PLE-katalysierten Hydrolyse von phenolischen Estern bei denen das
Chiralitätszentrum im Säureanteil des Moleküls und somit näher an der vom Enzym
angegriffenen Bindung lokalisiert ist (Abb. 2.17 rechts).170 Interessanterweise wurde
hier aus Löslichkeitsgründen nicht das freie Amin sondern das Hydrochlorid der Base
als Substrat eingesetzt.

AcO O O N(CH2CH2OCH3)2
⋅HCl
R1 O R2
O n
OMe
n = 1,2 R1 = H, Me, R2 = Et, nPr
Abb. 2.17: Racemische Substrate mit aromatischer Hydroxylgruppe, die in
Hydrolasen-katalysierte kinetische Racematspaltungen eingesetzt
worden sind.

Ebenfalls sehr gute Selektivitäten konnten LIU et al. in der enzymatischen Hydrolyse
eines phenolischen Esters mit dem Chiralitätszentrum im phenolischen Teil des
Moleküls erzielen. Sie erzielten E-Wert bis zu 60 bei der Cholesterolesterasen-
katalysierten Hydrolyse von Essigsäureestern des Lasofoxifene (Abb. 2.18).171
46 THEORETISCHER TEIL

N
O

CE
+
H2O

AcO HO AcO
(5R,6S) (5S,6R)
Lasofoxifene
Abb. 2.18: CE-katalysierte kinetische Racematspaltung zur Darstellung von
Lasofoxifene.

Zusammenfassend kann nach Kenntnisstand der Literatur zu Beginn dieser Arbeit


festgestellt werden, daß Ester von aromatischen Alkoholen von Enzymen als
Substrate akzeptiert werden. Die erzielten Selektivitäten waren zu jenem Zeitpunkt
aber sehr niedrig und präparativ nicht nutzbar. Erst in jüngster Zeit ist vermehrt in
Publikationen über Enantiomeren-differenzierende Hydrolysen von Phenylestern mit
präparativ nutzbaren Enantiomerenüberschüssen berichtet worden.

In eigenen Vorarbeiten wurde das O-Desmethyltramadol (rac-8, M1) als Substrat mit
aromatischer Hydroxylgruppe für eine Enzym-katalysierte Racematspaltung
ausgewählt. Das O-Desmethyltramadol, ein Hauptmetabolit des Wirkstoffs Tramadol,
und seine einzelnen Enantiomere sind für die Pharmakokinetik des Tramadols von
Bedeutung. Zudem bieten die Enantiomere dieser Verbindung nach Methylierung
Zugang zu den Enantiomeren des Tramadols.

Daß Ester des O-Desmethyltramadols, wie der (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-


(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15), als Substrate
von dem Enzym PLE akzeptiert werden, konnte bereits in diesen Vorarbeiten
demonstriert werden (Abb. 2.19).80
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 47

OH
O Pr
OH PLE
O Me2N O
Pr
Phosphatpuffer-
Lösung (pH 8.0) (+)-15
Me2N O +
10 % Cosolvens
rac-15 Me2N OH
RT
OH

(−)-8
Abb. 2.19: PLE-katalysierte Hydrolyse von (±)-Buttersäure-3-(2-dimethylamino-
methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15).

In der PLE-katalysierten Hydrolyse von rac-15 unter Zusatz von 10 % tert-Butanol


als Cosolvens konnte der enantiomerenreine Ester (+)-15 bei hohen Umsätzen
erhalten werden (Tabelle 2.6). Die Selektivität der Reaktion war insgesamt sehr
niedrig (E = 7). Unter Verwendung von 10 % Methanol als Cosolvens konnte eine
Steigerung der Aktivität und der Selektivität des Enzyms PLE beobachtet werden
(E = 11).

Tabelle 2.6: Zusammenfassung der Ergebnisse eigener Vorarbeiten zur PLE-


katalysierten Hydrolyse von rac-15

Reaktionsbedingungen E-Wert

Umsatz (nach 1.5 h) 23 %


9.0 U/ml; pH 8.0;
ee Ester (+)-15 76 % 7
10 % tert-Butanol
ee Phenol (−)-8 51 %

Umsatz (nach 0.5 h) 20 %


3.9 U/ml; pH 8.0;
ee Ester (+)-15 17 % 11
10 % Methanol
ee Phenol (−)-8 81 %

Es konnte somit gezeigt werden, daß in den Enzym-katalysierten


Racematspaltungen mit Verbindungen auf Basis des Tramadols eine für erste
Laborsynthesen zur Gewinnung von Enantiomeren ausreichende Selektivität erzielt
werden kann, und dies, obwohl die Chiralitätszentren nicht direkt an der zu
48 THEORETISCHER TEIL

hydrolysierenden Estergruppe lokalisiert sind. Des weiteren konnte belegt werden,


daß das zugesetzte Cosolvens einen entscheidenden Einfluß auf die Enzym-
katalysierte Hydrolyse von Tramadol-Analoga ausübt.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 49

2.4.1.1 Enzym-katalysierte Hydrolysen des (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-


(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15)

Ausgehend von den vorgestellten eigenen Vorarbeiten wurden weitergehende


Untersuchungen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung von phenolischen
Tramadol-Analoga durchgeführt. Im Vordergrund stand hierbei die Suche nach
Reaktionsbedingungen für ein in einem präparativen Maßstab nutzbaren Verfahren
zur enzymatischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga mit aromatischer
Hydroxylgruppe.
Die Schweineleber-Esterase (PLE) benötigt, wie andere Hydrolasen auch, kein
Coenzym oder Cofaktor, ist kommerziell verfügbar und verbindet eine geringe
Substratspezifität mit hoher Enantioselektivität.5 PLE ist eine der am erfolgreichsten
eingesetzten Hydrolasen in der enantiotopos-differenzierenden Hydrolyse von
Dicarbonsäure-diestern und von Diacetaten von Diolen5, welche bereits exemplarisch
in einem 100 mol Maßstab durchgeführt worden sind172. Aus diesen Gründen
erscheint die PLE als ein zweckmäßiges Enzym und wurde zunächst als
Biokatalysator für die Hydrolyse von Tramadol-Analoga beibehalten.

Da das Cosolvens in der enzymatischen Hydrolyse einen entscheidenden Einfluß


ausüben kann, wurde neben den bisher verwendeten Lösungsmitteln tert-Butanol
und Methanol ebenfalls der Einfluß von Aceton als Cosolvens auf die PLE-
katalysierte Hydrolyse des (±)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-
cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) untersucht (Tabelle 2.7).

Aceton ist ein übliches Cosolvens in der PLE-katalysierten Hydrolyse von Estern.5
Häufig kann ein aktivitäts- und selektivitätssteigernder Einfluß des Acetons auf die
PLE-Katalyse beobachtet werden. So berichten beispielsweise TAMM et al. von
einem Anstieg der Selektivität in einigen Fällen der PLE-katalysierten
Desymmetrisierung, wenn sie statt keinem 10 % Aceton als Cosolvens
verwendeten.173 PIETZSCH et al. untersuchten den Einfluß der Konzentration des
Cosolvens Aceton auf die Aktivität von PLE unter Standardaktivitätstest-
bedingungen.174 Sie beobachten bei einer Konzentration von 3 – 5 % Aceton eine
Aktivitätssteigerung der PLE von 75 % im Vergleich zur Aktivität der PLE ohne
Cosolvens. Sie berichten ebenfalls von einer Steigerung der Selektivität in der PLE-
50 THEORETISCHER TEIL

katalysierten kinetischen Racematspaltung von Allenen bei Zusatz von 3 % Aceton


als Cosolvens.

Tabelle 2.7: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 unter Zusatz von
10 % Aceton als Cosolvens (3.3 U/ml; Phosphatpuffer, pH 8.0)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E-Wert

5 Min 52 % 27 % 46 % 4

Aus Tabelle 2.7 geht hervor, daß Aceton als Cosolvens im Vergleich zu den
Cosolventien tert-Butanol und Methanol (Tabelle 2.6) zu einer weiteren Steigerung
der Aktivität der PLE führt, da die Reaktionsgeschwindigkeit erheblich zunimmt.
Dieser Einfluß auf die Reaktionsgeschwindigkeit geht allerdings mit Einbußen in der
Selektivität der Reaktion einher. Die Selektivität ist so gering, daß keine weiteren
Versuche in der Enzym-katalysierten Hydrolyse von Substraten mit aromatischer
Hydroxylgruppe mit Aceton als Cosolvens unternommen wurden. Für andere
Substrate, bei denen die Selektivität der enzymatischen Hydrolyse hoch genug ist,
kann sich die Verwendung von Aceton als Cosolvens zu einer Steigerung der
Reaktionsgeschwindigkeit anbieten.

Um die präparativen Möglichkeiten der Enzym-katalysierten Hydrolyse von


Substraten mit aromatischer Hydroxylgruppe zu demonstrieren, wurde die PLE-
katalysierte Hydrolyse von rac-15 in einem 3.5 mmol Maßstab durchgeführt. Es
wurden die bereits optimierten und bewährten Reaktionsbedingungen pH 8.0 und
10 % tert-Butanol als Cosolvens gewählt (Tabelle 2.9).

Um die einzusetzenden Lösungsmittelmengen zu reduzieren wurde für diese


Versuche in einem präparativen Maßstab eine erhöhte Substratkonzentration von ca.
0.09 mol/l statt der bisher verwendeten 0.025 mol/l gewählt. Nachdem ein Umsatz
von ca. 50 % erzielt worden war, wurde die Reaktion durch kontinuierliche Extraktion
mit Dichlormethan für mindestens 24 Stunden abgebrochen. In Vorversuchen hatte
sich die kontinuierliche Extraktion als effektivste Methode zur Aufarbeitung und
Extraktion herausgestellt, da sich das gebildete Phenol (−)-8 aufgrund seiner
amphoteren Eigenschaften63 sonst nur mit Verlusten in der Ausbeute erhalten läßt.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 51

LINTZ et al. erhielten ebenfalls zum Teil sehr schlechte Ausbeuten bei der Extraktion
des O-Desmethyltramadols (rac-8) bei nicht kontinuierlicher Weise (Tabelle 2.8).63

Tabelle 2.8: Extraktionsausbeuten für O-Desmethyltramadol (rac-8) beim


Ausschütteln wäßriger Lösungen mit organischen Lösungsmitteln
(Verhältnis 1 : 1) in Abhängigkeit vom pH-Wert63

pH 5.0 pH 7.0 pH 9.0 pH 11.0

Chloroform 5% 7% 88 % 70 %

Essigsäureethylester 6% 28 % 72 % n. b.

Nach kontinuierlicher Extraktion lassen sich das gebildete Phenol (−)-8 und der nicht
umgesetzte Ester (+)-15 durch Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1) an
Kieselgel trennen. Das (1S,2S)-konfigurierte Phenol (−)-8 konnte so in 49 %
Ausbeute mit einem ee-Wert von 76 % und der (1R,2R)-konfigurierte, nicht
umgesetzte Ester (+)-15 in 47 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 62 % erhalten
werden (Tabelle 2.9, S. 52).
Zur Angabe der Ausbeuten ist zu beachten, daß aufgrund des erreichten Umsatzes
von 52 % die maximal erreichbare Ausbeute des Phenols 52 % und die des Esters
48 % beträgt.
Die Selektivität der Reaktion läßt sich entsprechend durch einen E-Wert von 13
beschreiben. Der theoretische Verlauf der ee-Werte von Substrat und Produkt über
den Umsatz der Reaktion ist in Abb. 2.20 dargestellt. Aus ihr geht hervor, daß ab
einem Umsatz von ca. 70 % der nicht umgesetzte Ester (+)-15 enantiomerenrein
vorliegt. Um die präparativen Möglichkeiten der Enzym-katalysierten kinetischen
Racematspaltung zu demonstrieren, wurde daher in einem weiteren Versuch in
einem präparativen Maßstab (+)-15 enantiomerenrein dargestellt.
52 THEORETISCHER TEIL

Abb. 2.20: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (+)-15 (S) und Produkt (−)-8 (P)
bei einer Selektivität von E = 13.

Dazu wurden dieselben Reaktionsbedingungen wie zuvor gewählt, nur diesmal die
Reaktion nicht bei einem Umsatz von 50 % abgebrochen, sondern erst, wie aus Abb.
2.20 bestimmt, bei einem Umsatz von ca. 80 % (Tabelle 2.9 ). Der nicht umgesetzte
Ester (+)-15 konnte nach Aufarbeitung so in einer Ausbeute von 10 %
enantiomerenrein erhalten werden. Hiermit wurden sich die prinzipielle Möglichkeit
einer kinetischen Racematspaltung zu nutze gemacht, daß das nicht umgesetzte
Substrat selbst bei einer relativ schlechten Selektivität der Reaktion bei genügend
hohem Umsatz, und somit auf kosten der Ausbeute, enantiomerenrein erhalten
werden kann.

Tabelle 2.9: PLE-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-15 im 3.5 mmol Maßstab
(6.5 U/ml; Phosphatpuffer, pH 8.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute


Umsatz E
zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Phenol (−)-8

2h 52 % 62 % 47 % 76 % 49 % 13
3h 85 % ≥ 98 % 10 % 27 % 64 % 7

Da zu Beginn der beiden Reaktionen jeweils eine starke Trübung zu beobachten


war, die im Laufe der Reaktion verschwand, ist davon auszugehen, daß aufgrund der
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 53

geringen Löslichkeit des Esters rac-15, bei einem pH-Wert von 8.0, die
Substratkonzentration nicht mehr wesentlich erhöht werden kann. Häufig stellen
geringe Löslichkeiten von Substraten in Prozessen, die im wäßrigen Medium
durchgeführt werden, eine Limitierung der Substratkonzentration dar, obwohl es auch
einige hervorstechende Beispiele mit sehr hohen Substratkonzentrationen in
biokatalytischen Prozessen gibt.175

Auffällig in Tabelle 2.9 ist auch, daß der ermittelte E-Wert für beide Reaktionen unter
gleichen Reaktionsbedingungen mit steigendem Umsatz fällt, da dieser nach den in
Kap. 2.3.1.1 gemachten Voraussetzungen für eine gegebene Reaktion konstant sein
sollte. Eine Änderung des E-Werts im Verlauf der Reaktion stellt in der Regel eine
Abweichungen von den gemachten Voraussetzungen dar. Eine Möglichkeit zur
Erklärung dieses Verhaltens ist, daß die Vorraussetzung daß nur ein Enzym (aktives
Zentrum) an der Reaktion beteiligt ist, nicht erfüllt ist. Der E-Wert stellt in diesem Fall
ein gewichtetes Mittel aller Biokatalysatoren, die mit dem Substrat reagieren, dar.
PLE besteht aus mehreren Isoenzymen, die alle in der Hydrolyse von rac-15 beteiligt
sein können und unterschiedliche Aktivitäten und Selektivitäten zeigen. Ähnlich
haben PIETZSCH et al. auch schon zur Erklärung von schwankenden E-Werten in der
PLE-katalysierten Hydrolysen von Allen-Derivaten argumentiert.174

Zusammenfassend konnten die präparativen Möglichkeiten einer Enzym-


katalysierten kinetischen Racematspaltung von phenolischen Tramadol-Analoga am
Beispiel der PLE-katalysierten Hydrolyse von rac-15 gezeigt werden. Das Enzym
PLE zeigt eine hinreichend gute Aktivität hinsichtlich dieses nicht natürlichen
Substrates und katalysiert dessen Hydrolyse innerhalb von Stunden. Die Selektivität
der Reaktion ist allerdings noch nicht zufriedenstellend. Bei einem E-Wert von 13
läßt sich der nicht umgesetzte Ester (+)-15 in Ausbeuten von maximal 30 %
enantiomerenrein erhalten und das enantiomere Phenol (−)-8 läßt sich gar nicht mit
ee-Wert von über 90 % erhalten. Eine entscheidende Verbesserung der Selektivität
der PLE-katalysierten Hydrolyse von rac-15 konnte auch durch Variation des
Cosolvens nicht erreicht werden.

Um eine weitere Verbesserung in der Selektivität der Enzym-katalysierten Hydrolyse


von rac-15 zu erreichen, wurde auf den Versuch verzichtet, die PLE-katalysierte
54 THEORETISCHER TEIL

Reaktion zu Optimieren, da hier die Aussicht durch eine weitere Variation des
Cosolvens oder der Reaktionstemperatur zu einer gesteigerten Selektivität zu
kommen, als gering betrachtet wurde. Vielmehr wurde die Möglichkeit untersucht,
daß es eine oder sogar mehrere weitere Hydrolasen gibt, welche die Hydrolyse von
rac-15 mit einer höheren Selektivität katalysieren (Abb. 2.21).

OH
O Pr
OH Enzym
O Me2N O
Pr
Phosphatpuffer- (+)-15
Me2N O Lösung
+
10 % Cosolvens
rac-15 RT Me2N OH
OH

(−)-8
Abb. 2.21: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15.

Es wurde daher ein „Enzymscreening“ mit kommerziell verfügbaren Hydrolasen


durchgeführt. Dazu wurden 5 Lipasen und drei weitere Esterasen in die Enzym-
katalysierte Hydrolyse von rac-15 eingesetzt. Die Auswahl der Enzyme erfolgte auf
Basis eines Lipasen-Screening Grundkits. Es wurde beachtet, daß die vorwiegend in
der organischen Synthese verwendeten Enzyme (s. Kap. 2.3.2, S. 35) in dieser
Auswahl vertreten sind. Als Standardbedingungen wurde ein wäßrigen
Einphasensystem aus Phosphatpuffer, pH 7.0, mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens
verwendet (Tabelle 2.10). Somit lassen sich erzielte Ergebnisse auch mit denen der
bereits durchgeführten PLE-Katalyse vergleichen.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 55

Tabelle 2.10: Enzymscreening zur Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen


Einphasensystem (Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktions- ee Ester ee Phenol


Enzym Umsatz E-Wert
zeit (+)-15 (−)-8

Acetylcholinesterase
7.5 h 3% n. b. n. b. -
(AChE; 145 U/ml); pH 8.0
Candida antarctica Lipase
3.8 h 8% 3% 3% 1.1
(CAL; 0.8 U/ml)
Mucor miehei Lipase
19.5 h 25 % 11 % 30 % 2
(MML; 0.7 U/ml)
Horse liver esterase
4.0 h 31 % 17 % 51 % 4
(HLE; 0.3 U/ml)
Cholesterolesterase
24.0 h 90 % 72 % 39 % 5
(CE; 22 U/ml)
Porcine pancreatic Lipase
2.5 h 66 % 19 % 78 % 10
(PPL; 21 U/ml)
Burkholderia cepacia
22.0 h 35 % 75 % 67 % 11
Lipase (BCL; 15 U/ml)
Candida rugosa Lipase
3.0 h 64 % 98 % 45 % 10
(CRL; 3 U/ml)

Wie aus Tabelle 2.10 hervorgeht, wird die Hydrolyse des Esters rac-15 von den
meisten eingesetzten Hydrolasen mit einer ausreichend hohen Reaktions-
geschwindigkeit katalysiert.
In diesem Enzym-Screening zeigten alle katalytisch aktiven Enzyme die gleiche
Enantiopräferenz, es wurde, wie schon zuvor in der PLE-Katalyse beobachtet,
bevorzugt das (−)-Enantiomer des Esters zum aromatischen Alkohol umgesetzt.
Die Selektivitäten, die unter den Standardbedingungen des Enzym-Screenings
erreicht werden konnten, waren allerdings gering und für eine angestrebte
Racematspaltung im präparativen Maßstab zu niedrig. Nur drei Lipasen katalysieren
die Reaktion mit einer ähnlichen Selektivität wie die zuvor getestete PLE.

Von mehreren Autoren wird beschrieben, daß in Reaktionen mit Horse liver esterase
(HLE) als Katalysator geringfügig höhere ee-Werte als in der entsprechenden
Katalyse mit PLE erreicht werden können.176 In der Katalyse der Hydrolyse des
56 THEORETISCHER TEIL

Esters rac-15 konnte diese Beobachtung allerdings nicht bestätigt werden, da die in
der HLE-katalysierten Reaktion erzielte Selektivität geringer ist, als die der PLE
katalysierten Reaktion.
Eine höhere Selektivität, die eine in einem präparativ nutzbaren Rahmen
durchführbare Racematspaltung zulassen würde, war insgesamt nicht zu
beobachten. Ein weiteres Austesten von neuen Hydrolasen wurde nicht
durchgeführt, da die bisher getesteten Hydrolasen als repräsentativ betrachtet
wurden. Natürlich ist nicht auszuschließen, daß unter den kommerziell oder
andersseitig verfügbaren Enzymen welche sind, die eine höhere Selektivität zeigen,
doch sollte ein Enzym nach den in Kap. 2.3.2 (S. 35) gemachten Voraussetzungen
über einen langen Zeitraum in ähnlicher Präparation und Qualität kommerziell
verfügbar sein. Diese Voraussetzung wurde für weitere Enzyme nicht ohne weiteres
als erfüllt betrachtet.

Statt dessen wurde daraufhin versucht die Reaktionsbedingungen für eine Lipasen-
katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 zu optimieren.
Schon 1958 beschrieben SARDA und DESNUELLE das für Lipasen typische Phänomen
der „Grenzflächenaktivierung“.177 Lipasen haben im allgemeinen nur eine geringe
Aktivität gegenüber nichtassoziierten Substraten, die oberhalb der kritischen
Micellenkonzentration des Substrats steil ansteigt. Lipasen benötigen zur Aktivierung
also häufig aggregierte Moleküle, wie sie in einer Emulsion oder einer mizellaren
Lösung vorliegen. 1990 konnte durch Röntgenstrukturanalyse der beiden ersten
Lipasenstrukturen der Mechanismus aufgeklärt werden178: Die „Grenzflächen-
aktivierung“ der Lipasen beruht auf einem amphiphilen Peptidsegment, das wie ein
Deckel das aktive Zentrum des Enzyms bedeckt.179 Dieser scheint in Gegenwart
einer Grenzfläche im Zuge einer Konformationsänderung aufzuklappen und so dem
Substrat den Zugang zum aktiven Zentrum zu ermöglichen.180 Außerdem entsteht
beim Öffnen des Deckels eine große hydrophobe Fläche, an die das Substrat binden
kann.181 Allerdings zeigen nicht alle Lipasen diese Grenzflächenaktivierung.
Beispielsweise weist zwar die Candida antarctica Lipase (Typ B), deren
Tertiärstruktur bekannt ist, eine amphiphilen Deckelstruktur auf, aber keine Grenz-
flächenaktivierung.182
Um eine möglichst große Grenzfläche zu erhalten, wurde daher statt eines wäßrigen
Einphasensystems eine Emulsion aus Wasser und organischem Lösungsmittel, ein
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 57

wäßrig-organisches Zweiphasensystem, als Reaktionsmedium für eine Lipasen-


katalysierte Reaktion ausgewählt. Ein häufig in der Literatur verwendetes wäßrig-
organisches Zweiphasensystem besteht aus Phosphatpuffer und tert-Butyl-
methylether im Verhältnis 1 : 1. Die Verwendung des tert-Butyl-methylethers hat den
Vorteil, daß dieser Ether keine Peroxide bildet und somit verhältnismäßig gefahrlos
eingesetzt werden kann.

In einer feinen Emulsion aus Phosphatpuffer und tert-Butyl-methylether wurde


daraufhin eine Candida rugosa Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15
durchgeführt (Tabelle 2.11). Die Reaktionsgeschwindigkeit und somit die Aktivität der
Candida rugosa Lipase im wäßrig-organischen Zweiphasensystem ist ähnlich der im
wäßrigen Einphasensystem. Eine Aktivierung in Form einer erhöhten
Reaktionsgeschwindigkeit ist also nicht zu beobachten. Die Selektivität der Reaktion
ist aber wesentlich größer als im Einphasensystem. So konnte das gebildete Phenol
(−)-8 mit einem ee-Wert 85 % in 30 % Ausbeute und der nicht umgesetzte Ester
(+)-15 mit ee-Wert 75 % in 64 %Ausbeute isoliert werden. Dies entspricht einer
Selektivität von E = 27. Dieser Wert erreicht nahezu den angestrebten Bereich eines
Wertes von E ≥ 30, welcher für eine präparativ nutzbare Reaktion Voraussetzung ist.
Diese erhöhte Selektivität kann auf eine geringe Konformationsänderung der Lipase
in der Grenzfläche zurückgeführt werden. Diese Konformationsänderung bewirkt in
erster Linie, das sich der Deckel über dem aktiven Zentrum öffnet180, sie bewirkt aber
auch eine Veränderung der Polaritäten im aktiven Zentrum und somit der potentiellen
Bindungsstellen für das Substrat.181

Der vorhergehende Versuch wurde mit einer Candida rugosa Lipase durchgeführt,
die eine spezifische Aktivität von 2.4 U/mg hatte. Dieser Wert stellt für dieses Enzym
einen niedrigen dar und bedeutet, daß in dieser Enzym-Präparation neben der CRL
auch andere Enzyme und nicht katalytisch-aktive Proteine vorliegen, die auf die
Katalyse Einfluß nehmen können. Um einen etwaigen Einfluß anderer Proteine
auszuschließen oder wenigstens zu minimieren, wurde daraufhin eine weiter
aufgereinigte Präparation der Candida rugosa Lipase mit einer spezifischen Aktivität
von 37.0 U/mg in die Enzym-katalysierte Hydrolyse von rac-15 im wäßrig-
organischen Zweiphasensystem eingesetzt (Tabelle 2.11). Diese aufgereinigte
Candida rugosa Lipase ist ebenfalls kommerziell verfügbar.
58 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.11: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen


Zweiphasensystem (2.7 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; MTBE; 1 : 1)

spezifische
Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E-Wert
Aktivität

2.4 U/mg 3.25 h 51 % 75 % 85% 27

37.0 U/mg 5.25 h 33 % 58 % 90 % 34

Aus dieser Reaktion konnte das gebildete Phenol (−)-8 mit einem ee-Wert 90 % in
27 % Ausbeute und der nicht umgesetzte Ester (+)-15 mit ee-Wert 58 % in 58 %
Ausbeute isoliert werden. Die Selektivität dieser Reaktion kann mit einem E-Wert von
34 beschrieben werden. Diese weitere Erhöhung der Selektivität kann durch den
Ausschluß von Nebenaktivitäten in der Enzympräparation erklärt werden. In Abb.
2.22 ist der theoretische Verlauf der ee-Werte von Substrat und Produkt für diesen
E-Wert gegen den Umsatz aufgetragen.

Abb. 2.22: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (+)-15 (S) und Produkt (−)-8 (P)
bei einer Selektivität von E = 34.

Die erzielte Selektivität von E = 34 ist die höchste, die in einer Enzym-katalysierten
kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Anolga mit phenolischer Hydroxylgruppe
bisher erreicht worden ist. Sie liegt zudem in dem angestrebten Bereich von E ≥ 30.
Dies bedeutet, wie auch in Abb. 2.22 zu erkennen ist, daß ab einem Umsatz von ca.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 59

60 % der nicht umgesetzte Ester (+)-15 enantiomerenrein vorliegt und in einer


maximalen Ausbeute von ca. 40 % erhalten werden kann.

Es konnte somit gezeigt werden, daß eine Enzym-katalysierte Hydrolyse eines


Esters auf Tramadol-Basis unter Einbezug einer phenolischer Hydroxylgruppe mit
hoher Selektivität und Aktivität möglich ist. Dies, obwohl die vom Enzym
anzugreifende phenolische Hydroxylgruppe mehrere C-Atome von den Stereo-
zentren der Verbindungen entfernt ist.

Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Phenols 8 erfolgte


durch Vergleich der Drehwerte mit bereits publizierten.91,183 Von der Grünenthal
GmbH ist für das Hydrochlorid des (+)-(R,R)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-

cyclohexyl)-phenols ein Drehwert von [α ] 20


D
= + 5.4º (c = 1.0, MeOH) veröffentlicht

worden.91 Hierbei ist die Bestimmung der Absolutkonfiguration des (+)-8⋅HCl durch
Röntgenstrukuranalyse erfolgt.184
Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 15 und 16 erfolgte in Analogie
zu der des Phenols 8.

2.4.1.2 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-


(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16)

Neben den Effekten des Cosolvens auf die Enzym-katalysierte Hydrolyse von Estern
des O-Desmethyltramadols (rac-8), ist auch der Einfluß der Acylgruppe des
Substrats auf die Aktivität oder Selektivität der enzymatischen Reaktion von
Interesse.

Im allgemeinen stellt für Lipasen die einzige Limitierung hinsichtlich des akzeptierten
Substratspektrums ihre begrenzte Eignung für die Umsetzung raumerfüllender
Acylgruppen dar: gemäß dem Vorbild der Triglyceride werden lineare aliphatische
Acylgruppen besser umgesetzt als z.B. Arene.101,110,185
60 THEORETISCHER TEIL

Im Gegensatz zu Lipasen akzeptiert die PLE als Esterase keine stark hydrophoben
Substrate wie z.B. Triglyceride, sondern idealerweise wasserlösliche Ester. Daher
ergibt sich hinsichtlich der Substratstruktur für die PLE die Einschränkung kurzkettige
lineare aliphatische Acylgruppen einzusetzen. So werden Acetate von Alkoholen am
häufigsten von der PLE hydrolysiert. Längerkettige Acylgruppen werden nur in
Ausnahmefällen als Substrate akzeptiert.
Dieser Unterschied in dem Substratspektrum zeigt auch das sicherste Merkmal, um
eine Esterase als „Lipase“ zu klassifizieren: die Fähigkeit langkettige Glycerinester zu
hydrolysieren.101,185,186

Ebenfalls unter dem Aspekt der Wirtschaftlichkeit eines möglichen enzymatischen


Teilschrittes in der industriellen Synthese eines Tramadol-Analogons sollte die zu
verwendende Acylgruppe möglichst kurz sein. Denn das Substrat muß zuvor in
einem separaten Schritt verestert werden, wobei eine kürzere Acylgruppe eine
geringere einzusetzende Menge bedeutet. In der anschließenden Racematspaltung
wird der enzymatisch hydrolysierte Acylrest verworfen, dabei reduziert eine kürzere
Acylgruppe die zuverwerfende Masse.

Von diesen Voraussetzungen ausgehend wurde daher der (±)-Essigsäure-3-


(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) synthetisiert.
Wie bereits in Kap. 2.2 auf S. 21 dargestellt wurde, ist rac-16 im Vergleich zu rac-15
hydrolyselabil. Die Stabilität gegen Autohydrolyse bei pH 7.0 ist noch ausreichend
groß, hingegen bei pH 8.0 nicht mehr. Es können erhebliche Mengen an
Hydrolyseprodukt nach 16 h detektiert werden (Tabelle 2.12).

Tabelle 2.12: Überprüfung der Hydrolysestabilität von rac-16 in Phosphatpuffer-


Lösung in Anwesenheit von 10 % tert-Butanol

pH-Wert Reaktionszeit Hydrolyseprodukt

7.0 2h 0.1 % rac-8


8.0 2h 1.2 % rac-8
8.0 16 h 15.0 % rac-8

Das Substrat rac-16 wurde daraufhin in die Enzym-katalysierte Racematspaltung


eingesetzt (Abb. 2.23). Aufgrund der mangelnden Hydrolysestabilität von rac-16
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 61

wurde ein pH-Wert von 7.0 gewählt und zur Vergleichbarkeit mit den bisherigen
Ergebnissen als Reaktionsmedium das wäßrige Einphasensystem mit 10 % tert-
Butanol als Cosolvens. Als Enzyme wurden zunächst PLE und CRL aufgrund der
bisher mit diesen Enzymen erzielten Ergebnisse eingesetzt (Tabelle 2.13, Zeilen 1
und 2).

OH
O
OH Enzym
O Me2N O
Phosphatpuffer- (+)-16
Me2N O Lösung
+
10 % Cosolvens
rac-16 RT Me2N OH
OH

(−)-8
Abb. 2.23: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16.

Aus Tabelle 2.13 geht hervor, daß die CRL-katalysierte Reaktion wenig langsamer
verläuft, als die des entsprechenden Buttersäureesters rac-15 (Tabelle 2.10). Die
Selektivität der CRL-katalysierten Hydrolyse von rac-16, ausgedrückt in einem
E-Wert von 2, ist erheblich geringer als die Selektivität, die mit dem Ester rac-15 als
Substrat beobachtet wurde. Dies Ergebnis deutet darauf hin, daß langkettigere
Acylreste, wie in dem Ester rac-15 vorhanden, bevorzugt von dieser Lipase
umgesetzt werden. Auf eine Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem
als Reaktionsmedium wurde daraufhin verzichtet.

Die PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16 bei pH 7.0 verläuft mit ähnlicher
Reaktionsgeschwindigkeit wie die Hydrolyse des Buttersäureesters rac-15 bei pH 8.0
nur mit geringerer Selektivität. Die Aktivität des Enzyms PLE ist unter
standardisierten Aktivitätstestbedingungen allerdings auch bei pH 8.0 größer als bei
pH 7.0. Aus diesem Grund wurde auch eine PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16
bei pH 8.0 durchgeführt, obwohl das Substrat bei diesem pH-Wert entsprechend
hydrolyselabiler ist (Tabelle 2.13, Zeile 3).
62 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.13: Enzym-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-16 (Phosphatpuffer;


10 % tert-Butanol)

Reaktions ee Ester ee Phenol


Reaktionsbedingungen Umsatz E-Wert
zeit (+)-16 (−)-8

Candida rugosa Lipase


7.25 h 45 % 4% 26 % 2
(CRL; 2.4 U/ml) pH 7.0
Schweineleber-Esterase
1.75 h 36 % 35 % 52 % 4
(PLE; 3.3 U/ml), pH 7.0
Schweineleber-Esterase
0.75 h 31 % 50 % 74 % 10
(PLE; 2.6 U/ml), pH 8.0

Bei pH 8.0 verläuft die PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16 entsprechend der
höheren Aktivität des Enzyms auch schneller als bei pH 7.0. Nach einer
Reaktionszeit von 0.75 h werden ca. 30 % Umsatz erreicht, bei pH 7.0 wurde zum
Erreichen des entsprechenden Umsatzes ca. 1 h länger benötigt.
Die kurze Reaktionszeit begünstigt einen höheren Enantiomerenüberschuß des
gebildeten Phenols (−)-8, da die Autohydrolyse von rac-16 vergleichsweise langsam
ist und somit bei kurzen Reaktionszeiten wenig racemisches Phenol entsteht (<1 %
in 1 h nach Tabelle 2.12). Somit ist auch trotz der geringen Hydrolysestabilität von
rac-16 eine relativ hohe Selektivität von E = 10 in dieser Reaktion möglich. Die
beobachtete Selektivität liegt im Rahmen der Selektivität, die auch schon in der PLE-
katalysierten Hydrolyse des entsprechenden Buttersäureesters rac-15 erzielt wurde
(Tabelle 2.6). Verglichen mit der Hydrolyse des Buttersäureesters rac-15 verläuft die
Hydrolyse des kurzkettigeren Acetats rac-16 aber mit einer höheren Aktivität. Dies
Ergebnis bestätigt die zuvor gemachte Aussage, daß Acetate aufgrund ihres kurzen
Acylrests und der damit erhöhten Polarität eine größere Ähnlichkeit mit den
natürlichen Substraten besitzen und somit die geeigneteren Substrate für die PLE-
katalysierte Hydrolyse sind.

Es wurden allerdings keine weiteren Untersuchungen zur Enzym-katalysierten


Hydrolyse des Essigsäureesters rac-16 durchgeführt. Trotz der Hydrolyselabilität
dieser Verbindung lassen sich zwar enzymatische Reaktionen mit einer Selektivität
im Rahmen von hydrolysestabilen Substraten im Labormaßstab durchführen, aber
eine Umsetzung in einen größeren Maßstab ist nicht sinnvoll. Hier würde der Enzym-
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 63

katalysierten kinetischen Racematspaltung von stabilen Verbindungen wie rac-15,


die einen Zugang zu dem gleichen Phenol (−)-8 gestatten, der Vorzug gegeben.

Zusammenfassend stellt der Buttersäureester (C4) von O-Desmethyltramadol


(rac-15) ein Substrat dar, welches gleichermaßen von Lipasen und Esterasen
akzeptiert und umgesetzt wird. Ausgehend von diesem Substrat führen kurzkettigere
Ester wie Essigsäureester (C2) rac-16 zu Substraten, die von der Esterase PLE mit
größerer Aktivität bei ähnlicher Selektivität wie der Buttersäureester umgesetzt
werden, da es sich um einen bevorzugteren Acylrest im Substrat handelt. Von
Lipasen, wie der CRL, werden diese Substrate allerdings mit geringerer Aktivität und
auch Selektivität umgesetzt, da es sich nicht um für Lipasen typische Acylreste
handelt. Des weiteren sind diese Ester schon so aktiviert, daß sie nur eine begrenzte
Stabilität gegen Autohydrolysereaktionen aufweisen, welches gerade im Hinblick auf
eine Racematspaltung in einem präparativen Maßstab ein entscheidender Nachteil
ist.

Eine weitere Verlängerung der Acylgruppe über die C4-Säure hinaus, würde zwar zu
von Lipasen bevorzugteren Substraten führen, aber auch den Nachteil einer
ungünstigeren Bilanz für die enzymatische kinetische Racematspaltung beinhalten.
Aus anwendungsbezogener Sicht ist daher ein möglichst einfacher kurzer Acylrest zu
verwenden.

Oft haben auch aktivierte Ester wie Halogen- oder Methoxycarbonsäureester einen
günstigen aktivierenden Einfluß auf die Enzym-katalysierte Hydrolyse. Die
Darstellung eines Choressigsäureesters von O-Desmethyltramadol gelang aber
nicht, da diese Verbindung so reaktiv war, daß sie unter gaschromatographischen
und flüssigchromatographischen Bedingungen nicht stabil war.

2.4.1.3 Enzym-katalysierte Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-


(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8)

Die Hydrolyse eines Esters von rac-8 zur Gewinnung der Enantiomeren setzt die
Darstellung dieser Verbindung voraus, was einen, wenn auch geringen, Aufwand
64 THEORETISCHER TEIL

darstellt. Einfacher wäre eine direkte enzymatische Acylierung von rac-8. Dies
vermag die Enzym-katalysierte Transacylierung im organischen Medium zu leisten.
Zudem kann auch in diesem Medium eine Racematspaltung von Verbindungen
gelingen, deren Ester hydrolyselabil sind. Auch haben im organischen Medium
hydrophobe Verbindungen eine erhöhte Löslichkeit, so daß hier Substrate eingesetzt
werden können, die sonst nicht im wässerigen Milieu umgesetzt werden können. Ein
weiterer interessanter Aspekt ist, daß in der enzymatischen Transacylierung
bevorzugt das Enantiomer acyliert wird, welches in der Umkehrreaktion der
enzymatischen Hydrolyse bevorzugt hydrolysiert wird. Somit sollte in der
enzymatischen Transacylierung von rac-8 bevorzugt das (−)-Enantiomer acyliert
werden, da in der hydrolytischen Reaktion (−)-8 gebildet worden ist (Abb. 2.21).
Neben dem (−)-Ester bleibt das nicht umgesetzte (+)-8 in der Reaktion als Produkt
zurück (Abb. 2.25). Enzym-katalysierte Transacylierung und Hydrolyse sind daher
unter dem Blickpunkt der Synthese enantiokomplementär.

Unter diesen Gesichtspunkten ist die Entwicklung einer Methodik zur enzymatischen
Transacylierung von rac-8, obwohl Bedingungen zu einer selektiven Enzym-
katalysierten Hydrolyse bekannt sind, durchaus von großem Interesse und auch
anwendungsbezogen.

Da die Hydrolyse von Estern des O-Desmethyltramadols durch verschiedene


Hydrolasen katalysiert wird, sollte die Umkehrreaktion, die Transacylierung im
organischen Medium, ebenfalls von diesen Enzymen, bei Wahl der richtigen
Reaktionsbedingungen, katalysiert werden können. In eigenen Vorarbeiten gelang es
allerdings nicht, rac-8 in einer PLE-katalysierten Reaktion mit Vinylbutyrat (4 Äquiv.)
in Toluol als Lösungsmittel zu acylieren (Abb. 2.24).80 Es wurde zwar in dieser
Reaktion eine Katalysatorspezies aus MPEG/PLE gewählt, die eine höhere Aktivität
im organischen Lösungsmittel besitzt als native PLE81,82, doch ist das Enzym PLE im
allgemeinen wesentlich weniger aktiv im organischen Medium als Lipasen.5,6 Eine
Lipasen-katalysierte Transacylierung von rac-8 sollte daher trotz dieser Ergebnisses
möglich sein.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 65

Me2N OH
O Pr
OH MPEG/PLE
OH O
(−)-15
Vinylbutyrat +
Me2N Toluol OH
rac-8 RT OH

Me2N
(+)-8
Abb. 2.24: Versuch zur PLE-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8.

INAGAKI et al. führten die bereits auf S. 43 erwähnte enzymatische Acylierung des
1,1´-Binaphthalin-2,2´-diols (rac-36) mit 20 Äquiv. eines Vinylesters in Diisopropyl-
ether mit 10 % Aceton als Lösungsmittel mit guter Selektivität (E > 60) durch.162 Der
Zusatz an Aceton wurde benötigt, um das Substrat zu lösen, welches in reinem
Diisopropylether nur mäßig löslich war. Von einem Einfluß des Acetons auf die
Aktivität des Enzyms oder die Selektivität der Reaktion wird nicht berichtet.
Von diesen Reaktionsbedingungen ausgehend wurden für eine Enzym-katalysierte
Transacylierung des Substrats rac-8 2 Äquiv. Vinylpropionat als Acylierungsmittel
und das Lösungsmittel Diethylether als Reaktionsbedingungen ausgewählt (Abb.
2.25).

Me2N OH
O Et
OH Lipase
OH O
Vinylpropionat (−)-15
+
Me2N Diethylether
RT OH
rac-8 OH

Me2N
(+)-8

Abb. 2.25: Enzym-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-8.

Es wurden sieben Lipasen in die enzymatische Transacylierung unter den genannten


Bedingungen eingesetzt (Tabelle 2.14). Um den Verbrauch an Substrat und
eingesetzten Reagenzien möglichst gering zu halten, wurden alle Reaktionen in
einem 0.25 mmol Maßstab in 5 ml Lösungsmittel durchgeführt.
66 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.14: Versuche zur Transacylierung des Phenols rac-8 in Diethylether

Reaktionsbedingungen Reaktions-
Enzym Umsatz
(Äquiv.) zeit

Porcine pancreatic Lipase


Vinylpropionat (2) 14 d 0%
(PPL; 335 U/ml)
Burkholderia cepacia Lipase
Vinylpropionat (2) 14 d 0%
(BCL, 120 U/ml)
Candida rugosa Lipase
Vinylpropionat (2) 14 d 2%
(CRL; 29 U/ml)
Rhizopus niveus Lipase
Vinylpropionat (2) 14 d 0%
(0.026 U/ml)
Candida antarctica Lipase
Vinylpropionat (2) 14 d 0%
(CAL; 3.2 U/ml)
Rhizopus arrhizus Lipase
Vinylpropionat (2) 14 d 0%
(0.02 U/ml)
Aspergillus niger Lipase
Vinylpropionat (2) 14 d 0%
(1 U/ml)

Keine der in Tabelle 2.14 eingesetzten Lipasen katalysiert die Transacylierung von
rac-8 unter den gewählten Reaktionsbedingungen. Da die Enzyme CRL, BCL und
PPL in der Hydrolyse von rac-15 eine hohe Aktivität und eine moderate Selektivität
zeigen, ist davon auszugehen, daß diese Enzyme auch in der Acylierung von rac-8
aktiv sein sollten. Dies deutet daraufhin, daß für das Enzymscreening in Tabelle 2.14
ungeeignet Reaktionsbedingungen gewählt wurden. Hiervon ausgehend wurde
daraufhin, um bessere Bedingungen zu finden, eine ausgewählte Lipase (PPL) mit
5 Äquiv. Vinylacetat in verschiedenen Lösungsmitteln eingesetzt (Tabelle 2.15).
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 67

Tabelle 2.15: Versuche zur PPL-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8


unter verschiedenen Reaktionsbedingungen (335 U/ml)

Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)

Vinylacetat (5), 28 d 2%
Dichlormethan (H2O ges.)
Vinylacetat (5),
28 d 1%
Trichlormethan (H2O ges.)

Vinylacetat als Solvens 12 d 6%

Aus Tabelle 2.15 geht hervor, daß in den polaren Lösungsmitteln Dichlormethan und
Trichlormethan ebenfalls keine nennenswerte Acylierung zu beobachten ist. In
reinem Vinylacetat als Transacylierungsmittel und Lösungsmittel, was einem
Überschuß von 252 Äquiv. entspricht, ist eine geringe Enzym-katalysierte Bildung
des Acetats 16 nach 2 Wochen zu beobachten. Aufgrund des geringen Umsatzes
wurde keine Enantiomerenüberschußbestimmung durchgeführt. Die in Vinylacetat
als Solvens erzielte enzymatische Acylierung von O-Desmethyltramadol bestätigt die
zuvor gemachte Aussage, daß eine Acylierung von rac-8 unter geeigneten
Bedingungen möglich ist. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist aber extrem langsam. Es
wurden daher die beiden Lipasen BCL (Tabelle 2.16) und CRL (Tabelle 2.17 und
Tabelle 2.18), die in der Hydrolyse von rac-15 die größten Selektivitäten erreichten,
ebenfalls unter diesen Reaktionsbedingungen in die Transacylierung von rac-8
eingesetzt.
68 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.16: BCL-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-8 (120 U/ml)

Reaktionsbedingungen Nach
E-Wert
(Äquiv.) 28 d

Umsatz 3%
Vinylacetat (5), n. b.
ee Ester (−)-16 -
Diisopropylether
ee Phenol (+)-8 n. b.

Umsatz 18 %
Vinylacetat als Solvens ee Ester (−)-16 10 % 1.2
ee Phenol (+)-8 2%

Wie in der PPL-katalysierten Transacylierung von rac-8 wird auch mit dem Enzym
BCL eine Transacylierung mit Vinylacetat als Lösungsmittel beobachtet.
Entsprechend dem zuvor erzielten Ergebnis verläuft auch die BCL-katalysierte
Transacylierung mit einer geringen Reaktionsgeschwindigkeit. Ein Umsatz von 18 %
ist erst nach 3 Wochen zu beobachten (Tabelle 2.16). Es wird der (1S,2S)-
konfigurierte Ester (−)-16 mit einem ee-Wert von 10 % gebildet. Die Racemat-
spaltung verläuft allerdings unselektiv (E = 1.2).

Mit dem Enzym CRL wurden in der Hydrolyse von rac-15 die besten Ergebnisse
erzielt. In der enzymatischen Transacylierung ist, wie bei allen zuvor getesteten
Enzymen, kein nennenswerter Umsatz von rac-8 in den als Lösungsmittel
eingesetzten Ethern MTBE und Diisopropylether zu beobachten (Tabelle 2.17). In
Vinylacetat als Lösungsmittel ist ein Umsatz von 36 % nach 3 Wochen zu
beobachten. Die Verwendung des Acylierungsmittels nicht nur als Reagenz, sondern
auch als Solvens, führt somit bei allen eingesetzten Lipasen zu einer Acylierung des
Phenols rac-8, wenn auch mit relativ langsamer Reaktionsgeschwindigkeit. Die in
dieser Reaktion erzielte Selektivität ist zwar die bisher höchste, die zu beobachten
war, sie ist aber ausgedrückt in einem E-Wert von 3 als schlecht zu bewerten.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 69

Tabelle 2.17: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinyl-


acetat als Acylierungsmittel (14 U/ml)

Reaktionsbedingungen Nach
E-Wert
(Äquiv.) 28 d

Umsatz 2%
Vinylacetat (5), n. b.
ee Ester (−)-16 -
Diisopropylether
ee Phenol (+)-8 n. b.

Umsatz 8%
Vinylacetat (5), n. b.
ee Ester (−)-16 -
MTBE
ee Phenol (+)-8 n. b.

Umsatz 36 %
Vinylacetat als Solvens ee Ester (−)-16 38 % 3.0
ee Phenol (+)-8 21 %

Umsatz 66 %
Vinylacetat (5), 33 %
ee Ester (−)-16 2.5
Dichlormethan
ee Phenol (+)-8 26 %

Interessanterweise kann mit dem Lösungsmittel Dichlormethan in der CRL-


katalysierten Transacylierung von rac-8 mit Vinylacetat die größte Aktivität des
Enzyms beobachtet werden. Unter diesen Bedingungen werden 66 % Umsatz nach
3 Wochen erreicht. Eine Steigerung der Selektivität der CRL-katalysierten
Transacylierung verglichen mit dem Solvens Vinylacetat ist aber nicht zu
beobachten.

Von GAIS et al. ist in Untersuchungen zur MPEG/PLE-katalysierten Transacylierung


racemischer sekundärer Alkohole mit Vinylacetat, -propionat und –butyrat beobachtet
worden, daß mit zunehmender Kettenlänge des Acyldonors die Geschwindigkeit und
die Selektivität der Transacylierung zunehmen.81,84 Aus diesem Grund wurde
Vinylbutyrat als Acylierungsmittel in die CRL-katalysierte Transacylierung von rac-8
unter den bisher geeigneten Bedingungen, Acylierungsmittel oder Dichlormethan als
Lösungsmittel, eingesetzt (Tabelle 2.18). Mit Dichlormethan als Solvens und
70 THEORETISCHER TEIL

Vinylbutyrat als Acylierungsmittel ist allerdings nicht wie zuvor im Falle des
Vinylacetats ein Umsatz zu beobachten. Die CRL-katalysierte Reaktion mit
Vinylbutyrat als Acylierungs- und Lösungsmittel hingegen verläuft mit einer ähnlichen
geringen Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität wie die Reaktion in Vinylacetat.
Eine Steigerung wie im Falle der sekundären Alkohole in der MPEG/PLE-Katalyse ist
nicht zu beobachten.

Tabelle 2.18: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinyl-


butyrat als Acylierungsmittel (37 U/ml)

Reaktionsbedingungen nach
E-Wert
(Äquiv.) 17 d

Umsatz 4%
Vinylbutyrat (5), n. b.
ee Ester (−)-15 -
Dichlormethan
ee Phenol (+)-8 n. b.

Umsatz 15 %
Vinylbutyrat als Solvens ee Ester (−)-15 28 % 2
ee Phenol (+)-8 15 %

Mit dem Acylierungsmittel als Solvens ist eine Reaktionsbedingung gefunden


worden, in der eine Lipasen-katalysierte Transacylierung möglich ist, wenn auch mit
geringer Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität. Es lag nun nahe die PLE
ebenfalls unter diesen neuen Reaktionsbedingungen einzusetzen. Zusätzlich wurden
neben dem Acylierungsmittel noch Di- und Trichlormethan als Lösungsmittel
eingesetzt (Tabelle 2.19). Da native PLE im organischen Medium nur eine geringe
Aktivität besitzt, wurde MPEG/PLE als Katalysatorpräparation eingesetzt (vgl.
Kap. 2.1). Wie aus Tabelle 2.19 hervorgeht ist eine PLE-katalysierte Acylierung von
rac-8 in Di- oder Trichlormethan als Lösungsmittel nicht durchführbar. In
Vinylpropionat als Solvens ist eine PLE-katalysierte Transacylierung zu beobachten.
Somit ist es prinzipiell gelungen die für Lipasen gefundenen Reaktionsbedingungen
auf die PLE zu übertragen, allerdings ist die Reaktionsgeschwindigkeit wie in Fall der
Lipasen äußert gering.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 71

Tabelle 2.19: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols


rac-8

Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)

Vinylpropionat (5),
21 d 0%
Dichlormethan
Vinylpropionat (5),
21 d 0%
Trichlormethan

Vinylpropionat als Solvens 4d 5%

Zusammenfassend ist es gelungen, Reaktionsbedingungen zu finden, unter denen


eine Enzym-katalysierte Acylierung des Phenols rac-8 durchführbar ist. Die
Reaktionsgeschwindigkeit ist allerdings in allen Fällen sehr langsam. Die bisher
erzielten Reaktionszeiten von mehreren Wochen sind wenig ansprechend und für
eine präparative Racematspaltung nicht akzeptabel. Zudem sind keine geeigneten
Reaktionsbedingungen für eine selektive enzymatische Racematspaltung des
Phenols rac-8 gefunden worden. Die bisher erzielten Selektivitäten mit E-Werten von
1 bis 3 sind ebenfalls nicht für eine Racematspaltung des Phenols rac-8 im
präparativen Sinne verwendbar.
Die höchste Selektivität in der enzymatischen Acylierung von rac-8 wird mit der
Candida rugosa Lipase beobachtet, die somit nicht nur in der Hydrolyse des
Buttersäureesters von rac-8 das geeigneteste Enzym darstellt, sondern auch das für
die Umkehrreaktion, die Transacylierung von rac-8.

Daß die enzymatischen Hydrolysen mit hoher Selektivität katalysiert werden, die
Transacylierungen im organischen Medium jedoch nicht, kann gerade im Hinblick auf
die zusätzlich noch sehr langsame Reaktion dadurch erklärt werden, daß die
eingesetzten Enzyme im wäßrigen Medium flexibler sind. Eine Anpassung der
Struktur des aktiven Zentrums an unterschiedliche Strukturmerkmale des Substrats
bei der Bildung des Substrat-Enzym-Komplexes im Sinne eines „induced fit“ ist im
wäßrigen Milieu erleichtert, da Wassermoleküle als „molekulares Schmiermittel“
fungieren können.150,187,188 Auch kann die unterschiedliche Solvatation von
Reaktanden, hier gerade des sehr polaren Phenols, und von Übergangszuständen
72 THEORETISCHER TEIL

im organischen und wäßrigen Medium ein Grund für die unterschiedlichen


Selektivitäten sein.

Die in der enzymatischen Transacylierung erzielten Ergebnisse sind auch unter dem
Blickpunkt zu sehen, daß die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Reaktionen
erst einen Anfang in der Untersuchung der enzymatischen Acylierung von Tramadol-
Analoga mit phenolischer Hydroxylgruppe darstellen. Umfassendere
Untersuchungen zu Reaktionsparametern wie Acylierungsreagenz (s. Kap. 2.3.2.2),
Lösungsmitteleinfluß und Wasseraktivität können Reaktionsbedingungen aufzeigen,
unter denen eine selektive Enzym-katalysierte Racematspaltung von phenolischen
Substraten wie rac-8 durchaus möglich ist.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 73

2.4.1.4 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-


(3-dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17)

Ein neues Tramadol-Analoga, dessen Entwicklung in der GRÜNENTHAL GmbH mit


vielversprechenden Resultaten betrieben wird, ist das (±)-(2RS,3RS)-
4-Dimethylamino-2-(3-methoxyphenyl)-3-methyl-butan-2-ol (rac-38, Abb. 2.26).189 Es
unterscheidet sich vom Tramadol (rac-7) dadurch, daß es statt einem Cyclohexylring
eine offenkettige Struktur besitzt. Über die analgetische Aktivität offenkettiger
Tramadolderivate ist jüngst von BUSCHMANN, SUNDERMANN und MAUL berichtet
worden.46 Sie stellen Untersuchungen über die Aktivität der Enantiomeren des
3-(3-Dimethylamino-1-ethyl-1-hydroxy-2-methyl-propyl)-phenols vor. Diese Wirkstoffe
unterscheiden sich von rac-38 durch eine um ein C-Atom verlängerte Kette an der
tertiären OH-Gruppe. Außerdem wird direkt das Phenol untersucht, welches im Falle
des rac-38 wahrscheinlich ebenfalls in vivo als Metabolit gebildet wird.

OH
OMe

Me2N
rac-38
Abb. 2.26: Racemisches 4-Dimethylamino-2-(3-methoxyphenyl)-3-methyl-butan-
2-ol, ein Entwicklungskandidat der GRÜNENTHAL GmbH mit offenkettiger
Struktur.

Die Struktur des rac-38 bietet ebenso wie das Tramadol keinen direkten Angriffs-
punkt für eine Enzym-katalysierte Racematspaltung. Nach O-Demethylierung steht
aber auch hier die aromatische Hydroxylgruppe zur Verfügung. Es sollte daher
versucht werden, eine Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung mit diesem
offenkettigem Phenol (rac-11) durchzuführen.

Zuerst wurde die enzymatische Hydrolyse des Buttersäureesters von rac-11


untersucht, da im Falle des O-Desmethyltramadols in der Hydrolyse die besten
Ergebnisse in der Racematspaltung erzielt worden waren. Es wurde der racemische
Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17)
in die Enzym-katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.27). Als Reaktions-
74 THEORETISCHER TEIL

bedingungen wurden die bisherigen Standardreaktionsbedingungen, wäßriges


Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens bei Raumtemperatur, gewählt.
Als Enzyme wurden zunächst die bisher in der Hydrolyse von Estern des
O-Desmethyltramadols erfolgreich angewendeten Hydrolasen Schweineleber-
Esterase und Candida rugosa Lipase eingesetzt (Tabelle 2.20).

Me2N OH
O Pr
OH Enzym
O Pr O
Phosphatpuffer- 17
Me2N O Lösung
+
10 % Cosolvens OH
rac-17 RT OH

Me2N
11
Abb. 2.27: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17.

Die Ergebnisse der enzymatischen Hydrolysen von rac-17 sind in Tabelle 2.20
zusammengefaßt. Rac-17 wird von beiden eingesetzten Enzymen als Substrat
akzeptiert und beide Hydrolasen zeigen eine hohe Aktivität in der Hydrolyse des
Esters. Es ist allerdings nahezu keine Enantiomer-Differenzierung der beiden
Enzyme zu beobachten. Beide Reaktionen verlaufen unselektiv.

Tabelle 2.20: Enzym-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-17 (Phosphatpuffer;


10 % tert-Butanol)

Reaktions- ee Ester ee Phenol


Enzym Umsatz E-Wert
zeit 17 11

Schweineleber-Esterase
25 Min. 69 % 7% 1% 1.1
(PLE; 1.3 U/ml), pH 8.0
Candida rugosa Lipase
2.5 h 17 % 1% 3% 1.1
(CRL; 2.4 U/ml), pH 7.0

Der Grund für die mangelnde Selektivität der enzymatischen Reaktionen kann nur in
der Molekülstruktur des Substrates liegen. In Molekül rac-17 fehlt die geschlossenen
Ringstruktur des Tramadol-Moleküls, daher ist das Molekül und besonders die
Dimethylaminomethyl-Seitenkette viel flexibler. Von der angreifenden Seringruppe im
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 75

Enzym gesehen, liegen die Stereozentren am „anderen Ende“ der angegriffenen


Acylgruppe. Ihr Einfluß auf die Enantiomer-Differenzierbarkeit des Enzyms ist
aufgrund der erhöhten Flexibilität viel geringer als beispielsweise bei rac-15.
Den Versuch rac-17 in die CRL-katalysierte Hydrolyse im wäßrig-organischem
Zweiphasensystem einzusetzen, wurde nach den bisherigen Erfahrungen wenig
Erfolg in Aussicht gestellt und daher nicht durchgeführt.

2.4.1.5 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-


3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11)

Es wurde ebenfalls in einem „Enzymscreening“ untersucht, ob eine Enzym-


katalysierte Transacylierung des Phenols rac-11 möglich ist und ob diese unter
Umständen selektiver verläuft als die entsprechende enzymatische Hydrolyse.
Für diese Versuchsreihe wurde allerdings Diethylether als Lösungsmittel, nach
Reaktionsbedingungen von INAGAKI et al 162, gewählt, da zu dem Zeitpunkt dieser
Untersuchungen noch nicht bekannt war, daß das Transacylierungsreagenz ein
geeignetes Reaktionsmedium für die enzymatische Acylierung von Phenolen
darstellt. Um eine eventuelle enzymatische Reaktion günstig zu beeinflussen, wurde
Vinyllaurat als Acylierungsmittel gewählt (Abb. 2.28), da dies aufgrund seiner
erhöhten Kettenlänge in eine Lipasen-katalysierte Reaktion bevorzugter als
Vinylpropionat (vgl. Tabelle 2.14) umgesetzt werden könnte.

Me2N OH
OH
OH Enzym
OH
11
Vinyllaurat
Me2N Diethylether +
RT OH
rac-11 O C11H23

Me2N O
44
Abb. 2.28: Enzym-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-11.
76 THEORETISCHER TEIL

Allerdings, wie aus den Versuchen zur Transacylierung des O-Desmethyltramadols


in Diethylether zu erwarten war, ist auch bei allen in die Transacylierung von rac-11
eingesetzten Lipasen keine Reaktion zu beobachten (Tabelle 2.21).

Tabelle 2.21: Versuche zur Lipasen-katalysierten Transacylierung des Phenols


rac-11 in Diethylether

Reaktionsbedingungen Reaktions-
Enzym Umsatz
(Äquiv.) zeit

Burkholderia cepacia Lipase


Vinyllaurat (2) 14 d 0%
(BCL, 800 U/ml)
Candida rugosa Lipase
Vinyllaurat (2) 14 d 0%
(CRL; 29 U/ml)
Candida antarctica Lipase
Vinyllaurat (2) 14 d 0%
(CAL; 16 U/ml)
Rhizopus arrhizus Lipase
Vinyllaurat (2) 14 d 0%
(0.02 U/ml)
Aspergillus niger Lipase
Vinyllaurat (2) 14 d 0%
(0.001 U/ml)

Eine Enzym-katalysierte Acylierung von rac-11 wäre sicherlich unter den für das
O-Desmethyltramadol (rac-8) gefundenen Bedingungen möglich, doch wird auch hier
nach den bisherigen Ergebnissen sowohl in der Acylierung von rac-8 als auch in der
Hydrolyse von rac-17 keine Enantiomer-Differenzierung der Enzyme zu beobachten
sein.
Das offenkettige, phenolische Tramadol-Analogon rac-11 ist somit kein geeignetes
Substrat für eine Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung zur Darstellung von
Enantiomeren. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Flexibilität des
Moleküls vergleichen mit dem Tramadol-Molekül der Fall. Zur Darstellung der
Enantiomeren kann ausgehend von Verbindung 38 aber auf ein Verfahren zur
thermodynamischen oder klassischen Racematspaltung mit Weinsäurederivaten
zurückgegriffen werden.

Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Phenols 11 erfolgte


durch Vergleich der Drehwerte mit bereits in der Literatur publizierten Drehwerten der
Hydrochloride der Enantiomeren von 11.189
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 77

2.4.2 Substrate auf Basis sekundärer Hydroxylfunktionen

Während es sich bei dem Substrat O-Desmethyltramadol (rac-8) noch um einen


Metaboliten des Tramadols und daher um eine Substanz mit seit längerem
bekannten pharmakologischen Profil handelt, stellt die Gruppe der Tramadol-
Analoga mit zusätzlicher sekundärer Hydroxylfunktion, eine Gruppe von
Verbindungen mit bisher noch nicht erschlossenen Potential in der Schmerztherapie
dar. Entdeckt wurde diese interessante Gruppe von Verbindungen von der
GRÜNENTHAL GmbH bei systematischen Strukturvariationen des Tramadol-Grund-
gerüsts auf der Suche nach neuen analgetisch aktiven Verbindungen.
In die, im Rahmen dieser Arbeit, untersuchten enzymatischen Racematspaltungen
wurden die in Abb. 2.29 dargestellten hydroxylsubstituierten Tramadol-Analoga
eingesetzt. Sie leiten sich vom Tramadol dadurch ab, daß in 4- bzw. 5-Position des
Tramadols eine Hydroxylgruppe in den Cyclohexylring eingefügt worden ist. Der
Syntheseweg dieser Verbindungen wurde bereits in Kap. 2.2.1 auf S. 24 dargestellt.
Das zur Verbindung rac-14 epimere (±)-(1RS,2RS,4RS)-1,4-Diol ist nicht mehr im
Rahmen dieser Arbeit bearbeitet worden, obwohl die pharmakologischen
Eigenschaften dieser Verbindung ebenfalls untersucht werden.

OH OH OH
3 1 OMe 3 1 OMe
1,3-Diole: HO 6 6
Me2N Me2N
(±)-(1RS,3SR,6RS)-12 (±)-(1RS,3RS,6RS)-13

OH
1 OMe
1,4-Diol: HO 2
4 Me2N
(±)-(1RS,2RS,4SR)-14

Abb. 2.29: Hydroxysubstiutierte Tramadol-Analoga, die in der Enzym-katalysierten


kinetischen Racematspaltung als Substrate untersucht werden.

Sekundäre Alkohole sind die idealen, fast klassischen Substrate für eine Hydrolasen-
katalysierte kinetische Racematspaltung. Aufgrund der Vielzahl der einsetzbaren
Enzyme und deren geringer Substratspezifität bei trotzdem hoher Selektivität hat
diese Methode eine große Anwendungsbreite erlangt. Gerade bei unterschiedlicher
78 THEORETISCHER TEIL

Größe der Substituenten am Chiralitätszentrum werden häufig sehr hohe


Selektivitäten in der Enantiomer-Differenzierung des Enzyms beobachtet und sehr
gute Ergebnisse in der Racematspaltung erzielt. Daher gibt es in der Literatur auch
eine monatlich wachsende Zahl von Beispielen. Ebenso gibt es bis heute eine
Vielzahl von Beispielen zur Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltung von
substituierten Cyclohexanolderivaten als einen Sonderfall der sekundären
Alkohole.190,191,192
Exemplarisch seien hier die Enzym-katalysierte Racematspaltung von trans-
2-substituierten Cyclohexanolen191 (39, Abb. 2.30) und trans-2-substituierten
2-Cylohexenolen192 (40, Abb. 2.30) im organischen Medium erwähnt, welche sehr
gut untersuchte Reaktionen darstellen. Sie verlaufen im allgemeinen mit sehr guter
Selektivität und können so zur Synthese einer Vielzahl synthetisch wertvoller
Intermediate herangezogen werden.

OH OH OH OH
R R OMe

N
OMe
39 40 rac-41 rac-42
R = Me, Ph, SPh R = H, Br, SPh
I, Br, Cl, CN
NHPh, NO2, N3
OTs, OMe, OAc
CH2SPh, CH2COPh, CO2Et

Abb. 2.30: Beispiele von bereits in Lipasen-katalysierte Racematspaltungen im


organischen Medium eingesetzten Substraten auf Cyclohexanolbasis.
Dargestellt ist das bevorzugt umgesetzte Enantiomer.

Es wurden ebenfalls sterisch anspruchsvollere Verbindung wie beispielsweise rac-41


und rac-42 (Abb. 2.30) in die Lipasen-katalysierte Transacylierung eingesetzt. In der
CRL-katalysierten Acylierung von rac-41 mit Vinylacetat als Acyldonor und
Diisopropylether als Solvens konnte nach 22 h bei 50 % Umsatz (+)-41 mit einem
ee-Wert von 83 % und das entstandene Acetat mit einem ee-Wert von 94 % (E = 72)
erhalten werden.193 Die Acylierung von rac-42 wird ebenfalls von der Candida rugosa
Lipase katalysiert und verläuft mit noch höherer Selektivität. Der zurückbleibende
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 79

Alkohol kann mit 93 % ee und das erhaltene Acetat mit 94 % ee erhalten werden
(E = 110).194

In Analogie zu den Tramadol-Analoga ist in der Verbindung 42 ein tertiäres


Stickstoffatom vorhanden. Das cyclohexanolische Substrate, die wie das Tramadol
Dimethylaminomethyl-substituiert sind, ebenfalls von Hydrolasen als Substrate
akzeptiert werden, konnten KANERVA et al. zeigen.

NMe2 Lipase PS NMe2 NMe2


+
Vinylacetat
OH Diethylether OCOR OH
(−)-(1R,2R) (+)-(1S,2S)
38 %, 99 % ee 49 %, 96 % ee

CAL-B
NMe2 (Novozym 435) NMe2 NMe2
+
Vinylacetat
OH OCOR OH
Diethylether
(+)-(1R,2S) (−)-(1S,2R)
42 %, 98 % ee 34 %, 96 % ee

Abb. 2.31: Lipasen-katalysierte Transacylierungen von 2-Dimethylaminomethyl-


cyclohexanolen im organischen Medium.

KANERVA et al. gelang die Lipasen-katalysierte Acylierung von verschiedenen


2-Dialkylaminomethyl-cyclohexanolen mit hoher Selektivität. Sowohl für die cis- als
auch für die trans-konfigurierte Dimethylaminomethyl-substituierte Verbindung
wurden E-Werte größer 200 erreicht (Abb. 2.31).195 Im Falle der cis-konfigurierten
Verbindung verläuft die Novozym 435-katalysierte Acylierung äußerst langsam, die
Lipase PS-katalysierte Reaktion verläuft hingegen mit hoher Aktivität und Selektivität.

Von GOTOR et al. ist das am Stickstoffatom unsubstituierte racemische trans-


2-Aminocyclohexanol in die CAL-katalysierte Acylierung eingesetzt worden.196
Allerdings wurde bevorzugt eine Acylierung am Stickstoffatom beobachtet, die mit
mittelmäßiger bis guter Selektivität verlief. Eine Enzym-katalysierte Acylierung am
Sauerstoffatom konnte mit hoher Selektivität erreicht werden, indem die
N-Benzyloxycarbonyl geschützte Verbindung in die Pseudomonas cepacia Lipase
(BCL) katalysierte Transacylierung eingesetzt wurde (Abb. 2.32).
80 THEORETISCHER TEIL

H
N O Ph NHCbz NHCbz
BCL
O +
Vinylacetat
OH 1,4-Dioxan OCOMe OH
(−)-(1R,2R) (+)-(1S,2S)
31 %, 99 % ee 63 %, 49 % ee

H
N O Ph NHCbz NHCbz
CAL
+
O Vinylacetat
OH MTBE OCOMe OH
(−)-(1R,2S) (+)-(1S,2R)
43 %, 96 % ee 43 %, 96 % ee

Abb. 2.32: Lipasen-katalysierte Transacylierungen von N-Benzyloxycarbonyl


geschützten 2-Aminocyclohexanolen im organischen Medium.

In diesem Fall ließ sich das entsprechende cis-konfigurierte Isomer in der CAL-
katalysierten Transacylierung mit hoher Aktivität und Selektivität umsetzten (Abb.
2.32).197 Racemische 2-Methylamino-cyclohexanole lassen sind ebenfalls unter
diesen Bedingungen mit sehr guten Ergebnissen in die enzymatische
Racematspaltung einsetzten, wenn die freie Valenz am Stickstoff mit einer
Butoxycarbonyl-Gruppe (Boc) geschützt wird.198
Von SEKAR et al. wurden Untersuchungen zur Umkehrreaktion im wäßrigen Medium
durchgeführt. Es wurden Acetate von N-Aryl-substituierten 2-Aminocyclohexanolen in
die PLE-katalysierten Hydrolyse eingesetzt, die ebenfalls hochselektiv verlaufen.199

NAEMURA et al. berichten von Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltungen


von cis- und trans-1-Phenylcyclohexan-1,2-diol.200 Verbindungen, die dem Tramadol
ebenfalls strukturell ähnlich sind. Interessanterweise zeigen die Enzyme
Candida rugosa Lipase und Schweineleber-Esterase eine entgegengesetzte
Enantiopräferenz hinsichtlich der cis-konfigurierten Verbindung: In der Hydrolyse des
Acetats wird so von der PLE bevorzugt das (+)-Enantiomer bevorzugt zum 1R,2R-
konfigurierten (+)-Diol umgesetzt, von der CRL hingegen das (−)-Enantiomer (Abb.
2.33). Obwohl in der PLE-katalysierten Hydrolyse das (+)-Diol nur mit einem ee-Wert
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 81

von 84 % erhalten worden ist, konnte die enantiomerenreine Verbindung durch


anschließende Umkristallisation erhalten werden.
Ph Ph Ph
PLE
OH OH OH
(±) - Phosphatpuffer- +
OAc Lösung (pH 8.0) OH OAc
H 1 % EtOH H H
(+)-(1R,2R) (−)-(1S,2S)

46 %, 84 % ee 46 %, 85 % ee

Ph Ph Ph
CRL
OH OH OH
(±) - Phosphatpuffer- +
OAc Lösung (pH 7.5) OH OAc
H Cosolvens H H
(−)-(1S,2S) (+)-(1R,2R)
46 %, 27 % ee 46 %, 26 % ee

Abb. 2.33: Enzymatische Racematspaltungen von 1-Phenylcyclohexan-1,2-diolen.

Hinsichtlich der trans-konfigurierten Verbindung zeigen beide Enzyme die gleiche


Enantiopräferenz, beide Enzyme hydrolysieren das (−)-1S,2R-Enantiomer schneller.
82 THEORETISCHER TEIL

2.4.2.1 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-


dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-
ester (rac-18)

Ausgehend von den Ergebnissen zur enzymatischen Hydrolyse des (±)-Buttersäure-


3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) wurde für das
Substrat rac-18 wiederum das Butyrat als Acylrest gewählt, welches nach den zuvor
gemachten Aussagen für Lipasen und Esterasen gleichermaßen ein geeignetes
Substrat darstellen sollte. Ebenfalls werden, auch zu einer besseren Vergleichbarkeit
mit den bisherigen Ergebnissen, die Standardreaktionsbedingungen beibehalten.
Auf den bisherigen Erfahrungen in der Enzym-katalysierten Racematspaltung
aufbauend wurde darauf verzichtet, eine große Anzahl von Enzymen zu
untersuchen. Vielmehr wurden die Enzyme eingesetzt, die bereits gute katalytische
Eigenschaften hinsichtlich der Tramadol-Analoga als Substrate gezeigt hatten.
Eins dieser Enzyme ist die Schweineleber-Esterase, die sich als Enzym zur
kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga bewährt hat, daher wurde
rac-18 in die PLE-katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.34).

Me2N OH
OMe
O
O OH O
PLE
OMe Pr (−)-18
Pr O Phosphatpuffer-
+
Me2 N Lösung
10 % Cosolvens OH
rac-18 RT OMe
HO
Me2N
(+)-12
Abb. 2.34: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18.

Die PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 verlief mit hoher Aktivität des
Enzyms hinsichtlich der Hydrolyse des Substrates. So wurde nach 5.75 Stunden ein
Umsatz von ca. 40 % erreicht und anschließend die Reaktion durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach anschließender
Säulenchromatographie mit Essigsäureethylester und Methanol im Verhältnis 1 : 1
an Kieselgel konnte der 1R,3S,6R-konfigurierte Alkohol (+)-12 in 30 % Ausbeute mit
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 83

94 % ee isoliert werden. Der 1S,3R,6S-konfigurierte Ester (−)-18 konnte in 47 %


Ausbeute mit einem ee-Wert von 86 % erhalten werden (Tabelle 2.22).
Zur Angabe der Ausbeuten ist zu beachten, daß aufgrund des erreichten Umsatzes
von ca. 40 % die maximal zu erreichende Ausbeute des Alkohols bei 40 % und die
des Esters bei 60 % liegt.

Tabelle 2.22: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 (1.6 U/ml; Phosphat-
puffer, pH 8.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (−)-18 Ester (−)-18 (+)-12 Alkohol (+)-12

5.75 h 86 % 47 % 94 % 30 % 89

Die beobachtete Selektivität der Reaktion läßt sich durch einen E-Wert von 89
ausdrücken. Die in der Hydrolyse des Esters rac-18 erzielte Selektivität ist direkt
sehr hoch. Wie aus Abb. 2.35 hervorgeht liegt der nicht umgesetzte Ester (−)-18 ab
einem Umsatz von ca. 53 % enantiomerenrein vor und kann daher in hohen
Ausbeuten erhalten werden. Auch der gebildete Alkohol (+)-12 kann bis zu einem
Umsatz von ca. 40 % in der enzymatischen Hydrolyse mit guten ee-Werten isoliert
werden.
Es ist daher möglich beide Enantiomere in guter Ausbeute und mit guten bis sehr
guten Enantiomerenüberschüssen zu erhalten. Je nachdem, welches Enantiomer
gewünscht ist, kann die Reaktion bei einem Umsatz von ca. 40 % gestopt und der
(+)-Alkohol isoliert werden. Oder die Reaktion wird erst bei einem Umsatz von ca.
55 % aufgearbeitet und der (−)-Ester mit hohen Enantiomerenüberschüssen
erhalten, der dann noch anschließend zum (−)-Alkohol hydrolysiert werden muß.
84 THEORETISCHER TEIL

Abb. 2.35: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (−)-18 (S) und Produkt (+)-12
(P) bei einer Selektivität von E = 89.

Wie zu erwarten war, ist die zu erzielende Selektivität in der Hydrolyse eines Esters
von einem sekundären Alkohol, wie rac-18, höher als die Selektivität in der
Hydrolyse eines phenolischen Esters, wie z.B. bei rac-15.

Interessanterweise wird bei der PLE-katalysierten Hydrolyse des Phenylesters


rac-15 das (−)-1S,2S-konfigurierte Enantiomer schneller hydrolysiert und im Fall der
PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 das (+)-1R,3S,6R-konfigurierte
Enantiomer. Diese Substratspezifität läßt sich durch ein Selektivitätsmodel
veranschaulichen.
Da aufgrund der mikroheterogenen Zusammensetzung der PLE keine
Röntgenstrukturanalyse dieses Enzyms existiert, wurden die Strukturen von über
hundert Substraten verglichen, um daraus Rückschlüsse auf die dreidimensionale
Struktur des aktiven Zentrums zu ziehen. Daraus wurden trotz der komplizierten
Zusammensetzung der PLE Selektivitätsmodelle zur Erklärung von Substratspezifität
und Selektivität entworfen. So wurden bereits in den 80er Jahren Modelle zur
Vorhersage der Selektivität der PLE entworfen.201,202 1990 entwickelten JONES et al.
daraus ein Würfelmodell, das schematisch den Aufbau des aktiven Zentrums der
PLE wiedergeben soll (Abb. 2.36).204 Durch weitere Untersuchungen wurde es in den
folgenden Jahren modifiziert.203,204,205 Mit Hilfe dieses deduktiven Modells gelang es,
Voraussagen über potentielle neue Substrate zu treffen. Es werden jedoch nur
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 85

Hydrolysen von Carbonsäuremethylestern bzw. Dicarbonsäuredimethylestern


berücksichtigt.204

PB Ser
HL: große, hydrophobe Tasche
HS HS: kleine, hydrophobe Tasche
HL
PF: vordere, polare Tasche
PB: hintere, polare Tasche
PF Ser: Serin-Rest

Abb. 2.36: Modell für das aktive Zentrum der PLE nach JONES et al.

Um die Substratspezifität der PLE hinsichtlich der Hydrolyse der Substrate rac-15
und rac-18 erklären zu können, sind im Abb. 2.37 in der oberen Reihe die bevorzugt
umgesetzten Enantiomeren zur Vereinfachung als Alkohole nochmals dargestellt.

Me2N OH OH
OH OMe
HO
(−)-8 (+)-12 Me2N

OH
OH

MeO
NMe2 OH NMe2
OH

Abb. 2.37: Von der PLE bevorzugt umgesetzte Enantiomere.

In der unteren Reihe in Abb. 2.37 sind beide Moleküle so gedreht, daß die vom Serin
des Enzyms angegriffene Hydroxylgruppe in die Richtung des Serinrestes im
Kastenmodell nach JONES et al. zeigt. Die für die Selektivität der PLE notwendige
Dimethylaminomethyl-Gruppe80 beider Moleküle kann so in Wechselwirkung mit der
vorderen polaren Tasche treten. Der wenig flexible Cylohexylring mit dem Aromaten
befindet sich in der großen, hydrophoben Tasche. Die räumliche Anordnung dieser
Gruppen ist in beiden Molekülen gleich, was die Selektivität der PLE hinsichtlich
beider Moleküle zu erklären vermag.
86 THEORETISCHER TEIL

Die Candida rugosa Lipase zeigte in der Hydrolyse des Phenylesters rac-15 von
allen eingesetzten Enzymen die höchste Selektivität und auch größte Aktivität
hinsichtlich des Substrats. Zudem sind große, cyclische sekundäre Alkohole
Standardsubstrate für dieses Enzym (s. Kap. 2.3.2). Daher wurde rac-18 in die CRL-
katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.38). Als erstes Reaktionsmedium wurde
zum Vergleich mit der PLE-katalysierten Reaktion das wäßrige Einphasensystem
ausgewählt.

O OH
OMe
Pr O
O OH Me2N
CRL
OMe (+)-18
Pr O Phosphatpuffer-
Lösung +
Me2N
RT Me2N OH
rac-18 OMe

HO
(−)-12
Abb. 2.38: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18.

Die CRL zeigt, verglichen mit der PLE, eine etwas größere Aktivität hinsichtlich des
Substrats rac-18. So wurde nach 4.75 Stunden ein Umsatz von ca. 49 % erreicht.
Nach Aufarbeitung und anschließender Säulenchromatographie mit Diisopropylether
und Methanol im Verhältnis 1 : 1 an Kieselgel konnte der 1S,3R,6S-konfigurierte
Alkohol (−)-12 in 41 % Ausbeute mit 95 % ee isoliert werden. Der 1R,3S,6R-
konfigurierte Ester (+)-18 konnte in 41 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 86 %
erhalten werden (Tabelle 2.23).
Bei der Chromatographie der Reaktionsprodukte sind die isolierten Ausbeuten in
dem Laufmittel Diisopropylether und Methanol ein wenig besser als in dem Laufmittel
Essigsäureethylester und Methanol.
Die Selektivität der CRL-katalysierten Hydrolyse im wäßrigen Einphasensystem läßt
sich zusammenfassend durch einen E-Wert von 133 ausdrücken. Sie verläuft damit
selektiver als die entsprechende PLE-katalysierte Reaktion.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 87

Tabelle 2.23: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen


Einphasensystem (4.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-
Butanol)

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12

4.75 h 93 % 41 % 95 % 41 % 133

Aus den Drehwerten der Produkte geht hervor, daß die CRL interessanterweise eine
zur PLE entgegengesetzte Enantiopräferenz zeigt. Während in der PLE-katalysierten
Hydrolyse bevorzugt das (+)-Enantiomer hydrolysiert wird, setzt das Enzym CRL
bevorzugt das (−)-Enantiomer um.
Das die Enzyme PLE und CRL hinsichtlich eines Substrats wie rac-15 die gleiche
Enantiopräferenz zeigen und bei einem strukturell verwandten Substrat wie rac-18
eine entgegengesetzte, ist in ähnlicher Form ebenfalls von NAEMURA et al.
beobachtet worden. Wie aus Abb. 2.33 auf Seite 81 hervorgeht zeigen PLE und CRL
hinsichtlich des cis-1-Phenylcyclohexan-1,2-diol ebenfalls eine entgegengesetzte
Enantiopräferenz, wohingegen bei der entsprechenden trans-konfigurierten
Verbindung beide Enzyme das gleiche Enantiomer bevorzugt umsetzten (Abb.
2.39).200

OH OH

OH
OH
cis-konfiguriertes Racemat trans-konfiguriertes Racemat
entgegengesetzte Enantiopräferenz gleiche Enantiopräferenz

Abb. 2.39: Relative Enantiopräferenzen der Enzyme PLE und CRL hinsichtlich der
beiden isomeren 1-Phenylcyclohexan-1,2-diole.

Um den Einfluß einer möglichen Grenzflächenaktivierung, wie es schon beim


Substrat rac-15 zu beobachten war, zu untersuchen, wurde das wäßrig-organische
Zweiphasensystem als Reaktionsmedium für die CRL-katalysierte Hydrolyse von
rac-18 verwendet.
88 THEORETISCHER TEIL

Um eine möglichst große Grenzfläche zu erhalten, wurde die Reaktion in einer feinen
Emulsion aus Phosphatpuffer und tert-Butyl-methylether (MTBE) durchgeführt. Nach
ca. 6 Stunden wurde ein Umsatz von ca. 45 % beobachtet. Eine Verlängerung der
Reaktionszeit auf 72 Stunden führte zu keiner weiteren Hydrolyse. Die Reaktions-
lösung wurde dann aufgearbeitet und nach Chromatographie mit Diisopropylether
und Methanol im Verhältnis 1 : 1 an Kieselgel konnte der 1S,3R,6S-konfigurierte
Alkohol (−)-12 in 39 % Ausbeute enantiomerenrein (≥98 % ee) erhalten werden. Von
dem 1R,3S,6R-konfigurierte Ester (+)-18 konnte in 40 % Ausbeute auch ebenfalls die
enantiomerenreine Verbindung (≥98 % ee) erhalten werden (Tabelle 2.24). Die
Enantiomer-Differenzierung der Candida rugosa Lipase unter diesen Reaktions-
bedingungen ist also so hoch, daß das nicht favorisierte Enantiomer praktisch nicht
umgesetzt wird, selbst bei einer Verlängerung der Reaktionszeit auf 72 Stunden. Es
kann also eine nahezu perfekte kinetische Racematspaltung beobachtet werden,
was sich durch einen E-Wert von größer 200 ausdrückt. Ein Wechsel bei der
Katalyse mit CRL vom Ein- zum Zweiphasensystem führte wie schon beim
Phenylester rac-15 zu einer Steigerung der Selektivität in der enzymatischen
Hydrolyse.

Tabelle 2.24: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen


Zweiphasensystem (4.4 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.5; MTBE; 1 : 1)

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12

72 h ≥98 % 40 % ≥98 % 39 % >200

Zusammenfassend sind somit Reaktionsbedingungen gefunden worden, die optimale


Voraussetzungen für eine Enzym-katalysierte Hydrolyse von rac-18 im präparativen
Maßstab bieten. Die Selektivität der Reaktion ist so hoch, daß neben einer
Reaktionsführung in einem satzweisen Verfahren (batch) auch eine kontinuierliche
Reaktionsführung (CSTR) möglich ist.

Eine kontinuierliche Reaktionsführung zeichnet sich allgemein gegenüber dem Satz-


oder Chargen-Betrieb durch höhere Raum-Zeit-Ausbeuten und besser kontrollierbare
Reaktionsbedingungen aus. Ebenso reduzieren sich die produktspezifischen
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 89

Enzymkosten.206 Nachteil eines kontinuierlichen Verfahrens ist, daß der ee-Wert des
isolierten nicht umgesetzten Substrates bei gleichem Umsatz nicht so hoch ist, wie in
einem satzweisen Verfahren. Dies ist der Fall, da ein Teil des kontinuierlich
zugeführten racemischen Substrates wieder direkt den Reaktor verläßt und so den
ee-Wert der erhaltenen Produkte herabsenkt.207 Von RAKELS et al. ist der Verlauf des
ee-Wertes des nicht umgesetzten Substrates in einem satzweisen und einem
kontinuierlichen Reaktor über den Verlauf des Umsatzes für verschiedene E-Werte
theoretisch berechnet und aufgetragen worden (Abb. 2.40). Hierbei fällt auch auf,
daß in einem kontinuierlichen Verfahren selbst bei einer hohen Selektivität von
E = 100 gegen Ende der Reaktion der zurückbleibende Ester nicht enantiomerenrein
anfällt.

(A) satzweiser Reaktor (B) kontinuierlicher Reaktor

Abb. 2.40: Verlauf des Enantiomerenüberschusses des zurückbleibenden Substrats


als Funktion des Umsatzes in einer kinetischen Racematspaltung für
verschiedene E-Werte (E = 5, 10, 25, 100).

Diese reaktionstechnischen Voraussetzungen erfordern eine hohe Selektivität in der


Enzym-katalysierten Reaktion, damit eine kontinuierlichen Reaktionsführung als
Verfahren einsetzbar ist. Die CRL-katalysierte Hydrolyse von rac-18 im wäßrig-
organischen Zweiphasensystem wird diesen erhöhten Ansprüchen gegenüber einem
satzweisen Verfahren gerecht.
90 THEORETISCHER TEIL

Für ein mögliches Verfahren zur Darstellung von Tramadol-Analoga in einem


präparativen Maßstab stellt die Art der Aufarbeitung der Reaktionsmischung von
Alkohol und Ester in den bisher vorgestellten Reaktionen einen entscheidenden
Nachteil dar. Kontinuierliche Extraktion und Chromatographie stellen für eine
Synthese im Labormaßstab die üblichen Methoden zur Trennung dar, doch in einem
größeren Maßstab sind sie nicht kosteneffizient durchführbar und somit nur schwer
umzusetzen. Daher wird eine effiziente Methode zur Aufarbeitung benötigt, die auch
in einen größeren Maßstab übertragbar ist.
Bei Untersuchungen zu dem racemischen Substrat Buttersäure-3-dimethyl-
aminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22), die in
Kap. 2.4.2.6 beginnend auf Seite 120 vorgestellt werden, ist in Kooperation mit der
GRÜNENTHAL GmbH eine solche Methode gefunden worden. Bei dieser Methode
gelingt die Trennung, indem direkt am Ende der Reaktion selektiv der Ester aufgrund
seiner Polarität bei pH 7.0 aus der wäßrigen Reaktionslösung mit Diethylether oder
auch MTBE extrahiert wird. Der Alkohol läßt sich noch nicht bei diesem pH-Wert
extrahieren. Erst nachdem mit Na2CO3 ein pH-Wert von ca. 10 eingestellt worden ist,
ist auch die Löslichkeit des Alkohols soweit herabgesetzt, daß er mit Dichlormethan
aus der Reaktionslösung extrahiert werden kann. Der Unterschied in der Polarität
von Ester und Alkohol läßt sich durch genügend große Unterschiede im log P-Wert208
von Alkohol und Ester zeigen. Messungen zum log P-Wert sind für das Substrat
(±)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-
ester (rac-22) und den korrespondierenden Alkohol durchgeführt worden und werden
in Kap. 2.4.2.6 beginnend auf Seite 120 näher diskutiert. Insgesamt stellt diese
Aufarbeitung eine einfache und effiziente Methode dar mittels der auf ein
chromatographisches Trennverfahren verzichtet werden kann.

Um die Effizienz der Enzym-katalysierten kinetischen Racematspaltung mit


Aufarbeitung durch Extraktion bei verschiedenen pH-Werten zu demonstrieren,
wurde der Ester rac-18 in die CRL-katalysierte Hydrolyse im wäßrig-organischen
Zweiphasensystem eingesetzt. Anschließend wurde die Aufarbeitung durch
Extraktion bei verschiedenen pH-Werten auf das Zweiphasensystem übertragen.
Nachdem ein Umsatz von ca. 50 % in der enzymatischen Hydrolyse des Esters
rac-18 erreicht war, wurde die Reaktionslösung mit MTBE und Diethylether
extrahiert. Der nicht umgesetzte Ester (+)-18 konnte so in 51 % Ausbeute mit einem
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 91

ee-Wert von ≥98 % isoliert werden. Anschließend wurde die verbliebene


Reaktionslösung von Lösungsmittelresten befreit und auf pH 10 eingestellt. Der
Alkohohl (−)-12 konnte daraufhin mit Dichlormethan in 46 % Ausbeute mit 97 % ee
extrahiert werden (Tabelle 2.25). Somit konnten mittels dieser Methode sowohl Ester
als auch Alkohol in sehr guten Ausbeuten und Reinheiten extrahiert werden. Die
ebenfalls hohen Enantiomerenüberschüsse in Alkohol und Ester zeigen, daß eine
partielle Racemisierung während der Aufarbeitung nicht beobachtet werden kann.

Tabelle 2.25: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 wäßrig-organischen


Zweiphasensystem im 1.5 mmol Maßstab mit extraktiver Aufarbeitung
(6.7 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.2; MTBE; 1 : 1)

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12

48 h ≥98 % 51 % 97 % 46 % >200

Insgesamt konnte somit eine effiziente Enzym-katalysierte kinetische Racemat-


spaltung von rac-18 durchgeführt werden. Die CRL-katalysierte Hydrolyse dieses
Esters verläuft mit einer nahezu perfekten Selektivität und ermöglicht so den
einfachen Zugang zu beiden Enantiomeren des Alkohols 12. Für eine Darstellung
des Alkohols (+)-12 ist die Hydrolyse des nicht umgesetzten Esters notwendig. Dies
bedeutet einen zusätzlichen Reaktionsschritt, der dadurch umgangen werden kann,
daß zur Darstellung von (+)-12 die PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18
durchgeführt wird. Da die Enzyme CRL und PLE eine entgegengesetzte Enantio-
präferenz hinsichtlich dieses Substrates zeigen, wird von der PLE bevorzugt das
(+)-Enantiomer zum Alkohol (+)-12 hydrolysiert. Somit ermöglicht eine geeignete
Wahl des Enzym die Darstellung beider enantiomerer Alkohole mit hohen ee-Werten.
Neben einem chromatographischen Trennverfahren steht auch die Methode der
Extraktion bei verschiedenen pH-Werten zur einfachen Aufarbeitung der
Reaktionsmischung aus Alkohol und Ester zur Verfügung. Diese Methode hat den
Vorteil einfach, effizient und leicht in einen größeren Maßstab, wie einen späteren
Produktionsprozeß, übertragbar zu sein.
92 THEORETISCHER TEIL

In der Enzym-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 zeigte die Candida


antarctica Lipase Typ B bemerkenswerte katalytische Eigenschaften. Diese
Ergebnisse werden in Kap. 2.4.2.9 beginnend aus Seite 144 diskutiert. Aufgrund der
in der Novozym 435-katalysierten Transacylierung von rac-14 beobachteten Aktivität
und Selektivität dieses Enzyms, wurde diese Katalysatorpräparation auch in die
enzymatische Hydrolyse von rac-18 eingesetzt. Allerdings konnte nach einer
Reaktionszeit von 45 Stunden kein Umsatz in dem Versuch zur Novozym 435-
katalysierten Hydrolyse von rac-18 beobachtet werden (Tabelle 2.26). Die gesamte
Reaktionszeit über war das immobilisierte Enzym im wäßrigen Medium unlöslich.
Eine mögliche Erklärung für die hohe Aktivität dieser Enzympräparation im
organischen Medium und die im Gegensatz dazu niedrige Aktivität im wäßrigen
Medium, liegt darin, daß diese auf einem makroporösen Acrylharz immobilisierte
Präparation speziell für die Synthese von Estern konzipiert ist.126 Zusätzlich können
Stofftransportprobleme am heterogenen Katalysator nicht ausgeschlossen werden.

Tabelle 2.26: Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18
(CAL-B; Phosphatpuffer, pH 7.5; 10 % tert-Butanol)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester 18 ee Alkohol 12 E

45 h 0% - - -

Daraufhin wurde eine lyophilisierte Form der CAL-B, mit dem Handelsnamen
Chirazyme L2, in die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-18 eingesetzt. Aber
auch diese Enzympräparation zeigte eine relativ niedrige Aktivität in der
enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-18. So konnte in der Chirazyme L2-
katalysierten Reaktion lediglich ein Umsatz von 7 % zum Alkohol (−)-12 nach 46 %
Stunden beobachtet werden (Tabelle 2.27). Aufgrund der niedrigen Aktivität dieser
Lipasen im wäßrigen Medium wurden keine weiteren Versuche zu einer CAL-B-
katalysierten Hydrolyse von rac-18 unternommen.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 93

Tabelle 2.27: Chirazyme L2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 (CAL-B;


Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-18 ee Alkohol (−)-12 E

46 h 7% 8% n. b. -

Die Enantiomeren des Alkohols 12 sind bisher nicht in der Literatur beschrieben, so
daß zur Bestimmung der Absolutkonfiguration kein Drehwert zum Vergleich zur
Verfügung steht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Absolutkonfiguration der
Enantiomere des Alkohols 12 daher auf der Basis zugeordnet, daß alle bisher
hergestellten (αR,βR)-Tramadol-Analoga mit tertiärer Hydroxylgruppe eine positiven
Drehsinn des Drehwerts zeigen.184
Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 18, 46 und 47 erfolgte in
Analogie zu der des Alkohols 12.

2.4.2.2 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-


Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol
(rac-12)

Nachdem in der enzymatischen Hydrolyse von rac-18 sehr gute Ergebnisse erzielt
worden sind, wurde die Umkehrreaktion, die Enzym-katalysierte Transacylierung von
rac-12 im organischen Medium, ebenfalls untersucht.
Ein Verfahren zur enzymatischen Acylierung im organischen Medium neben dem
hydrolytischen Verfahren würde weiterhin den Vorteil bieten, hydrolyselabile oder
hydrophobe und daher im wäßrigen Milieu unlösliche Verbindungen einsetzten zu
können. Dieser Gesichtspunkt ist vor allem für zukünftige Tramadol-Analoga von
Bedeutung. Daher ist neben der enzymatischen Hydrolyse ebenfalls ein Verfahren
zur Enzym-katalysierten Acylierung von rac-12 untersucht worden (Abb. 2.41).

Begonnen wurden diese Untersuchungen mit der Burkholderia cepacia Lipase (BCL),
welche auch nach den in Kap. 2.3.2 gemachten Vorbemerkungen eine geeignete
Lipase zur Umsetzung sekundärer Alkohole sein sollte. So ist beispielsweise von
94 THEORETISCHER TEIL

KANERVA et al. das cis-2-Dimethylaminomethyl-cyclohexanol mit sehr guten


Resultaten in die Lipase PS-katalysierte Transacylierung eingesetzt worden.195

Me2N OH
OMe
O
O
OH Lipase R (−)-Ester
OMe
HO Vinylester
+
Me2N organisches
Lösungsmittel OH
rac-12 RT OMe
HO
Me2N
(+)-12

Abb. 2.41: Lipasen-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-12.

Als erste Reaktionsbedingungen zur BCL-katalysierten Acylierung von rac-12 wurde


Isopropenylacetat als Acylierungsmittel und Toluol und Acylierungsreagenz als
Lösungsmittel ausgewählt (Tabelle 2.28). In beiden Versuchen konnte allerdings
nach nahezu 3 Wochen keine Ester detektiert werden. Da diese Lipase eigentlich in
der Acylierung von rac-12 aktiv sein sollte, deuten diese Ergebnisse vielmehr auf
ungeeignete Reaktionsbedingungen hin.

Tabelle 2.28: Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12


mit Isopropenylacetat (40 U/ml)

Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)

Isopropenylacetat (6)
20 d 3%
Toluol

Isopropenylacetat als Solvens 20 d 3%

Daher wurde Vinylpropionat als Acyldonor gewählt, das eine etwas längere Alkylkette
trägt und somit für eine Lipase ein geeigneteres Acylierungsmittel darstellen sollte.
Des weiteren wurde die Enzymkonzentration in der Reaktionsmischung verdreifacht.
Die Lösungsmittel Toluol und Acylierungsreagenz wurden beibehalten. Unter diesen
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 95

leicht veränderten Bedingungen konnte anschließend in beiden Lösungsmitteln eine


BCL-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-12 beobachtet werden (Tabelle
2.29). Allerdings ist die beobachtete Aktivität der BCL hinsichtlich des Substrats
rac-12 gering. So konnte nach 8 Tagen lediglich ein Umsatz von 11 % bzw. 5 %
erzielt werden. Die Reaktion im Lösungsmittel Vinylpropionat wurde daraufhin
abgebrochen, da keine wesentliche Steigerung des Umsatzes zu erwarten war. Mit
einer Selektivität von E = 22 ist zudem für einen sekundären Alkohol eine relativ
niedrige Selektivität beobachtet worden. Nach den in der CRL-katalysierten
Hydrolyse erzielten Ergebnissen, wurde eine wesentliche höhere Selektivität in der
Acylierung von rac-12 erwartet. Im Lösungsmittel Toluol war eine etwas größere
Reaktionsgeschwindigkeit zu beobachten und daher wurde sie erst nach insgesamt
13 Tagen bei einem Umsatz von 12 % abgebrochen. Die in dieser Reaktion erzielte
Selektivität von E = 38 ist größer als in Vinylpropionat als Solvens und im
angestrebten Bereich von E ≥ 30. Insgesamt ist die Aktivität des Enzym BCL unter
den verwendeten Reaktionsbedingungen aber sehr niedrig.

Tabelle 2.29: BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit


Vinylpropionat (120 U/ml)

Reaktions- Mittel
bedingungen 8d E-Wert 13 d E-Wert E-Wert
(Äquiv.)

Umsatz 11 % 12 %
Vinylpropionat (5),
ee Ester (−)-46 94 % 34 95 % 43 38
Toluol
ee Alkohol (+)-12 8% 12 %

Umsatz 5% n. b.
Vinylpropionat
ee Ester (−)-46 91 % 22 n. b. - 22
als Solvens
ee Alkohol (+)-12 4% n. b.

Nach den guten Ergebnissen in der Hydrolyse des korrespondierenden Esters wurde
daraufhin die Candida rugosa Lipasen-katalysierte Acylierung von rac-12 untersucht.

In drei verschiedenen parallelen Ansätzen wurde der Alkohol rac-12 in die CRL-
katalysierte Acylierung mit Vinylpropionat in den Lösungsmitteln Diisopropylether,
96 THEORETISCHER TEIL

Toluol und Acylierungsmittel eingesetzt (Tabelle 2.30). Diisopropylether und Toluol


sind Standardlösungsmittel für die Enzym-katalysierte Transacylierung. Die
Verwendung des Acylierungsmittels nicht nur als Reagenz sondern auch als Solvens
erbrachte in der enzymatischen Acylierung der Tramadol-Analoga mit aromatischer
Hydroxylgruppe sehr gute Ergebnisse. Daher wurden diese drei Lösungsmittel zum
Vergleich ausgewählt.

Tabelle 2.30: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit


Vinylpropionat (37 U/ml)

Reaktionsbedingung 3d 6d 8d 11 d 16 d
(Äquiv.) (%) (%) (%) (%) (%)

Umsatz 0 2 2 3 -
Vinylpropionat (5),
ee Ester (−)-46 n. b. n. b. n. b. 90 -
Diisopropylether
ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. n. b. 2 -

Umsatz 37 57 58 58 -
Vinylpropionat (5),
ee Ester (−)-46 94 91 96 89 -
Toluol
ee Alkohol (+)-12 56 97 98 ≥98 -

Umsatz 23 41 48 53 58
Vinylpropionat 88 84 86 82 79
ee Ester (−)-46
als Solvens
ee Alkohol (+)-12 25 52 68 85 ≥90

In dem Solvens Diisopropylether ist die geringste Aktivität des Enzyms CRL
hinsichtlich des Substrats rac-12 zu erkennen. Entsprechend der Aktivität des
Enzyms im Lösungsmittel Diethylether ist auch die Selektivität mit E = 19 sehr gering
(Tabelle 2.31). Ether, wie auch der Diethylether im Falle der phenolischen Substrate
rac-8 und rac-11, sind damit nach den bisherigen Ergebnissen keine geeigneten
Lösungsmittel für eine Lipasen-katalysierte Transacylierung von Tramadol-Analoga.
Dies Ergebnis steht in Einklang mit den von JUNGEN gemachten Untersuchungen zur
MPEG/PLE-katalysierten Transacylierung racemischer Alkohole in verschiedenen
Lösungsmitteln. Im Lösungsmittel MTBE wurden durchweg niedrige Aktivitäten und
Selektivitäten erhalten.85
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 97

Im Falle der Lösungsmittel Toluol und Vinylpropionat ist die Aktivität der CRL viel
größer. So werden nach 6 Tagen Umsätze von 57 % bzw. 41 % erreicht. Das die
Reaktion im Lösungsmittel Toluol nach diesen 6 Tagen kaum noch voranschreitet,
kann durch die hohe Selektivität der Reaktion erklärt werden, da ab einem Umsatz
von 50 % die größte Menge des schneller reagierenden Enantiomers verbraucht ist
und sich die Reaktionsgeschwindigkeit dann nur noch nach dem langsamer
reagierenden Enantiomer richtet. Die hohe Selektivität der Reaktion wird durch einen
mittleren E-Wert von 109 belegt (Tabelle 2.31). Die Schwankungen des E-Werts, der
eigentlich über den gesamten Reaktionsverlauf konstant bleiben sollte, läßt sich
durch die Meßgenauigkeit der Bestimmung der ee-Werte erklären. Bei hohen
E-Werten führen schon sehr kleine Änderungen des ee-Werts zu Schwankungen im
E-Wert. Dies läßt sich auch am Verlauf der E-Werte in dem Lösungsmittel
Vinylpropionat erkennen. Da hier der E-Wert der Reaktion geringer ist, fallen die
Schwankungen innerhalb der Reaktionsdauer auch viel geringer aus. Insgesamt ist
die Selektivität der CRL-katalysierten Acylierung im Solvens Vinylpropionat mit einem
E-Wert von 23, trotz der akzeptablen Reaktionsgeschwindigkeit zu niedrig, um sie
präparativ interessant erscheinen zu lassen (Tabelle 2.31).

Tabelle 2.31: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12


mit Vinylpropionat

Reaktionsbedingungen
3d 6d 8d 11 d 16 d Mittel
(Äquiv.)

Vinylpropionat (5),
- - - 19 - 19
Diisopropylether

Vinylpropionat (5),
56 89 >200 89 - 109
Toluol

Vinylpropionat
19 19 26 27 25 23
als Solvens

Ein Nebenprodukt der enzymatischen Transacylierung ist der bereits erwähnte


Acetaldehyd, der aus dem primär entstehenden Vinylalkohol gebildet wird (vgl.
Kap 2.3.2.2 beginnend ab Seite 39). Gerade von der Lipase aus Candida rugosa ist
bekannt, daß sie durch Acetaldehyd deaktiviert werden kann.139,140,141 Von mehreren
98 THEORETISCHER TEIL

Autoren wird in diesem Fall eine Steigerung der Aktivität und Selektivität der CRL
berichtet, wenn statt Vinylacetat Isopropenylacetat verwendet wird.139,141b),142,209
Dieser Argumentation folgend wurde Isopropenylacetat als Acylierungsreagenz in die
CRL-katalysierte Transacylierung von rac-12 eingesetzt. Als Lösungsmittel wurden
Toluol, das zu der höchsten Selektivität mit Vinylpropionat geführt hat, und
Isopropenylacetat verwendet (Tabelle 2.32).

Tabelle 2.32: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit


Isopropenylacetat (37 U/ml)

Reaktionsbedingung
2d 5d 14 d 20 d
(Äquiv.)

Umsatz 19 % 34 % 47 % 58 %
Isopropenylacetat (6),
ee Ester (−)-47 n. b. ≥98 % 94 % 94 %
Toluol
ee Alkohol (+)-12 n. b. 60 % 70 % 88 %

Umsatz 3% 5% 13 % 16 %
Isopropenylacetat n. b. 10 % 24 % 24 %
ee Ester (−)-47
als Solvens
ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. 4% 6%

Im Lösungsmittel Toluol zeigt die CRL eine wesentlich höhere Aktivität als im
Acylierungsmittel als Solvens. Qualitativ deckt sich diese Beobachtung mit den
Ergebnissen, die mit dem Acylierungsreagenz Vinylpropionat erzielt wurden.
Allerdings ist die Reaktion in Isopropenylacetat sehr langsam, da nach fast
3 Wochen lediglich ein Umsatz von 16 % erreicht wurde. Die Reaktion verläuft mit
einem E-Wert von 2 außerdem nahezu unselektiv (Tabelle 2.33).
Die Selektivität der CRL-katalysierten Transacylierung mit Isopropenylacetat verläuft
in den ersten 5Tagen bis zu einem Umsatz von ca. 45% mit nahezu perfekter
Selektivität (E >200) und fällt danach ab. Die Reaktion im Lösungsmittel Toluol
verläuft mit Isopropenylacetat als Acylierungsmittel langsamer als mit Vinylpropionat.
Die in beiden Reaktionen im Mittel erzielten Selektivitäten sind im gleichen Rahmen
sehr gut. Dies deutet daraufhin, daß unter diesen Reaktionsbedingungen (Toluol,
Reaktionszeiten von 3 bis 5 Tagen) mit Vinylpropionat und Isopropenylacetat keine
Deaktivierung der CRL durch Acetaldehyd vorliegt.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 99

Tabelle 2.33: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12


mit Isopropenylacetat

Reaktionsbedingungen
2d 5d 14 d 20 d Mittel
(Äquiv.)

Isopropenylacetat (6),
n. b. >200 67 94 120
Toluol

Isopropenylacetat
n. b. n. b. 2 2 2
als Solvens

Aufgrund der erzielten Ergebnisse in der CRL-katalysierten Transacylierung wurde


ebenfalls versucht eine PLE-katalysierte Transacylierung von rac-12 zu erreichen
(Abb. 2.42). Beim Alkohol rac-12 handelt es sich um einen sekundären Alkohol, der
im Vergleich zum Phenol rac-8 ein geeigneteres Substrat für Schweineleber-
Esterase darstellen sollte.

O OH
OMe
R O
Me2N
OH PLE
OMe (+)-Ester
HO Vinylester +
Me2N organisches
Lösungsmittel Me2N OH
rac-12 OMe
RT HO

(−)-12
Abb. 2.42: PLE-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-12.

Native PLE zeigt im Gegensatz zu Lipasen allerdings praktisch keine Aktivität in der
Transacylierung von Alkoholen mit Vinylestern im organischen Medium. Es wurde
daher MPEG/PLE (vgl. Kap. 2.1) als Katalysatorpräparation in die Transacylierung
von rac-12 eingesetzt. Als Lösungsmittel wurde Toluol verwendet, da in diesem
Lösungsmittel die CRL eine hohe Aktivität zeigte, als Acylierungsmittel wurden
sowohl Vinylacetat als auch Isopropenylacetat eingesetzt (Tabelle 2.34).
100 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.34: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols


rac-12 (6.4 U/ml)

Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)

Vinylpropionat (5),
20 d 3%
Toluol

Isopropenylacetat (5),
20 d 0%
Toluol

Unter diesen Reaktionsbedingungen fand, wie schon zuvor beim Phenol rac-8, keine
PLE-katalysierte Reaktion in einem nennenswerten Umfang statt.
Um weitere Reaktionsmedien im Hinblick auf mögliche günstige Eigenschaften für
eine PLE/MPEG-katalysierte Reaktion von rac-12 zu testen, wurden drei weitere
Lösungsmittel untersucht. Mit Vinylpropionat als Acylierungsmittel wurde
Dichlormethan, MTBE und das Acylierungsmittel Vinylpropionat als Solventien in die
PLE/MPEG-katalysierte Acylierung von rac-12 eingesetzt (Tabelle 2.35). Außerdem
wurde in diesen Reaktionen die sechsfache Menge an Katalysator im Vergleich zu
den vorherigen Reaktionen eingesetzt.

Tabelle 2.35: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols


rac-12 mit Vinylpropionat (41.3 U/ml)

Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)

Vinylpropionat (5),
21 d 2%
Dichlormethan

Vinylpropionat (5),
4d 1%
MTBE

Vinylpropionat (200) 21 d 3%
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 101

Trotz dieser wesentlich gesteigerten Katalysatormenge konnte wiederum nur eine


minimale Menge an Acylierungsprodukt detektiert werden. Interessanterweise wurde
im Acylierungsmittel als Solvens die größte Menge an gebildeten Ester 46
beobachtet.

Um eine Deaktivierung des Enzyms durch Nebenprodukte ausschließen zu können,


wurde eine neue Katalysatorspezies aus PLE und Rinderserumalbumin (BSA) für die
Acylierung von Tramadol-Analoga eingesetzt.
Von GAIS et al. konnte nämlich gezeigt werden, daß die Aktivität der PLE von
verschiedenen Carbonyl-Nebenprodukten (Acetaldehyd, Aceton, Carbonsäuren aus
der Hydrolyse des Acyldonors) beträchtlich beeinflußt wird.84,85 Um einer Reaktion
dieser Carbonyl-Verbindungen mit Lysin-Resten des Enzyms entgegenzuwirken,
wurden Rinderserumalbumin und verschiedene aminhaltige Harze in der
Colyophilisierung mit PLE benutzt.83 Diese Verbindungen sollten statt des Enzyms
mit den Carbonyl-Nebenprodukten reagieren und so die Aktivität der PLE erhöhen.
Außerdem sollte die Nebenreaktion der PLE-katalysierte Hydrolyse des Acyldonors
durch geringe, zugesetzte Mengen an Wasser eingeschränkt werden

Für eine Acylierung von rac-12 wurde ein Colyophilisat aus PLE, BSA und MPEG
(PLE/BSA/MPEG) gewählt und eingesetzt, welches bei Standardsubstraten eine
hohe Aktivität im organischen Medium zeigt.83 Als Acylierungsmittel wurde
Vinylpropionat für die Reaktionen gewählt und diesmal das Lösungsmittel variiert. Es
wurden Dichlormethan und Toluol verwendet. Zum Lösungsmittel Toluol wurde
hierbei ein Wasserzusatz von 0.25 % gegeben (Tabelle 2.36).

Der Wasserzusatz wurde gemacht, da Wasser auch für die Enzymkatalyse in


organischen Lösungsmitteln von entscheidender Bedeutung ist. Es dient als
"Schmiermittel"150 zur Einstellung verschiedener Proteinkonformationen.85 In völlig
wasserfreien Systemen können Enzyme ihre Aktivität daher nicht entfalten. Vielfach
reicht allerdings schon eine sehr geringe Wassermenge (<1 %) zur Enzymkatalyse in
organischen Medien aus. Beeinflußt wird das System auch durch das Additiv MPEG,
daß die effektive Wasserkonzentration in der Enzymumgebung verringert210,211 und
so als "Puffer" für den Wassergehalt des Enzyms dient.212 Von JUNGEN ist in der
Katalyse mit MPEG/PLE in Toluol als Lösungsmittel die höchste Reaktions-
102 THEORETISCHER TEIL

geschwindigkeit bei einem Zusatz von 0.2 Vol% Wasser beobachtet worden.85 Daher
wurde für diesen Versuch mit dem Katalysator PLE/BSA/MPEG ein Wasserzusatz
von 0.25 % gewählt.

Tabelle 2.36: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des


Alkohols rac-12

Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)

PLE/BSA/MPEG (24.4 U/ml),


11 d 0%
Vinylpropionat (5), Dichlormethan

PLE/BSA/MPEG (20.0 U/ml), H2O (0.25 %),


11 d 0%
Vinylpropionat (5), Toluol

Im Laufe der Reaktionszeit änderte sich die Farbe des PLE/BSA-Katalysators von
weiß in ein dunkles rot-braun. Dies ist ein typisches Merkmal dafür, daß der Zusatz
BSA mit Carbonyl-Nebenprodukten reagiert. Diese Nebenprodukte können nur aus
der enzymatischen Hydrolyse des Vinylesters stammen. Eine derartige
Nebenreaktion in größerem Umfang ist ebenfalls von Ruppert84 wie auch anderen213
beobachtet worden.

O
+E
R1 OH

+ H2O A
O +E O
+ [R1-CO-E]
R1 O
B
+ R2-OH
O + H2O
O
R2 + E + R2-OH
R1 O R1 OH
C
Abb. 2.43: Hydrolyse des Acyldonors als Nebenreaktion der Transacylierung.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 103

In Abb. 2.43 ist das zu dieser Nebenreaktion gehörige Reaktionsschema


wiedergegeben. Nach der irreversiblen Bildung des Acyl/Enzym-Komplexes, kann
dieser die Nebenreaktion mit Wasser eingehen (A) oder den gewünschten
Reaktionsweg, die Reaktion mit dem racemischen Alkohol, beschreiten (B). Je nach
Wassermenge kann die unerwünschte Nebenreaktion sogar dominieren. Des
weiteren kann der gebildete Ester enzymatisch hydrolysiert werden (C) was die
enzymatische Transacylierung quasi-reversibel macht.

In beiden Reaktionsansätzen konnte aber kein Umsatz in der Acylierung von rac-12
detektiert werden. Insgesamt deuten somit die erzielten Ergebnisse in den
Versuchen zur PLE-katalysierten Transacylierung darauf hin, daß Tramadol-Analoga,
sowohl mit aromatischer als auch mit sekundärer Hydroxylfunktion, keine geeigneten
Substrate für eine PLE-katalysierte Reaktion im organischen Medium darstellen.
104 THEORETISCHER TEIL

2.4.2.3 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-


Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexylester (rac-19)

Der racemische Alkohol rac-13 ist eine pharmakologisch wirksame Verbindung, die
eine dem Tramadol ähnliche analgetische Aktivität besitzt. Das Hydrochlorid des
(±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diols (rac-13⋅HCl)
befindet sich in einem fortgeschrittenem Stadium der klinischen Entwicklung von der
GRÜNENTHAL GmbH. Die Verbindung zeigt ein solch gutes pharmakologisches Profil,
das eine direkte Vermarktung des Racemats ohne eine weitere Derivatisierung
erhofft werden kann (Abb. 2.44).184

OH OH
OMe ⋅HCl

Me2N

Abb. 2.44: Hydrochlorid von rac-13, dessen Vermarktung von der GRÜNENTHAL
GmbH angestrebt wird.

Die Substanz zeigte eine mittlere analgetische Aktivität in der Wirkstärke des
O-Desmethyltramadols (rac-8) bei außerordentlich hoher Bioverfügbarkeit. Dies stellt
einen Fortschritt gegenüber der bisherigen Therapie dar. Dazu ist die Halbwertszeit
im Körper dieser Substanz sowie die des O-Desmethyl-Metaboliten gegenüber
vergleichbaren Substanzen, wie dem Tramadol, verlängert.184
Der Wirkstoff rac-13⋅HCl zeigt, ähnlich wie das Tramadol, eine dreifaches Wirkprofil.
So existiert neben der µ-opioiden Wirkung auch Inhibierung der Wiederaufnahme der
Neurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5HT), was zu einer Inhibierung
der spinalen Schmerzleitung führt.184
Interessanterweise zeigen die Enantiomeren eine synergistische Wirkung, ähnlich
wie auch beim Tramadol, dies kann die weitere Entwicklung und später geplante
Vermarktung des Racemats ermöglichen. Trotzdem werden natürlich die einzelnen
Enantiomeren für eine pharmakologische Begutachtung benötigt.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 105

Obwohl es sich bei dieser Verbindung um ein 1,3-diaxial substituiertes Molekül


handelt, sollte versucht werden, die sehr guten Resultate in der Enzymkatalyse des
(1SR,3RS,4RS)-konfigurierten Epimers auf diese neue Verbindung zu übertragen
(Abb. 2.45).

Pr O OH
O OMe

Pr O OH Me2N
Hydrolase
OMe 19
Phosphatpuffer-
+
Me2N Lösung Me2N
RT OH
rac-19 HO OMe

13
Abb. 2.45: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-19.

Um ein Enzym zu identifizieren, daß die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-19
mit hoher Aktivität und Selektivität zu finden, wurden acht Hydrolasen unter den
bisherigen Standardbedingungen, wäßriges Einphasensystem (pH 7.0, pH 8.0 im
Falle der PLE) mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens, in die enzymatische Hydrolyse
des Esters rac-19 eingesetzt. Es konnte nach ein bis drei Tagen Reaktionszeit in
keinem Fall eine Hydrolyse des Substrates in einem nennenswerten Umfang
festgestellt werden (Tabelle 2.37). In allen Fällen konnte das eingesetzte Edukt
nahezu vollständig zurückerhalten werden (91 – 100 % Ausbeute).
106 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.37: Enzymscreening zur Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrigen


Einphasensystem (Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

Enzym Reaktionszeit Umsatz

Cholesterolesterase
24 h 1%
(CE; 11.0 U/ml)
Candida rugosa Lipase
29 h 0%
(CRL; 4.6 U/ml)
Chirazyme L-2
45 h 0%
(CAL-B; 38.8 U/ml)
Burkholderia cepacia Lipase
45 h 0%
(BCL; 0.05 U/ml)
Burkholderia cepacia Lipase
46 h 0%
(BCL, 30 U/ml)
Porcine pancreatic Lipase
23 h 1%
(PPL; 16.8 U/ml)
Chromobacterium viscosum Lipase
69 h 0%
(CVL, 0.18 U/mg)
Schweineleber-Esterase
41 h 0%
(PLE, 6.5 U/ml), pH 8.0

Da sich in der CRL-katalysierten Hydrolyse von Tramadol-Analoga neben dem


wäßrigen Einphasensystem das wäßrig-organische Zweiphasensystem als ein
geeignetes Reaktionsmedium herausgestellt hat, wurde rac-19 ebenfalls unter den
Reaktionsbedingungen eines Zweiphasensystems eingesetzt (Tabelle 2.38). Es
konnte allerdings auch in diesem Fall keine nennenswerte enzymatische Aktivität
beobachtet werden.

Tabelle 2.38: Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im


wäßrig-organischen Zweiphasensystem (9.2 U/ml; Phosphatpuffer,
pH 7.0; MTBE; 1 : 1)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester 19 ee Alkohol 13 E

69 h 1% n. b. n. b. -
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 107

Insgesamt stellen die hier eingesetzten Enzyme eine repräsentative Auswahl der
standardmäßig in der organischen Synthese eingesetzten Hydrolasen dar. Die in
Kap. 2.3.2 hervorgehobenen Enzyme sind ebenfalls in dieser Auswahl vertreten.
Daher ist es nicht wahrscheinlich, daß bei dem Versuch weitere Enzyme in die
Hydrolyse von rac-19 einzusetzen ein Enzym gefunden wird, daß diese Reaktion
katalysiert und zudem noch die in Kap. 2.3.2 gemachten Voraussetzungen erfüllt.
Da unter den zur Hydrolyse von rac-19 verwendeten Enzymen und Reaktions-
bedingungen die zuvor eingesetzten Tramadol-Analoga als Substrate akzeptiert
wurden, ist die Konsequenz, daß rac-19 kein geeignetes Substrat für eine
enzymatische Hydrolyse darstellt. Ein naheliegender Grund warum dieser 1,3-diaxial
substituierte Ester nicht von den getesteten Enzymen als Substrat akzeptiert wird,
kann der sterischen Anspruch der tertiären Hydroxylgruppe, die sich in direkter Nähe
zu der vom Enzym anzugreifenden Estergruppe befindet, sein.

Um dennoch eine Enzym-katalysierte Racematspaltung erzielen zu können, wurde


daher zunächst versucht eine enzymatische Transacylierung des
korrespondierenden Alkohols rac-13 zu erreichen.
108 THEORETISCHER TEIL

2.4.2.4 Versuche zur enzymatischen Transacylierungen von


(±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexan-1,3-diol (rac-13)

Nachdem sich der 1,3-diaxial substituierte Ester rac-19 als kein geeignetes Substrat
für eine enzymatische Hydrolyse herausgestellt hatte, wurde die enzymatische
Transacylierung des Alkohols rac-13 auch in der Hoffnung untersucht, daß
zumindest der Alkohol aufgrund seines geringeren Raumbedarfs als Substrat
akzeptiert werden würde und einer enzymatischen Reaktion zugänglich ist (Abb.
2.46).

OH OH
OMe

OH OH Me2N
Lipase
OMe 13
Vinylester
+
Me2N organisches O
NMe2
Lösungsmittel
rac-13
RT R O OH OMe

19
Abb. 2.46: Enzymatische Transacylierung des Alkohols rac-13.

Obwohl es sich bei dem Grundkörper des Alkohols rac-13, ein substituiertes
Cyclohexan-1,3-diol, um eine für chirale Auxiliare interessante Zwischenstufe
handelt, sind bis heute nur wenige Publikationen zu einer enzymatischen
Racematspaltung erschienen.
Daß eine Acylierung von Cylohexan-1,3-diol selbst möglich ist, wurde bereits 1992
von BHATTACHARYA et al.214 sowie später 1996 MATTSON et al.215 gezeigt. Von beiden
ist jeweils die cis /trans-Mischung der Epimeren in die Hydrolasen katalysierte
Acylierung im organischen Medium eingesetzt worden. Von BHATTACHARYA et al.
wurde eine Mischung verschiedener Proteasen aus Streptomyces griseus (Pronase)
mit äquimolaren Mengen p-Nitrophenylacetat in Pyridin zur Acylierung verwendet. Es
wurde eine 1 : 1 Mischung der cis- und trans-kofigurierten Monoacetate in 42 %
Ausbeute erhalten. MATTSON et al. verwendeten immobilisierte Candida antarctica
Lipase Typ B (Novozym 435) mit S-Ethylthiooctanoat216 als Acylierungsmittel. Unter
diesen Reaktionsbedingungen konnte sogar eine Diacylierung beobachtet werden.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 109

Die Absolutkonfiguration des am langsamten reagierenden Isomers wurde zu


(1S,3S) bestimmt.214
Beim Cyclohexan-1,3-diol sind die Hydroxylgruppen allerdings nicht wie beim
Alkohols rac-13 in axialer Position fixiert, so daß bei diesem Substrat die Acylierung
einer 1,3-diaxialen Spezies als unwahrscheinlich anzunehmen ist.

Von GOTOR et al. ist ein Beispiel einer enzymatischen Acylierung eines höher
substituierten Cyclohexan-1,3-diol-Derivats veröffentlicht worden.217 Die von einer
Lipase aus Chromobacterium viscosum katalysierte Acylierung des (3S,5S)-
5-Ethynyl-4-methyl-cyclohex-4-ene-1,3-diols in Vinylacetat als Solvens verläuft mit
einer hohen Aktivität und führt mit 100 %Umsatz zu dem an 5 Position acylierten
Monoacetat (Abb. 2.47). Somit wird die am wenigsten sterisch gehinderte
Hydroxylgruppe acyliert.

CVL O
Vinylacetat
HO OH O OH
100 % Umsatz

Abb. 2.47: Enzymatische Transacylierung von cis-5-Ethynyl-4-methyl-cyclohex-4-


ene-1,3-diol mit Vinylacetat.

Um eine enzymatische Acylierung des Alkohols rac-13 zu erreichen, wurde dieses


Substrat zunächst unter für Transacylierungen im allgemeinen geeigneten
Bedingungen mit Vinylpropionat in Toluol eingesetzt. Als Katalysatoren wurden vier
verschiedene Lipasen verwendet (Tabelle 2.39). In keinem Fall konnte eine Enzym-
katalysierte Reaktion beobachtet werden. Im Fall des epimeren Alkohols rac-12
konnte unter diesen Reaktionsbedingungen ein E-Wert von 109 in der CRL-
katalysierten Transacylierung erreicht werden.
110 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.39: Enzymscreening zur enzymatischen Transacylierung des Alkohols


rac-13 in Toluol

Reaktionsbedingungen Reaktions- Umsatz


Enzym
(Äquiv.) zeit

Candida rugosa Lipase


Vinylpropionat (5) 72 h 0%
(CRL; 37 U/ml)
Porcine pancreatic Lipase
Vinylpropionat (5) 72 h 0%
(PPL; 67 U/ml)
Cholesterolesterase
Vinylpropionat (5) 72 h 0%
(CE; 35 U/ml)
Novozym 435
Vinylpropionat (5) 72 h 1%
(CAL-B)

Im Fall des Novozym 435 konnten Spuren des gewünschten Propionsäureesters von
13 detektiert werden. Daher wurde dies Enzym unter verschiedenen Reaktions-
bedingungen in die Transacylierung des Alkohols rac-13 eingesetzt. Es wurden
Dichlormethan und das Acylierungsmittel Vinylpropionat als Lösungsmittel verwendet
(Tabelle 2.40). Eine Enzym-katalysierte Reaktion war aber auch unter diesen
Bedingungen nicht zu beobachten.

Tabelle 2.40: Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von


Alkohol rac-13 (CAL-B)

Umsatz nach Umsatz nach


Reaktionsbedingungen
2.75 d 6d

Vinylpropionat (5),
1% 1%
Toluol

Vinylpropionat (5),
0% 0%
Dichlormethan

Vinylpropionat
1% 1%
als Solvens

Isopropenylacetat (5), 1% 1%
Toluol
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 111

In Anlehnung an die von GOTOR et al. publizierten Bedingungen zur enzymatischen


Acylierung des cis-5-Ethynyl-4-methyl-cyclohex-4-ene-1,3-diols,217 wurde daraufhin
die Chromobacterium viscosum Lipase in Vinylpropionat als Solvens in die
Acylierung von rac-13 eingesetzt. Zusätzlich wurde noch Triethylamin als Additiv
zugesetzt (Tabelle 2.41).
In verschiedenen Fällen wurde bei der Verwendung von Triethylamin von einem
positiver Effekt dieses Additivs auf das Ergebnis der enzymatischen Acylierung
berichtet.213,218 Durch die Zugabe einer organische Base werden Säurespuren in der
Reaktionsmischung neutralisiert, wodurch eine Aktivierung des Enzyms erreicht wird.

Tabelle 2.41: Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol


rac-13 unter Zusatz von Triethylamin

Reaktionsbedingungen Umsatz Umsatz


Enzym
(Äquiv) nach 5 d nach 12 d

Novozym 435 Vinylpropionat als Solvens


2% 4%
(CAL-B) Triethylamin (1.4)
Chromobacterium viscosum Vinylpropionat als Solvens
Lipase (CVL, 0.7 U/ml) 0% 1%
Triethylamin (1.4)
Burkholderia cepacia Lipase Vinylpropionat als Solvens
0% 0%
(BCL, 80 U/ml) Triethylamin (1.4)

Aus Tabelle 2.41 geht hervor, das eine Acylierung des Alkohols rac-13 nicht erreicht
werden kann. Weder das von GOTOR et al. beschriebene Enzym CVL katalysiert
diese Reaktion, noch führt der Zusatz Triethylamin zu einer Aktivierung der Enzyme
in einem zu wünschenden Umfang.

Entsprechend den Ergebnissen in den Versuchen zur enzymatischen Hydrolyse


wurde das 1,3-diaxiale Diol rac-13 auch unter den Reaktionsbedingungen einer
Transacylierung im organischen Medium nicht von den getesteten Hydrolasen als
Substrat akzeptiert. Das Ziel eine Enzym-katalysierte Racematspaltung mit diesem
Substrat durchzuführen scheint daher nicht erreichbar zu sein.
Eine mögliche Erklärung sind die sterischen Wechselwirkungen der beiden
1,3-diaxial angeordneten Hydroxylgruppen.
112 THEORETISCHER TEIL

Allerdings kann auch im allgemeinen eine enzymatische Reaktion an einer axial


konfigurierten Hydroxylgruppe erschwert sein. So konnten nämlich TANIKAGA et al. im
Falle verschiedener 3-substituierter Cyclohexanole keine enzymatische Acylierung
beobachten, wenn sich die Hydroxylgruppe in axialer Position im Cyclohexylring
befand, wohingegen bei den gleichen Substraten mit equatorialer Hydroxylgruppe
eine enzymatische Racematspaltung möglich war (Abb. 2.48).219

OH OH Lipase PS
R +
Vinylacetat
R
(1S,3S)
(1R,3R)
Lipase PS
R OH + OH R OAc
Vinylacetat
R
Benzol, 30 °C (−)-(1R,3S)
(1R,3S) (1S,3R)

R = Ph, SPh, Bn, SO2Ph

Abb. 2.48: Unterschiedliche Reaktivitäten der Lipase PS hinsichtlich equatorialen


und axialen Hydroxylgruppen.

Im Falle der von MATTSON et al. beschrieben Racematspaltung einer Mischung von
cis- und trans-Cyclohexan-1,3-diol, war das zurückbleibende, am langsamsten
reagierende Isomer ebenfalls (+)-(1S,3S)-konfiguriert.215
Im Falle der enzymatischen Racematspaltung von N-substituierten cis-
2-Aminocylhexanolen, konnte von GOTOR et al. ebenfalls keine CAL-B-katalysierte
Acylierung beobachtet werden, wenn die Hydroxylgruppe axial fixiert war.197 Eine
entsprechende Acylierung des trans-konfigurierten Epimers verlief hochselektiv.196
Der Unterschied in der Reaktivität beider Substrate wurde von den Autoren ebenfalls
durch die geometrische Anordnung der axialen Hydroxylgruppe erklärt.

Da demzufolge der Alkohol rac-13 aufgrund seiner geometrischen Anordnung keiner


enzymatischen Reaktion zugänglich ist, bietet sich die Möglichkeit an, die
Verbindung so zu Modifizieren, daß sie als Substrat akzeptiert werden kann.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 113

2.4.2.5 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-


(6-dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester
(rac-21)

Nachdem sich gezeigt hatte, daß weder der 1,3-diaxial substituierte Ester rac-19
noch der korespondierende Alkohol rac-13 aufgrund der geometrischen Anordnung
der Hydroxylgruppe als Substrat in eine Enzym-katalysierte Racematspaltung
eingesetzt werden können, wurde nach einer geeigneten Modifizierung des Alkohols
rac-13 gesucht, um ihn einer enzymatischen Reaktion zugänglich zu machen.

Pr O OH Hydrolase OH OH
OMe OMe
Phosphatpuffer-
Me2N Lösung Me2N
rac-19 13

Abb. 2.49: Versuch zur enzymatische Hydrolyse des Esters rac-19.

Eine erste Alternative zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-19 ist die
Möglichkeit den Alkohol rac-13 in ein cyclisches Carbonat (rac-48) unter Einbindung
der tertiären Hydroxylgruppe zu überführen und anschließend eine enzymatische
Racematspaltung dieser Verbindung durchzuführen (Abb. 2.50). Das solche
cyclischen Carbonate als Substrate in eine Hydrolasen-katalysierte Reaktion
eingesetzt werden können, ist bereits von MATSUMOTO et al. sowie GUIBE-JAMPEL et
al. demonstriert worden.220

OH OH O O
OMe OMe Hydrolase
Phosphatpuffer-
Me2N Me2N Lösung
rac-13 rac-48

Abb. 2.50: Enzym-katalysierte Racematspaltung des Carbonats rac-48 als


alternative Route zur Darstellung der einzelnen Enantiomeren von 13.

Von BURK et al. wird eine effiziente Methode zur Überführung von 1,3-Diolen in
cyclische Carbonate beschrieben. Nachdem es ihnen nicht gelang ein 1,3-Diol mit
114 THEORETISCHER TEIL

verschiedenen bekannten Methoden unter Verwendung von Kohlenstoffmonoxid,


Phosgen, Trichloracetylchlorid und 1-1´-Carbonyldiimidazol die gewünschte
Verbindung zu erhalten, ist ihnen diese Reaktion schließlich erfolgreich unter
Verwendung von Bis-(trichlormethyl)-carbonat (Triphosgen221) gelungen.222 Es wurde
daher versucht rac-13 unter den von BURK et al. beschriebenen Reaktions-
bedingungen in das Carbonat rac-48 zu überführen (Abb. 2.51).

0.5 Äquiv. O
Triphosgen
OH OH O O
10 Äquiv. Pyridin
OMe (⋅HCl) OMe

Me2N Dichlormethan Me2N


− 76 °C
rac-13 (⋅HCl) rac-48

Abb. 2.51: Versuch zur Darstellung des Carbonats rac-48 durch Acylierung mit
Triphosgen.

Rac-13 wurde sowohl als Hydrochlorid als auch als freie Base in diese Reaktion
eingesetzt. Aufgrund der Giftigkeit des während der Reaktion freigesetzten Phosgens
wurde keine Reaktionskontrolle durchgeführt. Nach Chromatographie der erhaltenen
Reaktionsmischungen konnten neben dem zurückgewonnenen Edukt nur jeweils
nicht näher charakterisierte Zersetzungsprodukte erhalten werden. Dies ist wahr-
scheinlich darauf zurückzuführen, daß aufgrund der hohen Reaktivität des
Triphosgens bzw. Phosgens eine Acylierung am Stickstoff als Nebenreaktion auftritt.
Die am Stickstoff acylierte Spezies kann anschließend eine N-Dealkylierung
eingehen. Diese Nebenreaktion wurde versucht zu unterdrücken, indem rac-13 als
Hydrochlorid eingesetzt wurde.

Eine Prozedur zur Überführung von rac-13 in das cyclische Carbonat unter milderen
Reaktionsbedingungen wurde von KUTNEY et al. beschrieben. Sie beschreiben die
Überführung eines cyclischen 1,2-diols in das entsprechende Carbonat unter
Verwendung von 1-1´-Carbonyldiimidazol in Toluol.223 Daraufhin wurde versucht
rac-13 mittels dieses Reagenzes unter den von KUTNEY et al. publizierten
Bedingungen in rac-48 zu überführen (Abb. 2.52).
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 115

O
4 Äquiv.
OH OH O O
OMe 1,1´-Carbonyldiimidazol OMe

Me2N Toluol, Rückfluß Me2N


5h
rac-13 rac-48

Abb. 2.52: Versuch zur Darstellung des Carbonats rac-48 durch Acylierung mit
1,1´-Carbonyldiimidazol.

Rac-13 wurde wieder sowohl als Hydrochlorid als auch als freie Base eingesetzt. Die
Reaktion wurde abgebrochen nachdem jeweils kein Edukt mehr detektiert werden
konnte. Die rohen Produktmischungen wurden mittels Massenspektroskopie
untersucht und es konnte ein Fragment mit einer Masse von 305 detektiert werden,
dem M+ von rac-48 zugeordnet wurde. Nach Chromatographie (EE : MeOH = 2 : 1
über Kieselgel) konnte allerdings keine gewünschtes Produkt erhalten werden. Da
das Vorhandensein von 48 in der rohen Produktmischung nachgewiesen wurde, ist
zu vermuten, daß das Carbonat 48 unter den Bedingungen der Chromatographie
nicht stabil ist. Es wird daher angenommen, daß selbst wenn rac-48 ohne
Chromatographie dargestellt werden könnte, es aufgrund seiner mangelnden
Stabilität kein geeignetes Substrat für eine enzymatische Hydrolyse darstellt.
Diese Route zur Darstellung der einzelnen Enantiomeren von 13 mittels eines
cyclischen Carbonats (rac-48) als Substrat für eine enzymatische Racematspaltung,
wurde daraufhin nicht weiter verfolgt.

Um trotzdem eine Möglichkeit zur Enzym-katalysierten Racematspaltung von rac-13


aufzuzeigen, wurde auf die bereits vorgestellte Methode der Enzym-katalysierten
Racematspaltung von Phenylestern zurückgegriffen (siehe Abb. 2.55, S. 116). Dazu
ist es notwendig rac-13 durch O-Demethylierung in das entsprechende Phenol zu
überführen und dies dann selektiv an der aromatischen Hydroxylgruppe zu verestern.

Die Etablierung der phenolischen Hydroxylgruppe erfolgte analog zur Darstellung


des Phenols rac-8 durch Reaktion mit Diisobutylaluminiumhydrid (DiBAl-H) in Toluol
unter Rückfluß in guter Ausbeute (88 %).91 Eine Dealkylierung am Stickstoff war nicht
zu beobachten (Abb. 2.53).
116 THEORETISCHER TEIL

OH OH OH OH
OMe DiBAl-H OH
Toluol
Me2N Rückfluß Me2N
rac-13 rac-20, 88 %

Abb. 2.53: Darstellung des Phenols rac-20 durch O-Demethylierung mit DiBAl-H.

Zur selektiven Darstellung des Phenylesters rac-21 erfolgte nach einer Methode von
RICE et al (s. Kap. 2.2, S. 16).95 Dazu wurde das Phenol rac-20 mit 10 Äquivalenten
Buttersäureanhydrid in Gegenwart eines Überschusses an wäßriger NaHCO3-
Lösung in sehr guter Ausbeute (93 %) zu rac-21 umgesetzt (Abb. 2.54).

OH OH OH OH
OH NaHCO3-Lösung O Pr
10 Äquiv. Buttersäure-
Me2N Me2N O
anhydrid
rac-20 RT, 30 Min. rac-21, 93 %

Abb. 2.54: Selektive Darstellung des Esters rac-21.

Mit rac-21 steht nun ein Substrat zur Verfügung, das nach den Untersuchungen zur
enzymatischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga mit aromatischer
Hydroxylgruppe als Substrat akzeptiert werden sollte. Der Ester rac-21 wurde
daraufhin in die Enzym-katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.55).

OH OH
O Pr
OH OH Enzym Me2N O
O Pr
Phosphatpuffer- (+)-21
Me2N O Lösung
+
RT Me2N
rac-21 OH
HO OH

(−)-20

Abb. 2.55: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21.

Im Rahmen der Untersuchungen zur enzymatischen Hydrolyse des Phenylesters


rac-15 hatte sich gezeigt, das in der Schweineleber-Esterase-katalysierten Reaktion
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 117

und in der Candida rugosa Lipase-katalysierten Reaktion gute Ergebnisse erzielt


worden sind. Daher wurde rac-21 in die von diesen Enzymen katalysierte Hydrolyse
zunächst unter Standardbedingungen, wäßrige Phosphatpufferlösung mit 10 % tert-
Butanol als Cosolvens, eingesetzt (Tabelle 2.42). Es wurde ebenfalls das Enzym
Cholesterolesterase, welches aus Candida rugosa erhalten wird, in die Hydrolyse
von rac-21 unter den genannten Bedingungen eingesetzt.

Tabelle 2.42: Enzym-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-21 im wäßrigen


Einphasensystem (Phosphatpuffer; 10 % tert-Butanol)

Reaktions- ee Ester ee Phenol


Reaktionsbedingungen Umsatz E-Wert
zeit (+)-21 (−)-20

Cholesterolesterase
16.8 h 64 % 71 % 11 % 2
(CE; 3.3 U/ml) pH 7.0
Schweineleber-Esterase
3.3 h 82 % 20 % 6% 1.3
(PLE; 4.9 U/ml), pH 8.0
Candida rugosa Lipase
18.5 h 40 % 31 % 17 % 2
(CRL; 4.6 U/ml), pH 7.0

Aus Tabelle 2.42 geht hervor, daß der Phenylester rac-21 im Gegensatz zu dem
Ester der sekundären Hydroxylgruppe (rac-19) ein Substrat für eine enzymatische
Racematspaltung ist. Alle drei eingesetzten Enzyme zeigen eine hohe Aktivität in der
Hydrolyse dieses Esters. Die Aktivität der getesteten Enzyme ist im Bereich der
Aktivität hinsichtlich des Esters rac-15. Die unter diesen Standardbedingungen eines
Enzymscreenings erzielte Selektivitäten sind allerdings für alle Enzym sehr schlecht.
Im Rahmen der Untersuchungen zum Phenylesters rac-15 wurden unter gleichen
Bedingungen höhere Selektivitäten in der CRL- und PLE-katalysierten Hydrolyse
erzielt. Die höchste Selektivität in der Hydrolyse des Phenylesters rac-15 wurde in
der CRL-katalysierten Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem
beobachtet. Daher wurde der Phenylester rac-21 ebenfalls in die CRL-katalysierte
Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem eingesetzt (Tabelle 2.43).
118 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.43: CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrig-


organischen Zweiphasensystem (4.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0;
MTBE; 1 : 1)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E

46 h 57 % 89 % 28 % 5

Die unter diesen Bedingungen erzielte Selektivität, ausgedrückt in einem E-Wert von
5, ist zwar höher als die, die im wäßrigen Einphasensystem beobachtet wurde, sie ist
allerdings für eine kinetische Racematspaltung dieses Esters zu gering.
Somit ist wie im Falle des Esters rac-15 auch mit dem Esters rac-21 in der CRL-
katalysierte Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem die höchste
Selektivität beobachtet worden. Insgesamt konnte die prinzipielle Möglichkeit zu
einer Enzym-katalysierten Racematspaltung des 1,3-diaxial substituierten Alkohols
rac-13 aufgezeigt werden und so wiederum die Anwendbarkeit der Methode einer
Enzym-katalysierten Racematspaltung von phenolischen Estern demonstriert
werden.
Die bisher in der enzymatischen Hydrolyse des Phenylesters rac-21 erzielte
Selektivität ist mit einem E-Wert von 5 sehr gering. Allerdings wurden in den ersten
Versuchen zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-15 auch ähnlich niedrige
Selektivitäten beobachtet, die dann optimiert werden konnten. Daher kann eine
Optimierung der Reaktionsbedingungen (Enzym, Cosolvens, Kettenlänge des Esters
u.a.) hier möglicherweise auch zu einer Steigerung der Selektivität führen.

Außerdem stehen zur Steigerung des Enantiomerenüberschusses der Produkte


einer enzymatischen Racematspaltung noch anwendungstechnische Möglichkeiten
offen. So kann das gewünschte enantiomerenangereicherte Produkt wieder in eine
enzymatische Reaktion eingesetzt werden.5,6 Diese Strategie ist bereits von vielen
Autoren untersucht worden224, so daß hier bereits Wege zur Vereinfachung und zur
Optimierung aufgezeigt worden sind.225 Beispielsweise sind hierzu von CHEN et al.
Untersuchungen zur Vorhersage des günstigsten Umsatzes gemacht worden.106

In der konkurrierenden klassischen oder thermodynamischen Racematspaltung von


rac-13 mit Weinsäurederivaten können sehr gute Ergebnisse erzielt werden.184 Diese
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 119

Methode ist zur Trennung der Enantiomeren in einem präparativen Maßstab


geeignet.

Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Phenols 20 erfolgte


durch Vergleich der Drehwerte mit denen, die bereits für die Enantiomeren der
Hydrochloride des O-methylierten Alkohols 13 publiziert sind.98
Die Bestimmung der Absolutkonfiguration des Esters 21 erfolgte in Analogie zu der
des Phenols 20.
120 THEORETISCHER TEIL

2.4.2.6 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-


dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-
ester (rac-22)

Der racemische Alkohol 2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-


1,4-diol (rac-14) ist die interessanteste Verbindung, der Rahmen dieser Arbeit
diskutierten Substrate, da das (+)-(1S,2R,4R)-Enantiomer eine wichtige Vorstufe des
Wirkstoffs (+)-50, dem para-Fluorbenzylether von (+)-14, ist. Dieser Wirkstoff ist ein
vielversprechender Entwicklungskandidat der GRÜNENTHAL GmbH97, der in der
präklinischen Entwicklung weit vorangeschritten ist. Aufgrund des stark
unterschiedlichen pharmakologischen Profils der einzelnen Enantiomeren ist eine
Vermarktung der enantiomerenreinen Verbindung (+)-50 geplant (Abb. 2.56).184

F OH
OMe ⋅HCl
O
Me2N
(+)-50⋅HCl

Abb. 2.56: (+)-(1S,2R,4R)-2-Dimethylaminomethyl-4-(4-fluoro-benzyloxy)-1-


(3-methoxy-phenyl)-cyclohexanol hydrochlorid ein vielversprechender
Entwicklungskandidat der GRÜNENTHAL GmbH.

Diese Substanz zeigt eine sehr starke analgetische Aktivität, die über die von
Morphin hinausgeht. Somit könnte ein Einsatz in der Therapie gegen sehr starke
Schmerzen erfolgen. Aufgrund einer sehr hohen Wirkstärke von (+)-50 ist hierzu nur
die Verabreichung geringster Mengen nötig. Dabei ist auch eine orale Einnahme
möglich, was einen Fortschritt zu der bisherigen Therapie darstellt. Eine weitere
Verbesserung ist, daß die häufig als Nebenwirkung auftretende Atemdepression
gegenüber vergleichbaren Wirkstoffen, wie dem Morphin, vermindert ist.184
Interessanterweise zeigt dieser Wirkstoff, wie das Tramadol, eine µ-opioide und eine
nicht-opioide Wirkung. Doch während beim Tramadol die Inhibierung der
Wiederaufnahme der Neurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5HT)
hauptsächlich über das (−)-Enantiomer erfolgt, zeigt in diesem Falle das (+)-50
neben der µ-opioiden Wirkung auch die Wirkung der Wiederaufnahmehemmung.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 121

Das Wirkprofil des Racemats Tramadol konnte somit in einem Enantiomer eines
neuen Wirkstoffs vereint werden.184
Das entsprechende (−)-Enantiomer zeigt ebenfalls eine analgetische Aktivität, die
aber nicht an die Wirkstärke von (+)-50 heranreicht. Zudem verursacht es starke
Nebenwirkungen (Herz-Kreislauf-Beschwerden), die im Falle des (+)-50 weniger
stark ausgeprägt sind. Durch die Fluor-Substitution am Aromaten wird eine
verlangsamte Metabolisierung im Körper erreicht.184 Erst kürzlich ist über das nicht
fluorsubstituierte (+)-4-Benzyloxytramadol ist mit ausgewählten pharmakologischen
Daten berichtet worden.46i) Diese zeigen ebenfalls eine im Vergleich zum Tramadol
gesteigerte Affinität zum µ–Opioidrezeptor.

Obwohl in diesem Fall die Verwendung eines einzelnen Enantiomers geplant ist,
werden natürlich beide einzelnen Enantiomeren für eine pharmakologische
Begutachtung benötigt.

Wie der isomere Alkohol rac-12 ist auch rac-14 aufgrund der equatorial
angeordneten sekundären Hydroxylgruppe ein Substrat, daß sich für eine
Hydrolasen-katalysierte Racematspaltung anbietet. Ausgehend von den bisherigen
Ergebnissen zur enzymatischen Hydrolyse von Tramadol-Analoga wurde wiederum
das Butyrat als Acylrest gewählt und unter den bisherigen Standardbedingungen,
wäßriges Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens, in die enzymatische
Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.57).

OH
OMe
Pr O
Me2N
O
OH (+)-22
Enzym
OMe
Pr O Phosphatpuffer-
Me2N Lösung +
O 10 % Cosolvens
rac-22 Me2N OH
RT OMe
HO

(−)-14
Abb. 2.57: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22.
122 THEORETISCHER TEIL

Als erstes Enzym wurde die Lipase aus Burkholderia cepacia als Katalysator in die
enzymatische Hydrolyse des Esters rac-22 eingesetzt (Tabelle 2.44). Nach
22 Stunden Reaktionszeit konnte kein Produkt mittels DC-Reaktionskontrolle
detektiert werden, daraufhin wurde die Reaktionstemperatur auf 35 ºC für die
restliche Reaktionszeit erhöht. Nach insgesamt 48 Stunden Reaktionszeit konnte
immer noch kein Umsatz beobachtet werden, daraufhin wurde die Reaktion
abgebrochen. In der BCL-katalysierten Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit
Vinylpropionat wurde ebenfalls eine nur geringe Aktivität dieses Enzyms festgestellt
(Tabelle 2.29). Eine Erklärung könnte sich aus dem aktiven Zentrum dieser Lipase
ergeben: von KAZLAUSKAS et al. wurden die aktiven Zentren verschiedener Lipasen
untersucht, hierbei zeigte sich, daß die BCL226 verglichen mit der CRL227 über eine
viel schmalere Tasche zur Bindung des Alkohols verfügt.228 Dies mag der Grund
dafür sein, daß dies Enzym die relativ großen Moleküle der Tramadol-Analoga nur
mit geringer Aktivität akzeptiert.

Tabelle 2.44: Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 (20 U/ml;
Phosphatpuffer, pH 7.5; 10 % tert-Butanol)

Reaktions- ee Ester ee Alkohol


Enzym Umsatz E-Wert
zeit 22 14

Burkholderia cepacia
48 h 0% n. b. n. b. -
Lipase

In der Transacylierung des korrespondierenden Alkohols rac-14 zeigte die


Enzympräparation Novozym 435 (CAL-B) sehr gute Aktivität und auch Selektivität
(s. Kap. 2.4.2.9 beginnend ab S. 144). Daraufhin wurde das Novozym 435 auch in
die Hydrolyse des Esters rac-22 eingesetzt (Tabelle 2.45). Wie schon bei der
Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 zuvor ist die Aktivität dieser
immobilisierten Candida antarctica Lipase auch in der Hydrolyse des Esters rac-22
gering. Erst nach einer Reaktionszeit von 10 Tagen ist ein Umsatz von 35 % bei
einer moderaten Selektivität, ausgedrückt in einem E-Wert von 24, erzielt worden.
Die CAL-B hydrolysiert bevorzugt den (−)-Ester zum Alkohol (−)-14. Damit zeigt sie
die gleiche Enantiopräferenz wie zuvor beim Substrat rac-18, bei dessen Lipasen-
katalysierter Hydrolyse bevorzugt der Alkohol (−)-12 gebildet wird.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 123

Tabelle 2.45: CAL-B-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22 mit verschiedenen


Enzympräparationen (Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktions- ee Ester ee Alkohol


Enzym Umsatz E-Wert
zeit (+)-22 (−)-14

Novozym 435
10 d 35 % 67 % 85 % 24
(CAL-B)
Chirazyme L2
45 h 7% 9% ≥98 % >200
(CAL-B, 58 U/ml)

Eine höhere Aktivität in der Candida antarctica Lipase des Esters rac-22 wurde von
einer lyophilisierten Form unter dem Namen Chirazyme L2 erwartet (Tabelle 2.45).
Allerdings konnte nach 45 Stunden lediglich ein Umsatz von 7 % erzielt werden. Ein
Umsatz, der in der gleichen Zeit auch in der Novozym 435-katalysierten Hydrolyse
des Esters rac-18 erreicht worden war. Eine Verlängerung der Reaktionszeit würde
sicherlich zu höheren Umsätzen führen, aber eine Reaktionszeit von bis zu 10 Tagen
erscheint für einen möglichen zukünftigen Produktionsprozeß nicht zweckmäßig.
Interessanterweise ist die Selektivität dieser Reaktion bis zum erreichten Umsatz
außerordentlich hoch. Es wurde praktisch nur der (−)-Ester hydrolysiert. Diese hohe
Selektivität wird als E > 200 ausgedrückt. Bei einem höheren Umsatz wäre dieser
E-Wert aussagekräftiger, da bei niedrigen Umsätzen kleine Schwankungen in der
Bestimmung des ee-Werts des Alkohols zu hohen Schwankungen im E-Wert führen
können, außerdem kann es bei Abweichungen von den Voraussetzungen zum E-
Wert zu einem Abfall der Selektivität mit Fortschreiten der Reaktion kommen.

Die Candida rugosa Lipase hat in der Hydrolyse von rac-18 und Transacylierung von
rac-12 sehr gute Aktivitäten und Selektivitäten gezeigt. Zunächst wurde die CRL in
die Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem mit 10 % tert-
Butanol als Cosolvens eingesetzt (Tabelle 2.46). Nach 24 Stunden konnte bei einem
Umsatz von 27 % ein ee-Wert von 92 % im Alkohol (−)-14 bei einem ee-Wert im
Ester von 38 % erzielt werden. Dies entspricht einem E-Wert von 34. Wie schon bei
der Hydrolyse des Esters rac-18 wird von dem Enzym CRL, wie zuvor auch von der
CAL-B, das (−)-Enantiomer des Substrats bevorzugt umgesetzt. Die erzielte
Selektivität ist niedriger als die, die in der Hydrolyse der isomeren Verbindung rac-18
124 THEORETISCHER TEIL

erzielt wurde. Für eine Hydrolyse in einem größeren präparativen Maßstab wäre die
Selektivität aber hoch genug. In Abb. 2.22 auf S. 58 ist die Abhängigkeit der ee-
Werte von Substrat (+)-22 und Produkt (−)-14 bei einer Selektivität von E = 34
dargestellt. Aus dieser Abbildung geht hervor, daß ab einem Umsatz von ca. 60 %
der nicht umgesetzte Ester enantiomerenrein vorliegt.

Tabelle 2.46: CRL-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22 in verschiedenen


Reaktionssystemen (Candida rugosa Lipase; 4.5 U/ml)

Reaktions- ee Ester ee Alkohol


Reaktionsbedingungen Umsatz E-Wert
zeit (+)-22 (−)-14

Einphasensystem
(Phosphatpuffer, pH 7.0; 24 h 27 % 38 % 92 % 34
10 % tert-Butanol)
Zweiphasensystem
(Phosphatpuffer, pH 7.5; 5d 34 % 37 % 69 % 8
MTBE; 1 : 1)

Nach der Hydrolyse im wäßrigen Einphasensystem, wurde die CRL-katalysierte


Hydrolyse im organisch-wäßrigen Zweiphasensystem als Reaktionsmedium
durchgeführt (Tabelle 2.46). Bisher zeigte die CRL im Zweiphasensystem bei meist
ähnlicher Aktivität eine höhere Selektivität. Im Fall des Substrates rac-22 ist die
Reaktionsgeschwindigkeit im organisch-wäßrigen Zweiphasensystem erheblich
niedriger als im Einphasensystem. Zum Erreichen eines Umsatzes von 34 % werden
5 Tage benötigt. Diese Verlängerung der Reaktionszeit kann durch eine für das
Substrat rac-22 weniger günstiger Konformation des Enzyms, welche die Diffusion
des Esters in das aktive Zentrum und die anschließende Bildung des Acyl-Enzyms
erschwert, hervorgerufen werden. Die Selektivität der Hydrolyse im Zweiphasen-
system ist ebenfalls erheblich niedriger als die im Einphasensystem. Dies würde sich
durch eine für das Substrat rac-22 weniger günstiger Konformation des Enzyms
ebenfalls erklären lassen.

Zur Vorhersagbarkeit der Selektivität in Lipasen-katalysierten Reaktionen


entwickelten KAZLAUSKAS et al. einfache empirische Modelle (Abb. 2.58). Mit diesen
Modellen läßt sich die Selektivität hinsichtlich des bevorzugt reagierenden
Enantiomers für sekundäre229 und primäre230 Alkohole vorhersagen, wobei die
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 125

Substituenten am Stereozentrum nur aufgrund ihrer Größe unterschieden werden.231


Durch gezielte Veränderung von Substraten konnte gezeigt werden, daß die
Selektivität durch Erhöhung des Größenunterschieds der Substituenten gesteigert
wird. Die Anwendung dieses Models auf große, höher substituierte Verbindungen
muß aber nicht immer gelingen, da es nicht für solche Verbindungen im Detail belegt
worden ist.

HO
HO H H

M L M L

sekundäre Alkohole primäre Alkohole

Abb. 2.58: Empirische Selektivitätsmodelle nach KAZLAUSKAS et al. Das jeweils


gezeigte Enantiomer wird schneller in einer Lipasen-katalysierten
Reaktionen umgesetzt (L = großer Substituent, M = kleiner Substituent).

Im Fall des Esters 22 wird von der CRL bevorzugt das (−)-(1R,2S,4S)-konfigurierte
Enantiomer umgesetzt. Dies läßt sich mit dem KAZLAUSKAS Modell in Einklang
bringen (Abb. 2.59). Zum Vergleich sind in Abb. 2.59 neben dem Alkohol (−)-14 die
von der CRL bevorzugten Enantiomere (−)-41193 und (+)-42194 abgebildet. Auf alle
drei Enantiomere läßt sich das Selektivitätsmodell nach KAZLAUSKAS et al. anwenden.

OH OH OH
OMe

NMe2 N
OMe
OH
MeO
(−)-14 (−)-41 (+)-42

Me2N OH
OMe
HO
(−)-14

Abb. 2.59: Von der CRL entsprechend dem von KAZLAUSKAS et al. entwickelten
Modell bevorzugt umgesetzte Enantiomere.
126 THEORETISCHER TEIL

In weiteren Untersuchungen zur Candida rugosa Lipase wurde das aktive Zentrum
dieses Enzyms von KAZLAUSKAS et al. mit dem anderer verglichen.228 Das aktive
Zentrum der CRL wird durch eine weite Öffnung beschrieben, die es ermöglicht auch
große sekundäre Alkohole als Substrate zu akzeptieren.227 Des weiteren ist eine
tunnelartige Tasche in direkter Nähe zum aktiven Zentrum, die den Acylrest
aufnehmen kann. Im Vergleich zu dem aktiven Zentrum der CRL verfügt die CE über
eine ähnliche weite Öffnung, die es diesem Enzym ermöglicht ebenfalls große
sekundäre Alkohole umzusetzen.232
Diese Betrachtungen führten zu der Überlegung die Cholesterolesterase in die
enzymatische Hydrolyse des Esters rac-22 einzusetzen (Abb. 2.60).

OH
OMe
Pr O
Me2N
O
OH CE
OMe (+)-22
Pr O Phosphatpuffer-
Me2N Lösung (pH 7.0) +
O 10 % Cosolvens Me2N OH
rac-22 RT OMe
HO

(−)-14
Abb. 2.60: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22.

Die CE-katalysierte Hydrolyse wurde unter den Reaktionsbedingungen des wäßrigen


Einphasensystems bei pH 7 mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens durchgeführt. Das
Enzym zeigte eine gute Aktivität in der Hydrolyse, daher wurde die Reaktion bereits
nach 2.5 Stunden abgebrochen und aufgearbeitet (Tabelle 2.47). Nach dieser
Reaktionszeit lag der gebildete Alkohol (−)-14 bei einem Umsatz von 21 %
enantiomerenrein vor, der noch nicht umgesetzte Ester hatte 30 % ee. Die
Cholesterolesterase hydrolysiert bevorzugt das (−)-Enantiomer und zeigt somit die
gleiche Enantiopräferenz wie die CRL. Die in der CE-katalysierten Hydrolyse des
Esters rac-22 erreichte Selektivität von E größer 200 ist wesentlich höher als die
zuvor beobachteten Selektivitäten. Für ein repräsentatives Beispiel ist der erreichte
Umsatz allerdings zu niedrig. Die Reaktion wurde daher wiederholt und nach
19.5 Stunden bei einem Umsatz von 38 % abgebrochen. Bei diesem Umsatz lag der
gebildete Alkohol (−)-14 nur noch mit einem ee-Wert von 93 % vor (Tabelle 2.47).
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 127

Tabelle 2.47: CE-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22 (9 U/ml; Phosphat-


puffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

2.5 h 21 % 30 % ≥98 % >200


19.5 h 38 % 67 % 93 % 55

Für eine Selektivität von E > 200 hätte er enantiomerenrein vorliegen müssen. Die
Selektivität der Reaktion bei einem Umsatz von 38 % läßt sich daher auch nur mit
einem E-Wert von 55 beschreiben. Ein geringer Abfall der Selektivität der Reaktion
bei höheren Umsätzen wurde auch schon in der PLE-katalysierten Hydrolyse von
rac-15 beobachtet (Tabelle 2.9, S 52). Eine Änderung des E-Werts im Verlauf der
Reaktion stellt in der Regel eine Abweichungen von den gemachten
Voraussetzungen zum E-Wert dar. Bei sehr hohen Selektivitäten ist außerdem zu
beachten, daß geringe Schwankungen im gemessenen ee-Wert zu einen großen
Differenz im E-Wert führt.

Die CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 wurde daraufhin wiederholt und mit
dem bereits vorgestellten Verfahren zur Gewinnung der Produkte durch Extraktion
bei verschiedenen pH-Werten aufgearbeitet. Zum Aufarbeitung der Reaktion nach
22.5 Stunden wurde die Reaktionslösung mit Diethylether bei pH 7 extrahiert. Es
konnte (+)-22 in 53 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 91 % isoliert werden.
Nachdem die verbliebene wäßrige Phase durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10
eingestellt wurde, konnte (−)-14 in 45 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 91 % durch
Extraktion mit Dichlormethan erhalten werden (Tabelle 2.48).
128 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.48: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 mit extraktiver


Aufarbeitung (6.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (+)-22 Ester (+)-22 (−)-14 Alkohol (−)-14

22.5 h 91 % 53 % 91 % 45 % 67

Es konnte eine Selektivität von 67 bei einem Umsatz von ca. 46 % beobachtet
werden. Sowohl der nicht umgesetzte Ester (+)-22 als auch der Alkohol (−)-14 liegen
mit einem ee-Wert von 91 % vor. Dies Ergebnis stellt eine gute Ausgangsbasis zur
Gewinnung der einzelnen Enantiomeren von 14 dar. Würde die Reaktion früher
abgebrochen, kann der Alkohol (−)-14 mit hohen ee-Werten erhalten werden (vgl.
Tabelle 2.47). Würde man die Reaktion später bei einem Umsatz größer 50 %
abbrechen, könnte der enantiomerenreine Ester (+)-22 erhalten werden.
Mit dieser präparativen Reaktion konnte demonstriert werden, daß die CE-
katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 ein geeignetes Verfahren zur Darstellung
der Enantiomeren von 14 darstellt. In der Katalyse mit dem Enzym wurde die
höchste Selektivität in der Hydrolyse des Esters rac-22 beobachtet. Somit stellt
dieses Enzym einen interessanten Katalysator nicht nur in der Racematspaltung von
Tramadol-Analoga dar.

Für eine enzymatische Hydrolyse von Tramadol-Analoga in einem präparativen


Maßstab kann die geringe Löslichkeiten der entsprechenden Ester unvorteilhaft sein,
da dadurch nur geringe Konzentrationen verwendet werden können, die ein erhöhtes
Lösungsmittelaufkommen mit den sich daraus ergebenen Konsequenzen notwendig
macht. Günstiger für einen Prozeß sind hohe Substratkonzentrationen.
Es wurde daher erwogen, das Hydrochlorid des Esters rac-22 in die CE-katalysierte
Hydrolyse einzusetzen, da die Hydrochloride von Tramadol-Analoga im allgemeinen
sehr gut wasserlöslich sind.
Die Verwendung von basischen Verbindungen in Form ihrer Hydrochloride in der
Enzym Katalyse ist bisher selten. Eines der wenigen Beispiele hierzu stammt von
HUTCHINSON et al., die einen phenolischen Ester mit einem tertiären Amin auch als
Hydrochlorid in die PLE-katalysierte Hydrolyse eingesetzt haben (Abb. 2.17 rechts,
S. 45)170.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 129

Die CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 in Form seines Hydrochlorids wurde
mit der gleichen Substratkonzentration (0.014 mol/l) durchgeführt, die auch bei der
Verwendung der freien Base als Substrat gewählt wurde (Tabelle 2.49). Das
Hydrochlorid des Esters zeigte keinerlei Schwierigkeiten bei der Löslichkeit im
wäßrigen Milieu. Ein Cosolvens wäre zur Löslichkeitsvermittlung nicht notwendig,
wurde aber zur besseren Vergleichbarkeit mit den zuvor durchgeführten Katalysen
mit dem Enzym beibehalten. Eine um ein vielfaches höhere Substratkonzentration
wäre wahrscheinlich durch die Verwendung des Hydrochlorids des Substrats
möglich. Dies wurde aber zunächst nicht untersucht.

Tabelle 2.49: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl (9 U/ml;


Phosphatpuffer, pH 7.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

19.5 h 43 % 86 % 94 % 89

In Tabelle 2.49 ist das Ergebnis der CE-katalysierten Reaktion zusammengefaßt.


Verglichen mit dem zuvor erzielten Ergebnis in der Hydrolyse der freien Base
(Tabelle 2.48) ist kein signifikanter Unterschied zu erkennen. Mit einer Selektivität
von E = 89 verläuft die Reaktion weiterhin mit hoher Aktivität und Selektivität des
Katalysators. Dies ist ein sehr wichtiges Resultat, denn der Einsatz der Substrate in
Form ihrer Hydrochloride bringt einige Vorteile: Hydrochloride sind einfach zu
handhaben, sie sind lagerstabil, sie sind im wäßrigen Medium sehr gut löslich, und
die Hydrochloridfällung stellt eine weitere Möglichkeit zur Aufreinigung des Substrats
dar.

Eine Darstellung von (+)-14 zur Synthese des gewünschten Produkts (+)-50 durch
eine CE-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids des Esters rac-22 stellt zwar eine
technisch durchführbare Reaktion dar, ist allerdings umständlich, da der nicht
umgesetzte Ester (+)-22 erst noch in einem zusätzlichen Reaktionsschritt hydrolysiert
werden müßte. Einfacher wäre eine enzymatische Hydrolyse die direkt zu (+)-14 als
Produkt führen würde.
Da im Falle des Substrats rac-18 die Enzyme CRL und PLE eine entgegengesetzte
Enantiopräferenz zeigten, wurde diese Eigenschaft der Katalysatoren ebenfalls für
130 THEORETISCHER TEIL

das Substrat rac-22 erhofft, denn dies würde zu dem Ziel eines Hydrolyseproduktes
(+)-14 in der PLE-katalysierten Hydrolyse führen.

Daher wurde der Ester rac-22 anschließend als Substrat in die PLE-katalysierte
Hydrolyse im wäßrigen Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens
eingesetzt (Abb. 2.61). Das Ergebnis dieser Reaktion ist in Tabelle 2.50 zusammen-
gefaßt.

Me2N OH
OMe
Pr O

O (−)-22
OH PLE
OMe
Pr O Phosphatpuffer-
+
Me2N Lösung (pH 8.0)
O 10 % Cosolvens OH
rac-22 OMe
RT
HO
Me2N
(+)-14
Abb. 2.61: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22.

Die Aktivität der PLE hinsichtlich der Hydrolyse des Substrats rac-22 ist niedriger als
in der Hydrolyse des isomeren Esters rac-18. Die gleiche Verschiebung in der
Aktivität hinsichtlich dieser beiden Substrate konnte zuvor schon in der Katalyse der
CRL beobachtet werden. Interessanterweise erfolgt die PLE-katalysierte Hydrolyse
des Esters rac-22 mit einem E-Wert von 34. Die gleiche Selektivität wurde zuvor
auch in der CRL-katalysierten Hydrolyse beobachtet. Somit ist die Selektivität dieser
Reaktion zwar gut, bleibt aber hinter der Selektivität der Katalyse der CE zurück.

Tabelle 2.50: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 (3 U/ml; Phosphat-


puffer, pH 8.0; 10 % tert-Butanol)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester (−)-22 ee Alkohol (+)-14 E

16.5 h 18 % 22 % 93 % 34
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 131

In der CRL-katalysierten Hydrolyse wurde bevorzugt das (−)-(1R,2S,4S)-konfigurierte


Enantiomer umgesetzt. In der PLE-katalysierten Hydrolyse wird hingegen das
(+)-(1S,2R,4R)-Enantiomer bevorzugt hydrolysiert. Damit zeigt die Schweineleber-
Esterase eine zu den anderen getesteten Enzymen entgegengesetzte
Enantiopräferenz. Dieses konnte zuvor auch an dem isomeren Substrat rac-18
beobachtet werden. Somit kann, wie erhofft, der enantiomerenangereicherte Alkohol
(+)-14 als direktes Reaktionsprodukt in einer enzymatischen Racematspaltung
erhalten werden. Im Hinblick auf eine Synthese des gewünschten Produkts (+)-50
stellt dies eine Vereinfachung dar.

Zur Visualisierung der Enantiopräferenz der PLE wurden in Abb. 2.62 die bevorzugt
umgesetzten Enantiomere (+)-12 und (+)-14 dem Kastenmodell nach JONES et al.
angepaßt dargestellt.

PB Ser HL: große, hydrophobe Tasche


HS: kleine, hydrophobe Tasche
HL HS
PF: vordere, polare Tasche
PB: hintere, polare Tasche
PF Ser: Serin-Rest

OH
OH
MeO MeO
OH NMe2 OH NMe2

(+)-12 (+)-14

OH OH
OMe OMe
HO HO
Me2N Me2N

Abb. 2.62: Von der PLE entsprechend dem Kastenmodell nach JONES et al.
bevorzugt umgesetzte Enantiomere.

Wie aus Abb. 2.62 hervorgeht, zeigt die Hydroxylgruppe des Moleküls (+)-12 genau
in Richtung der Hydroxylgruppe am Serin-Rest, dagegen zeigt die Hydroxylgruppe
von (+)-14 ein wenig von dem Serin-Rest weg in eine andere Richtung. Dies kann die
132 THEORETISCHER TEIL

Ursache für die Unterschiedliche Aktivität des Enzym hinsichtlich der beiden
Substrate sein und erklären, warum rac-18 schneller als rac-22 umgesetzt wird. In
beiden Molekülen zeigen die Dimethylaminomethylgruppen in Richtung der vorderen,
polaren Tasche.

Kommerziell verfügbare PLE ist in der Regel eine Mischung verschiedener


Isoenzyme. Analytisch können diese Isoenzyme durch isoelektrische Fokussierung
aufgetrennt werden.128a),129 Obwohl 1988 von JONES et al. noch keine wesentlichen
Unterschiede in Selektivität und Substratspezifität in der Katalyse der Isoenzyme
erkannt werden konnten233, wurde hingegen in neueren Arbeiten von MATTSON et al.
signifikante Unterschiede in den katalytischen Eigenschaften der einzelnen
Isoenzyme aufgezeigt.130 Da Isoenzym-angereicherte Fraktionen der PLE
kommerziell verfügbar sind (z.B. bei ROCHE DIAGNOSTICS als Chirazyme E1 und
Chirazyme E2), wurde ebenfalls ein möglicher Einfluß der Isoenzymzusammen-
setzung der PLE untersucht. Hierzu wurde das Isoenzym-angereicherte
Chirazyme E1 in die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-22 eingesetzt. Mit
diesem Enzym wurden zuvor in der GRÜNENTHAL GmbH enzymatische Hydrolysen
durchgeführt. Hierbei konnte in systematischen Untersuchungen ein günstiger
Einfluß von 16 % Aceton als Cosolvens auf die Hydrolyse von Tramadol-Analoga
gefunden werden.184 Auf diese Ergebnisse zurückgreifend wurde ebenfalls ein
Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens für die Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse
des Esters rac-22 gewählt (Tabelle 2.51).

Tabelle 2.51: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 unter Zusatz
von 16 % Aceton als Cosolvens mit extraktiver Aufarbeitung
(1.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.014 M Substrat)

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14

42 h 27 % 74 % 97 % 23 % 85

Die Reaktion wurde nach einer Reaktionszeit von 42 Stunden bei einem Umsatz von
ca. 24 % abgebrochen und nach der Methode der Extraktion bei verschiedenen
pH-Werten aufgearbeitet. Wie zuvor sind die isolierten Ausbeuten sehr gut, da die
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 133

Gesamtausbeute 97 % beträgt. Die Trennung erfolgt aufgrund der unterschiedlichen


Hydrophobizität der Verbindungen. Ausgedrückt werden kann dies anhand von
ausreichend großen Unterschiede im log P-Wert (Tabelle 2.52). Dabei handelt es
sich in diesem Fall um den Logarithmus des Verteilungskoeffizienten zwischen
Wasser und Cyclohexan.

Tabelle 2.52: Log P-Werte (Wasser / Cyclohexan) für rac-14 und rac-22 bei
verschiedenen pH-Werten

pH rac-14 rac-22

7.0 -2.691 0.557


7.4 -2.297 0.946
8.0 -1.724 1.498
10.0 -0.680 2.333
12.0 0.633 2.360

Die Selektivität der Chirazyme E1 Präparation in der Hydrolyse des Esters rac-22 ist
sehr hoch. Der Alkohol (+)-14 konnte mit einem ee-Wert von 97 % und der Ester
(−)-22 mit einem ee-Wert von 27 erhalten werden. Insgesamt ist also die Selektivität
mit einem E-Wert von 85 größer als die der PLE-katalysierten Reaktion.
Damit stellt das Isoenzym-angreicherte Chirazyme E1 einen geeigneteren
Katalysator als die gesamte Isoenzym-Mischung PLE dar. Zudem scheint dieses
Ergebnis die von MATTSON et al. gemachte Aussage, daß die einzelnen Isoenzyme
signifikante Unterschiede hinsichtlich der Selektivität zeigen, zu belegen. Da
allerdings im Rahmen dieser Arbeit keine Untersuchungen zur Zusammensetzung
der einzelnen Enzym-Katalysatoren und ihrer Selektivität gemacht wurden, konnte
dieser Gesichtspunkt nicht weiter vertieft werden.

Im Hinblick auf eine mögliche Anwendung dieses Verfahrens wurde der Esters
rac-22 auch in Form des Hydrochlorids dieser Verbindung in die Chirazyme E1-
katalysierte Hydrolyse unter Verwendung von 16 % Aceton als Cosolvens eingesetzt.
Der Verlauf des Umsatzes sowie der ee-Werte von Substrat und Produkt ist durch
Entnahme einzelner Proben über einen Zeitraum von 23 Stunden verfolgt worden
(Abb. 2.63). Es ist zu erkennen, daß bis zu einem Umsatz von 12 % der Alkohol
134 THEORETISCHER TEIL

(+)-14 nahezu enantiomerenrein vorliegt (E > 200) und daß danach der ee-Wert fällt.
Entsprechend dem Gegebenheiten einer kinetischen Racematspaltung steigt der
ee-Wert des Esters (−)-22 mit dem Umsatz. Nach 22.5 Stunden liegt der Alkohol mit
einem ee-Wert von 95 % und der Ester mit einem ee-Wert von 28 % vor, dies
entspricht einem E-Wert von 50 (Tabelle 3.50, obere Zeile). Danach wurde die
Reaktionsmischung mit der Methode der Extraktion bei unterschiedlichen pH-Werten
aufgearbeitet (Tabelle 3.50, untere Zeile).

100

90
E = 50
80

70
ee-Wert (%)

60 ee-Wert Ester
ee-Wert Alkohol
50

40

30 E = 50

20

10

0
0 5 10 15 20
Umsatz (%)

Abb. 2.63: Verlauf der ee-Werte von Alkohol (+)-14 und Ester (−)-22 in der

Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl.

Wie aus Tabelle 2.53 hervorgeht, konnte der Alkhohl nur mit einem ee-Wert von
91 % erhalten werden und somit ergibt sich ein E-Wert von 27. Da der ee-Wert des
Alkohols nach 22.5 Stunden in der Reaktionslösung noch bei 95 % lag und bei der
Extraktion des Alkohols (+)-14 noch Reste des zuvor nur unvollständig extrahierten
Esters (−)-22 erhalten wurden, ist anzunehmen, daß der Abfall in dem ee-Wert des
Alkohols während der Aufarbeitung erniedrigt worden ist. Während der Extraktion bei
pH 10 sind vermutlich Teile des (−)-Ester zum (−)-Alkohol hydrolysiert, was einen
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 135

Abfall des ee-Wertes von (+)-14 zur Folge hat. Somit beschreibt der aus der
Reaktionslösung bestimmte E-Wert von 50 die Selektivität der kinetischen
Racematspaltung zutreffender. Die im Vergleich zur Hydrolyse der freien Base des
Esters rac-22 geringere Selektivität läßt sich durch die geänderten Reaktions-
bedingungen erklären. In der Hydrolyse des Hydrochlorids wurde eine
Substratkonzentration von 0.200 mol/l gewählt, die um ein vielfaches höher ist, als
die in der Hydrolyse der freien Base mit 0.014 mol/l. Um eine vergleichbare
Reaktionsgeschwindigkeit in der Hydrolyse des Hydrochlorids zu erreichen, ist die
Enzymmenge um etwa den gleichen Faktor von 1.6 U/ml auf 22.8 U/ml erhöht
worden. Aus Tabelle 2.51 und Tabelle 2.53 läßt sich abschätzen, daß die
Reaktionsgeschwindigkeit tatsächlich in etwa gleich groß ist. Insgesamt hat die
Erhöhung der Substrat- und Enzymkonzentration zu einer kleinen Verringerung der
Selektivität in der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse geführt.

Tabelle 2.53: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl unter


Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens mit extraktiver Aufarbeitung
(22.8 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.200 M Substrat)

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14

(22.5 h) (26 %) (95 %) (50)


24 h 28 % 65 % 91 % 18 % 27

Da das Hydrochlorid des Esters rac-22 auch in der Konzentration von 0.231 mol/l
ohne den Zusatz von Aceton als Cosolvens gut löslich ist, entsteht die Frage, ob
überhaupt ein Cosolvens in der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse von
rac-22⋅HCl notwendig ist. Um diese Fragestellung zu untersuchen, wurden zwei
parallele Reaktionen durchgeführt. In einer Reaktion wurde unter sonst identischen
Bedingungen (22.8 U/ml Chirazyme E1; Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.200 M
rac-22⋅HCl) 16 % Aceton als Cosolvens verwendet, in der anderen kein Cosolvens.
Aus beiden Reaktionen wurden Proben entnommen, die dann extrahiert und
analysiert wurden. Die Reaktionsgeschwindigkeiten der Reaktionen lassen sich in
Abb. 2.64 erkennen, in welcher der Verlauf des Umsatzes über die Zeit dargestellt
136 THEORETISCHER TEIL

ist. Beide Zeit-Umsatz Kurven zeigen nach ca. 50 Stunden Reaktionszeit einen
Rückgang im Umsatz. Dies wurde durch einen systematischen Fehler,
wahrscheinlich bei der Extraktion der Probe oder durch eine weitere Temperatur-
schwankung, verursacht. Es ist deutlich zu erkennen, daß die Reaktion ohne Zusatz
von Aceton als Cosolvens mit höherer Reaktionsgeschwindigkeit verläuft.
Beispielsweise wird in der Katalyse ohne Cosolvens bereits nach 7.5 Stunden ein
Umsatz von 21 % erreicht. Zum Vergleich wird dieser Umsatz in der Katalyse mit
Aceton als Cosolvens erst nach 175 Stunden (1 Woche) beobachtet. Dieser
Unterschied in der Aktivität des Enzyms wird wahrscheinlich durch eine Inhibition des
Enzyms durch das Cosolvens Aceton verursacht.

45

40 E = 31 E = 27 E = 27
Umsatz = 41 %
E =157
35
E = 30
30 mit 16 % Aceton als Cosolvens
Umsatz (%)

ohne Cosolvens
25

E > 200
20
E > 200
15 E > 200 Umsatz = 21 %

10

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Reaktionszeit (h)

Abb. 2.64: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse von rac-22⋅HCl mit und ohne
Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens.

Im Vergleich zu den zuvor vorgestellten Reaktionen verlaufen beide Reaktionen mit


eine niedrigeren Reaktionsgeschwindigkeit. Dies ist auf einen technischen Defekt
zurückzuführen, der die Reaktionstemperatur im Vergleich zu den vorherigen
Versuchen herabsetzte. Neben dem Einfluß des Acetons auf die Aktivität der
Enzymkatalyse ist auch ein Einfluß des Cosolvens auf die Selektivität der
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 137

Chirazyme E1-katalysierten Reaktionen zu beobachten. Ein direkter Vergleich der


Selektivitäten beider Reaktionen in Abb. 2.64 ist aber aufgrund des niedrigen
Umsatzes in der Reaktion mit Cosolvens kaum möglich, da ein Vergleich der
E-Werte nur bei gleichem Umsatz aussagekräftig ist. Bei Erfüllung aller in
Kap. 2.3.1.1 gemachten Voraussetzungen ist der E-Wert über den Verlauf der
Reaktion konstant. Im Verlauf der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten
enzymatischen Hydrolysen von Tramadol-Analoga konnte allerdings häufiger ein
langsames Abfallen des E-Wertes mit dem Fortschreiten einer Reaktion beobachtet
werden. Aus Abb. 2.64 geht hervor, daß in der Reaktion mit dem Cosolvens Aceton
nach 175 Stunden ein E-Wert größer 200 bei einem Umsatz von 21 % beobachtet
wird. In der Reaktion ohne Cosolvens ist bei dem gleichen Umsatz von 21 % der
E-Wert allerdings auch größer 200, dieser Umsatz wird nur schon viel früher nach
7.5 Stunden erreicht. Somit verlaufen beide Reaktionen in ihrem Anfang
hochselektiv. In der Reaktion ohne Cosolvens ist danach allerdings ein starker Abfall
in der Selektivität mit dem Umsatz der Reaktion zu beobachten. Bei 40 % Umsatz
läßt sich die Selektivität nur noch durch einen E-Wert von 27 beschreiben. Hier ist
ein direkter Vergleich mit der Reaktion mit einem Zusatz von Aceton als Cosolvens
nicht mehr möglich.
Eine von der GRÜNENTHAL GmbH beobachtete Abhängigkeit der Chirazyme E1-
katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl vom Acetonzusatz ist in Tabelle 2.55
auf S. 142 dargestellt.

Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der Enantiomeren des Alkohols 14 erfolgte


durch Vergleich des Drehwerts, der bereits für die Verbindung (+)-50⋅HCl, das
Hydrochlorid des para-Fluorbenzylethers zum Alkohol (+)-14, publiziert ist.97 Hierbei

erfolgte die Bestimmung der Absolutkonfiguration des (+)-50⋅HCl durch Röntgen-


strukuranalyse.184
Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 22, 23, 24 und 45 erfolgte in
Analogie zu der des Alkohols 14.
138 THEORETISCHER TEIL

2.4.2.7 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-


dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-
ester (rac-23)

Da bisher keine Racematspaltung über diastereomere Salzbildung mit dem Alkohol


rac-14 gelungen ist, stellt die Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung bisher
das einzige Verfahren zur Gewinnung der Enantiomeren von 14 in einem
präparativen Maßstab dar.
Somit ist die GRÜNENTHAL GmbH bei diesem Substrat auf eine enzymatische
Methode zur Gewinnung der einzelnen Enantiomeren angewiesen. Zugleich ist die
Verbindung (+)-50 auch eine in der präklinischen Forschung weit vorangeschrittene
Verbindung. Dies macht die Entwicklung einer enzymatischen Methode zur Synthese
von (+)-14 notwendig, welche die Bereitstellung von Kilogrammmengen in einem
Technikumsmaßstab zu leisten vermag. Ein endgültiger Produktionsprozeß für die
Verbindung (+)-50 sollte zur dritten klinischen Testphase bekannt sein.

Im Hinblick auf einen technisch durchführbaren enzymatischen Prozeß stellt sich die
Frage, ob eine Veresterung von rac-14 mit der Buttersäurechlorid zur Darstellung
von rac-22 unter dem Aspekt einer möglichen Geruchsbelästigung realisierbar ist.
Die technische Durchführbarkeit dieser Reaktion und der anschließenden
enzymatischen Hydrolyse ist in jedem Fall gegeben.184
Aufgrund dieser Vorbehalte wurde die Möglichkeit einer Variation des Acylrestes des
Substrats in Erwägung gezogen. In Vorversuchen zeigte sich, daß Valerian-
säurechlorid ebenfalls sehr penetrant unangenehm riecht und somit auch nicht in
Frage kommt. Aus wirtschaftlicher Sicht läßt sich eine Verlängerung des Acylrestes
bis zur Hexansäure (C6) vertreten. Eine Verkürzung des Acylrestes ist ebenfalls eine
weitere Möglichkeit. Aufgrund der schlechten Erfahrungen in der Synthese des
Acetats rac-24 wurde dieser Ansatz zunächst aber nicht verfolgt, sondern vielmehr
das Capronat von rac-14 dargestellt und dessen Eigenschaften als Substrat in der
PLE-katalysierten Hydrolyse untersucht (Abb. 2.65).
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 139

Me2N OH
OMe
C5H11 O

O
(−)-23
OH Chirazyme E1
OMe
C5H11 O Phosphatpuffer-
+
Me2N Lösung (pH 7.0)
O 16 % Cosolvens OH
rac-23 RT OMe
HO
Me2N
(+)-14
Abb. 2.65: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23.

Die Reaktionsbedingungen der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters


rac-23 wurden entsprechend den zuvor durchgeführten Hydrolysen gewählt. Es
wurde die freie Base als Substrat eingesetzt. Durch den längeren Acylrest ist das
Substrat rac-23 hydrophober als beispielsweise das Butyrat rac-22. Als eine
Konsequenz war eine herabgesetzte Löslichkeit des Substrats zu beobachten. Zu
Beginn der Reaktion war die Reaktionslösung stark getrübt und klärte sich dann
langsam mit Voranschreiten des Umsatzes. Die Aktivität des Katalysators und damit
auch die Reaktionsgeschwindigkeit war moderat. Nach 24 Stunden, bei einem
Umsatz von ca. 46 %, wurde mit der Methode der Extraktion bei verschiedenen pH-
Werten aufgearbeitet. Bei einem pH-Wert von 7.0 konnte durch Spuren von Hexan-
säure (Capronsäured) verunreinigter und daher penetrant ziegenähnlich riechender
Ester (−)-23 mit einem ee-Wert von 92 % in 54 % Ausbeute isoliert werden.
Anschließend wurde bei pH 10 der Alkohol (+)-14 einem ee-Wert von 77 % in 46 %
Ausbeute erhalten (Tabelle 2.54). Die Selektivität der Reaktion läßt sich durch E = 24
beschreiben und verläuft somit mit geringerer Selektivität als die Hydrolyse des
Butyrats rac-22.

d
capra (lat.) = Ziege.
140 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.54: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-23 unter Zusatz
von 16 % Aceton als Cosolvens (3.1 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0)

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14

24 h 92 % 54 % 77 % 46 % 24

Unter anwendungstechnischen Aspekten ist der ziegenähnliche Geruch der


Hexansäure ein ausschlaggebender Nachteil, da keine Verbesserung gegenüber
dem Geruch der Buttersäure erzielt worden ist. Hier könnte die Verwendung des
Propionats als Acylrest den Mittelweg zwischen mangelnder Stabilität des Substrats
(Acetat) und Geruchsbelästigung (Butyrat und höhere Ester) darstellen.

Der zu beobachtende Einfluß des Acylrests auf die Selektivität der Enzym-
katalysierte Hydrolyse ist ebenfalls eine Nachteil der Verwendung des Substrats
rac-23. Da das Enzym Schweineleber-Esterase bevorzugt kurzkettige wasserlösliche
Ester wie Acetate hydrolysiert, stellt das Substrat rac-23 durch seinen großen
Acylrest ein eher ungeeignetes Substrat dar.

2.4.2.8 Darstellung von (+)-14 durch enzymatische Racematspaltung im


präparativen Maßstab

Zur Bereitstellung erster größerer Mengen an (+)-14 im Halbkilogramm-Maßstab für


die präklinische Entwicklung des Wirkstoffs (+)-50 in der GRÜNENTHAL GmbH wurde
dort eine optimierte Laborsynthese entwickelt und eingesetzt. Ein solches Verfahren
stellt eine besondere Herausforderung an die Effizienz der Enzym-katalysierten
Racematspaltung und die Aufarbeitungsmethode dar.
Aufgrund der Robustheit der enzymatischen Hydrolyse als Methode zur Darstellung
enantiomerenangereicherter Verbindungen wurde daher von der GRÜNENTHAL GmbH
eine PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 durchgeführt (Abb. 2.66). Es
wurden 200 g Hydrochlorid des Esters rac-22 mit 1.5 g Chirazyme E1 im wäßrigen
Einphasensystem aus Phosphatpuffer (pH 7.0) und 16 % Aceton als Cosolvens
umgesetzt.184 Bei einem Umsatz von ca. 52 % wurde zur Aufarbeitung die auch in
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 141

einem Kilogramm-Maßstab einfach und effizient durchzuführenden Methode der


Extraktion von Ester und Alkohol bei jeweils unterschiedlichen pH-Werten verwendet.
Diese Methode hat den Vorteil auf chromatographische Trennverfahren verzichten zu
können, da solche Verfahren in einem späteren Produktionsprozess nur schwer
umzusetzen ist. Weiterhin wurde während der Durchführung darauf verzichtet den
pH-Wert durch Zugabe von Natronlauge konstant zu halten. Dies führte während der
Reaktion zu einer Schwankung des pH-Werts im Phosphatpuffers um 0.5.

Me2N OH
OMe
Pr O

O
OH (−)-22
Chirazyme E1
OMe
Pr O Phosphatpuffer-
Me2N Lösung (pH 7.0) +
O
⋅HCl 16 % Aceton OH
RT OMe
rac-22⋅HCl HO
Me2N
(+)-14
Abb. 2.66: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl.

Des weiteren wurde als Substrat in der enzymatischen Hydrolyse nicht mehr die freie
Base des Esters rac-22 eingesetzt, da diese in höheren Konzentrationen nicht mehr
im wässrigen Medium löslich ist. Stattdessen wurde das Hydrochlorid der Verbindung
eingesetzt, welches eine sehr viel größere Löslichkeit hat. Die Isoenzym-
angereicherte PLE-Präparation Chirazyme E1 wurde als Katalysator wegen der
Enantiopräferenz für das (+)-Enantiomer eingesetzt, so daß der benötigte (+)-Alkohol
direkt als Reaktionsprodukt erhalten wird. Weiterhin verfügt das Chirazyme E1
gegenüber der PLE über eine höhere Selektivität hinsichtlich des Substrates rac-22.
Auch stellt allgemein eine lyophilisierte Form des Enzyms, wie beim Chirazyme E1,
einen einfach zu handhabenden Katalysator dar.
Ebenfalls wurde Aceton als Cosolvens verwendet. In der GRÜNENTHAL GmbH konnte
eine deutliche Abhängigkeit des ee-Wertes des gebildeten Alkohols (+)-14 von der
zugesetzten Menge an Aceton beobachtet werden (Tabelle 2.55).184
142 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.55: Abhängigkeit der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters


rac-22⋅HCl vom Acetonzusatz bei einer Reaktionszeit von 48 Stunden
(Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.5 g Substrat)

Aceton- ee Ester Gehalt ee Alkohol Gehalt


E
zusatz (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14

16 % 94 % 56 % 96 % 44 % 174
9% 98 % 51 % 90 % 49 % 86
0% 98 % 50 % 73 % 50 % 28

Insgesamt konnte in diesem Versuch der nicht umgesetzte Ester (−)-22 in 99 %


Ausbeute mit einem ee-Wert von 72 % und der gebildete Alkohol (+)-14 in 96 %
Ausbeute mit einem ee-Wert von 93 % isoliert werden (Tabelle 2.56). Durch
anschließende Kristallisation des Alkohols konnte dessen ee-Wert auf >99 %
gesteigert werden.184,234

Tabelle 2.56: Von der GRÜNENTHAL GmbH durchgeführte Chirazyme E1-katalysierte


Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl unter Zusatz von 16 % Aceton als
Cosolvens mit extraktiver Aufarbeitung (Phosphatpuffer, pH 7.0;
200 mM Substrat)

Enzym Reaktions- Umsatz Ester (−)-22 Alkohol (+)-14 E


zeit Ausbeute ee Ausbeute ee
Chirazyme E1
15 h 52 % 99 % 72 % 96 % 93 % 59
(22.4 U/ml)

Eine geringe Steigerung der Selektivität der Reaktion läßt sich beobachten, wenn
man nach der Hälfte der Reaktionszeit nochmals Enzym zugibt.

Hiermit konnte gezeigt werden, daß eine enzymatische Laborsynthese, wie sie im
Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde, in eine Multigramm-Maßstab zur Darstellung
erster Kilogramm-Mengen übertragen werden kann. Als besonders wirkungsvoll ist
dabei die Aufarbeitung durch Extraktion bei verschiedenen pH-Werten zu betrachten.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 143

Sie stellt einen Schlüsselschritt für die Aufarbeitung der enzymatische Hydrolyse dar.
Diese Methode hat sich im Halbkilogramm-Maßstab in der GRÜNENTHAL GmbH
etabliert und würde sich auch in einen späteren Produktionsprozeß einsetzten
lassen.

Eine alternative Möglichkeit zu einer effizienten Trennung von Ester und Alkohohl bei
einer enzymatischen Racematspaltung stellt die von THEIL et al. vorgestellte
Extraktion nach Lipasen-katalysierter Fluoracylierung dar.235 Dies Verfahren basiert
auf der Verteilung zwischen organischer und fluoriger Phase und erlaubt eine
Isolierung der Produkte aus dem Reaktionsgemisch, die auch in einem industriellen
Großmaßstab angewendet werden kann.

O
CAL-B
OH CF3(CF2)7(CH2)2CO2CH2CF3 O (CF2)7CF3 OH
+
Ph MeCN, Rt Ph Ph

Extraktion mit n-C6F14

O (CF2)7CF3 OH

Ph Ph
47 %, 98 % ee 48 %, > 98 % ee
fluorige Phase (n-C6F14) org. Phase (MeOH)

Abb. 2.67: Lipasen-katalysierte kinetische Racematspaltung von Phenylethanol und


anschließender extraktiver Trennung mit Hilfe eines fluorig-organischen
Zweiphasensystems.

In einer CAL-B-katalysierten Transacylierung wird hierzu das schneller reagierende


(R)-Enantiomer des Phenylethanols mit einem hochfluorierten Acylrest acyliert (Abb.
2.67). Der mit diesem „Teflon-Schwanz“236 ausgestatte Ester kann anschließend
selektiv n-Perfluorhexan extrahiert werden. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß
sich in der fluorigen Phase auch noch der Überschuß an fluorierten Acylierungsmittel
befindet, dessen Abtrennung noch nötig sein kann.
144 THEORETISCHER TEIL

2.4.2.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-


Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol
(rac-14)

Nachdem mit der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 bereits
ein Verfahren zur Darstellung des Alkohols (+)-14 und damit zur Synthese des
gewünschten Produkts (+)-50 zur Verfügung steht, wurde die Enzym-katalysierte
Transacylierung von rac-14 unter dem Aspekt untersucht, eine Möglichkeit zur
Racematspaltung neuer hydrophober und daher im wäßrigen Milieu unlöslicher
Tramadol-Analoga zu schaffen. Ein Verfahren zur enzymatischen Acylierung im
organischen Medium bietet neben dem bereits etablierten hydrolytischen Verfahren
den Vorteil alternativer Reaktionsbedingungen. Da in der Lipasen-katalysierten
Hydrolyse bevorzugt (−)-14 gebildet wurde, wird in der Umkehrrektion, der Enzym-
katalysierte Transacylierung von rac-14 im organischen Medium, ebenfalls (−)-14
bevorzugt acyliert und es kann wie in der PLE-katalysierten Hydrolyse das
gewünschte (+)-Enantiomer des Alkohols als Produkt isoliert werden (Abb. 2.68).

Me2N OH
OMe
R O

O
(−)-Ester
OH Lipase
OMe
HO Vinylester
organisches +
Me2N
Lösungsmittel OH
rac-14
RT OMe
HO
Me2N
(+)-14

Abb. 2.68: Lipasen-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14.

Zunächst wurde die Candida rugosa Lipase als Katalysator in die Transacylierung
des Alkohols rac-14 eingesetzt. Als Acyldonoren wurden Vinylacetat und
Isopropenylacetat in Toluol und Acyldonor als Lösungsmittel verwendet. Die
Ergebnisse dieser Reaktionen sind in Tabelle 2.57 zusammengefaßt. Wie schon
zuvor in der CRL-katalysierten Hydrolyse der korrespondierenden Ester rac-22 und
rac-18 zu beobachten war, ist die Aktivität der CRL hinsichtlich des Alkohols rac-12
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 145

höher als hinsichtlich des Alkohols rac-14. Die in den CRL-katalysierten


Transacylierungen des Alkohols rac-14 beobachteten Reaktionsgeschwindigkeiten
sind gering, ebenso die beobachteten Selektivitäten. Die CRL empfiehlt sich daher
eher als Katalysator für die Substrate 12 und 18. Interessanterweise wird in CRL-
katalysierten Acylierung mit Isopropenylacetat in Toluol der höchste Umsatz bei
höchster Selektivität erzielt. Dies Ergebnis unterstützt die These, daß während der
Reaktion gebildetes Acetaldehyd das Enzym deaktiviert. In einem solchen Fall bietet
sich die Verwendung von Isopropenylacetat als Acylierungsmittel an.

Tabelle 2.57: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit


Vinylacetat und Isopropenylacetat (37 U/ml)

Reaktionsbedingungen nach
E-Wert
(Äquiv.) 16 d

Umsatz 18 %
Vinylacetat (6),
ee Ester (−)-24 44 % 5
Toluol
ee Alkohol (+)-14 72 %

Umsatz 11 %
Vinylacetat
ee Ester (−)-24 47 % 4
als Solvens
ee Alkohol (+)-14 48 %

Umsatz 25 %
Isopropenylacetat (6),
ee Ester (−)-24 68 % 14
Toluol
ee Alkohol (+)-14 87 %

Umsatz 12 %
Isopropenylacetat
ee Ester (−)-24 77 % 10
als Solvens
ee Alkohol (+)-14 35 %

Eine in der jüngeren Literatur häufig mit großem Erfolg zur Acylierung sekundärer
Alkohole verwendete Enzympräparation ist das Novozym 435, welches eine auf
einem makroporösen Acrylharz immobilisierte Candida antarctica Lipase Typ B ist.126
Daraufhin wurde das Novozym 435 in die Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit
Vinylacetat in den Lösungsmitteln Toluol und Dichlormethan eingesetzt (Tabelle
146 THEORETISCHER TEIL

2.58). Die Aktivität dieses Enzyms hinsichtlich des Substrats rac-14 ist verglichen mit
den zuvor durchgeführten enzymatischen Transacylierung außerordentlich hoch.
Bereits nach 48 Stunden werden Umsätze von 70 % bzw. 79 % erreicht. Die
Selektivität in beiden Reaktionen ist auch sehr hoch. In dem polaren Lösungsmittel
Dichlormethan wird ein E-Wert von 99 erzielt.

Tabelle 2.58: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit


Vinylacetat (10 mg immobilisierte CAL-B)

Reaktionsbedingungen nach
E-Wert
(Äquiv.) 48 h

Umsatz 70 %
Vinylacetat (6),
ee Ester (−)-24 90 % 38
Toluol
ee Alkohol (+)-14 67 %

Umsatz 79 %
Vinylacetat (6),
ee Ester (−)-24 90 % 99
Dichlormethan
ee Alkohol (+)-14 ≥98 %

Auf Basis dieser guten Ergebnisse, wurde daraufhin Vinylpropionat als


Acylierungsmittel in die Novozym 435-katalysierte Transacylierung eingesetzt. Um
den Einfluß des Lösungsmittels auf das Ergebnis der Transacylierung zu
untersuchen, wurden als Lösungsmittel Toluol, Toluol mit einem Zusatz von 0.2 %
Wasser, Dichlormethan und Acylierungsmittel eingesetzt (Tabelle 2.59). Von JUNGEN
ist zuvor in der Katalyse mit MPEG/PLE in Toluol als Lösungsmittel die höchste
Reaktionsgeschwindigkeit bei einem Zusatz von 0.2 Vol% Wasser beobachtet
worden.85 Diesem Ergebnis zufolge wurde die Verwendung des Zusatzes an Wasser
zum Lösungsmittel in der CAL-B Katalyse untersucht. Alle Reaktionslösungen waren
zu Beginn der Reaktion klar und farblos. Nach 24 Stunden zeigten alle Reaktionen
eine milchige Trübung. In der Reaktion mit H2O-Zusatz war zusätzlich noch ein
weißer Niederschlag zu erkennen. Nach 24 Stunden wurden alle Reaktionen bei
einem Umsatz von 50 % abgebrochen. In Toluol als Lösungsmittel wurde eine hohe
Selektivität von E = 90 beobachtet. Verglichen mit dem Acylierungsmittel Vinylacetat
ist hier eine Steigerung in der Selektivität der Novozym 435-katalysierten Acylierung
erreicht worden. Ein Zusatz von 0.2 % Wasser zum Lösungsmittel Toluol führt
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 147

sowohl zu einer Erniedrigung der Aktivität des Enzyms hinsichtlich des Substrats
rac-14 als auch zu einer Erniedrigung der Selektivität der Reaktion. Von RUPPERT84
und JUNGEN85 wurde zuvor eine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit und der
Selektivität der PLE-katalysierten Transacylierung geschildert. Dieses konnte nicht
auf die CAL-B katalysierte Transacylierung übertragen werden. Ein anzunehmender
Grund hierfür ist eine aufgrund der hohen Aktivität des Enzym verstärkte Hydrolyse
des Acyldonors als Nebenreaktion. Diese „Nebenaktivität“ des Enzyms führt zu dem
scheinbar geringeren Umsatz hinsichtlich des umgesetzten Substrats rac-14.

Tabelle 2.59: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit


Vinylpropionat (10 mg immobilisierte CAL-B)

Reaktionsbedingungen nach
E-Wert
(Äquiv.) 24 h

Umsatz 51 %
Vinylpropionat (5),
ee Ester (−)-45 92 % 89
Toluol
ee Alkohol (+)-14 95 %

Umsatz 35 %
Vinylpropionat (5),
ee Ester (−)-45 89 % 30
Toluol
mit Zusatz von H2O (0.2 %) ee Alkohol (+)-14 56 %

Umsatz 50 %
Vinylpropionat (5),
ee Ester (−)-45 98 % >200
Dichlormethan
ee Alkohol (+)-14 86 %

Umsatz 52 %
Vinylpropionat
ee Ester (−)-45 97 % 192
als Solvens
ee Alkohol (+)-14 88 %

In den Lösungsmitteln Dichlormethan und Acylierungsmittel werden außerordentlich


hohe Selektivitäten in der enzymatischen Acylierung von rac-14 erzielt. In dem
Lösungsmittel Dichlormethan werden mit Vinylpropionat als Acylierungsmittel höhere
Selektivitäten als mit Vinylacetat erzielt, dies wurde zuvor auch in Toluol beobachtet.
148 THEORETISCHER TEIL

In der Reaktion des achiralen Acylierungsreagenzes mit dem Enzym wird der
Acyl/Enzym-Komplex gebildet. Da sich im diesem Komplex die Acylgruppe direkt im
aktiven Zentrum befindet, beeinflußt die Struktur des Carbonsäureteils des
Enolesters die Steuerung der Enantiomeren-Diskriminierung beim Angriff des
chiralen Nucleophils (Abb. 2.69).237 Untersuchungen zum Einfluß der Kettenlänge
von Enolestern auf das Ergebnis von Transacylierungen lassen den Schluß zu, daß
die optimale Kettenlänge sowohl vom verwendeten Enzym als auch von der Struktur
des Substratalkohols abhängt. Dies macht eine individuelle Optimierung der
enzymatischen Transacylierung für jedes Substrat notwendig.

Abb. 2.69: Einfluß des Acyldonors auf die Steuerung der Enantiomeren-
Diskriminierung eines Enzyms.237a)

Insgesamt stellt die Novozym 435 katalysierte Transacylierung von rac-14 eine
interessante Alternative zur Gewinnung der Enantiomeren von 14 dar. Aktivität und
Selektivität des Enzyms sind hervorragend. Um das vorhandene Potential dieses
Katalysators zu erschließen, wurde die Katalysatormenge halbiert und der Einfluß
auf die Transacylierung in den Lösungsmitteln Toluol und Vinylpropionat untersucht
(Tabelle 2.60). Zusätzlich wurde in einer weiteren Reaktion ein Zusatz von
Triethylamin zum Lösungsmittel Toluol gemacht. Interessanterweise zeigten alle
Reaktion, mit Ausnahme der Reaktion unter Zusatz von Triethylamin, nach ca.
48 Stunden eine milchige Trübung. Wie aus Tabelle 2.60 hervorgeht, erreichen alle
drei Reaktionen nach 7.6 Stunden einen Umsatz von ca. 50 % und bleiben nahezu
bei diesem Umsatz bis zum Reaktionsende nach 47.75 Stunden stehen. Da die
Reaktionsgeschwindigkeit des langsamer reagierenden Enantiomers im Vergleich zu
dem des schneller reagierenden vernachlässigbar gering ist, spricht dies für eine
hohe Enantiomeren-Diskriminierung des Enzyms. Entsprechend sind die E-Werte
aller drei Reaktionen auch hoch (Tabelle 2.61).
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 149

Tabelle 2.60: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit


Vinylpropionat (5 mg immobilisierte CAL-B)

Reaktionsbedingungen
7.6 h 23.3 h 47.75 h
(Äquiv.)

Umsatz 51 % 53 % 53 %
Vinylpropionat (5),
ee Ester (−)-45 88 % 91 % 91 %
Toluol
ee Alkohol (+)-14 91 % 98 % ≥98 %

Umsatz 50 % 53 % 52 %
Vinylpropionat
ee Ester (−)-45 92 % 93 % 92 %
als Solvens
ee Alkohol (+)-14 93 % ≥98 % ≥98 %

Vinylpropionat (5), Umsatz 54 % 55 % 56 %

Triethylamin (0.25), ee Ester (−)-45 92 % 93 % 91 %


Toluol ee Alkohol (+)-14 ≥98 % ≥98 % ≥98 %

Der erzielte E-Wert im Lösungsmittel mit nur 5 mg Katalysator entspricht dem der mit
10 mg erhalten wurde. Somit ist hier eine Reduzierung der Katalysatormenge
problemlos möglich. In Vinylpropionat als Solvens ist der erzielte E-Wert zwar ein
wenig geringer als mit der doppelten Katalysatormenge, aber noch in der zuvor
erzielten Größenordnung, so daß hier eine Reduzierung der Enzymmenge noch
vertretbar ist.
150 THEORETISCHER TEIL

Tabelle 2.61: E-Werte der Novozym 435-katalysierten Transacylierungen des


Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat (5 mg immobilisierte CAL-B)

Reaktionsbedingungen
7.6 h 23.3 h 47.75 h Mittel
(Äquiv.)

Vinylpropionat (5),
49 97 111 84
Toluol

Vinylpropionat
81 144 125 119
als Solvens

Vinylpropionat (5),
125 144 111 131
Triethylamin (0.25), Toluol

Interessanterweise wird im Lösungsmittel Toluol unter Zusatz von Triethylamin eine


höhere Selektivität als in reinem Toluol erzielt. Durch einen Zusatz von Triethylamin
kann eine Steigerung der Selektivität erreicht werden. Diese Beobachtung ist auch
bereits von verschiedenen Autoren publiziert worden.218a),213 Das Triethylamin dient
im organischen Medium zur Pufferung der als Nebenprodukt entstandenen
Carbonsäure. In Abb. 2.43 auf Seite 102 ist das zu dieser Nebenreaktion gehörige
Reaktionsschema wiedergegeben. Die Carbonsäure entsteht durch die Neben-
reaktion des Acyl/Enzym-Komplexes mit in Spuren im Reaktionsmedium vor-
handenem Wasser und führt so zu einer Hydrolyse des Acylierungsreagenzes. In
Abwesenheit des Triethylamins als Base kann die gebildete Carbonsäure an der
Enzym-Oberfläche gebunden werden und kann durch ionische Wechselwirkungen
die elektrostatische Umgebung beeinflussen, wodurch wiederum kleine
Konformationsänderungen im Protein möglich sind, welche die Aktivität und
Selektivität des Enzyms verändern.218a)

In der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 wurde ein günstiger


Einfluß des Acyldonors Isopropenylacetat auf die Enzymkatalyse beobachtet, da
während der Reaktion kein Acetaldehyd freigesetzt wird. In der Novozym 435-
katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat wird
ebenfalls nach 24 Stunden ein Umsatz von ca. 50 % beobachtet (Tabelle 2.62).
Erreicht wurde dieser Umsatz, wie nach Tabelle 2.60 anzunehmen ist, schon nach
8 Stunden. Die mit diesem Acylierungsreagenz in dem Lösungsmittel Toluol erzielte
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 151

Selektivität ist höher als die, die mit Vinylacetat und Vinylpropionat in Toluol
beobachtet wurde. Es empfiehlt sich auch in der Novozym 435-katalysierten
Transacylierung die Verwendung von Isopropenylacetat als Acylierungsmittel.

Tabelle 2.62: Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit


Isopropenylacetat (10 mg immobilisierte CAL-B)

Reaktionsbedingungen Nach
E-Wert
(Äquiv.) 24 h

Umsatz 51 %
Isopropenylacetat (5),
ee Ester (−)-24 94 % 170
Toluol
ee Alkohol (+)-14 ≥98 %

Es wurde der Versuch durchgeführt eine PLE-katalysierte Transacylierung des


Alkohols rac-14 zu erreichen. Nach den Ergebnissen in der PLE/MPEG- und
PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 ist allerdings
kein Erfolg zu erwarten, zumal die PLE wie die CRL rac-18 in der Hydrolyse als
Substrat gegenüber rac-22 bevorzugt. So konnte in der PLE/MPEG-katalysierten
Transacylierung des Alkohols rac-14 auch kein nennenswerter Umsatz unter
verschiedenen Reaktionsbedingungen beobachtet werden (Tabelle 2.63).

Tabelle 2.63: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols


rac-14 (6.4 U/ml)

Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)

Vinylpropionat (5),
20 d 2%
Toluol

Isopropenylacetat (5),
20 d 0%
Toluol

Für eine Acylierung von rac-14 wurde auch das Colyophilisat aus PLE, BSA und
MPEG (PLE/BSA/MPEG) eingesetzt, welches bei Standardsubstraten eine hohe
Aktivität im organischen Medium zeigt.83 In der PLE/BSA/MPEG-katalysierten
152 THEORETISCHER TEIL

Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat in Toluol wurde eine stark
erhöhte Katalysatorkonzentration verwendet (Tabelle 2.64). Die Farbe des PLE/BSA-
Katalysators änderte sich im Laufe der Reaktionszeit von weiß in ein dunkles rot-
braun. Dies belegt die enzymatische Hydrolyse des Acylierungsmittels zu Carbonyl-
Nebenprodukten wie Essigsäure. Eine enzymatische Acylierung des Substrates
rac-14 war allerdings auch mit dieser stark erhöhten Katalysatormenge nicht
möglich.

Tabelle 2.64: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des


Alkohols rac-14 (2000 U/ml)

Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)

Vinylacetat (5),
11 d 0%
Toluol

In der PLE-katalysierten Hydrolyse des korrespondierenden Esters rac-23 wurde


eine isoenzymangereicherte Fraktion der Schweineleber-Esterase (Chirazyme E1)
mit großem Erfolg eingesetzt. Dies Enzympräparation führte zu einer Erhöhung der
Aktivität und Selektivität im Vergleich zu der kompletten Isoenzymmischung (PLE).
Daraufhin wurde rac-14 auch in die Chirazyme E1-katalysierte Transacylierung mit
Vinylpropionat in Toluol eingesetzt (Tabelle 2.65). Nach 48 Stunden konnte ein
minimaler Umsatz beobachtet werden, der allerdings hochselektiv verlief.

Tabelle 2.65: Versuch zur Chirazyme E1-katalysierten Transacylierung des


Alkohols rac-14 (33 U/ml; 5 Äquiv. Vinylpropionat in Toluol)

Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-45 ee Alkohol (−)-14 E

47.75 h 2% ≥98 % 3% -

Zusammenfassend konnte gezeigt werden, daß die Enzym-katalysierte


Transacylierung des Alkohols rac-14 eine effiziente Methode zur Darstellung der
einzelnen Enantiomere darstellt. In Novozym 435 katalysierten Reaktionen wird in
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 153

der Regel eine hohe Aktivität des Enzyms CAL-B beobachtet, so daß die
Reaktionszeiten denen der Hydrolyse im wäßrigen Milieu entsprechen. Die mit dieser
Enzympräparation erzielten Selektivitäten sind sehr hoch. Somit ist die enzymatische
Transacylierung durchaus geeignet, die Bereitstellung enantiomerenreiner
Verbindungen in einem größeren Maßstab zu leisten. Gerade für unpolare Substrate,
die nicht im wässrigen Medium löslich sind, sind die Bedingungen der Enzym-
katalysierten Transacylierung ideal geeignet, eine Racematspaltung durchzuführen.
So konnte beispielsweise die GRÜNENTHAL GmbH eine kinetische Racematspaltung
eines neuen Tramadol-Analogons (rac-52 in Abb. 2.70) aufbauend auf den im
Rahmen dieser Arbeit erreichten Ergebnissen erzielen. Das in Abb. 2.70 dargestellte
Naphtyl-Derivat zu rac-14 ist im wäßrigen Milieu in Form eines Buttersäureesters
unlöslich und es konnte keine PLE-katalysierte Hydrolyse beobachtet werden. Im
organischen Medium konnte allerdings unter den vorgestellten
Reaktionsbedingungen eine effiziente CAL-B-katalysierte Racematspaltung zur
Darstellung des gewünschten (+)-Enantiomers erreicht werden.184

Me2N OH
OMe
R O

OH O
CAL-B (−)-Ester
OMe
HO Vinylester
organisches +
Me2N OH
Lösungsmittel OMe
rac-52 RT HO
Me2N

(+)-52

Abb. 2.70: Durch die GRÜNENTHAL GmbH durchgeführte CAL-B-katalysierte Trans-


acylierung von rac-52, eines Naphtyl-Derivats zu rac-14.
154 THEORETISCHER TEIL

2.4.3 Substrate auf der Basis tertiärer Hydroxylfunktionen

Tertiäre Alkohole und deren Ester sind wahrscheinlich aufgrund von sterischen
Hinderungen im allgemeinen keine Substrate für Hydrolasen-katalysierte
Racematspaltungen. Bis heute sind nur einige wenige Beispiele für Hydrolasen-
katalysierte Umsetzungen dieser Substrate bekannt.134,238,239,240

O´HAGEN et al. konnten 1992 zeigen, daß aktivierte Ester tertiärer Alkohole, die eine
Acetylengruppe am stereogenen Zentrum enthalten, von der Candida rugosa Lipase
akzeptiert und mit mittleren Selektivitäten hydrolysiert werden. Erklärt wurde dies
dadurch, daß die Acetylengruppe in der Lage ist die Bindungsstelle des
Wasserstoffs, im Falle von sekundären Alkoholen, zu belegen.238 Daß die
Schweineleber-Esterase ebenfalls Ester tertiärer Alkohole, die eine Acetylengruppe
am stereogenen Zentrum tragen, mit hoher Selektivität hydrolysiert, zeigten COOPE et
al. am Beispiel eines tertiären Buttersäureesters des Quinuclidinols unter Zusatz von
Methanol als Cosolvens.134 KONIGSBERGER et al. erweiterten diese Substratgruppe
um aktivierte Ester von Trifluormetlyl-substituierten Cyanhydrinen, die mit sehr guten
Selektivitäten von der CRL umgesetzt wurden.239

Um die vom Enzym anzugreifende Estergruppe möglichst nah an den


Chiralitätszentren zu lokalisieren und so eine möglichst große Enantiomer-
Differenzierung des Enzyms zu erhalten, wurde in eigenen Vorarbeiten Ester rac-43
unter Einbezug der tertiären Hydroxylgruppe synthetisiert. Der Ester rac-43 wurde
anschließend zwei PLE-katalysierten Hydrolysen mit tert-Butanol und Methanol als
Cosolvens unterworfen, die aber nur jeweils 3 % Hydrolyseprodukt nach 100 h bzw.
26 h ergaben (Abb. 2.71).80
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 155

Pr O
O OMe

Pr O PLE Me2N
OMe 43
Phosphatpuffer-
Lösung (pH 8.0) +
Me2N OH
10 % Cosolvens OMe
rac-43 RT
Me2N
7
Abb. 2.71: Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-43.

Diese Ergebnisse legen nahe, daß Ester der tertiären Hydroxylgruppe vom Tramadol
keine Substrate für das Enzym PLE sind, da sie sterisch sehr anspruchsvoll und
elektronisch nicht aktiviert sind.

2.4.3.1 Versuche zur Enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-


Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-
phenyl)-cyclohexylester (rac-25)

In Vorversuchen zur Darstellung des (±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-


3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) zeigte sich, daß die
Reaktivität der tertiären Hydroxylgruppe ausgesprochen hoch ist. Eine Veresterung
der tertiären Hydroxylgruppe gelang durch Reaktion von Buttersäureanhydrid mit
Pyridin in Dichlormethan bei Raumtemperatur in quantitativer Ausbeute. Da unter
diesen Reaktionsbedingungen auch die sekundäre Hydroxylgruppe acyliert wird,
kann nach Aufarbeitung der Diester rac-25 erhalten werden. Aufgrund des einfachen
Zugangs zu dieser Verbindung, wurde untersucht, ob sie gegebenenfalls ein Substrat
für eine enzymatische Hydrolyse darstellt. Da sich anhand des Esters rac-19 gezeigt
hatte, daß keine enzymatische Hydrolyse der sekundären Estergruppe möglich ist,
bietet der Diester rac-25 die Möglichkeit einer enzymatischen Hydrolyse der tertiären
Estergruppe (Abb. 2.72).
156 THEORETISCHER TEIL

O O

Pr O O Pr
O O OMe

Pr O O Pr Enzym Me2N
OMe 25
Phosphatpuffer-
Me2N Lösung +
10 % Cosolvens
rac-25 O
RT
Pr O OH
OMe

Me2N
19
Abb. 2.72: Versuch zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-25.

Der Diester rac-25 wurde daraufhin in die Enzym-katalysierte Hydrolyse im wäßrigen


Einphasensystem eingesetzt. Als Enzym wurden die CE und die CRL unter
Verwendung von 10 % tert-Butanol als Cosolvens und die PLE unter Verwendung
von 16 % Aceton eingesetzt (Tabelle 2.66). Die Enzyme CE und CRL wurden
aufgrund ihrer großen hydrophoben Taschen im aktiven Zentrum ausgewählt, die
PLE wegen der von COOPE et al. erzielten Ergebnisse in der Hydrolyse eines
tertiären Buttersäureesters.

Tabelle 2.66: Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25

Enzym Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz

Cholesterolesterase Phosphatpufferlösung,
25 h 0%
(CE; 13.1 U/ml) pH 7.0; 10 % tert-Butanol

Candida rugosa Lipase Phosphatpufferlösung,


44 h 0%
(CRL; 9.3 U/ml) pH 7.0; 10 % tert-Butanol

Schweineleber-Esterase Phosphatpufferlösung,
42 h 1%
(PLE; 4.9 U/ml) pH 7.0; 16 % Aceton
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 157

Wie aber in Tabelle 2.66 zu ersehen ist, konnte mit allen drei Enzymen, unter den
jeweiligen Bedingungen, keine Hydrolyse des Diesters rac-25 beobachtet werden. In
allen Reaktionen wurde die eingesetzte Menge Esters rac-25 nach Extraktion
nahezu vollständig zurückerhalten werden. Ein Ergebnis, das nach den Resultaten in
der Hydrolyse des Esters rac-43 und dem Kenntnisstand der Literatur erwartet
werden konnte.

Der Diester rac-25 ist somit aufgrund von sterischen Hinderungen keine Substrat für
eine Hydrolasen-katalysierte Racematspaltung. Im Umkehrschluß bedeutet dies aber
auch, daß keine Enzym-katalysierte Acylierung der tertiären Hydroxylgruppe zu
erwarten ist. Daß die tertiäre Hydroxylgruppe in der Transacylierung nicht interferiert,
ist eine wichtige Voraussetzung dafür, daß die hydroxysubstituierten Tramadol-
Analoga direkt in Enzym-katalysierte Racematspaltung eingesetzt werden können.

Von FANG et al. ist, um der sterischen Hinderung von tertiären Alkoholen zu
begegnen und sie so einer Enzym-katalysierten Reaktion leichter zugänglich zu
machen, eine einfache Modifikation durchgeführt worden. Die tertiären Alkohole
wurden zunächst in die entsprechenden ß-Alkoxy Alkohole überführt und
anschließend deren primäre Alkoholfunktionalität von Lipasen mit zufriedenstellender
Aktivität und mäßiger Selektivität acyliert (Abb. 2.73).241 Diese Modifikation könnte
zur enzymatischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga eingesetzt werden, bei
denen nur eine tertiäre Hydroxylgruppe für eine Hydrolasen-katalysierte Reaktion zur
Verfügung steht.

OH BSL oder O
OH O O
CRL oder
O
PPL
Isopropenyl-
acetat
MTBE 33-78 % ee
E = 2.5 - 9.4
Abb. 2.73: Enzymatische Racematspaltung von modifizierten tertiären Alkoholen.
158 THEORETISCHER TEIL

2.5 Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Methoden zur Enzym-katalysierten
kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga. Unter Nutzung dieser
Methoden sollten beide Enantiomere von neuen Molekülen auf Tramadol-Basis
dargestellt werden.

In Untersuchungen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung von Tramadol (rac-7),


konnte, den Erwartungen entsprechend, gezeigt werden, daß Verbindungen mit
lediglich einer tertiären Hydroxylgruppe im allgemeinen keine Substrate für Enzym-
katalysierte Reaktionen sind. Dies ist Voraussetzung dafür, daß Tramadol-Analoga
mit weiteren reaktiven Hydroxylgruppen im Molekül direkt in Enzym-katalysierte
Racematspaltung eingesetzt werden können, ohne daß Nebenreaktionen an der
tertiären Hydroxylgruppe zu erwarten sind.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Enzym-katalysierten


Racematspaltung von Tramadol-Analoga mit phenolischer Hydroxylgruppe durch-
geführt. In dieser Gruppe von Substraten konnte am Beispiel des O-Desmethyl-
tramadols (rac-8) gezeigt werden, daß sich gute Ergebnisse in der Lipasen-
katalysierten Hydrolyse erzielen lassen, die dazu geeignet sind die Enantiomere
dieser Verbindung in einem präparativen Maßstab darzustellen. So konnte in der
CRL-katalysierte Hydrolyse des entsprechenden Buttersäureesters (rac-15) im
wäßrig-organischen Zweiphasensystem das gebildete Phenol (−)-8 mit einem
ee-Wert von 90 % in 27 % Ausbeute isoliert werden (E = 34). Dies ist innerhalb der
durchgeführten Untersuchungen zur Enzym-katalysierten kinetischen Racemat-
spaltung von Tramadol-Analoga mit phenolischer Hydroxylgruppe die höchste
erzielte Selektivität. Offenkettige, phenolische Tramadol-Analoga, wie das
untersuchte 3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11),
werden zwar als Substrate in der Enzym-katalysierten Hydrolyse akzeptiert, jedoch
sind die zu beobachtenden Selektivitäten so gering, daß keine geeignete Methode
zur Trennung der Enantiomeren gefunden werden konnte. Die zu geringe
Enantiomeren-Differenzierung tritt wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Flexibilität
dieser Moleküle gegenüber den cyclischen Verbindungen auf.
ZUSAMMENFASSUNG 159

Zusammenfassend zeigen die durchgeführten Untersuchungen zu Substraten auf


Tramadol-Basis mit phenolischer Hydroxylgruppe, daß die Enzym-katalysierte
Racematspaltung hier prinzipiell einen Zugang zu den einzelnen Enantiomeren dar
zu stellen vermag. Dies ist insbesondere beachtlich, da viele analgetisch aktive
Moleküle über eine aromatische Hydroxylgruppe verfügen, sonst aber über keine
funktionelle Gruppe, die für eine Racematspaltung genutzt werden könnte.

Als zweite Gruppe von Verbindungen wurden Tramadol-Analoga untersucht, die eine
zusätzliche sekundäre Hydroxylgruppe im Cyclohexylgerüst tragen. Zu diesen
Verbindungen gehören aktuelle, analgetisch aktive Entwicklungskandidaten der
GRÜNENTHAL GmbH, wie z.B. das Hydrochlorid des enantiomerenreinen para-
Fluorbenzylethers (+)-50.

In Untersuchungen zu dem Cyclohexanol-Tramadol-Analogon (1RS,3SR,6RS)-


6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) konnte
gezeigt werden, daß dieses Substrat sowohl in der Hydrolyse als auch in der
Transacylierung mit sehr hohen Selektivitäten in Enzym-katalysierten kinetischen
Racematspaltungen umgesetzt werden kann. So konnte anhand der Enzym-
katalysierten Hydrolyse des entsprechenden Buttersäureesters (rac-18) eine äußerst
effiziente kinetische Racematspaltung demonstriert werden. Die CRL-katalysierte
kinetische Racematspaltung dieses Esters verläuft mit einer nahezu perfekten
Selektivität (E > 200) und mittels extraktiver Aufarbeitung können der Alkohol (−)-12
und der nicht umgesetzte Ester (+)-18 in sehr hohen Ausbeuten erhalten werden.

OH Me2N OH
OMe OMe
HO
Me2N O OH HO
(+)-12 PLE OMe CRL (−)-12
+ Pr O
O +
Me2N OH Me2N OH
OMe OMe
rac-18 Pr O
O
O Me2N
Pr (−)-18 (+)-18

Abb. 2.74: Enzym-katalysierten Hydrolysen von rac-18 zur Darstellung beider


Enantiomere.
160 THEORETISCHER TEIL

Einen einfachen Zugang zu dem enantiomeren Alkohol (+)-12 ermöglicht die PLE-
katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 (E = 89). Da das Enzym PLE eine zur CRL
entgegengesetzte Enantiopräferenz zeigt, wird der Alkohol (+)-12 erhalten werden
(Abb. 2.74). Somit ermöglicht eine geeignete Wahl des Enzym die Darstellung beider
enantiomerer Alkohole mit hohen ee-Werten.
Auch in der alternativen enzymatischen Reaktionsführung im organischen Medium,
der Lipasen-katalysierten Acylierung, verläuft die CRL-katalysierten Transacylierung
des Alkohols rac-12 mit überaus hoher Selektivität (E = 120). Die erzielten
Ergebnisse zeigen, daß die Enzym-katalysierte Transacylierung im organischen
Medium des Alkohols rac-12 eine interessante Alternative, auch in einem präparative
Maßstab, zur Hydrolyse im wäßrigen Medium darzustellen in der Lage ist.

OH OH
Me2N
OMe OMe
Pr O Pr O
Me2N
O (−)-22 O
(+)-22
OH
PLE OMe CRL +
+ Pr O CE
Me2N OH
OH Me2N
O OMe
OMe rac-22
HO HO
Me2N
(+)-14 (−)-14

Abb. 2.75: Enzym-katalysierten Hydrolysen von rac-22 zur Darstellung beider


Enantiomere.

Auch im Fall der zum rac-12 epimeren Verbindung (1RS,2RS,4SR)-2-Dimethyl-


aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) konnte gezeigt
werden, daß dieses Cyclohexanol-Tramadol-Analoga hochselektiven enzymatischen
Racematspaltungen zugänglich ist. Es konnte demonstriert werden, daß wie im Falle
der Verbindung rac-12 die PLE-katalysierte Hydrolyse (Chirazyme E1, E = 85) mit
einer zur CRL (E = 34) und CE (E = 89) entgegengesetzten Enantiopräferenz verläuft
(Abb. 2.75). Die gezielte Darstellung beider Enantiomere durch eine geeignete Wahl
des Enzym ist ebenfalls bei diesem Substrat möglich.
In der enzymatischen Transacylierung des Alkohols rac-14 konnte gezeigt werden,
daß mit einer immobilisierten CAL-B als Katalysator außerordentlich gute
Ergebnisse erzielt werden (E > 200). Die CAL-B zeigt in der Regel bei
ZUSAMMENFASSUNG 161

ausgezeichneter Selektivität eine so hohe Aktivität, daß Reaktionszeiten im Bereich


von enzymatischen Hydrolysen erreicht werden. Somit ist die Enzym-katalysierte
Transacylierung von rac-14 dazu geeignet ist, die Bereitstellung enantiomerenreiner
Verbindungen in einem größeren Maßstab zu leisten. Gerade für unpolare Substrate,
die nicht im wässrigen Medium löslich sind, sind die Bedingungen der Enzym-
katalysierten Transacylierung ideal geeignet, eine Racematspaltung durchzuführen.

Insgesamt konnte gezeigt werden, daß sich mit Ausnahme des 1,3-diaxial
substituierten 6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diols
(rac-13) Cyclohexanol-Tramadol-Analoga nahezu ideal in der Enzym-katalysierten
Racematspaltung verhalten. Bei der Verbindung 13 sind wahrscheinlich sterische
Hinderungen des Moleküls für die nicht Reaktivität verantwortlich, die aber als
spezielle Ausnahme dieser Verbindung zu betrachten sind. Die Enzym-katalysierte
Hydrolyse von Cyclohexanol-Tramadol-Analoga stellt ein effizientes Verfahren zur
Synthese enantiomerenreiner Verbindungen dar. Bei diesem Verfahren konnte eine
einfache und effiziente Aufarbeitung durch Extraktion von Ester und Alkohol bei
verschiedenen pH-Werten etabliert werden. Es wurde aufgezeigt, daß beide
Enantiomere der gewünschten Verbindung je nach Wahl des geeigneten Enzyms
durch Enzym-katalysierte Racematspaltung dargestellt werden können.

Im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen konnten verschiedene


Möglichkeiten zu der Optimierung Enzym-katalysierter Racematspaltungen von
Tramadol-Analoga aufgezeigt werden:

• Zur Steigerung der Substratkonzentration von Tramadol-Analoga im wässrigen


Medium ist es gelungen statt der freien Basen deren Hydrochloride, die eine
wesentlich höhere Löslichkeit haben, als Substrate einzusetzen.

• Durch die Wahl der Butyratgruppe als Acylrest kann in enzymatischen Hydrolysen
ein geeignetes Substrat geschaffen werden, welches sowohl von Lipasen als auch
Esterasen mit guter Selektivität umgesetzt wird.

• Anhand der CRL-katalysierten Hydrolyse von Tramadol-Analoga konnte gezeigt


werden, daß bei in einem Wechsel vom wässrigen Einphasensystem zum wässrig-
organischen Zweiphasensystem als Reaktionsmedium eine Steigerung der
Selektivität von Lipasen-katalysierten Reaktionen möglich ist.
162 THEORETISCHER TEIL

• Als eine einfache, effiziente und ökonomische Methode zur Aufarbeitung von
enzymatischen Hydrolysen konnte die Extraktion von Ester und Alkohol bei
verschiedenen pH-Werten etabliert werden, wodurch auf aufwendige
chromatographische Trennverfahren verzichtet werden kann.

• In der Enzym-katalysierten Transacylierung konnte durch die Verwendung von


Isopropenylacetat als Acylierungsmittel, welches kein Acetaldehyd bildet, eine
Steigerung der Aktivität und Selektivität gegenüber konventionellen Vinylestern
beobachtet werden.

• Es konnte gezeigt werden, daß im besonderen die Enzyme PLE, CRL und CAL-B
zu einer kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga geeignet sind. Sie
zeigen eine hohe Aktivität und Selektivität. Zudem sind diese Enzyme gut
untersucht und über einen größeren Zeitraum in ähnlicher Präparation und Qualität
kommerziell verfügbar.

Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß sich verschiedene


Tramadol-Analoga als gute Substrate für Enzym-katalysierte kinetische Racemat-
spaltungen eignen. Im allgemeinen können sowohl in der Hydrolyse als auch in der
Transacylierung gute Aktivitäten der Enzyme bei genügender Selektivität beobachtet
werden. Es konnte daher in dieser Arbeit gelingen, die Enzym-katalysierten
kinetischen Racematspaltungen als Methode zur Darstellung einzelner Enantiomere
von verschiedenartigen neuen Tramadol-Analoga in einem präparativen Maßstab zu
etablieren. Beachtenswert ist hierbei, daß die vom Enzym anzugreifende
Hydroxylgruppe mehrere C-Atome von den Stereozentren der Verbindungen entfernt
lokalisiert ist.
AUSBLICK 163

2.6 Ausblick

Aufbauend auf den zur Hydrolyse und Transacylierung von Tramadol-Analoga


entwickelten Verfahren und gesammelten Erfahrungen, sollten weitere synthetisch
wertvolle Substrate gesucht werden, die mit anderen Methoden nur schwer
enantiomerenrein zugänglich sind. Hier bieten sich biologisch aktive Moleküle an, die
neben einer aromatischen Hydroxylgruppe über keine weiteren funktionellen
Gruppen verfügen, die für eine Racematspaltung genutzt werden können.
Im besonderen bieten sich hier weitere Tramadol-Analoga an, die statt über eine
sekundäre Hydroxylgruppe über eine Aminogruppe im Cyclohexylring verfügen.
Hinweise auf eine analgetische Aktivität dieser Gruppe von Verbindungen sind
ebenfalls vorhanden (Abb. 2.76).184

OH OH
OMe OMe
H2N H2N
Me2N Me2N

Abb. 2.76: Neue interessante Tramadol-Analoga mit zusätzlicher Aminogruppe.

Aus Arbeiten von GOTOR et al. geht hierzu hervor, daß es allgemein möglich ist,
Amine als Substrate in CAL-B-katalysierten Transacylierungen hochselektiv zu
acylieren.242 Auch N-selektive Lipasen-katalysierte Acylierungen von cyclischen
Aminoalkoholen sind ebenfalls von GOTOR et al. beschrieben worden.243

Unter dem Gesichtspunkt der Etablierung eines präparativen Verfahrens zur Enzym-
katalysierten Transacylierung im organischen Medium, nicht nur von Tramadol-
Analoga, wäre die Entwicklung einer Methode zur Aufarbeitung der Reaktion, welche
auf chromatographische oder destillative Trennschritte verzichtet, von großem
Vorteil.
3 Experimenteller Teil
ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 165

3.1 Allgemeine Vorbemerkungen

3.1.1 Eingesetzte Computerprogramme

Visualisierung von E-Werten


„Enantiomeric Ratio“ Copyright © 1994, 1995: K. Faber, H. Hönig, Technical
University of Graz.

Konvertierung in das Portable Document Format (PDF)


„Adobe Acrobat“ Copyright © 1987 - 1999: Adobe Systems Inc.

Chemische Strukturen
„ChemDraw“ Copyright © 1985 - 2000: CambridgeSoft, Cambridge.

3.1.2 Analytische Methoden und Geräte

Gaschromatographie (GC)
Umsatz- und Reinheitsbestimmungen wurden mit Kapillar-GC-Geräten von VARIAN
(Varian 3800 mit 2 Split/Splitness-Injektionssystem), CHROMPACK (CP 9000) und
CARLO ERBA (Mega 5360) durchgeführt. Die Peakdetektion erfolgte über einen
Flammenionisationsdetektor (FID) bei einer Detektionstemperatur von 330 ºC. Es
wurden folgende Bedingungen gewählt:

CP-Sil-8

Säulenspezifikation: 95 % Methylpolysiloxan, 5 % Phenylpolysiloxan

Säulenlänge: 30 m
Innerer Säulendurchmesser: 0.32 mm

Filmdicke: 0.25 µm

Trägergas und -druck: H2, 75 kPa (Varian 3800) bzw. 100 kPa (Mega 5360)
166 EXPERIMENTELLER TEIL

Es wurden dabei folgende Standardprogramme bei einer Injektionstemperatur von


250 ºC verwendet:

100 ºC (5 Min.) → 250 ºC (20 ºC/Min.; 5 Min.) → 300 ºC (30 ºC/Min.;


S1
15 Min.)

50 ºC (5 Min.) → 150 ºC (30 ºC/Min.; 2 Min.) → 250 ºC (20 ºC/Min.;


S2
2 Min.) → 300 ºC (30 ºC/Min.; 15 Min.)

Die in der vorliegenden Arbeit angegebenen Werte wurden unter Annahme eines
Fehlerbereichs von 0.5 % auf ganze Zahlen gerundet. Abgeleitete Größen wurden
mit den Originaldaten berechnet.

Gaschromatographische Bestimmungen der Enantiomerenüberschüsse erfolgte


durch vorherige Trennung an folgenden chiralen stationären Phasen:

CP-Chirasil-Dex-CB (CHROMPACK)

Säulenspezifikation: Permethyl-β-Cyclodextrin
Säulenlänge: 25 m
Innendurchmesser: 0.25 mm
Filmdicke: 0.25 µm
Trägergas und -druck: H2, 100 kPa

Lipodex-γ-6-Me (MACHEREY-NAGEL)

Säulenspezifikation: 2,3-O-Dipentyl-6-O-methyl-γ-Cyclodextrin
Säulenlänge: 25 m
Innendurchmesser: 0.25 mm
Filmdicke: 0.15 µm
Trägergas und -druck: H2, 100 kPa
ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 167

Lipodex-E (MACHEREY-NAGEL)

Säulenspezifikation: Octakis-(2,6-di-O-pentyl-3-O-butyryl)-γ-
Cyclodextrin
Säulenlänge: 25 m
Innendurchmesser: 0.25 mm
Filmdicke: 0.15 µm
Trägergas und -druck: H2, 100 kPa

Massenspektroskopie (MS)

Gerät: Varian MAT 212 S, Erfassung mit Varian MAT SS 200. Falls nicht anders
vermerkt, wurde als Standardbedingung Elektronenionisation (EI, 70 eV) oder
chemische Ionisation (CI, Methan, 100 eV) verwendet. Die Angabe von Massen der
Fragmentionen (m/z) erfolgte als dimensionslose Zahl. Es wurden nur Signale mit
hoher Intensität oder besonders charakteristische Signale aufgeführt.

GC-MS-Analysen
Geräte: Gaschromatograph: Varian Modell 3700, Massenspektrometer: Varian MAT
112 S. Ionisation: 70 eV (EI) oder MeOH, 40 eV (CI).

Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
Geräte zur analytischen HPLC: Millipore Waters 600E Systemcontroller; UV/VIS-
Detektion (λ = 190-400 nm) mit einem Waters 996 Photodiode Array Detektor; RI-
Detektion mit einem Waters 410 Differential Refraktometer; Waters 510 Pumpen;
RP-Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm).
Geräte zur präparativen HPLC: Merck Novaprep 200; UV-Detektion (λ = 273 nm);
RP-Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm,
Filmdicke 10 µm) und eine VARIAN Anlage mit UV-Detektion (λ = 273 nm); RP-
Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm,
Filmdicke 10 µm) oder RP-Select B-LiChrosor b® der Firma MERCK (Säulenlänge
250 mm, Innendurchmesser 25 mm, Filmdicke 7 µm).
Geräte zur analytischen HPLC an chiraler stationärer Phase: Millipore Waters 600 E
Systemcontroller; UV/VIS-Detektion (λ = 190-400 nm) mit einem Waters 996
Photodiode Array Detektor; Waters 510 Pumpen; Chiralcel OD-Vorsäule; Chiralcel
168 EXPERIMENTELLER TEIL

OD-H Säule der Firma BAKER-DAICEL (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser


46 mm, derivatisierte Cellulose auf Silicagel) und Millipore Waters 600 E
Systemcontroller; UV-Detektion (λ = 273 und 254 nm) mit einem Waters Lamda-Max
481; Chiralcel OD-H Säule der Firma BAKER-DAICEL (Säulenlänge 250 mm,
Innendurchmesser 46 mm, derivatisierte Cellulose auf Silicagel).

NMR-Spektroskopie
Geräte: Varian VXR 300 (300 MHz, 75 MHz), Varian Gemini 300 (300 MHz,
75. MHz), Varian Inova 400 (400 MHz, 100 MHz), Varian Unity (500 MHz, 125. MHz).
Alle Spektren wurden bei 20 ºC aufgenommen. Als interner Standard diente
Tetramethylsilan (TMS). Chemische Verschiebungen δ wurden in ppm bezogen auf
TMS (δ = 0.00 ppm) und Kopplungskonstanten J in Hz angegeben. Die Aufspaltungs-
muster wurden generell nach erster Ordnung interpretiert, wobei folgende
Abkürzungen zur Beschreibung benutzt wurden: s = Singulett; d = Dublett; t =
Triplett; q = Quartett; m = Multiplett; dm = Multiplett eines Dubletts; tm = Multiplett
eines Tripletts; br = breit.
13
Die C-NMR-Spektren sind 1H-breitband-entkoppelt. Die Substitutionsmuster der
13
C-NMR-Signale wurden den J-modulierten Spinecho-Spektren (APT) und mit u = C,
CH2 und d = CH, CH3 angegeben. Zur genauen Zuordnung wurden HETCOR-
Spektren gemessen.

FT-Infrarotspektroskopie (IR)
Gerät: Perkin-Elmer FTIR 1760 S.
Die Proben wurden als KBr-Presslinge (KBr) oder als kapillare Filme (kapillar)
präpariert. Die Spektren wurden im Bereich von 4000 – 700 cm-1 aufgenommen. Die

Lage der Absorptionsbanden (∼


ν) wurde in cm-1 angegeben; bei der Charakterisierung
wurden nur Banden mit Intensität >40 % aufgelistet, wobei die Abkürzungen s (stark,
Absorption >80 %), m (mittelstark, Absorption 60 – 80 %) und w (schwach,
Absorption 40 – 60 %) verwendet wurden.

Elementaranalyse

Gerät: Heraeus CHNO-Rapid. Eine Substanzprobe wurde für ∆C,H,N <0.4 % als
authentisch betrachtet.
ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 169

Polarimetrie
Gerät: Perkin-Elmer-Polarimeter PE 241. Die Messung der Drehwerte erfolgte bei
20 ºC in einer Mikroküvette (Länge 10 cm) mit der Natriumdoppellinie (λ = 589.0 und

589.6 nm). Die Angabe der spezifischen Drehung [α ] 20


D
erfolgte in (grd⋅dm3)/(dm⋅g),

die Angabe der Konzentration c in (g/dm3).

Autotitrator
Gerät: STAT-Titrino 718 der Firma METROHM. Das Gerät wurde im pH-STAT Modus
mit NaOH-Maßlösungen (1 N und 0.1 N) der Firma MERCK betrieben.

Ultrafiltration
Gerät: Ultrafiltrationszelle Amicon Modell 2800 mit einer Membran PM 30
(Ausschlußgrenze: >30 kDa) von MILLIPORE.

Gefriertrocknung
Gerät: Christ Alpha 2-4.

Schmelzpunkte
Gerät: Büchi-Schmelzpunktapparatur SMP-20.
Die Schmelzpunkte wurden unkorrigiert angegeben.

Siedepunkte
Die Siedepunkte wurden unkorrigiert angegeben.

Dünnschichtchromatographie
Es wurden DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 der Firma MERCK mit einer Schichtdicke
von 0.25 mm verwendet. Die Detektion erfolgte durch UV-Fluoreszenzlöschung bei
λ = 254 nm sowie durch Anfärben mit einer Lösung aus Eisessig / dest. H2O / konz.
H2SO4 / p-Anisaldehyd (in einem Volumenverhältnis von 75 : 2 : 1.5 : 1) und an-
schließendem Erhitzen.

Präparative Säulenchromatographie
Es wurde Kieselgel 60, 0.062 - 0.100 mm, der Firma MERCK verwendet.
170 EXPERIMENTELLER TEIL

3.1.3 Lösungsmittel und Reagenzien

Die verwendeten Lösungsmittel wurden mit den laborüblichen Methoden getrocknet


und absolutiert. Die Reagenzien wurden, wenn nicht ausdrücklich anders erwähnt, in
handelsüblicher Qualität ohne weitere Aufreinigung eingesetzt. Diisobutyl-
aluminiumhydrid wurde von der SCHERING AG zur Verfügung gestellt, der ich an
dieser Stelle ebenfalls für die Unterstützung dieser Arbeit danken möchte.

Methanol
Die Trocknung erfolgte, indem Methanol mit Magnesium-Spänen zur Reaktion
gebracht und anschließend destilliert wurde.

Diisopropylether
Die Entfernung von Peroxiden aus Diisopropylether sowie dessen Vortrocknung
wurde durch Säulenfiltration über basischem Aluminiumoxid erreicht. Dies erfolgte
vor jedem Gebrauch, zusätzlich wurde vor jedem Gebrauch und insbesondere vor
jedem Einengen mit essigsaurer Kaliumiodidlösung auf Peroxide getestet.e

Transacylierungsreagenzien
Essigsäure-vinylester (Vinylacetat), Essigsäure-isopropenylester (Isopropenylacetat)
und Propionsäure-vinylester (Vinylpropionat) wurden über NaCO3 destilliert, um
Spuren von Säure zu entfernen, bevor sie in die Enzym-katalysierte Transacylierung
eingesetzt wurden.

3.1.4 Verwendete Proteine

Pferdeleber-Esterase (HLE, EC 3.1.1.1)


SIGMA; Aktivität: 0.74 U/mg Lyophilisat (Buttersäureethylester, pH 8.0, 25 ºC).
Schweineleber-Esterase (PLE, EC 3.1.1.1)
a) BOEHRINGER MANNHEIM; 30 mg Enzym in 3 ml 3 M (NH4)2SO4, pH 6.
Aktivität >120 U/mg Protein (100 mM Buttersäureethylester, pH 7.0, 25 ºC).

e
Autorenkollektiv, Organikum, 17. Aufl., VEB-Verlag Berlin 1988.
ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 171

b) ROCHE DIAGNOSTICS; 306 mg Enzym in 30.6 ml3 M (NH4)2SO4, pH 6.


Aktivität 130 U/mg Protein (100 mM Buttersäureethylester, pH 7.0, 25 ºC).
c) ROCHE DIAGNOSTICS; Chirazyme E1 (lyophilisierte PLE, Fraktion 1).
Aktivität: 33.0 U/m g Lyophilisat (100 mM Buttersäureethylester, pH 7.0, 25 ºC).
Burkholderia cepacia Lipase (BCL, EC 3.1.1.3)
wurde bezogen als Pseudomonas cepacia Lipase (PCL):
a) FLUKA; Aktivität: 40 U/mg (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC).
b) SIGMA; Aktivität: 0.09 U/mg (Glycerin-triester, pH 7.0; 37 ºC).
Candida antarctica Lipase (CAL-B, EC 3.1.1.3)
a) BOERINGER MANNHEIM; Chirazyme L-2 (lyophilisierte CAL, Typ B, CAL-B).
Aktivität: 1.0 MU/6.452 g Lyophilisat (100 mM Glycerin-tributyrat, pH 7.0, 25 ºC).
b) NOVO NORDISK; Novozym 435 (immobilisierte CAL, Typ B, CAL-B).
Aktivität: ca. 7 U/mg (Veresterung 1-Propanol mit n-Dodecansäure, 60 ºC)
Diese Lipase wurde mittels rekombinater DNA-Technik in dem Wirt-Organismus
Aspergillus oryzae produziert und anschließend auf einem makroporösen
Acrylharz immobilisiert.126 Novozym 435 wurde freundlicherweise von NOVO
NORDISK zur Verfügung gestellt.
c) FLUKA; Aktivität: 3.2 U/mg (CAL) Lyophilisat; bezogen als Bestandteil eines
Lipasen-Screening Grundkits.
Candida rugosa Lipase (CRL, EC 3.1.1.3)
wurde bezogen als Candida cylindracea Lipase (CCL):
FLUKA; Aktivität: 37 U/mg Lyophilisat (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC).
FLUKA; Aktivität: 25.9 U/mg Lyophilisat (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC).
FLUKA; Aktivität: 2.4 U/mg Lyophilisat (Glycerin-trioleat, pH 8.0, 40 ºC); bezogen
als Bestandteil eines Lipasen-Screening Grundkits.
Cholesterolesterase (CE, EC 3.1.1.13)
BOERINGER MANNHEIM; aus Candida rugosa (ehemals Candida cylindracea).
Aktivität: 52 KU/2.96 g Lyophilisat (Cholesterol oleate, 25 ºC).
Chromobacterium viscosum Lipase (CVL, EC 3.1.1.3)
SIGMA; Aktivität: 3.58 U/mg Lyophilisat (Olivenöl, pH 7.7; 37 ºC).
Porcine pancreatic Lipase (PPL, EC 3.1.1.3)
wurde bezogen als Lipase aus hog pancreas:
FLUKA; Aktivität: 16.8 U/mg (Olivenöl, pH 8.0; 37 ºC).
172 EXPERIMENTELLER TEIL

Acetylcholinesterase (AChE, EC 3.1.1.7)


SIGMA; Typ V-S aus Electrophorus electricus (electric eel);
Aktivität: 970 U/mg (Acetylchlolin, pH 8, 37 ºC).

Aus einem Lipasen-Screening Grundkit (FLUKA) wurden eingesetzt:


- Rhizomucor miehei bezogen als Mucor miehei Lipase (EC 3.1.1.3; 1.3 U/mg)
- Rhizopus arrhizus Lipase (EC 3.1.1.3; 2 U/g)
- Rhizopus niveus Lipase (EC 3.1.1.3; 2.6 U/g)
- Aspergillus niger Lipase (EC 3.1.1.3; 1 U/mg)

Das Colyophilisat aus PLE/BSA/MPEG (1.5 % Proteingehalt) wurde


freundlicherweise von Herrn Dr. V. Jadhav zur Verfügung gestellt. Dieser Katalysator
wurde wie in Kap. 3.2.1 auf S. 174 beschrieben aus 6 ml (60 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 180 U/mg), 2 g MPEG5000 und 2 g BSA durch Gefriertrocknung
hergestellt.83 Die spezifische Aktivität dieses Colyophilisats betrug
2.22 U/mg Colyophilisat oder 148 U/mg PLE (Aktivitätsbestimmung nach Kap. 3.2.2,
S. 174).

Bei der Einordnung der Lipasen ergeben sich einige taxonomische Besonderheiten.
Mehrere Lipasen wurden nach Klonierung und Sequenzierung neu identifiziert und
klassifiziert. So wurde 1992 die Candida cylindracea Lipase neu zur Candida rugosa
Lipase, 1995 die Pseudomonas cepacia Lipase neu zur Burkholderia cepacia Lipase
und die Mucor miehei Lipase neu zur Rhizomucor miehei Lipase klassifiziert.6,101
Zudem ergab die Klonierung und Sequenzierung der Lipasen aus Rhizopus arrhizus
und Rhizopus niveus eine nahezu 100% Identität dieser Enzyme.101 Ein
unterschiedliches Substratspektrum dieser Enzyme ist somit nicht zu erwarten.
Um eine einheitliche Nomenklatur zu Verwenden, werden die Enzyme
dementsprechend in dieser Arbeit durchgehend nach ihrer aktuellen Klassifizierung
benannt und nicht ungedingt so, wie sie bezogen wurden.
Des weiteren werden in dieser Arbeit auch einige von Herstellern eingeführte
Eigennamen von Proteinen verwendet, um bestimmte Eigenschaften dieser
Enzympräparationen zu verdeutlichen. So wird im folgenden der Begriff
Chirazyme E1 statt PLE verwendet, um zu zeigen, daß es sich um lyophilisierte PLE
der Fraktion 1 handelt. Ebenso soll der verwendete Begriff Novozym 435
ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 173

verdeutlichen, daß es sich um eine immobilisierte Candida antarctica Lipase des


Typs B handelt.

Aktivitätsangaben verschiedener Proteine in dieser Arbeit beziehen sich auf die vom
Hersteller angegebenen Methode der Aktivitätsbestimmung. Aktivitätsbestimmungen
mit Tramadolderivaten als Substrat wurden nicht durchgeführt.

Alle Proteine wurden für nicht länger als 6 Monate bei 2 ºC gelagert.

3.1.5 Besondere Arbeitstechniken

Alle Reaktionen mit feuchtigkeits- oder luftempfindlichen Reagenzien wurden in


ausgeheizten Schlenkkolben unter Argon-Schutzgasatmosphäre mittels Spritzen-
technik durchgeführt.

Ester von Tramadol-Analoga sind im allgemeinen nicht im wäßrigen


Einphasensystemen löslich und neigen dazu an Glasflächen Kolloide zu bilden. Alle
Substrate der Enzym-katalysierten Hydrolysen wurden daher vorher in dem
jeweiligen Cosolvens gelöst und dann langsam zur Phosphatpuffer-Lösung gegeben.
Nach anfänglicher Trübung während der Zugabe entstanden klare, homogene
Lösungen. Aufgrund der Dimethylaminomethyl-Seitenkette reagieren alle
eingesetzten Substrate schwach basisch, so daß sich während der Zugabe des
Substrats zur Phosphatpuffer-Lösung der pH-Wert änderte. Es wurde daher vor
Zugabe des Enzyms der pH-Wert der Lösung mit verdünnter Salzsäure wieder auf
den gewünschten Wert eingestellt.

Enzym-katalysierte Transacylierungen wurden in unbehandelten Schnapp-


deckelgläschen durchgeführt, da diese durch ihre günstigen
Oberflächeneigenschaften nicht zu einem Festkleben des Enzyms an der
Glasoberfläche führten. Mit Wasser gesättigte Lösungsmittel wurden bei 20 ºC mit
dest. Wasser gesättigt. Proben zur Reaktionskontrolle wurden zur Trocknung und zur
Abtrennung von Proteinen über eine mit NaSO4 und Celite gefüllte Pasteurpipette
filtriert.
174 EXPERIMENTELLER TEIL

3.2 Darstellung und Analytik der MPEG/PLE Präparationen

3.2.1 Darstellung von MPEG/PLE84,85

3 ml PLE/(NH4)2SO4-Suspension (entspricht 30 mg natives Protein) wurden durch


Ultrafiltration unter Eiskühlung durch eine PM 30-Membran (Ausschlußgrenze:
>30 kDa) mit 1 L dest. Wasser unter 1.0 bar N2-Überdruck entsalzt. Der Rückstand
wurde mit ca. 250 ml dest. Wasser aufgenommen. Die leicht getrübte Suspension
wurde unter Rühren mit 1000 mg MPEG5000 versetzt, für 3 h gerührt, in flüssigem
Stickstoff gefroren und für 60 h bei Raumtemperatur im Hochvakuum (0.01 mbar,
RT) lyophilisiert. Das so gefriergetrocknete Colyophilisat aus MPEG/PLE (3 %
Proteingehalt) wurde als weißer, flockiger Feststoff mit einer Ausbeute von 100 %
erhalten.

3.2.2 Standardtest zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE86

O O
PLE
+
O Rt, pH 8 OH OH

Abb. 3.1: Enzymatische Verseifung von Buttersäureethylester.

90 ml Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M, pH 8.00) wurden mit 3 ml Buttersäureethylester


(22.7 mmol) versetzt und heftig gerührt, so daß eine feine Emulsion entstand. Die
Mischung wurde auf pH 8.00 eingestellt. Nach Zugabe von ca. 1 mg Enzym
(entspricht 100 µl PLE/(NH4)2SO4-Suspension oder 34 mg MPEG/PLE; ca. 100 -
200 U) wurde der pH-Wert durch einen Autotitrator mit 1 N NaOH-Lösung konstant
gehalten und der Verbrauch an NaOH-Lösung über 2 Stunden verfolgt. Anhand des
Verbrauchs an 1 N NaOH-Lösung ließ sich die Enzymaktivität bestimmen (Zur
Programmierung des Autotitrators siehe Kap. 3.7.1, S. 271). Hierzu wurde der
Verbrauch an NaOH-Lösung gegen die Zeit aufgetragen und der Verbrauch pro
Minute anhand von zwei Meßpunkten im linearen Bereich des Diagramms bestimmt.
DARSTELLUNG UND ANALYTIK DER MPEG/PLE PRÄPARATIONEN 175

Die Enzymaktivität ist definiert als:

Formel 3.1: 1 U = 1 µmol hydrolysierter Buttersäureethylester/(Min⋅mg Protein)

Die Proteinmenge wurde im Falle der MPEG/PLE direkt eingewogen, im Falle der
PLE/(NH4)2SO4-Suspension mit einer Eppendorf-Pipette (Genauigkeit: 100 µl
±0.8 %) abgemessen.

Tabelle 3.1: Standardaktivität verschiedener Enzympräparationen

Enzympräparation Standardaktivität

PLE/(NH4)2SO4-Suspension 120 – 180 U

Colyophilisat MPEG/PLE 110 – 150 U/mg PLE

Colyophilisat PLE/BSA/MPEG 148 U/mg PLE

Chirazyme E1 (lyophilisierte PLE) 26 – 30 U


176 EXPERIMENTELLER TEIL

3.3 Darstellung der Substrate zur enzymatischen


Racematspaltung

3.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften

3.3.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Freisetzung der racemischen Basen


(AAV 1)91

Zur Freisetzung der Base aus ihrem Hydrochlorid wurde dieses in einer Emulsion
aus Wasser (0.5 ml/mmol) und Dichlormethan (0.4 ml/mmol) suspendiert. Unter
Rühren wurde langsam 40 %ige Natronlauge (0.13 bis 0.20 ml/mmol) zugetropft und
für ca. 30 Min. nachgerührt bis der gesamte Feststoff reagiert hatte. Nach
Phasentrennung wurde dreimal mit Dichlormethan (jeweils 1 ml/mmol)
nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat
getrocknet. Nach Einengen im Rotationsverdampfer wurde die freie Base in der
Regel als farbloses, Sirup ähnliches Öl erhalten, das vorsichtig im Hochvakuum von
Lösungsmittelresten befreit wurde. Alle freien Basen haben die Eigenschaft bei der
Entfernung von Lösungsmittelresten unter vermindertem Druck stark zu schäumen,
daher ist diese Operation mit besonderer Sorgfalt und gegebenenfalls unter gelindem
Erwärmen zur Erhöhung der Viskosität der Lösung durchzuführen.

3.3.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester


von Phenolen244 (AAV 2)

Zu einer Mischung von 1.2 Äq. Säureanhydrid und 0.1 Äq. Pyridin in Dichlormethan
wurde unter Rühren das Phenol gegeben. Die Reaktionslösung wurde für 2 - 3 Tage
bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem durch DC-Kontrolle kein Edukt mehr
detektiert werden konnte, wurde die Reaktionsmischung über Nacht mit
ges. NaHCO3-Lösung gerührt, um überschüssiges Säureanhydrid zu hydrolysieren.
Nach Phasentrennung wurde dreimal mit Diethylether (2 ml/mmol) nachextrahiert.
Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet, im
Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum von Lösungsmittelresten
befreit.
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 177

3.3.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester


von Hydroxysubstituierten-Tramadolen (AAV 3)

Das Hydrochlorid oder die freie Base des sekundären Alkohols wurde in abs.
Tetrahydrofuran oder Diethylether (3.15 ml/mmol) suspendiert. Anschließend wurden
bei der angegebenen Temperatur vorsichtig 2.5 Äq. Kalium-tert-butylat im Falle des
Hydrochlorids oder 1.0 Äq. Kalium-tert-butylat im Falle der freien Base zugegeben
(exotherme Reaktion, gegebenenfalls Kühlen). Es entstand in allen Fällen eine klare,
schwach gelbe bis dunkelgelbe Lösung. Danach wurde noch eine halbe Stunde
nachgerührt und anschließend unter Eiskühlung bei 5 ºC über einen Zeitraum von
10 Min. 1.0 - 1.5 Äq. Säurechlorid in Tetrahydrofuran oder Diethylether
(0.47 ml/mmol) zugetropft. Zur Vervollständigung der Reaktion wurde die Lösung
noch eine Stunde bei der angegeben Reaktionstemperatur gerührt und danach über
Nacht bei Raumtemperatur. Anschließend wurde die hellgelbe Reaktionslösung mit
einem Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 20 Stunden kräftig gerührt, um
überschüssiges Säurechlorid zu hydrolysieren. Nach Phasentrennung wurde dreimal
mit Dichlormethan (1.25 ml/mmol) nachextrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen wurden über NaSO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer
wurde der Ester als farbloses bis gelbliches, sirupöses Öl erhalten, das im
Hochvakuum von Lösungsmittelresten befreit wurde.

3.3.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung von Hydrochloriden aus


den racemischen Basen (AAV 4)

Die Base wird in einer Mischung aus trockenem Aceton (1.40 ml/mmol) und Ethanol
(0.28 ml/mmol) gelöst. Anschließend wird zur Vermeidung von Nebenreaktionen, wie
Eliminierungen, schonend durch Zugabe von 1 Äq. Wasser und 1 Äq.
Trimethylchlorsilan das Hydrochlorid ausgefällt, abfiltriert und im Hochvakuum
getrocknet.
178 EXPERIMENTELLER TEIL

3.3.2 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen


Transacylierung

3.3.2.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-


phenyl)-cyclohexanol (rac-7)

Die Base rac-7 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden
10 g (33.3 mmol) rac-7⋅HCl in 16 ml dest. Wasser und 12 ml Dichlormethan
suspendiert und mit 4.4 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung
wurden 8.70 g (33.0 mmol, 99 %) rac-7 als farbloser Sirup erhalten.

OH
10
5 6 1 9 11
O
3 7 15
4 2 14
N 12
13
8

rac-7: MW = 263.4 g⋅mol-1


H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.2 ppm (dd, 1 H, 3J = 8 Hz, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H),
1

7.2 (s, 1 H, 10-H), 7.0 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 12-H), 6.8 (dm, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 3.8 (s,
3 H, 15-H), 2.4 (dd, 3J=4 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 7´-H), 2.1 - 2.0 (m, 7 H, 8-H, 7-H), 1.9 -
1.5 (m, 8 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H).

13
C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 159.5 ppm [u] (C-11), 152.0 [u] (C-9), 128.9 [d]
(C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.2 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 76.9 [u] (C-1), 61.6 [u]
(C-7), 55.2 [d] (C-15), 47.7 [d] (C-8), 44.8 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.9
[u] (C-4), 22.3 [u] (C-5).

13
Die Zuordnung der C-NMR-Signale war durch einen Vergleich mit Literaturdaten
eindeutig möglich.245
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 179

3.3.2.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-


cyclohexyl)-phenol (rac-8)91

Zu 5.2 g (19.8 mmol) rac-7, gelöst in 9 ml abs. Toluol, wurden bei Raumtemperatur
40 ml 20 %ige Diisobutylaluminiumhydrid-Lösung (39.6 mmol) in abs. Toluol
zugetropft, wobei es zu einer leicht exothermen Reaktion und einer Gasentwicklung
kam. Anschließend wurde für 15 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlung auf
Raumtemperatur wurden unter Eiskühlung 11.3 ml Ethanol so zugetropft, daß eine
Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Danach wurde 15 Min.
nachgerührt. Ebenfalls unter Eiskühlung wurden daraufhin 11.3 ml eines
Ethanol/Wasser-Gemisches (1 : 1) wieder so zugetropft, daß eine Innentemperatur
von 15 ºC nicht überschritten wurde. Anschließend wurde die Reaktionslösung mit
ca. 20 ml Toluol verdünnt und danach noch eine Stunde bei Raumtemperatur
nachgerührt. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert und mit fünf Volumenteilen
Essigsäureethylester bei 60°ºC für 30 Min. nachextrahiert. Nach Filtration wurden die
vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet und am
Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 4.592 g
(18.4 mmol, 93 %) eines farblosen Öls erhalten, welches farblose Kristalle mit einem
Schmelzpunkt von 139 ºC bildete.

OH
10
5 6 1 9 11
OH
3 7
4 2 14
N 12
13
8

rac-8: MW = 249.4 g⋅mol-1


H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.5 ppm (s, 1 H, 10-H), 7.2 (dd, 3J = 8 Hz, 3J = 8 Hz,
1

1 H, 13-H), 6.8 (m, 2 H, 12-H, 14-H), 2.4 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 14 Hz, 1 H, 7´-H), 2.2 -
1.4 (m, 15 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H).

13
C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 157.0 ppm [u] (C-11), 151.0 [u] (C-9), 129.4 [d]
(C-13), 116.0 [d] (C-14), 113.3 [d] (C-12), 113.0 [d] (C-10), 78.3 [u] (C-1), 61.7 [u]
(C-7), 47.6 [d] (C-8), 44.4 [u] (C-2), 41.0 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.7 [u] (C-4), 22.2
[u] (C-5).
180 EXPERIMENTELLER TEIL

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 249 (M+, 18), 121 (3), 58 (100), 45 (6).

MS (CI, Isobutan, 100 eV) m/z (%):306 ([M + C4H9]+, 4), 250 ([M + H]+, 100), 249 (M+,
10).

IR (KBr): ∼
ν = 3201 (s), 2985 (s), 2863 (s), 2834 (s), 2789 (s), 2425 (w), 1280 (s),
1252 (m), 1215 (s), 1166 (m), 1118 (m), 1098 (m), 1079 (m), 1033 (w), 10006 (w),
988 (s), 963 (m), 905 (w), 865 (m), 846 (m), 763 (m), 707 (m) cm-1.

C15H23NO2 (249.2 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 72.25 71.98
H 9.30 9.10
N 5.62 5.56

3.3.2.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-


dimethyl-propyl)-phenol (rac-11)

Die Base rac-11 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden

5.0 g (19.3 mmol) rac-11⋅HCl in 19 ml dest. Wasser und 2 ml Dichlormethan


suspendiert und mit 10 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung
wurden 4.188 g (18.8 mmol, 97 %) rac-11 als farbloser Sirup erhalten, welcher
farblose, weiße Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 98 ºC bildete.

OH
8
1 7 9
4 OH
3 5
2 12
N 10
11
6

rac-11: MW = 223.3 g⋅mol-1


H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 8.3 – 8.1 (br s, 1 H, 9-OH), 7.21 (s, 1 H, 8-H), 7.06 (t,
1

3
J = 8 Hz, 1 H, 11-H), 6.82 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 10-H/12-H), 6.61 (dd, 3J = 8 Hz, 4J =
2 Hz, 1 H, 10-H/12-H), 2.67 (dd, 3J = 11 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H´), 2.31 (s, 6 H, 6-H),
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 181

2.23 (dd, 3J = 3 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H), 2.06 (m, 1 H, 2-H), 1.49 (s, 3 H, 4-H), 0.65
(d, 3J = 7 Hz, 3 H, 3-H).

C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 156.5 ppm [u] (C-9), 149.4 [u] (C-7), 128.5 [d]
13

(C-11), 117.2 [d] (C-12), 113.9 [d] (C-10), 113.7 [d] (C-8), 78.4 [u] (C-1), 64.1 [u]
(C-5), 45.6 [d] (C-6), 40.1 [d] (C-2), 21.8 [d] (C-4), 14.8 [d] (C-3).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 223 (M+, 10), 181 (3), 138 (3), 121 (11), 107 (6), 95 (4), 93
(10), 91 (5), 86 (69), 77 (9), 71 (18), 65 (14), 58 (100), 45 (62).

IR (KBr): ∼
ν = 3225 (s), 2981 (s), 2955 (s), 2884 (s), 2838 (s), 2802 (s), 2653 (s),
2567 (m), 1615 (m), 1585 (s), 1507 (s), 1485 (s), 1467 (s), 1282 (s), 1255 (s), 1240
(s), 1260 (s), 1176 (m), 1162 (w), 1123 (s), 1103 (w), 1077 (w), 876 (s), 841 (s), 793
(s), 743 (m), 707 (s), 688 (w), 545 (w), 531 (w), 487 (w) cm-1.

C13H21NO2 (223.3 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 69.92 69.73
H 9.48 9.56
N 6.27 6.23

3.3.2.4 Darstellung von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-


(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12)

Die Base rac-12 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden

3.293 g (10.4 mmol) rac-12⋅HCl in 5 ml dest. Wasser und 20 ml Dichlormethan


suspendiert und mit ca. 3.0 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung
wurden 2.883 g (10.3 mmol, 99 %) rac-12 als farbloser, zäher Sirup erhalten, der
unter gelindem Erwärmen in einen Achatmörser überführt wurde und dort
anschließend erstarrte. 2.273 g (8.1 mmol, 79 %) wurden so als farblose Kristalle mit
einem Schmelzpunkt von 49 ºC gewonnen und 0.552 g (2.0 mmol, 19 %) als
farbloser Sirup zurückbehalten.
182 EXPERIMENTELLER TEIL

OH
5 10
6 1 9 11
HO O
3 7 15
4 2 14
N 12
13
8

rac-12: MW = 279.4 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 ppm (t, 1 H, 13-H), 7.10 (s, 1 H, 10-H), 7.01 (d,
1

3
J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.75 (ddd, 3J = 9 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 4.12 (m,
1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H, 15-H), 2.50 – 2.75 (br s, 1 H, 1-OH), 2.38 (dd, 2J = 14 Hz,
3
J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.25 – 1.20 (m, 14 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.6 [u] (C-11), 150.7 [u] (C-9), 129.1 [d] (C-13),
117.2 [d] (C-14), 111.6 [d] (C-12), 110.8 [d] (C-10), 78.6 [u] (C-1), 67.5 [d] (C-5), 60.7
[u] (C-7), 55.2 [d] (C-15), 50.0 [u] (C-6), 47.8 [d] (C-8), 44.3 [d] (C-2), 35.7 [u] (C-4),
26.3 [u] (C-3).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 64), 234 (5), 135 (11), 107 (4), 84 (3) 58 (100).

IR (in CHCl3): ∼
ν = 3371 (s), 3079 (s), 2945 (s), 2860 (s), 2831 (s), 2784 (s), 1600 (s),
1583 (s), 1484 (s), 1463 (s), 1432 (s), 1365 (m), 1315 (m), 1287 (s), 1255 (s), 1206
(m), 1158 (s), 1096 (s), 1074 (s), 1048 (s), 1012 (m), 979 (m), 959 (m), 861 (m), 844
(m), 829 (w), 782 (s), 756 (s), 730 (m), 704 (s), 666 (m), 569 (w) cm-1.

C16H25NO3 (279.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 68.79 68.44
H 9.02 9.38
N 5.01 4.93
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 183

3.3.2.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-


(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13)

Die Base rac-13 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden
2.422 g (7.7 mmol) rac-13⋅HCl in 10 ml dest. Wasser und 30 ml Dichlormethan
suspendiert und mit ca. 1.5 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung
wurden 2.092 g (7.5 mmol, 98 %) rac-13 als weißer Feststoff mit einem
Schmelzpunkt von 106 ºC erhalten.

OH OH
10
5 6 1 9 11
O
3 7 15
4 2 14
N 12
13
8

rac-13: MW = 279.4 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.99 ppm (s, 1 H, 1-OH), 7.26 (t, 3J = 8 Hz, 1 H,
1

13-H), 7.09 (s, 1 H, 10-H), 6.99 (s, 1 H, 14-H), 6.75 (m, 1 H, 12-H), 5.15 (s, 1 H,
5-OH), 4.06 (s, 1 H, 5-H), 3.82 (s, 3 H, 15-H), 2.47 (m, 2 H, 7-H, 3-H), 2.15 (d, 1 H,
7-H´), 2.12 (s, 6 H, 8-H), 2.05 (m, 1 H, 4-H), 1.97 (ddd, 4J = 2.75 Hz, 3J = 2.75 Hz,
2
J = 14.6 Hz, 1 H, 6-H), 1.92 (m, 1 H, 2-H), 1.75 (dd, 1 H, 2J = 14.6 Hz, 3J = 3.05 Hz,
6-H´), 1.60 – 1.65 (m, 2 H, 4-H´, 3-H´).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.6 ppm [u] (C-11), 150.2 [u] (C-9), 129.1 [d]
(C-13), 117.0 [d] (C-14), 111.5 [d] (C-12), 110.8 [d] (C-10), 79.0 [u] (C-1), 67.0 [d]
(C-5), 61.3 [u] (C-7), 55.1 [d] (C-15), 47.8 [d] (C-8), 44.9 [u] (C-6), 44.0 [d] (C-2), 33.6
[u] (C-4), 21.8 [u] (C-3).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 17), 135 (5), 58 (100), 45 (4).

IR (KBr): ∼
ν = 3375 (s), 3046 (m), 2969 (s), 2942 (s), 2874 (s), 2826 (s), 1598 (s),
1488 (s), 1461 (s), 1438 (s), 1406 (w), 1377 (w), 1326 (m), 1285 (s), 1263 (s), 1246
(s), 1206 (m), 1177 (m), 1158 (s), 1113 (m), 1083 (w), 1044 (s), 1011 (m), 986 (m),
971 (m), 956 (m), 926 (w), 883 (s), 852 (s), 835 (m) 789 (s), 706 (s), 597 (m) cm-1.
184 EXPERIMENTELLER TEIL

C16H25NO3 (279.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 68.79 68.65
H 9.02 9.25
N 5.01 4.93

3.3.2.6 Darstellung von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-1-


(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14)

Die Base rac-14 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden

1.802 g (5.7 mmol) rac-14⋅HCl in 10 ml dest. Wasser und 30 ml Dichlormethan


suspendiert und mit ca. 0.9 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung
wurden 1.578 g (5.5 mmol, 99 %) rac-14 als farbloser, zäher Sirup erhalten, der
unter gelindem Erwärmen in einen Achatmörser überführt wurde und dort
anschließend erstarrte. 1.300 g (4.7 mmol, 82 %) wurden so als farblose Kristalle mit
einem Schmelzpunkt von 44 ºC gewonnen und 0.278 g (1 mmol, 17 %) als farbloses
sirupöses Öl zurückbehalten.

OH
10
5 6 1 9 11
O
HO 3 7 15
4 2 14
N 12
13
8

rac-14: MW = 279.4 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.25 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.13 (s, 1 H,
1

10-H), 7.01 (s, 1 H, 12-H), 6.78 (ddd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 3.81
(s, 3 H, 15-H), 3.75 (m, 1 H, 4-H), 2.7 - 2.9 (br s, OH), 2.42 (dd, 2J = 14 Hz,
3
J = 4.5 Hz, 1 H, 7-H´), 2.22 – 1.60 (m, 14 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.7 ppm [u] (C-11), 151.0 [u] (C-9), 129.3 [d]
(C-13), 117.5 [d] (C-14), 111.7 [d] (C-12), 111.3 [d] (C-10), 76.2 [u] (C-1), 71.2 [d]
(C-4), 61.5 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.5 [d] (C-2), 39.7 [u] (C-6), 37.2
[u] (C-3), 31.9 [u] (C-5).
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 185

IR (KBr): ∼
ν = 3391 (s), 2945 (s), 2860 (s), 2829 (s), 2781 (s), 1604 (s), 1584 (s),
1483 (s), 1464 (s), 1431 8s), 1369 (w), 1287 (s), 1253 (s), 1167 (m), 1135 8w), 1074
(m), 1041 (s), 990 (s), 960 (m), 853 (w), 828 (w), 782 (m), 703 (m) cm-1.

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 11), 234 (2), 135 (2), 58 (100), 45 (2).

C16H25NO3 (279.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 68.79 68.82
H 9.02 8.81
N 5.01 4.99

3.3.3 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse

3.3.3.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-


1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 2.00 g (8.0 mmol) rac-8 mit einer
Mischung aus 1.52 g (9.6 mmol) Buttersäureanhydrid und 0.06 g (0.8 mmol) Pyridin
in 20 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und Säulenchromatographie
(EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf(rac-15)= 0.31; Rf (rac-8) = 0.10) wurden
2.401 g (7.5 mmol, 94 %) eines weiß-grauen kristallinen Feststoffs mit einem
Schmelzpunkt von 54 ºC erhalten.

OH 10
5 6 1 9 11 16 18
O 15
7 17
4 3 2 14
N 12
O
13
8

rac-15: MW = 319.4 g⋅mol-1


H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.3 ppm (m, 1 H, 13-H), 7.2 (s, 1 H, 10-H), 6.9 (m,
1

2 H, 12-H, 14-H), 2.5 (t, 3J = 5 Hz, 2 H, 16-H), 2.4 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H,
186 EXPERIMENTELLER TEIL

7´-H), 2.1 - 1.4 (m, 17 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H),
1.0 (t, 3J = 5 Hz, 3 H, 18-H).

C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 172.1 ppm [u] (C-15), 152.2 [u] (C-11), 150.8 [u]
13

(C-9), 128.8 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 119.0 [d] (C-12), 118.6 [d] (C-10), 76.9 [u]
(C-1), 61.5 [u] (C-7), 47.7 [d] (C-8), 44.7 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 36.2 [u] (C-16), 27.9
[u] (C-3), 26.8 [u] (C-4), 22.2 [u] (C-5), 18.4 [u] (C-17), 13.7 [d] (C-18).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 319 (M+, 9), 58 (100).

IR (KBr): ∼
ν = 3400 (w), 3091 (m), 2975 (s) 2945, 2856 (s), 2829 (s), 1755 (s), 1608
(m), 1588 (m), 1461 (m), 1445 (m), 1434 (s), 1417 (s), 1383 (m), 1156 (s), 1156 (s),
1096 (s), 808 (m), 708 (m) cm-1.

C19H29NO3 (319.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 71.44 71.03
H 9.15 9.19
N 4.38 4.35

3.3.3.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-


1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 2.490 g (10.0 mmol) rac-8 mit
einer Mischung aus 1.318 g (12.9 mmol) Essigsäureanhydrid und 0.08 g (1.0 mmol)
Pyridin in 40 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf(rac-16)= 0.26;
Rf (rac-8) = 0.10) wurden 2.881 g (9.9 mmol, 99 %) eines weißen kristallinen
Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von 84 ºC erhalten.
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 187

OH
10
5 6 1 9 11
O 15 16
7
4 3 2 14
N 12
O
13
8

rac-16: MW = 291.4 g⋅mol-1


H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 7.3 ppm (m, 3 H, 13-H, 10-H, 12-H/14-H), 6.93 (m,
1

1 H, 12-H/14-H), 5.8 – 6.4 (br s, 1 H, 1-OH), 2.38 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 14 Hz, 1 H,


7´-H), 2.29 (s, 3 H, 16-H), 2.25 – 1.25 (m, 16 H, 2-H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H).

13
C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 169.3 ppm [u] (C-15), 152.0 [u] (C-11), 150.5 [u]
(C-9), 128.7 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 118.9 [d] (C-12), 118.4 [d] (C-10), 77.3 [u]
(C-1), 61.5 [u] (C-7), 47.7 [d] (C-8), 44.7 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.8
[u] (C-4), 22.2 [u] (C-5), 21.1 [d] (C-16).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 291 (M+, 31), 121 (3), 58 (100) 45 (8).

IR (KBr): ∼
ν = 3076 (w), 3007 (w), 2981 (w), 2947 (s), 2924 (s), 2856 (m), 2828 (m),
2786 (m), 1755 (s), 1609 (w), 1588 (w), 1482 (w), 1459 (m), 1436 (m), 1377 (m),
1293 (w), 1268 (w), 1213 (s), 1154 (m), 1140 (w), 1094 (w), 1085 (w), 1022 (m), 991
(m), 965 (m), 938 (w), 889 (w), 839 (w), 806 (w), 784 (w), 710 (w) cm-1.

C17H25NO3 (291.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 70.07 69.91
H 8.65 8.13
N 4.81 4.71

3.3.3.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-


hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 1.786 g (8.0 mmol) rac-11 mit
einer Mischung aus 1.52 g (9.6 mmol) Buttersäureanhydrid und 0.06 g (0.8 mmol)
Pyridin in 20 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und
188 EXPERIMENTELLER TEIL

Säulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1, 1 % Triethylamin über Kieselgel,


Rf (rac-17)= 0.58) wurden 1.995 g (6.8 mmol, 85 %) eines farblosen Öls erhalten.

OH 8
1 7 9 14 16
4 O 13
5
3 2 12 15
N 10 O
11
6

rac-17: MW = 293.4 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 (s, 1 H, Ar), 7.22 (s, 1 H, Ar), 7.15 (s, 1 H, Ar),
1

6.87 (m, 1 H, 11-H), 2.57 (dd, 3J = 11 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H´), 2.44 (t, 3J = 7 Hz,
2 H, 14-H), 2.22 (s, 6 H, 6-H), 2.14 (dd, 3J = 3 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H), 1.94 (m, 1 H,
2-H), 1.69 (m, 2 H, 15-H), 1.40 (s, 3 H, 4-H), 0.96 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 16-H), 0.70 (d, 3J
= 7 Hz, 3 H, 3-H).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 170.8 ppm [u] (C-13), 149.5 [u] (C-9), 149.3 [u] (C-
7), 127.3 [d] (C-11), 122.0 [d] (C-12), 118.3 [d] (C-10), 118.1 [d] (C-8), 76.2 [u] (C-1),
63.0 [u] (C-5), 44.7 [d] (C-6), 39.3 [d] (C-2), 35.2 [u] (C-14), 20.9 [d] (C-4), 17.4 [u]
(C-15), 14.8 [d] (C-3), 12.6 [d] (C-16).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 293 (M+, 4), 86 (7), 84 (12), 71 (4), 58 (100), 45 (7).

IR (kapillar): ∼
ν = 2971 (s), 2877 (m), 2827 (m), 2784 (m), 1759 (s), 1608 (m), 1586
(m), 1466 (s), 1370 (m), 1236 (m), 1153 (s), 1098 (w), 1080 (w), 1029 (m), 947 (m),
838 (w), 704 (m) cm-1.

C17H27NO3 (293.4 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 69.59 69.52
H 9.28 8.93
N 4.77 4.67
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 189

3.3.3.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino-


methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 3.265 g
(10.3 mmol) rac-12⋅HCl, gelöst in 33 ml abs. THF, mit 2.950 g (26.3 mmol) Kalium-
tert-butylat über einen Zeitraum von 10 Min. mit 1.66 ml (1.703 g, 16.0 mmol)
Buttersäurechlorid, gelöst in 3 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1:1 über Kieselgel,
Rf (rac-18) = 0.41; Rf (rac-12) = 0.18) wurden 2.915 g (8.3 mmol, 81 %) eines klaren
sirupösen Öls erhalten.

O OH
18 10
5 6 1 9 11
19 16 O O
17 3 7 15
4 2 14
N 12
13
8

rac-18: MW = 349.5 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.26 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.14 (s, 1 H,
1

10-H), 7.03 (s, 1 H, 12-H), 6.75 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 5.21 (m, 1 H,
5-H), 3.82 (s, 3 H, 15-H), 2.42 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.30 – 1.40 (m,
18 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 0.91 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.8 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.6 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 78.4 [u]
(C-1), 71.1 [d] (C-5), 60.5 [u] (C-7), 55.1 [d] (C-15), 47.7 [d] (C-8), 46.0 [u] (C-6), 44.1
[d] (C-2), 36.4 [u] (C-17), 32.2 [u] (C-4), 25.9 [u] (C-3), 18.5 [u] (C-18), 13.6 [d]
(C-19).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 350 ([M+H]+, 9), 349 (M+, 38), 262 (7), 135 (8), 58 (100), 45
(3).

IR (kapillar): ∼
ν = 2947 (s), 2864 (m), 2831 (s), 2784 (m), 1730 (s), 1600 (m), 1583
(m), 1484 (s), 1462 (s), 1432 (m), 1383 (m), 1358 (m), 1306 (m), 1288 (s), 1256 (s),
190 EXPERIMENTELLER TEIL

1186 (s), 1093 (m), 1048 (s), 1018 (m), 978 (m), 963 (m), 864 (w), 847 (w), 784 (m),
756 (m) 704 (w) cm-1.

C20H31NO4 (349.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 68.74 68.44
H 8.94 8.77
N 4.01 4.30

3.3.3.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino-


methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei –10 ºC, dazu wurden 3.50 g (12.5 mmol)
rac-13, gelöst in 102 ml abs. Diethylether und auf –10 ºC gekühlt, mit 1.408 g
(12.5 mmol) Kalium-tert-butylat und 1.203 g (11.3 mmol) Buttersäurechlorid, gelöst in
8 ml abs. Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 4.235 g eines gelben,
öligen Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie (Diisopropyl-
ether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.29) wurden 1.904 g (5.4 mmol, 44 %)
rac-19 als sirupöses Öl und 1.787 g einer Mischfraktion aus rac-13 (Rf = 0.16) und
rac-19 erhalten. Nach erneuter Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH =
1 : 1 über Kieselgel) wurden weitere 0.593 g (1.7 mmol, 14 %) rac-19 und 0.582 g
Mischfraktion erhalten.

O
18

19 16 O OH
17 10
5 6 1 9 11
O
3 7 15
4 2 14
N 12
13
8

rac-19: MW = 349.5 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 ppm (t,
1 3
J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.12 (s,
1 H,.10-H), 7.02 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 6.75 (dd, 3J = 8 Hz, 3J = 3 Hz, 1 H, 12-H),
5.17 (m, 1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H, 15-H), 2.29 – 3.36 (m, 2 H, 17-H), 2.11 (s, 6 H, 8-H),
2.08 – 1.63 (m, 11 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 18-H), 0.96 (t, 3J = 7.5 Hz, 3 H, 19-H).
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 191

C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.7 ppm [u] (C-16), 159.7 [u] (C-11), 149.0 [u]
13

(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.7 [d] (C-14), 112.0 [d] (C-12), 111.6 [d] (C-10), 76.1 [u]
(C-1), 70.5 [d] (C-5), 61.1 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 46.6 [d] (C-8), 43.4 [u] (C-6), 43.0
[d] (C-2), 37.0 [u] (C-17), 29.6 [u] (C-4), 22.4 [u] (C-3), 18.9 [u] (C-18), 14.0 [d]
(C-19).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 16), 135 (6), 58 (100).

IR (kapillar): ∼
ν = 3584 (m), 3079 (s), 2944 (m), 2873 (m), 2766 (m), 1733 (s), 1601
(m), 1584 (m), 1485 (m), 1461 (s), 1432 (m), 1381 (w), 1287 (s) 1255 (s), 1201 (s),
1188 (s), 1166 (s), 1104 (m), 1088 (m), 1049 (m), 985 (w), 960 (w) 860 (w), 825 (w),
782 (w), 734 (w), 702 (w) cm-1.

C20H31NO4 (349.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 68.74 68.35
H 8.94 9.08
N 4.01 4.30

3.3.3.6 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-3-(6-Dimethylaminomethyl-1,3-


dihydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-20)91

Zu 1.790 g (6.4 mmol) rac-13, gelöst in 8 ml abs. Toluol, wurden bei


Raumtemperatur 42 ml Diisobutylaluminiumhydrid-Lösung (1 M, 42.0 mmol) in abs.
Toluol zugetropft, wobei es zu einer leicht exothermen Reaktion und einer starken
Gasentwicklung kam. Anschließend wurde die Reaktionslösung für 1 Stunde bei
Raumtemperatur und danach für weitere 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach
Abkühlung auf Raumtemperatur wurden unter Eiskühlung 5.0 ml Ethanol so
zugetropft, daß eine Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Danach
wurde 15 Min. nachgerührt. Ebenfalls unter Eiskühlung wurden anschließend 10.0 ml
eines Ethanol/Wasser-Gemisches (1 : 1) wieder so zugetropft, daß eine
Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Nach Filtration wurde die
192 EXPERIMENTELLER TEIL

organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer unter


vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 1.653 g (5.6 mmol, 88 %) eines farblosen
Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von 74 ºC erhalten, welcher noch Spuren rac-13
enthielt. Eine chromatographische Abtrennung dieser Verunreinigung war nicht
möglich, daher wurde im folgenden die in Spuren verunreinigte Substanz eingesetzt.

OH OH
10
5 6 1 9 11
OH
3 7
4 2 14
N 12
13
8

rac-20: MW = 265.4 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (mt, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.1 – 6.8 (br s,
1

1 H, 11-OH), 6.98 (s, 1 H, 10-H), 6.80 (s, 1 H, 14-H), 6.64 (dd, 1 H, 3J = 8 Hz,
4
J = 2 Hz, 12-H), 6.0 – 6.1 (br s, 2 H, 1-OH, 5-OH), 4.05 (m, 1 H, 5-H), 2.50 – 1.45
(m, 15 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 157.0 ppm [u] (C-11), 150.0 [u] (C-9), 129.6 [d]
(C-13), 116.3 [d] (C-14), 113.9 [d] (C-10), 112.5 [d] (C-12), 79.4 [u] (C-1), 67.8 [d]
(C-5), 61.6 [u] (C-7), 48.1 [d] (C-8), 45.1 [u] (C-6), 44.1 [d] (C-2), 33.6 [u] (C-4), 22.3
[u] (C-3).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 16), 135 (6), 58 (100).

IR (kapillar): ∼
ν = 3584 (m), 3079 (s), 2944 (m), 2873 (m), 2766 (m), 1733 (s), 1601
(m), 1584 (m), 1485 (m), 1461 (s), 1432 (m), 1381 (w), 1287 (s) 1255 (s), 1201 (s),
1188 (s), 1166 (s), 1104 (m), 1088 (m), 1049 (m), 985 (w), 960 (w) 860 (w), 825 (w),
782 (w), 734 (w), 702 (w) cm-1.
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 193

3.3.3.7 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino-


methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21)95

1.190 g (4.5 mmol) rac-20 wurde zu einer Lösung aus 50 ml dest. Wasser und 6.42 g
NaHCO3 (76.4 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Nach einer Stunde hatte sich
eine klare Lösung gebildet, zu der innerhalb von 15 Minuten tropfenweise 6.65 ml
(6.40 g, 40.5 mmol) Buttersäureanhydrid unter starker Gasentwicklung gegeben
wurden. Anschließend wurde noch 15 Min. bei Raumtemperatur zur
Vervollständigung der Reaktion gerührt und danach dreimal mit jeweils 15 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4
getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 1.446 g braunes,
sirupöses Rohprodukt erhalten. Nach Säulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1
über Kieselgel, Rf = 0.33; Rf (rac-13) = 0.26) konnten 1.417 g (4.2 mmol, 93 %)
rac-21 als schwach hellbrauner Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 79 ºC erhalten
werden.

OH OH
10
5 6 1 9 11 16 18
O 15
3 7 17
4 2 14
N 12
O
13
8

rac-21: MW = 335.4 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.27 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.20 ( br s, 1 H, -
1

H), 7.09 (m, 1 H, -H), 6.88 (dd, 3J = 9 Hz, 4J = 2 Hz, 1 H, -H), 4.01 (mt, 3J = 3 Hz,
1 H, 5-H), 2.5 – 1.5 (m, 19 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 16-H, 17-H), 0.97 (t,
3
J = 7 Hz, 3 H, 18-H).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.2 ppm [u] (C-15), 151.0 [u] (C-11), 150.3 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 119.7 [d] (C-12), 118.7 [d] (C-10), 78.7 [u]
(C-1), 67.2 [d] (C-5), 61.4 [u] (C-7), 47.5 [d] (C-8), 46.1 [u] (C-6), 44.0 [d] (C-2), 36.5
[u] (C-16), 33.6 [u] (C-4), 22.1 [u] (C-3), 18.8 [u] (C-17), 14.0 [d] (C-18).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 265 (M+, 14), 121 (3), 58 (100) 45 (6).
194 EXPERIMENTELLER TEIL

IR (KBr): ∼
ν = 3371 (m), 3169 (s9, 2946 (s), 2830 (s), 2786 (m), 1615 (m) 1585 (m),
1481 (s), 1424 (s), 1369 (w), 1352 (m), 1305 (m), 1293 (s), 1278 (s) 1251 (s), 1221
(m), 1165 (m), 1108 (s), 1075 (s), 1033 (m), 1007 (m), 984 (s), 952 (s), 904 (m), 874
(m), 863 (m), 841 (s), 782 (s), 734 (m), 703 (s), 579 (w), 469 (w) cm-1.

3.3.3.8 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylamino-


methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 2.761 g
(8.7 mmol) rac-14⋅HCl, gelöst in 28 ml abs. THF, mit 1.500 g (13.4 mmol) Kalium-
tert-butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 1.410 ml (1.447 g, 13.6 mmol)
Buttersäurechlorid, gelöst in 2 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.39;
Rf (rac-14) = 0.14) wurden 2.396 g (6.9 mmol, 79 %) eines klaren sirupösen Öls
erhalten.

OH
10
5 6 1 9 11
17 O
19 16 O 3 7 15
4 2 14
18
N 12
13
O 8

rac-22: MW = 349.5 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H,
1

10-H), 6.93 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (ddd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 4.78
(m, 1 H, 4-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.35 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.25 –
1.50 (m, 18 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 0.89 (t, 3J = 7 Hz, 3 H,
19-H).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.5 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.8 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.1 [d] (C-10), 76.1 [u]
(C-1), 73.3 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.4 [d] (C-2), 39.4
[u] (C-6), 36.9 [u] (C-17), 33.3 [u] (C-3), 27.9 [u] (C-5), 18.9 [u] (C-18), 14.0 [d]
(C-19).
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 195

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 8), 135 (2), 58 (100), 45 (3).

IR (kapillar): ∼
ν = 3077 (w), 2960 (s), 2873 (m), 2831 (m), 2783 (m) 1728 (s), 1601
(m), 1583 (m), 1483 (s), 1462 (s), 1432 8s), 1384 (m), 1356 (w), 1287 (s), 1254 (s),
1184 (s), 1093 (m), 1047 (s), 1013 (s), 997 (s), 964 (w), 784 (m), 703 (m) cm-1.

C20H31NO4 (349.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 68.74 68.68
H 8.94 9.01
N 4.01 4.43

3.3.3.9 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylamino-


methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei 0 ºC, dazu wurden 1.700 g (5.4 mmol)
rac-14⋅HCl, gelöst in 20 ml abs. Diethylether auf 0 ºC gekühlt, mit 1.510 g
(13.45 mmol) Kalium-tert-butylat und mit 1.090 g (8.1 mmol) Hexansäurechlorid,
gelöst in 2.6 ml abs. Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 2.370 g eines
gelben, zähflüssigen Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie
(Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.57; Rf (rac-14) = 0.19) und
anschließender präparativer HPLC (EE : MeOH = 1 : 1 über RP-Säule 18) konnten
1.562 g (4.1 mmol, 77 %) rac-23 als trübes, sirupöses Öl erhalten werden, welches
nach NMR- und GC-Analytik noch Spuren des Diesters der Hexansäure und rac-14
enthielt.

OH
10
5 6 1 9 11
21 19 17 O
16 O 3 7 15
4 2 14
20 18
N 12
13
O 8

rac-23: MW = 377.5 g⋅mol-1


196 EXPERIMENTELLER TEIL

H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.19 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H,
1

10-H), 6.93 (s, 1 H, 14-H), 6.70 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 2.5 Hz, 1 H, 12-H), 6.08 (br s,
1 H, 1-OH), 4.78 (m, 1 H, 4-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.4 – 1.5 (m, 19 H, 2-H, 3-H, 5-H,
6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 1.25 (m, 4 H, 19-H, 20-H), 0.83 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 21-H).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.7 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.6 [u]
(C-9), 129.4 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.2 [d] (C-10), 76.0 [u]
(C-1), 73.2 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 47.9 [d] (C-8), 43.2 [d] (C-2), 39.4
[u] (C-6), 34.9 [u] (C-17) 33.3 [u] (C-3), 31.6 [u] (C-19), 27.9 [u] (C-5), 25.1 [u] (C-18),
22.7 [u] (C-20), 14.3 [d] (C-21).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 377 (M+, 10), 135 (3), 58 (100).

MS (CI, Isobutan, 100 eV) m/z (%): 434 ([M + C4H9]+, 3), 378 ([M + H]+, 100), 262 (4).

IR (kapillar): ∼
ν = 2955 (s), 2861 (s), 2832 (m), 2783 (m), 1729 (s), 1601 (m),1583
(m), 1484 (s), 1464 (s), 1432 (s), 1380 (m), 1355 (m), 1317 (m), 1288 (s), 1251 (s),
1176 (s), 1137 (m), 1097 (m), 1049 (m), 1034 (s), 1014 (s), 783 (m), 736 (w), 703 (m)
cm-1.

C22H35NO4 (377.5 g⋅mol-1): berechnet gefunden

C 69.99 70.15
H 9.34 9.49
N 3.71 3.61
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 197

3.3.3.10 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylamino-


methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei 0 ºC, dazu wurden 1.700 g (5.4 mmol)
rac-14⋅HCl, gelöst in 20 ml Diethylether auf 0 ºC gekühlt, mit 1.510 g (13.45 mmol)
Kalium-tert-butylat und mit 0.630 g (8.0 mmol) Essigsäurechlorid, gelöst in 2.6 ml
Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 1.816 g eines gelben, öligen
Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH =
1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.46; Rf (rac-14) = 0.19) wurden 1.292 g einer gelblich
öligen Mischung aus rac-24 und eines Diesters (Rf = 0.51) aus rac-14 und
Essigsäure (Verhältnis nach den Signalen der Protonen der Methoxygruppe (15-H)
im 1H-NMR: 4 : 1) erhalten. Ein Versuch zur weiteren Aufreinigung durch präparative
HPLC (Acetonitril : Wasser = 3 : 1 über RP-Select B-LiChrosor b-Säule) führte zur
Zersetzung von rac-24. Eine weitere Aufreinigung von rac-24 war somit nicht
möglich. Im folgenden wurde daher die nach Säulenchromatographie erhaltene
Mischung eingesetzt.
OH
10
5 6 1 9 11
O
17 16 O 3 7 15
4 2 14
N 12
13
O 8

rac-24: MW = 263.4 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.18 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.10 (s, 1 H,
1

10-H), 6.90 (s, 1 H, 12-H), 6.70 (md, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 4.77 (m, 1 H, 4-H), 3.75
(s, 3 H, 15-H), 2.34 (md, 2J = 14 Hz, 1 H, 7-H´), 2.30 – 1.45 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 5-H,
6-H, 7-H, 8-H, 17-H).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 170.9 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.8 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.8 [d] (C-12), 111.1 [d] (C-10), 76.0 [u]
(C-1), 73.7 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.2 [d] (C-8), 43.3 [d] (C-2), 39.4
[u] (C-6), 33.3 [u] (C-3), 27.9 [u] (C-5), 21.8 [d] (C-17).
198 EXPERIMENTELLER TEIL

3.3.3.11 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-


dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25)

Zu einer Mischung von 1.750 g (6.3 mmol) rac-13 und 0.250 g (0.5 mmol) Pyridin in
5 ml Dichlormethan wurden unter Rühren 1.090 g (6.9 mmol) Buttersäureanhydrid
gegeben. In einer schwach exothermen Reaktion verfärbte sich die Reaktionslösung
hierbei schwach gelb. Die Reaktionslösung wurde für 26 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt, bis durch DC-Kontrolle kein Edukt mehr detektiert werden
konnte. Anschließend wurde die schwach gelbe Reaktionslösung mit einem
Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 20 Stunden kräftig gerührt. Nach
Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml Dichlormethan extrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen wurden mit dest. Wasser gewaschen und über
NaSO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurde ein gelbliches,
Sirup ähnliches Öl erhalten, das im Hochvakuum von Pyridinresten befreit wurde.
Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel,
Rf = 0.48) wurden 1.916 g (4.6 mmol, 67 %) rac-25 erhalten.

O O
18 22
21
16 O O 20 23
19 17
1 10
5 6 9 11
O
3 7 15
4 2 14
N 12
13
8

rac-25: MW = 419.6 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.24 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 6.76 (m, 3 H,
1

10-H, 12-H, 14-H), 5.18 (m, 1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H), 15-H), 3.09 (dd, 2J = 15 Hz,
4
J = 3 Hz, 1 H, 6-H´), 2.46 – 2.30 (m, 4 H, 6-H, 7-H´,17-H/21-H), 2.22 (t, 3J = 7 Hz,
2 H, 17-H/21-H), 2.09 (s, 6 H, 8-H), 1.95 – 1.60 (m, H, 2-H, 3-H, 4-H, 7-H, 18-H,
22-H), 1.01 (t , 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H/23-H), 0.95 (t , 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H/23-H).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.6 ppm [u] (C-16), 171.9 [u] (C-20), 159.1 [u]
(C-11), 143.0 [u] (C-9), 128.8 [d] (C-13), 117.9 [d] (C-14), 112.4 [d] (C-12), 111.4 [d]
(C-10), 84.0 [u] (C-1), 69.0 [d] (C-5), 59.0 [u] (C-7), 55.2 [d] (C-15), 45.8 [d] (C-8),
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 199

44.8 [d] (C-2), 37.5 [u] (C-17), 36.4 [u] (C-21), 28.8 [u] (C-4), 18.5 [u] (C-18), 18.2 [u]
(C-22), 13.9 [d] (C-19), 13.7 [d] (C-23).

MS (CI, Isobutan, DEP, 100 eV) m/z (%): 477 ([M + C4H9]+, 2), 420 ([M + H]+, 100),
375 (11), 355 (13), 332 (63), 287 (73), 275 (15), 199 (44), 187 (23), 113 (13), 97 (10),
85 (24), 83 (21), 81 (30), 79 (14), 71 (31).

IR (kapillar): ∼
ν = 2963 (s), 2943 (s), 2874 (m), 2819 (m), 2765 (m), 1733 (s), 1605
(m), 1585 (m), 1490 (m), 1461 (s), 1433 (s), 1382 (m), 1362 (m), 1292 (s), 1256 (s),
1191 (s), 1154 (s), 1097 (s), 1049 (m). 1029 (m), 991 (m), 973 (m),849 (w), 803 (w),
778 (w), 700 (w) cm-1.

Die Synthese von rac-25 erfolgte ebenfalls gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur in
THF mit einer Ausbeute von 96 %.

3.3.4 Darstellung der racemischen Ester zur Bestimmung des Umsatzes in


der enzymatischen Transacylierung

3.3.4.1 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Essigsäure-4-dimethylamino-


methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-47)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g
(0.25 mmol) rac-12, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-
butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.031 g (0.39 mmol)
Essigsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.30;
Rf (rac-12) = 0.18) wurden 0.054 g (0.17 mmol, 68 %) eines klaren, gelblichen Öls
erhalten.
200 EXPERIMENTELLER TEIL

O OH
5 10
6 1 9 11
16 O O
17 7 15
3 14
4 2
N 12
13
8

rac-47: MW = 321.4 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.06 (s, 1 H,
1

10-H), 6.95 (d, 3J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.69 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 5.12
(m, 1 H, 5-H), 3.73 (s, 3 H, 15-H), 2.32 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.26 –
1.10 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 169.0 ppm [u] (C-16), 158.4 [u] (C-11), 149.1 [u]
(C-9), 127.9 [d] (C-13), 115.9 [d] (C-14), 110.3 [d] (C-12), 109.6 [d] (C-10), 77.0 [u]
(C-1), 69.9 [d] (C-5), 59.4 [u] (C-7), 54.1 [d] (C-15), 46.7 [d] (C-8), 44.9 [u] (C-6), 43.1
[d] (C-2), 31.2 [u] (C-4), 24.8 [u] (C-3), 20.3 [d] (C-17).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 321 (M+, 8), 135 (4), 86 (11), 84 (18), 58 (100), 47 (4).

IR (kapillar): ∼
ν = 2946 (m), 2830 (w),1730 (s),1601 (w), 1584 (w), 1483 (w), 1462
(m), 1431 (w), 1287 (m), 1250 (s), 1157 (w), 1034 (m), 785 (w), 733 (m) cm-1.

3.3.4.2 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylamino-


methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-46)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g
(0.25 mmol) rac-12, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-
butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.036 g (0.39 mmol)
Propionsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.36;
Rf (rac-12) = 0.18) wurden 0.060 g (0.18 mmol, 71 %) eines klaren, schwach
gelblichen sirupösen Öls erhalten.
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 201

O OH
18 5 10
6 1 9 11
16 O O
17 3 7 15
4 2 14
N 12
13
8

rac-46: MW = 335.4 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.07 (s, 1 H,
1

10-H), 6.96 (d, 3J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.69 (md, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 5.13 (m, 1 H,
5-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.33 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.26 – 1.30 (m,
16 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H), 1.01 (t, 3J = 8 Hz, 3 H, 18-H).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.7 ppm [u] (C-16), 159.4 [u] (C-11), 150.1 [u]
(C-9), 129.0 [d] (C-13), 117.0 [d] (C-14), 111.5 [d] (C-12), 110.7 [d] (C-10), 78.0 [u]
(C-1), 70.6 [d] (C-5), 60.9 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.2 [d] (C-8), 46.3 [u] (C-6), 44.5
[d] (C-2), 32.6 [u] (C-4), 38.3 [u] (C-17), 26.3 [u] (C-3), 9.6 [d] (C-18).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 335 (M+, 12), 279 (3), 135 (5), 84 (11), 58 (100).

IR (kapillar): ∼
ν = 2944 (s), 2862 (m), 2831 (m), 2783 (m), 1732 (s), 1601 (m), 1584
(m), 1483 (m), 1462 (s), 1429 (m), 1351 (w), 1286 (m), 1255 (s), 1193 (s), 1158 (m),
1083 (m), 1048 (m), 1023 (m), 785 (m), 732 (w), 702 (w) cm-1.

3.3.4.3 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylamino-


methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24)

Die Synthese erfolgte, indem 0.070 g (0.25 mmol) rac-14, gelöst in 1 ml


Dichlormethan, mit 2.3 ml (25 mmol) Vinylacetat und 500 mg Novozym 435 versetzt
und bei Raumtemperatur gerührt wurden. Die Rührgeschwindigkeit wurde dabei nicht
zu hoch gewählt, um den immobilisierten Katalysator nicht zu beeinträchtigen. Nach
96 h konnte kein Edukt 14 mehr detektiert werden. Die Reaktionslösung wurde vom
Katalysator abfiltriert, mit 2 ml Dichlormethan versetzt und für weitere 15 h mit 5 ml
ges. NaHCO3-Lösung gerührt, um während der Reaktion entstandene Essigsäure zu
neutralisieren. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit je 5 ml Dichlormethan
202 EXPERIMENTELLER TEIL

nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4 getrocknet.


Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.080 g (0.25 mmol, 99 %)
gelbliches Öl erhalten.

OH
10
5 6 1 9 11
O
17 16 O 3 7 15
4 2 14
N 12
O 8
13

rac-24: MW = 321.4 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.16 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.03 (s, 1 H,
1

10-H), 6.91 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 4.78 (m, 1 H, 4-
H), 3.71 (s, 3 H, 15-H), 2.33 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.20 – 1.55 (m,
17 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 169.4 ppm [u] (C-16), 158.3 [u] (C-11), 149.3 [u]
(C-9), 127.9 [d] (C-13), 116.0 [d] (C-14), 110.5 [d] (C-12), 109.7 [d] (C-10), 74.6 [u]
(C-1), 72.2 [d] (C-4), 59.9 [u] (C-7), 54.0 [d] (C-15), 46.7 [d] (C-8), 41.9 [d] (C-2), 38.0
[u] (C-6), 31.9 [u] (C-3), 26.5 [u] (C-5), 20.4 [d] (C-17).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 322 (3), 321 (M+, 11), 135 (3), 118 (3), 86 (57), 84 (91), 58
(100), 49 (16), 47 (16).

IR (kapillar): ∼
ν = 2951 (s), 2862 (w), 2831 (m), 2781 (w), 1730 (s), 1602 (s), 1584
(s), 1483 (s), 1463 (s), 1431 (m), 1366 (m), 1317 (w), 1286 (s), 1252 (s), 1171 (m),
1094 (w), 1034 (s), 998 (m), 962 (w), 913 (m), 786 (m), 733 (s), 704 (m) cm-1.
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 203

3.3.4.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylamino-


methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-45)

Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g
(0.25 mmol) rac-14, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-
butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.036 g (0.39 mmol)
Propionsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.33;
Rf (rac-14) = 0.14) wurden 0.055 g (0.16 mmol, 66 %) eines klaren, schwach
gelblichen sirupösen Öls erhalten.

OH
10
5 6 1 9 11
17 O
16 O 3 7 15
4 2 14
18 N 12
O 8
13

rac-45: MW = 335.4 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.17 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H,
1

10-H), 6.93 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 4.77 (m, 1 H, 4-
H), 3.72 (s, 3 H, 15-H), 2.50 – 1.55 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 7-H´, 8-H, 17-
H), 1.07 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 18-H).

13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 174.2 ppm [u] (C-16), 159.7 [u] (C-11), 150.7 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.8 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 76.0 [u]
(C-1), 73.4 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.4 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.3 [d] (C-2), 39.4
[u] (C-6), 33.2 [u] (C-3), 28.2 [u] (C-17), 27.8 [u] (C-5), 9.5 [d] (C-18).

MS (EI, 70 eV) m/z (%): 335 (M+, 10), 135 (3), 86 (37), 84 (57), 58 (100), 49 (7).

IR (kapillar): ∼
ν = 2947 (s), 2861 (w), 2831 (m), 2782 (w), 1728 (s), 1602 (s), 1584
(s), 1483 (s), 1728 (s), 1602 (s), 1584 (s), 1483 (s), 1463 (s), 1430 (s), 1352 (w),
1287 (m), 1255 (m), 1193 (s), 1084 (s), 1047 (s), 1020 (s), 997 (m), 962 (w), 911 (w),
785 (m), 734 (s), 704 (m) cm-1.
204 EXPERIMENTELLER TEIL

3.3.5 Versuche zur Darstellung von (±)-(1RS,5RS,8RS)-8-


Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-2,4-dioxa-bicyclo-[3.3.1]-
nonan-3-on (rac-48)

3.3.5.1 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit Bis-
(trichlormethyl)-carbonat222,246

1.150 g (3.6 mmol) rac-13⋅HCl und 2.888 g (36.5 mmol) Pyridin wurden in 20 ml abs.
Dichlormethan gelöst und auf −76 ºC gekühlt. Zu der klaren Lösung wurde über
einen Zeitraum von 10 Min. bei −76 ºC eine Lösung von 0.520 g (1.75 mmol) Bis-
(trichlormethyl)-carbonatf (Triphosgen) in 8 ml abs. Dichlormethan mittels Spritzen-
technik gegeben. Anschließend wurde noch 1.5 Stunden bei −76 ºC gerührt, dabei
verfärbte sich die Lösung schwach gelb und es bildete sich ein weißer Feststoff.
Nachdem die Lösung über einen Zeitraum von 1 Stunde auf Raumtemperatur
erwärmt wurde, wurde ein Überschuß an ges. NaHCO3-Lösung zugegeben und für
weitere 10 Stunden gerührt. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4
getrocknet, und das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt. Es
konnten 1.284 g einer Rohmischung erhalten werden, welche noch Pyridin enthielt.
Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel,
Rohmischung: Rf (Pyridin) = 0.68, Rf (1) = 0.34, Rf (2) = 0.28, Rf (rac-13) = 0.10)
konnte allerdings nur eine Mischung von nicht näher charakterisierten
Zersetzungsprodukten und 0.334 g rac-13 erhalten werden.

Ein analoger Versuch mit rac-13 als Edukt führte zum gleichen Ergebnis.

f
S. B. Damle, Safe handling of diphosgene and triphosgene, Chem. & Eng. News 1993, 71, 4.
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 205

3.3.5.2 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit


1,1´-Carbonyldiimidazol223,247

500 mg (1.8 mmol) rac-13 wurden in 15 ml abs. Toluol gelöst und mit 1.162 g
(7.2 mmol) 1,1´-Carbonyldiimidazol versetzt. Die Reaktionslösung wurde
anschließend für 5 Stunden unter Rückfluß erhitzt und danach für weitere
15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Reaktionslösung
mit einem Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 10 Stunden kräftig gerührt.
Nach Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml Dichlormethan extrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4 getrocknet und das
Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt. Nach
Säulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1 über Kieselgel) konnten drei nicht näher
charakterisierte Fraktionen (66 mg (Rf = 0.75); 15 mg (Rf = 0.75 und Rf = 0.47);
0.47 mg (Rf = 0.47)) erhalten werden und 138 mg einer Hauptfraktion (Rf = 0.30). Die
spektroskopischen Daten dieser Fraktion lassen folgende Struktur vermuten:

O
17

N N 16 O
1 10
5 6 9 11
19 18
O
4 3 15
2 12
14
13

49: MW = 298.3 g⋅mol-1


H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 8.05 ppm (s, 1 H, 17-H), 7.33 (t, J = 2 Hz, 1 H,
1

Ar/Im), 7.15 (t, J = 8 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.97 (t, J = 1 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.87 (dd, J = 8 Hz,
J = 1 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.82 (t, J = 2 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.71 (dd, J = 8 Hz J = 3 Hz, 1 H,
Ar/Im), 6.08 (m, 1 H, 2-H), 5.32 (m, 1 H, 5-H), 3.71 (s, 3 H, 15-H), 2.82 (dm,
J = 17 Hz, 1 H, Cy), 2.58 (dm, J = 17 Hz, 1 H, Cy), 2.33 (m, 2 H, Cy), 1.96 (m, 2 H,
Cy).

(Ar: Proton am Arylring, Im: Proton am Imidazolring, Cy: Proton am Cyclohexylring)


206 EXPERIMENTELLER TEIL

C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.8 ppm [u] (C-11), 148.4 [u] (C-9), 142.5 [u]
13

(C-1), 137.3 [n. b.] (C-2), 133.1 [u] (C-16), 130.8 [d] (C-17), 129.6 [d] (C-13), 124.1
[d] (C-17/19), 117.8 [d] (C-14), 117.3 [d] (C-17/19), 112.7 [d] (C-12), 111.3 [d] (C-10),
75.2 [d] (C-5), 55.5 [d] (C-15), 33.0 [u] (C-6), 26.9 [u] (C-4), 23.5 [u] (C-3).

Vor Säulenchromatographie: MS (EI, 70 eV) m/z (%): 305 (M+[rac-48], 22), 298
(M+[rac-49], 20), 186 (83), 121 (17), 58 (100).

Ein analoger Versuch mit rac-13⋅HCl als Edukt führte zum gleichen Ergebnis, hier
konnte allerdings neben rac-49 auch rac-13 in geringen Mengen isoliert werden.
ÜBERPRÜFUNG DER HYDROLYSESTABILITÄT DER ESTERSUBSTRATE 207

3.4 Überprüfung der Hydrolysestabilität der Estersubstrate

3.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Überprüfung der Hydrolysestabilität


der racemischen Substrat Ester (AAV 5)

Der racemische Ester (ca. 0.1 bis 0.2 mmol) wurde in 1 ml (10 Vol%) des
organischen Cosolvens gelöst und unter kräftigem Rühren langsam zu 9 ml wäßriger
Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M) gegeben. Die Mischung wurde anschließend auf den
gewünschten pH-Wert eingestellt. Danach wurde die Reaktionslösung für
mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur ohne Enzym gerührt. Im Anschluß
wurde die Reaktionslösung mit Dichlormethan extrahiert, getrocknet, am
Rotationsverdampfer eingeengt und dünnschicht- und gaschromatographisch
untersucht.

3.4.2 Hydrolysestabilität des Esters rac-15

Die Stabilität des Esters rac-15 gegen Autohydrolyse wurde bereits in eigenen
Vorarbeiten untersucht80.

3.4.3 Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und
rac-25

Die Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25
wurde in unabhängigen Versuchen nach AAV 5 überprüft. Dazu wurde die in Tabelle
3.1 angegebene Menge Substrat in 1 ml tert-Butanol und 9 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und über die in Tabelle 3.1 angegebene Zeit
bei Raumtemperatur gerührt. Nach Aufarbeitung konnte nur der jeweilige Ester nach
GC-Analytik nachgewiesen werden.
208 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.2: Überprüfung der Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19,
rac-21, rac-22 und rac-25

Substrat Substratmenge Reaktionszeit Hydrolyseprodukt (GC)

rac-17 50 mg 24 h nein
rac-18 50 mg 46 h nein
rac-19 50 mg 65 h nein
rac-22 50 mg 46 h nein
rac-21 50 mg 24 h nein
rac-25 50 mg 95 h nein

3.4.4 Hydrolysestabilität des Esters rac-23

Die Hydrolysestabilität des Esters rac-23 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurden
50 mg (0.16 mmol) rac-23 in 1.48 ml Aceton (16 %Vol) und 7.78 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und für vier Tage bei Raumtemperatur gerührt.
Nach Aufarbeitung konnte keine Hydrolyse durch GC-Analytik nachgewiesen
werden.

3.4.5 Hydrolysestabilität des Esters rac-16

Die Hydrolysestabilität des Esters rac-16 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurden
in zwei verschiedenen parallelen Ansätzen jeweils 50 mg (0.17 mmol) rac-16 in 1 ml
tert-Butanol und 9 ml wäßriger Phosphatpufferlösung bei dem in Tabelle 3.3
angegeben pH-Wert gelöst und über die in Tabelle 3.3 angegebene Zeit bei
Raumtemperatur gerührt.
ÜBERPRÜFUNG DER HYDROLYSESTABILITÄT DER ESTERSUBSTRATE 209

Tabelle 3.3: Überprüfung der Hydrolysestabilität des Esters rac-16 bei


verschiedenen pH-Werten

pH-Wert Reaktionszeit Hydrolyseprodukt (GC)

7.0 2h 0.1 % rac-8


8.0 2h 1.2 % rac-8
8.0 16 h 15.0 % rac-8

3.4.6 Hydrolysestabilität des Esters rac-24

Die Hydrolysestabilität des Esters rac-24 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurden
50 mg (0.16 mmol) rac-24 (enthält Diessigsäurester von rac-24) in 1.48 ml Aceton
(16 %Vol) und 7.78 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und für vier
Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach Aufarbeitung konnten 40 mg einer
Mischung aus drei Komponenten erhalten werden: rac-14, rac-24 und
Diessigsäurester von rac-24. Nach GC-Analytik wies die Mischung 2 % rac-14 auf.
210 EXPERIMENTELLER TEIL

3.5 Bestimmung von Umsätzen und Enantiomerenverhältnissen

Die Umsätze der enzymkatalysierten Reaktionen wurden gaschromatographisch


(GC) oder flüssigchromatographisch an chiraler stationärer Phase (HPLC) ermittelt.
Die ermittelten Umsätze werden auf ganze Zahlen gerundet angegeben. Die
Retentionszeiten der Verbindungen sind in Tabelle 3.4 und Tabelle 3.6 aufgeführt.

Tabelle 3.4: Trennbedingungen zur gaschromatographischen Analyse der


Reaktionsmischung zur Umsatzbestimmung an achiraler Phase

Temperatur- Retentionszeiten
Reaktionsmischung
programm (Min.)

rac-8, rac-15 S1 (CP9000) tR (8) = 10.7 tR (15) = 11.8

rac-8, rac-16 S1 (CP9000) tR (8) = 10.7 tR (16) = 10.9

rac-11, rac-17 S1 (CP9000) tR (11) = 9.4 tR (17) = 10.6

rac-12, rac-18 S1 (CP9000) tR (12) = 11.4 tR (18) = 12.8

rac-12, rac-18 S1 (Varian 3800) tR (12) = 12.4 tR (18) = 14.6

rac-12, rac-47 S1 (Varian 3800) tR (12) = 12.4 tR (47) = 13.1

rac-12, rac-46 S1 (Varian 3800) tR (12) = 12.4 tR (46) = 13.8

rac-13, rac-19 S1 (Varian 3800) tR (13) = 12.3 tR (19) = 13.6

rac-20, rac-21 S1 (Varian 3800) tR (20) = 12.0 tR (21) = 13.0

rac-14, rac-22 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.8 tR (22) = 14.5

rac-14, rac-23 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.8 tR (23) = 16.2

rac-14, rac-24 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.4 tR (24) = 13.0

rac-14, rac-45 S1 (Varian 3800) tR (14) = 12.5 tR (45) = 13.8

Die Enantiomerenverhältnisse wurden entweder gaschromatographisch oder


flüssigchromatographisch an chiralen stationären Phasen ermittelt. Die ermittelten
ee-Werte werden auf ganze Zahlen gerundet angegeben. Die Retentionszeiten der
BESTIMMUNG VON UMSÄTZEN UND ENANTIOMERENVERHÄLTNISSEN 211

einzelnen Enantiomere unter den jeweiligen Trennbedingungen sind in Tabelle 3.5


und Tabelle 3.6 angegeben.

Tabelle 3.5: Trennbedingungen zur gaschromatographischen Bestimmung von


Enantiomerenverhältnissen

Ver- Chirale Retentionszeit


Temperatur-Programma)
bindung Phase (Min.)

100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.;


CP-Chirasil- tR ((+)-8) = 72.9
rac-8 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.)
Dex-CB tR ((−)-8) = 73.5
→ 200 ºC (10 ºC/Min.)

110 ºC (5 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.;


CP-Chirasil- tR ((+)-15) = 59.1
rac-15 5 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.) →
Dex-CB tR ((−)-15) = 59.6
200 ºC (10 ºC/Min.)

100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.;


CP-Chirasil- tR ((+)-16) = 67.7
rac-16 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.)
Dex-CB tR ((−)-16) = 68.1
→ 200 ºC (10 ºC/Min.)

140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.;


CP-Chirasil- tR ((+)-12) = 21.6
rac-12 2 Min.) → 180 ºC (10 ºC/Min.; 2 Min.) →
Dex-CB tR ((−)-12) = 22.1
200 ºC (10 ºC/Min.)

100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.;


Lipodex γ- tR ((+)-18) = 192.0
rac-18 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.)
6-Me tR ((−)-18) = 194.0
→ 200 ºC (10 ºC/Min.)

100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.;


Lipodex γ- tR ((+)-47) = 116.4
rac-47 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.)
6-Me tR ((−)-47) = 117.6
→ 200 ºC (10 ºC/Min.)

100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.;


Lipodex γ- tR ((+)-46) = 171.6
rac-46 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.)
6-Me tR ((−)-46) = 175.4
→ 200 ºC (10 ºC/Min.)
212 EXPERIMENTELLER TEIL

Fortsetzung Tabelle 3.5:

140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.;


CP-Chirasil- tR ((+)-14) = 22.8
rac-14 2 Min.) → 180 ºC (10 ºC/Min.; 2 Min.) →
Dex-CB tR ((−)-14) = 23.5
200 ºC (10 ºC/Min.)

100 ºC (45 Min.) → 130 ºC (10 ºC/Min.;


Lipodex γ- tR ((−)-22) = 71.8
rac-22 15 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; 5 Min.)
6-Me tR ((+)-22) = 76.3
→ 200 ºC (10 ºC/Min.)

Lipodex γ- 140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; tR ((−)-24) = 70.3


rac-24
6-Me 2 Min.) → 170 ºC (10 ºC/Min) tR ((+)-24) = 74.5

Lipodex γ- 140 ºC (2 Min.) → 160 ºC (10 ºC/Min.; tR ((−)-45) = 71.8


rac-45
6-Me 2 Min.) → 170 ºC (10 ºC/Min) tR ((+)-45) = 76.3

a) Trägergas H2 mit 100 kPa Vordruck; Split 1:40.

Tabelle 3.6: Trennbedingungen zur Bestimmung von Enantiomerenverhältnissen


durch HPLC Analyse an Chiralcel OD-H Phase

Flow Retentionszeitena)
Verbindung Laufmittel-Verhältnis
(mL / Min.) (Min.)

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-8) = 19.1


rac-8 0.75
970 : 30 : 1 tR ((−)-8) = 20.3

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-15) = 9.9


rac-15 0.75
970 : 30 : 1 tR ((−)-15) = 11.0

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-16) = 10.1


rac-16 0.75
970 : 30 : 1 tR ((−)-16) = 12.1

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-11) = 36.2


rac-11 0.75
990 : 10 : 1 tR ((−)-11) = 46.0

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-17) = 13.7


rac-17 0.75
990 : 10 : 1 tR ((−)-17) = 16.5
BESTIMMUNG VON UMSÄTZEN UND ENANTIOMERENVERHÄLTNISSEN 213

Fortsetzung Tabelle 3.6:

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-12) = 21.0


rac-12 0.75
970 : 30 : 1 tR ((−)-12) = 29.5

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-18) = 11.8


rac-18 0.75
970 : 30 : 1 tR ((−)-18) = 17.7

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-13) = 20.7


rac-13 0.75
950 : 50 : 1 tR ((−)-13) = 24.0

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-19) = 16.1


rac-19 0.75
950 : 50 : 1 tR ((−)-19) = 22.9

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-20) = 26.5


rac-20 0.75
950 : 50 : 1 tR ((−)-20) = 29.3

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-21) = 13.9


rac-21 0.75
950 : 50 : 1 tR ((−)-21) = 15.2

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-14) = 26.8


rac-14 0.75
950 : 50 : 1 tR ((−)-14) = 39.9

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-22) = 13.5


rac-22 0.75
950 : 50 : 1 tR ((−)-22) = 19.4

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-23) = 13.2


rac-23 0.75
950 : 50 : 1 tR ((−)-23) = 18.3

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-24) = 21.1


rac-24 0.75
950 : 50 : 1 tR ((−)-24) = 26.3

n-Hexan / i-PrOH / Et2NH tR ((+)-45) = 16.3


rac-45 0.75
950 : 50 : 1 tR ((−)-45) = 20.0

a) Die Detektion erfolgte bei λ = 273 und 254 nm.


214 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6 Enzym-katalysierte Racematspaltungen im wäßrigen und


organischen Medium

3.6.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften

3.6.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im


wäßrigen Einphasen System (AAV 6)

Der racemische Ester (0.5 bis 2 mmol) wurde in 4 ml (10 Vol%) des organischen
Cosolvens gelöst und unter kräftigem Rühren langsam zu 36 ml wäßriger
Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M) gegeben. Dabei entstand häufig zuerst eine Trübung
durch Emulsionsbildung, die aber rasch verschwand und eine klare Lösung
hinterließ. Aufgrund der Basizität der Substrate wurde die Mischung anschließend
auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Danach wurde die Reaktionslösung für
24 Stunden ohne Enzym gerührt. Nachdem durch DC- und GC-Reaktionskontrolle
überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte,
wurde das Enzym zugegeben. Danach wurde der Ansatz bei Raumtemperatur über
den gesamten Reaktionszeitraum kräftig gerührt. Der pH-Wert der Reaktionslösung
wurde durch einen pH-STAT Autotitrator mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten.
Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurde über die gesamte Reaktionsdauer verfolgt.
Zur GC-Reaktionskontrolle wurden 0.5 ml-Proben entnommen. Die Proben wurden
mit ca. 0.5 ml dest. Wasser verdünnt und zweimal mit ca. 1.5 ml Dichlormethan
extrahiert. Die organische Phase wurde abgetrennt und zum Trocknen durch eine mit
Na2SO4 gefüllte Pasteurpipette gegeben. Zum Abbruch der Reaktion und zur
Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung in einem Perforator mit Dichlormethan für
ein bis zwei Tage kontinuierlich extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
wurden anschließend mit Na2SO4 getrocknet, im Rotationsverdampfer eingeengt und
unter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit.

3.6.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrig-


organischen Zweiphasen System (AAV 7)

Der racemische Ester (0.5 bis 1 mmol) wurde in 5 ml MTBE gelöst und unter
kräftigem Rühren langsam zu einer Emulsion aus 20 ml wäßriger Phosphatpuffer-
Lösung (0.1 M) und 15 ml MTBE gegeben. Es entstand in allen Fällen eine klare
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 215

Emulsion, die anschließend aufgrund der Basizität der Substrate auf den
gewünschten pH-Wert eingestellt wurde. Danach wurde die Reaktionslösung für
24 Stunden ohne Enzym gerührt. Nachdem durch DC- und GC-Reaktionskontrolle
überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte,
wurde das Enzym zugegeben. Danach wurde der Ansatz bei Raumtemperatur über
den gesamten Reaktionszeitraum heftig gerührt, so daß eine feine Emulsion
entstand. Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde durch einen pH-STAT Autotitrator
mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten. Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurde
über die gesamte Reaktionsdauer verfolgt. Zur GC-Reaktionskontrolle wurden
0.5 ml-Proben entnommen. Die Proben wurden mit ca. 0.5 ml dest. Wasser verdünnt
und dreimal mit ca. 1.5 ml Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde
abgetrennt und zum Trocknen durch eine mit Na2SO4 gefüllte Pasteurpipette
gegeben. Zum Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung wurde die
Reaktionslösung in einem Perforator mit Dichlormethan für 48 Stunden kontinuierlich
extrahiert. Anschließend wurde die organische Phase mit Na2SO4 getrocknet, im
Rotationsverdampfer eingeengt und unter vermindertem Druck von
Lösungsmittelresten befreit.

3.6.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Transacylierung in


organischen Lösungsmitteln (AAV 8)

Das racemische Substrat (0.25 mmol) und das Acylierungsmittel wurden in 5 ml des
organischen Lösungsmittels gelöst. Die Reaktionslösung wurde für 24 Stunden ohne
Enzym bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem durch DC- und GC-
Reaktionskontrolle überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion
stattgefunden hatte, wurde das Enzym zugegeben und die Mischung für einige
Minuten kräftig gerührt, um das Enzym möglichst fein zu verteilen. Danach wurde der
Ansatz über den restlichen Reaktionszeitraum langsam gerührt. Zur GC-
Reaktionskontrolle wurden 500 µl-Proben entnommen und zur Abtrennung von
Proteinen und eventuell vorhandenem MPEG mit 1.5 ml Dichlormethan über eine mit
Na2SO4 und Celite gefüllte Pasteurpipette filtriert.
216 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.2 Berechnung des E-Werts

Folgende Formeln wurden zur Berechnung der E-Werte benutzt6,106,108:

ln [1 − c(1+ eeP )]
Formel 3.2: E= , für c < 50 %
ln [1− c(1− ee P )]

ln [(1− c)(1− ee S )]
Formel 3.3: E= , für c > 50 %
ln [(1− c)(1+ ee S )]

ee S
Formel 3.4: Umsatz ber =
ee S + ee P

 1− ee S   ee P (1− ee S ) 
ln   ln  (ee + ee ) 
1 + (eeS /ee P )   S 
E=  =
P
Formel 3.5:
 1 + ee S   ee P (1+ ee S ) 
ln   ln  
1 + (eeS /ee P )   ee P + ee S ) 

(mit: c = Umsatz, ee P = ee-Wert des Produkts, ee S = ee-Wert des Substrats)

Alle E-Werte in dieser Arbeit wurden aus dem ee-Wert des Substrats und dem
ee-Wert des Produkts berechnet. Dazu wurde Formel 3.5, die sich aus Formel 3.4
eingesetzt in Formel 3.2 oder Formel 3.3 ergibt, verwendet.6 Von einer Berechnung
des E-Werts aus dem gemessenen Umsatz und nur einem ee-Wert wurde
abgesehen.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 217

3.6.3 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-


dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15)

3.6.3.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen


Einphasensystem unter Zusatz von Aceton als Cosolvens

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml Aceton und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 100 µl (1.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die
Reaktion wurde nach 5 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.248 g einer Mischung aus Ester (+)-15
und Phenol (−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.7: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 unter Zusatz von
Aceton als Cosolvens

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

5 Min 52 % 27 % 46 % 4

3.6.3.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
1.135 g (3.6 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml tert-Butanol und 72 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 400 µl (4.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die
Reaktion wurde nach 2 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 52 % durch
kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31;
Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.532 g (1.67 mmol, 47 %) (+)-15 und 0.428 g (1.72 mmol,
49 %) (−)-8 isoliert werden.
218 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.8: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen


Einphasensystem

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute


E
zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Phenol (−)-8

2h 62 % 47 % 47 % 49 % 13

3.6.3.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen


Einphasensystem zur Darstellung von (+)-15

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
1.120 g (3.5 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml tert-Butanol und 72 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 400 µl (4.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die
Reaktion wurde nach 3 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 85 % durch
kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (CHCl3 : i-Propanol = 2 : 1 über Kieselgel, Rf ((−)-8) = 0.22;
Rf ((+)-15) = 0.01) konnten 0.560 g (2.25 mmol, 64 %) (−)-8 und 0.113 g (0.35 mmol,
10 %) (+)-15 isoliert werden.

(+)-15: [α ] 20
D
= + 10.74º (c = 0.7, MeOH)

(−)-8: [α ] 20
D
= − 3.43º (c = 1.5, MeOH)

Tabelle 3.9: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen


Einphasensystem

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute


E
zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Phenol (−)-8

3h ≥ 98 % 10 % 27 % 64 % 7
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 219

3.6.3.4 Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15 im


wäßrigen Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 0.6 mg Acetylcholinesterase (AChE;
970 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 7.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.297 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol
(−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.10: Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

7.5 h 3% n. .b. n. .b. -

3.6.3.5 CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 10 mg Candida antarctica Lipase
(CAL; 3.2 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion
wurde nach 3.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.310 g einer Mischung aus Ester (+)-15
und Phenol (−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.11: CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

3.75 h 8% 3% 3% 1.1
220 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.3.6 Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im


wäßrigen Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 20 mg Lipase aus Mucor miehei
(1.3 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 19.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.245 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol
(−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.12: Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

19.5 h 25 % 11 % 30 % 2.1

3.6.3.7 HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Horse liver esterase (HLE;
0.74 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 4 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und
aufgearbeitet. Es konnten 0.284 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8
erhalten werden.

Tabelle 3.13: HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

4h 31 % 17 % 51 % 4
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 221

3.6.3.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Cholesterolesterase (CE;
17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 24 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.231 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol
(−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.14: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

24 h 90 % 72 % 39 % 5

3.6.3.9 PPL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Porcine pancreatic Lipase (PPL;
16.8 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 2.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.259 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol
(−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.15: PPL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

2.5 h 66 % 19 % 78 % 10
222 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.3.10 BCL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Burkholderia cepacia Lipase
(BCL, 40 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion
wurde nach 22 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.318 g einer Mischung aus Ester (+)-15
und Phenol (−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.16: BCL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

22 h 35 % 75 % 67 % 11

3.6.3.11 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen


Einphasensystem mit roher CRL

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 3 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und
aufgearbeitet. Es konnten 0.284 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8
erhalten werden.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 223

Tabelle 3.17: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen


Einphasensystem

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E

3h 64 % 98 % 45 % 10

3.6.3.12 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen


Zweiphasensystem mit roher CRL

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.0, dazu wurden
0.316 g (1.0 mmol) des Esters rac-15 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 45 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 3.25 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 51 % durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31;
Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.203 g (0.64 mmol, 64 %) (+)-15 und 0.076 g (0.30 mmol,
30 %) (−)-8 isoliert werden.

(+)-15: [α ] 20
D
= + 17.90º (c = 1.3, MeOH)

(−)-8: [α ] 20
D
= − 11.45º (c = 2.0, MeOH)

Tabelle 3.18: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen


Zweiphasensystem mit roher CRL

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute


E
zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Alkohol (−)-8

3.25 h 75 % 64 % 85 % 30 % 27
224 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.3.13 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen


Zweiphasensystem mit aufgereinigter CRL

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1.0 mmol) des Esters rac-15 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 3 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
37 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 5.25 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 33 % durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31;
Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.186 g (0.58 mmol, 58 %) (+)-15 und 0.068 g (0.27 mmol,
27 %) (−)-8 isoliert werden.

Tabelle 3.19: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen


Zweiphasensystem mit aufgereinigter CRL

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Phenol Ausbeute


E
zeit (+)-15 Ester (+)-15 (−)-8 Alkohol (−)-8

5.25 h 58 % 58 % 90 % 27 % 34

3.6.4 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-


3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16)

3.6.4.1 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen


Einphasensystem mir roher CRL

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 40 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 7.25 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 225

und aufgearbeitet. Es konnten 0.286 g einer Mischung aus Ester (+)-16 und Phenol
(−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.20: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-16 ee Phenol (−)-8 E

7.25 h 45 % 4% 26 % 2

3.6.4.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen


Einphasensystem bei pH 7.0

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 100 µl (1.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die
Reaktion wurde nach 1.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit
Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.179 g einer Mischung
aus Ester (+)-16 und Phenol (−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.21: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 bei pH 7.0

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-16 ee Phenol (−)-8 E

1.75 h 36 % 35 % 52 % 4

3.6.4.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen


Einphasensystem bei pH 8.0

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 80 µl (0.8 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die
Reaktion wurde nach 45 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
226 EXPERIMENTELLER TEIL

abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.229 g einer Mischung aus Ester (+)-16
und Phenol (−)-8 erhalten werden.

Tabelle 3.22: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 bei pH 8.0

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-16 ee Phenol (−)-8 E

0.75 h 31 % 50 % 74 % 10

3.6.5 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethyl-


aminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8)

3.6.5.1 Versuche zur enzymatischen Transacylierung des Phenols rac-8


unter Verwendung verschiedener Lipasen

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in sieben


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.056 g (0.25 mmol) des
Phenols rac-8 mit 50 mg (0.50 mmol) Vinylpropionat und der in Tabelle 3.23
aufgeführten Menge Lipase in 5 ml Diethylether versetzt.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 227

Tabelle 3.23: Versuche zur Lipasen-katalysierten Transacylierung des Phenols


rac-8

Enzymmenge Umsatz nach


Enzym
14 d (GC)

Porcine pancreatic Lipase


100 mg 0%
(PPL; 16.8 U/mg)
Burkholderia cepacia Lipase
15 mg 0%
(BCL, 40 U/mg)

Candida rugosa Lipase


60 mg 2%
(CRL; 2.4 U/mg)

Rhizopus niveus Lipase


50 mg 0%
(2.6 U/g)
Candida antarctica Lipase
5 mg 0%
(CAL; 3.2 U/mg)

Rhizopus arrhizus Lipase


50 mg 0%
(2 U/g)
Aspergillus niger Lipase
5 mg 0%
(1 U/mg)

3.6.5.2 Versuch zur PPL-katalysierten Transacylierungen des Phenols rac-8


mit Vinylacetat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) des
Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.24 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 100 mg Porcine pancreatic Lipase (PPL; 16.8 U/mg) umgesetzt. In allen
Reaktionen entstand vor Enzymzugabe eine klare Lösung. Die PPL bildete eine
Suspension, da das Enzym nicht löslich war. Nach 24 Stunden Reaktionszeit hatten
sich alle Reaktionen aufgrund einer Braunfärbung des Enzyms dunkel verfärbt.
228 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.24: Versuche zur PPL-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8


mit Vinylacetat

Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)

112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat


28 d 2%
5 ml Dichlormethan (H2O ges.)

112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat


28 d 1%
5 ml Trichlormethan (H2O ges.)

5.8 ml (63 mmol) Vinylacetat 12 d 6%

3.6.5.3 BCL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) des
Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.25 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 15 mg Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 40 U/mg) umgesetzt. In allen
Reaktionen entstand eine Suspension, als das unlösliche Enzym zur klaren
Reaktionslösung gegeben wurde.

Tabelle 3.25: BCL-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-8 mit Vinylacetat

Reaktionsbedingungen 28 d E-Wert

Umsatz (GC) 3%
112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat
ee Ester (−)-16 n. b. -
5 ml Diisopropylether
ee Phenol (+)-8 n. b.

Umsatz (GC) 18 %
5.8 ml (63 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 10 % 1.2
ee Phenol (+)-8 2%
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 229

3.6.5.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) des
Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.26 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 30 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 2.4 U/mg) umgesetzt. In allen
Reaktionen entstand eine Suspension, als das unlösliche Enzym zur klaren
Reaktionslösung gegeben wurde.

Tabelle 3.26: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit


Vinylacetat

Reaktionsbedingungen 28 d E-Wert

Umsatz (GC) 2%
112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat
ee Ester (−)-16 n. b. -
5 ml Diisopropylether
ee Phenol (+)-8 n. b.

Umsatz (GC) 8%
112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat
ee Ester (−)-16 n. b. -
5 ml MTBE
ee Phenol (+)-8 n. b.

Umsatz (GC) 36 %
5.8 ml (63 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 38 % 3
ee Phenol (+)-8 21 %

Umsatz (GC) 66 %
112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat
ee Ester (−)-16 33 % 2.5
5 ml Dichlormethan
ee Phenol (+)-8 26 %
230 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.5.5 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit


Vinylbutyrat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.062 g (0.25 mmol) des
Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.27 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. In beiden
Reaktionen entstand eine weiße Suspension, da sowohl das Enzym unlöslich war,
als auch Anteile des Substrat sich nicht vollständig lösten.

Tabelle 3.27: CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit


Vinylbutyrat

Reaktionsbedingungen 17 d E-Wert

143 mg (1.25 mmol) Umsatz (GC) 4%


Vinylbutyrat ee Ester (−)-15 n. b. -
5 ml Dichlormethan ee Phenol (+)-8 n. b.

Umsatz (GC) 15 %
5 ml (39 mmol)
ee Ester (−)-15 28 % 2
Vinylbutyrat
ee Phenol (+)-8 15 %

3.6.5.6 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols


rac-8

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.063 g (0.25 mmol) des
Phenols rac-8 unter den in Tabelle 3.28 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 45 mg MPEG/PLE (153 U/mg PLE, 3 % Proteingehalt) umgesetzt.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 231

Tabelle 3.28: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols


rac-8

Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat


21 d 0%
5 ml Dichlormethan

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat


21 d 0%
5 ml Trichlormethan

5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 4d 5%

3.6.6 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-


(3-dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17)

3.6.6.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.147 g (0.5 mmol) des Esters rac-17 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 40 µl (0.4 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die
Reaktion wurde nach 25 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.104 g einer Mischung aus Ester 17
und Phenol 11 erhalten werden.

Tabelle 3.29: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 17 ee Phenol 11 E

25 Min. 69 % 7% 1% 1.1
232 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.6.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen


Einphasensystem mit roher CRL

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.147 g (0.5 mmol) des Esters rac-17 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 40 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 2.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.128 g einer Mischung aus Ester 17 und Phenol 11
erhalten werden.

Tabelle 3.30: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 17 ee Phenol 11 E

2.5 h 17 % 1% 3% 1.1

3.6.7 Versuche zur Enzymatischen Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-


(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11)
unter Verwendung verschiedener Lipasen

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in fünf


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.056 g (0.25 mmol) des
Phenols rac-11 mit 125 mg (0.50 mmol) Vinyllaurat und der in Tabelle 3.31
aufgeführten Menge Lipase in 5 ml Diethylether versetzt.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 233

Tabelle 3.31: Versuche zur Lipasen-katalysierten Transacylierung des Phenols


rac-11

Enzymmenge Umsatz nach


Enzym
14 d (GC)

Burkholderia cepacia Lipase


100 mg 0%
(BCL, 40 U/mg)

Candida rugosa Lipase


60 mg 0%
(CRL; 2.4 U/mg)

Candida antarctica Lipase


10 mg 0%
(CAL; 3.2 U/mg)

Rhizopus arrhizus Lipase


50 mg 0%
(2 U/g)

Aspergillus niger Lipase


5 mg 0%
(1 U/mg)

3.6.8 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-


dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-
ester (rac-18)

3.6.8.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.174 g (0.50 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 50 µl (0.5 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die
Reaktion wurde nach 5.75 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 40 % durch
kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (EE : MeOH : TEA = 50 : 50 : 1 an Kieselgel,
234 EXPERIMENTELLER TEIL

Rf ((−)-18) = 0.32; Rf ((+)-12) = 0.15) konnten 0.082 g (0.23 mmol, 47 %) (−)-18 und
0.042 g (0.15 mmol, 30 %) (+)-12 isoliert werden.

(−)-18: [α ] 20
D
= − 6.01º (c = 1.50, MeOH)

(+)-12: [α ] 20
D
= + 21.70º (c = 0.80, MeOH)

Tabelle 3.32: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (−)-18 Ester (−)-18 (+)-12 Alkohol (+)-12

5.75 h 86 % 47 % 94 % 30 % 89

3.6.8.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.500 g (1.43 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
37 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war zu Beginn stark getrübt, am Ende der
Reaktionszeit klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 4.75 Stunden bei Umsatz
(GC) von ca. 49 % durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 an
Kieselgel, Rf ((+)-18) = 0.36; Rf ((−)-12) = 0.18) konnten 0.216 g (0.62 mmol, 43 %)
(+)-18 und 0.162 g (0.58 mmol, 41 %) (−)-12 isoliert werden.

(+)-18: [α ] 20
D
= + 7.03º (c = 0.72, MeOH)

(−)-12: [α ] 20
D
= − 28.30º (c = 1.00, MeOH)
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 235

Tabelle 3.33: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen


Einphasensystem

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12

4.75 h 93 % 41 % 95 % 41 % 133

3.6.8.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen


Zweiphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.5, dazu wurden
0.349 g (1.0 mmol) des Esters rac-18 in 26 ml MTBE und 26 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 6 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
37 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 72 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 45 % durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1:1 an Kieselgel,
Rf ((+)-18) = 0.36; Rf ((−)-12) = 0.18) konnten 0.140 g (0.40 mmol, 40 %) (+)-18 und
0.110 g (0.39 mmol, 39 %) (−)-12 isoliert werden.

(+)-18: [α ] 20
D
= + 7.03º (c = 0.72, MeOH)

(−)-12: [α ] 20
D
= − 28.30º (c = 1.00, MeOH)

Tabelle 3.34: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen


Zweiphasensystem

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12

72 h ≥98 % 40% ≥98 % 39 % >200


236 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.8.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen


Zweiphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.2, dazu wurden
0.500 g (1.43 mmol) des Esters rac-18 in 25 ml MTBE und 25 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.2) gelöst und mit 13 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
25.9 U/mg) versetzt. Nach 48 Stunden bei einem Umsatz von ca. 50 % wurde zum
Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die Reaktionslösung zunächst einmal mit
40 ml MTBE extrahiert und anschließend dreimal mit je 30 ml Diethylether. Die
vereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet und im
Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.254 g (0.73 mmol, 50.8 %) farbloser,
öliger Ester (+)-18 mit einem ee-Wert von ≥98 % isoliert werden. Die verbliebene
wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck von
Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt.
Anschließend wurde viermal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und die
vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am
Rotationsverdampfer wurden 0.184 g (0.66 mmol, 46.1 %) Alkohol (−)-12 mit einem
ee-Wert von 97 % erhalten.

(+)-18: [α ] 20
D
= + 7.9º (c = 0.69, MeOH)

(−)-12: [α ] 20
D
= − 28.60º (c = 0.93, MeOH)

Tabelle 3.35: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 wäßrig-organischen


Zweiphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (+)-18 Ester (+)-18 (−)-12 Alkohol (−)-12

48 h ≥98 % 51 % 97 % 46 % >200
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 237

3.6.8.5 Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18


im wäßrigen Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.5, dazu wurden
0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 60 mg Novozym 435 (immobilisierte
CAL-B) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos, das immobilisierte
Enzym unlöslich. Die Reaktion wurde nach 45 Stunden durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.200 g
Ester rac-18 erhalten werden.

Tabelle 3.36: Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester 18 ee Alkohol 12 E

45 h 0% - - -

3.6.8.6 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.245 g (0.70 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Chirazyme L-2 (CAL-B;
154 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 46 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.240 g einer Mischung aus Ester (+)-18 und Alkohol
(−)-12 erhalten werden.

Tabelle 3.37: Chirazyme L2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-18 ee Alkohol (−)-12 E

46 h 7% 8% n. b. -
238 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethyl-


aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12)

3.6.9.1 Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12


mit Isopropenylacetat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
Alkohols rac-12 mit jeweils 5 mg Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 40 U/mg) unter
den in Tabelle 3.38 aufgeführten Reaktionsbedingungen umgesetzt. Zu Beginn der
Reaktion waren die Reaktionslösungen getrübt, da das Substrat nicht vollständig
löslich war. Nach 24 Stunden waren die Reaktionen, die in Toluol durchgeführt
wurden, klar.

Tabelle 3.38: Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12


mit Isopropenylacetat

Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)

145 mg (1.45 mmol) Isopropenylacetat,


20 d 3%
5 ml Toluol

5 ml (70 mmol) Isopropenylacetat 20 d 3%

3.6.9.2 BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit


Vinylpropionat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
Alkohols rac-12 mit jeweils 15 mg Burkholderia cepacia Lipase (BCL, 40 U/mg) unter
den in Tabelle 3.39 aufgeführten Reaktionsbedingungen umgesetzt.

Tabelle 3.39: BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit


Vinylpropionat
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 239

Reaktions- Mittel
8d E-Wert 13 d E-Wert
bedingung E-Wert

125 mg (1.25 mmol) Umsatz (GC) 11 % 12 %


Vinylpropionat, ee Ester (−)-46 94 % 34 95 % 43 38
5 ml Toluol ee Alkohol (+)-12 8% 12 %

Umsatz (GC) 5% n. b.
5 ml (49.95 mmol)
ee Ester (−)-46 91 % 22 n. b. - 22
Vinylpropionat
ee Alkohol (+)-12 4% n. b.

3.6.9.3 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit


Vinylpropionat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
Alkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.40 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. Zu Beginn der
Reaktion waren die Reaktionslösungen getrübt, da Substrat und Enzym nicht
vollständig löslich waren. Nach 24 Stunden war die Reaktion, die in Toluol
durchgeführt wurde, klar.
240 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.40: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit


Vinylpropionat

3d 6d 8d 11 d 16 d
Reaktionsbedingung
(%) (%) (%) (%) (%)

125 mg (1.25 mmol) Umsatz (GC) 0 2 2 3 -


Vinylpropionat, ee Ester (−)-46 n. b. n. b. n. b. 90 -
5 ml Diisopropylether ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. n. b. 2 -

125 mg (1.25 mmol) Umsatz (GC) 37 57 58 58 -


Vinylpropionat, ee Ester (−)-46 94 91 96 89 -
5 ml Toluol ee Alkohol (+)-12 56 97 98 ≥98 -

Umsatz (GC) 23 41 48 53 58
5 ml (49.95 mmol) 88 84 86 82 79
ee Ester (−)-46
Vinylpropionat
ee Alkohol (+)-12 25 52 68 85 ≥90

Tabelle 3.41: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12


mit Vinylpropionat

Reaktionsbedingungen 3d 6d 8d 11 d 16 d Mittel

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat,


- - - 19 - 19
5 ml Diisopropylether

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat,


56 89 >200 89 - 109
5 ml Toluol

5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 19 19 26 27 25 23


ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 241

3.6.9.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit


Isopropenylacetat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
Alkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.42 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. Zu Beginn der
Reaktion waren die Reaktionslösungen getrübt, da das Substrat nicht vollständig
löslich war. Nach 24 Stunden war die Reaktion, die in Toluol durchgeführt wurde,
klar.

Tabelle 3.42: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit


Isopropenylacetat

Reaktionsbedingung 2d 5d 14 d 20 d

145 mg (1.45 mmol) Umsatz (GC) 19 % 34 % 47 % 58 %


Isopropenylacetat, ee Ester (−)-47 n. b. ≥98 % 94 % 94 %
5 ml Toluol ee Alkohol (+)-12 n. b. 60 % 70 % 88 %

Umsatz (GC) 3% 5% 13 % 16 %
5 ml (70 mmol) n. b. 10 % 24 % 24 %
ee Ester (−)-47
Isopropenylacetat
ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. 4% 6%

Tabelle 3.43: E-Werte der CRL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12


mit Isopropenylacetat

Reaktionsbedingungen 2d 5d 14 d 20 d Mittel

145 mg (1.45 mmol)


n. b. >200 67 94 120
Isopropenylacetat, 5 ml Toluol

5 ml (70 mmol) Isopropenylacetat n. b. n. b. 2 2 2


242 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.9.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols


rac-12

a) mit 7 mg MPEG/PLE

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
Alkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.44 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 7 mg PLE/MPEG (153 U/mg PLE, 3 % Proteingehalt) in 5 ml Toluol
umgesetzt.

Tabelle 3.44: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols


rac-12

Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat 20 d 3%

125 mg (1.25 mmol) Isopropenylacetat 20 d 0%

b) mit 45 mg PLE/MPEG

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
Alkohols rac-12 unter den in Tabelle 3.45 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 45 mg PLE/MPEG (153 U/mg PLE, 3 % Proteingehalt) umgesetzt.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 243

Tabelle 3.45: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols


rac-12

Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat


21 d 2%
5 ml Dichlormethan

125 mg (1.25 mmol Vinylpropionat


4d 1%
5 ml MTBE

5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 21 d 3%

3.6.9.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des


Alkohols rac-12

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei


verschiedenen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols
rac-12 und 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat unter den in Tabelle 3.46
aufgeführten Reaktionsbedingungen und mit der dort angegebenen Menge an
Colyophilisat aus PLE/BSA/MPEG (148 U/mg PLE, 1.5 % Proteingehalt) umgesetzt.
In beiden Reaktionen entstanden klare Lösungen. Die Farbe des PLE/BSA-
Katalysators änderte sich im Laufe der Reaktionszeit von weiß in ein dunkles rot-
braun.

Tabelle 3.46: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des


Alkohols rac-12

Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)

55 mg PLE/BSA/MPEG in 5 ml Dichlormethan 11 d 0%
45 mg PLE/BSA/MPEG, 12 µl H2O in 6 ml Toluol 11 d 0%
244 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.10 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-


Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexylester (rac-19)

3.6.10.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter


Verwendung verschiedener Lipasen im wäßrigen Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolysen erfolgten gemäß AAV 6 in sieben verschiedenen


Ansätzen bei pH 7.0, dazu wurden jeweils 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-19 in
4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit
der in Tabelle 3.47 angegebenen Menge der jeweiligen Lipase versetzt. Die
Reaktionen wurden nach der in Tabelle 3.47 angegebenen Reaktionszeit durch
kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Die
erhaltenen Ausbeuten sind in Tabelle 3.47 angegeben.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 245

Tabelle 3.47: Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter
Verwendung verschiedener Lipasen

Enzym- Reaktions- Ausbeute Umsatz


Enzym
menge zeit Ester 19 (GC)

Cholesterolesterase 25 mg 24 h 181 mg 1%
(CE; 17.5 U/mg)

Candida rugosa Lipase 5 mg 29 h 190 mg 0%


(CRL; 37 U/mg)

Chirazyme L-2 10 mg 45 h 195 mg 0%


(CAL-B; 155 U/mg)

Burkholderia cepacia Lipase 20 mg 45 h 200 mg 0%


(BCL; 0.09 U/mg)

Burkholderia cepacia Lipase 30 mg 46 h 194 mg 0%


(BCL, 40 U/mg)
Porcine pancreatic Lipase 40 mg 23 h 195 mg 1%
(PPL; 16.8 U/mg)

Chromobacterium viscosum 2 mg 69 h 200 mg 0%


Lipase (CVL, 3.58 U/mg)

3.6.10.2 Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im


wäßrig-organischen Zweiphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-19 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 10 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
37 U/mg) versetzt. Die Reaktion wurde nach 69 Stunden durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.184 g
Ester 19 erhalten werden.
246 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.48: Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im


wäßrig-organischen Zweiphasensystem

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 19 ee Alkohol 13 E

69 h 1% n. b. n. b. -

3.6.10.3 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im


wäßrigen Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-19 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 200 µl (2.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die
Reaktion wurde nach 41 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.191 g Ester 19 erhalten werden.

Tabelle 3.49: Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 19 ee Alkohol 13 E

41 h 0% - - -

3.6.11 Versuche zur Enzymatischen Transacylierungen von


(±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexan-1,3-diol (rac-13)

3.6.11.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol


rac-13 unter Verwendung verschiedener Lipasen

Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 247

Alkohols rac-13 mit 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat und der in Tabelle 3.50
aufgeführten Menge Lipase in 5 ml Toluol versetzt.

Tabelle 3.50: Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol


rac-13 unter Verwendung verschiedener Lipasen

Enzymmenge Umsatz nach Umsatz nach


Enzym
3 h (GC) 72 h (GC)

Candida rugosa Lipase


5 mg 0% 0%
(CRL; 37 U/mg)
Porcine pancreatic Lipase
20 mg 0% 0%
(PPL; 16.8 U/mg)
Cholesterolesterase
10 mg 0% 0%
(CE; 17.5 U/mg)
Novozym 435
10 mg 0% 1%
(immobilisierte CAL-B)

3.6.11.2 Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von


Alkohol rac-13

Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
Alkohols rac-13 unter den in Tabelle 3.51 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 20 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt.
248 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.51: Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von


Alkohol rac-13

Umsatz nach Umsatz nach


Reaktionsbedingungen
66 h (GC) 6 d (GC)

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat,


1% 1%
5 ml Toluol

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat,


0% 0%
5 ml Dichlormethan

125 mg (1.25 mmol) Isopropenylacetat


1% 1%
5 ml Toluol

5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 1% 1%

3.6.11.3 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol


rac-13 unter Zusatz von Triethylamin

Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
Alkohols rac-13 mit 5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat und 50 mg (0.36 mmol)
Triethylamin sowie der in Tabelle 3.52 aufgeführten Menge Lipase versetzt.

Tabelle 3.52: Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol


rac-13 unter Zusatz von Triethylamin

Enzym- Umsatz nach Umsatz nach


Enzym
menge 5 d (GC) 12 d (GC)

Novozym 435
30 mg 2% 4%
(immobilisierte CAL-B)

Chromobacterium viscosum Lipase


1 mg 0% 1%
(CVL, 3.58 U/mg)

Burkholderia cepacia Lipase


10 mg 0% 0%
(BCL, 40 U/mg)
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 249

3.6.12 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-


dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21)

3.6.12.1 CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.170 g (0.51 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 7.5 mg Cholesterolesterase (CE;
17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 16.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.107 g einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol
(−)-20 erhalten werden.

Tabelle 3.53: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E

16.75 h 64 % 71 % 11 % 2

3.6.12.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.184 g (0.55 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 150 µl (1.5 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die
Reaktion wurde nach 16.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit
Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.116 g einer Mischung
aus Ester (+)-21 und Phenol (−)-20 erhalten werden.
250 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.54: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E

3.25 h 82 % 20 % 6% 1.3

3.6.12.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.170 g (0.51 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
37 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 18.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.141 g einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol
(−)-20 erhalten werden.

Tabelle 3.55: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im Einphasensystem

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E

18.5 h 40 % 31 % 17 % 2

3.6.12.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrig-organischen


Zweiphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.162 g (0.48 mmol) des Esters rac-21 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
37 U/mg) versetzt. Die Reaktion wurde nach 46 Stunden durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.138 g
einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol (−)-20 erhalten werden.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 251

Tabelle 3.56: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im Zweiphasensystem

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-21 ee Phenol (−)-20 E

46 h 57 % 89 % 28 % 5

3.6.13 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-


dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-
ester (rac-22)

3.6.13.1 Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 im


wäßrigen Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.5, dazu
wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 20 mg Burkholderia cepacia
Lipase (BCL, 40 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Da nach
22 Stunden Reaktionszeit noch kein Produkt mit DC-Reaktionskontrolle detektiert
werden konnte, wurden die Reaktionstemperatur auf 35 ºC für die restliche
Reaktionszeit erhöht. Nach insgesamt 48 Stunden Reaktionszeit wurde durch
kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es
konnten 0.187 g Ester rac-22 erhalten werden.

Tabelle 3.57: Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

48 h 0% - - -
252 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.13.2 Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 20 mg Novozym 435
(immobilisierte CAL-B) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos; das
immobilisierte Enzym unlöslich. Da nach 19 Stunden Reaktionszeit noch kein
Produkt mit DC-Reaktionskontrolle detektiert werden konnte, wurden weitere 40 mg
Novozym 435 zur Reaktionslösung gegeben. Nach insgesamt 10 Tagen
Reaktionszeit wurde durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.200 g Ester rac-22 erhalten werden.

Tabelle 3.58: Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

10 d 35 % 67 % 85 % 24

3.6.13.3 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Chirazyme L-2 (CAL-
B; 154 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 45 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.181 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol
(−)-14 erhalten werden.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 253

Tabelle 3.59: Chirazyme L2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

45 h 7% 9% ≥98 % >200

3.6.13.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 7 mg Candida rugosa Lipase
(CRL; 25.9 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion
wurde nach 24 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.180 g einer Mischung aus Ester (+)-22
und Alkohol (−)-14 erhalten werden.

Tabelle 3.60: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen


Einphasensystem

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

24 h 27 % 38 % 92 % 34

3.6.13.5 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrig-organischen


Zweiphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.5, dazu
wurden 0.350 g (1.0 mmol) des Esters rac-22 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 7 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
25.9 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion
wurde nach 5 Tagen durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
254 EXPERIMENTELLER TEIL

und aufgearbeitet. Es konnten 0.226 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol
(−)-14 erhalten werden.

Tabelle 3.61: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrig-organischen


Zweiphasensystem

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

5d 34 % 37 % 69 % 8

3.6.13.6 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß in zwei Reaktionen nach AAV 6


bei pH 7.0, dazu wurden jeweils 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-
Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit jeweils
20 mg Cholesterolesterase (CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar
und farblos. Die Reaktionen wurden nach 2.5 Stunden und 18.5 Stunden durch
kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es
konnten 0.189 g und 0.185 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol (−)-14
erhalten werden.

Tabelle 3.62: CE-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-22

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

2.5 h 21 % 30 % ≥98 % >200


19.5 h 38 % 67 % 93 % 55
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 255

3.6.13.7 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen


Einphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Cholesterolesterase
(CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Zum Abbruch
der Reaktion nach 22.5 Stunden und zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung
dreimal mit je 40 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
wurden mit Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten
0.105 g (0.30 mmol, 53 %) (+)-22 mit einem ee-Wert von 91 % isoliert werden. Die
verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem
Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10
eingestellt. Anschließend wurde dreimal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und
die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am
Rotationsverdampfer wurden 0.071 g (0.25 mmol, 45 %) (−)-14 mit einem ee-Wert
von 91 % erhalten.

(+)-22: [α ] 20
D
= + 14.14º (c = 1.02, MeOH)

(−)-14: [α ] 20
D
= − 34.75º (c = 1.05, MeOH)

Tabelle 3.63: CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 mit extraktiver


Aufarbeitung

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (+)-22 Ester (+)-22 (−)-14 Alkohol (−)-14

22.5 h 91 % 53 % 91 % 45 % 67
256 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.13.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.221 g (0.57 mmol) des Esters rac-22⋅HCl in 4 ml tert-Butanol und 36 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 20 mg Cholesterolesterase
(CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion
wurde nach 19.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.166 g einer Mischung aus Ester (+)-22
und Alkohol (−)-14 erhalten werden.

Tabelle 3.64: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-22 ee Alkohol (−)-14 E

19.5 h 43 % 86 % 94 % 89

3.6.13.9 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen


Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 75 µl (0.8 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die
Reaktion wurde nach 16.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit
Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.179 g einer Mischung
aus Ester (−)-22 und Alkohol (+)-14 erhalten werden.

Tabelle 3.65: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (−)-22 ee Alkohol (+)-14 E

16.5 h 18 % 22 % 93 % 34
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 257

3.6.13.10 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen


Einphasensystem unter Zusatz von Aceton als Cosolvens

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 6.4 ml (16 Vol%) Aceton und 33.6 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 1.9 mg Chirazyme E1 (PLE,
Fraktion 1, 33.0 U/mg). Die Reaktionslösung war klar und farblos. Zum Abbruch der
Reaktion nach 42 Stunden, bei einem Umsatz von ca. 22 %, und zur Aufarbeitung
wurde die Reaktionslösung zunächst zweimal mit je 30-40 ml MTBE und
anschließend mit dreimal mit je 40 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer
eingeengt. Es konnten 0.147 g (0.42 mmol, 74 %) (−)-22 mit einem ee-Wert von
27 % isoliert werden. Die verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer
unter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von
Na2CO3 auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml
Dichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4
getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.037 g (0.13 mmol,
23 %) (+)-14 mit einem ee-Wert von 97 % erhalten.

Tabelle 3.66: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 unter Zusatz
von Aceton als Cosolvens

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14

42 h 27 % 74 % 97 % 23 % 85
258 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.13.11 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester


rac-22 (rac-22⋅HCl) im wäßrigen Einphasensystem

Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22

(rac-22⋅HCl) unter Zusatz von Aceton als Cosolvens

1.00 g (2.59 mmol) rac-22⋅HCl wurden zu einer Mischung aus 2 ml (16 Vol%) Aceton
und 10.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M, pH 7.0) gegeben. Die Lösung
wurde anschließend auf pH 7.0 eingestellt. Nachdem durch GC-Reaktionskontrolle
überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte,
wurden 9 mg Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) zugegeben. Danach wurde
der Ansatz bei Raumtemperatur über den gesamten Reaktionszeitraum kräftig
gerührt. Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde durch einen pH-STAT Autotitrator
mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten. Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurde
über die gesamte Reaktionsdauer verfolgt. Zur HPLC-Reaktionskontrolle wurden
analog zur AAV 6 zehn 100 µl Proben entnommen. Nach 24 Stunden wurde zum
Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die Reaktionslösung zunächst viermal
mit je 30-40 ml MTBE extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit
Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.591 g
(1.69 mmol, 65 %) farbloser, öliger Ester (−)-22 mit einem ee-Wert von 28 % isoliert
werden. Die verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter
vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3
auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml Dichlormethan
extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach
Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.165 g einer Mischung aus 82 %
(0.46 mmol, 18 %) Alkohol (+)-14 mit einem ee-Wert von 91 % und 18 % (0.10 mmol,
4 %) Ester (−)-22 (mit einem ee-Wert von 28 %) erhalten.

(−)-22: [α ] 20
D
= − 4.62º (c = 0.96, MeOH)

(+)-14: [α ] 20
D
= + 26.40º (c = 0.32, MeOH)
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 259

Tabelle 3.67: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl unter


Zusatz von Aceton als Cosolvens

Reaktions- Umsatz (HPLC) ee Ester (−)-22 ee Alkohol (+)-14 E


zeit (%) (%) (%)

1h 2 2 ≥98 -
1.5 h 3 3 ≥98 -
3h 4 5 ≥98 -
4.25 h 7 7 ≥98 -
5.25 h 8 9 ≥98 -
7.25 h 10 11 ≥98 -
22.5 h 20 26 95 50

Tabelle 3.68: Ergebnis nach Aufarbeitung der Chirazyme E1-katalysierten


Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14

24 h 28 % 65 % 91 % 18 % 27

Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22⋅HCl


mit und ohne Zusatz von Aceton als Cosolvens

In zwei parallelen Versuchen wurde 1.00 g (2.59 mmol) rac-22⋅HCl einmal zu einer
Mischung aus 2 ml Aceton (16 Vol%) und 10.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung
(0.1 M, pH 7.25) und ein zweitesmal zu 12.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung
(0.1 M) gegeben. Die Lösungen wurden anschließend auf pH 7.25 eingestellt.
Nachdem durch GC-Reaktionskontrolle überprüft worden war, daß keine nicht-
enzymatische Reaktion stattgefunden hatte, wurde zu beiden Versuchen jeweils
9 mg Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) zugegeben. Danach wurden die
Ansätze über den gesamten Reaktionszeitraum kräftig gerührt. Aufgrund eines
technischen Defekts fiel die Temperatur nach 8 Stunden für die restliche
260 EXPERIMENTELLER TEIL

Reaktionszeit drastisch ab. Zur HPLC-Reaktionskontrolle wurden analog zur AAV 6


100 µl Proben entnommen.

Tabelle 3.69: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse von rac-22⋅HCl mit und ohne
Zusatz von Aceton als Cosolvens

mit Zusatz von Aceton ohne Zusatz von Aceton


Umsatz ee Ester ee Alkohol Umsatz ee Ester ee Alkohol
Zeit (HPLC) (−)-22 (+)-14 (HPLC) (−)-22 (+)-14
(h) (%) (%) (%) (%) (%) (%)

2.5 6 n. b. ≥98 8 n. b. ≥98


5 7 9 ≥98 18 21 ≥98
7.5 8 13 ≥98 21 31 98
22 16 20 ≥98 36 47 98
27 13 22 ≥98 38 59 90
30 17 23 ≥98 38 61 89
48 15 27 ≥98 36 65 88
103 17 30 ≥98 43 74 85
175 21 29 ≥98 42 75 85
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 261

Tabelle 3.70: E-Werte der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse von rac-22⋅HCl


mit und ohne Zusatz von Aceton als Cosolvens

Reaktionszeit mit Zusatz von Aceton ohne Zusatz von Aceton


(h) E-Wert E-Wert
2.5 >200 >200
5 >200 >200
7.5 >200 134
22 >200 157
27 >200 34
30 >200 31
48 >200 30
103 >200 27
175 >200 27

3.6.14 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-


dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl-
ester (rac-23)

3.6.14.1 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23 im wäßrigen


Einphasensystem mit Aufarbeitung durch kontinuierliche Extraktion

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.432 g (1.14 mmol) des Esters rac-23 in 6.4 ml (16 Vol%) Aceton und 33.6 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 3.8 mg Chirazyme E1 (PLE,
Fraktion 1, 33.0 U/mg). Die Reaktionslösung war während der ersten Stunden der
Reaktion stark getrübt, in Laufe der Reaktion verschwand diese Trübung. Nach
24 Stunden wurde zum Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die
Reaktionslösung zunächst dreimal mit je 30-40 ml MTBE und dann dreimal mit je
25 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit
Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.234 g
262 EXPERIMENTELLER TEIL

(0.62 mmol, 54 %) durch Spuren von Hexansäure penetrant ziegenähnlich


riechender Ester (−)-23 mit einem ee-Wert von 92 % isoliert werden. Die verbliebene
wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck von
Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt.
Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und die
vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am
Rotationsverdampfer wurden 0.146 g (0.52 mmol, 46 %) (+)-14 als Öl mit einem ee-
Wert von 77 % erhalten.

(−)-23: [α ] 20
D
= − 6.70º (c = 1.93, MeOH)

(+)-14: [α ] 20
D
= + 25.83º (c = 0.9, MeOH)

Tabelle 3.71: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-23 unter Zusatz
von Aceton als Cosolvens

Reaktions- ee Ester Ausbeute ee Alkohol Ausbeute


E
zeit (−)-22 Ester (−)-22 (+)-14 Alkohol (+)-14

24 h 92 % 54 % 77 % 46 % 24

3.6.15 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-


Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol
(rac-14)

3.6.15.1 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14

Die Enzym-katalysierte Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.72 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL; 37 U/mg) umgesetzt. In allen Reaktionen
entstand eine klare Lösung in der das unlösliche Enzym suspendiert war.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 263

Tabelle 3.72: CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14

Reaktionsbedingungen 16 d E-Wert

108 mg (1.5 mmol) Umsatz (GC) 18 %


Vinylacetat ee Ester (−)-24 44 % 5
5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 72 %

Umsatz (GC) 11 %
5 ml (54 mmol)
ee Ester (−)-24 47 % 4
Vinylacetat
ee Alkohol (+)-14 48 %

125 mg (1.5 mmol) Umsatz (GC) 25 %


Isopropenylacetat ee Ester (−)-24 68 % 14
5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 87 %

Umsatz (GC) 12 %
5 ml (70 mmol)
ee Ester (−)-24 77 % 10
Isopropenylacetat
ee Alkohol (+)-14 35 %

3.6.15.2 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit


Vinylacetat

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.73 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 10 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt. Zu Beginn der
Reaktion waren alle Reaktionslösungen klar und farblos. Nach 24 Stunden zeigten
alle Reaktionen eine milchige Trübung.
264 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.73: Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit


Vinylacetat

Reaktionsbedingungen 48 h E-Wert

129 mg (1.5 mmol) Umsatz (HPLC) 70 %


Vinylacetat, ee Ester (−)-24 90 % 38
5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 67 %

125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 79 %


Vinylacetat, ee Ester (−)-24 90 % 99
5 ml Dichlormethan ee Alkohol (+)-14 ≥98 %

3.6.15.3 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit


Vinylpropionat

a) mit 10 mg Novozym 435

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in drei


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.74 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 10 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt. Zu Beginn der
Reaktion waren alle Reaktionslösungen klar und farblos. Nach 24 Stunden zeigten
alle Reaktionen eine milchige Trübung. In der Reaktion mit H2O-Zusatz war
zusätzlich noch ein weißer Niederschlag zu erkennen.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 265

Tabelle 3.74: Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat, katalysiert


durch 10 mg Novozym 435

Reaktionsbedingungen 24 h E-Wert

125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 51 %


Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 92 % 89
5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 95 %

125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 35 %


Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 89 % 30
10 µl H2O, 5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 56 %

125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 50 %


Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 98 % >200
5 ml Dichlormethan ee Alkohol (+)-14 86 %

Umsatz (HPLC) 52 %
5 ml (49.95 mmol)
ee Ester (−)-45 97 % 192
Vinylpropionat
ee Alkohol (+)-14 88 %

b) mit 5 mg Novozym 435

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in vier


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.75 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 5 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt. Zu Beginn der
Reaktion waren alle Reaktionslösungen klar und farblos. Bis auf die Reaktion unter
Zusatz von Triethylamin zeigten die anderen Reaktion nach ca. 48 Stunden eine
milchige Trübung.
266 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.75: Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat, katalysiert


durch 5 mg Novozym 435

Reaktionsbedingung 7.6 h 23.3 h 31.5 h 47.75 h

125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 51 % 53 % 52 % 53 %


Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 88 % 91 % 91 % 91 %
5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 91 % 98 % 95 % ≥98 %

Umsatz (HPLC) 50 % 53 % 52 % 52 %
5 ml (49.95 mmol)
ee Ester (−)-45 92 % 93 % 92 % 92 %
Vinylpropionat
ee Alkohol (+)-14 93 % ≥98 % ≥98 % ≥98 %

125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 54 % 55 % 56 % 56 %


Vinylpropionat, ee Ester (−)-45 92 % 93 % 93 % 91 %
6 mg Triethylamin, ee Alkohol (+)-14 ≥98 % ≥98 % ≥98 % ≥98 %
5 ml Toluol

Tabelle 3.76: E-Werte der Novozym 435-katalysierten Transacylierungen des


Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat

Reaktionsbedingungen 7.6 h 23.3 h 31.5 h 47.75 h Mittel

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat,


49 97 78 111 84
5 ml Toluol

5 ml (49.95 mmol) Vinylpropionat 81 144 125 125 119

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat,


125 144 144 111 131
6 mg Triethylamin, 5 ml Toluol
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 267

3.6.15.4 Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit


Isopropenylacetat

Die Enzym-katalysierten Transacylierung erfolgte gemäß AAV 8. Dazu wurde


0.070 g (0.25 mmol) des Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.77 aufgeführten
Reaktionsbedingungen mit 10 mg Novozym 435 (immobilisierte CAL-B) umgesetzt.
Die Reaktionslösungen war über die gesamten Reaktionszeit klar und farblos.

Tabelle 3.77: Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit


Isopropenylacetat

Reaktionsbedingungen 24 h E-Wert

125 mg (1.25 mmol) Umsatz (HPLC) 51 %


Isopropenylacetat, ee Ester (−)-24 94 % 170
5 ml Toluol ee Alkohol (+)-14 ≥98 %

3.6.15.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols


rac-14

Die Enzym-katalysierten Transacylierungen erfolgten gemäß AAV 8 in zwei


verschiedenen parallelen Ansätzen. Dazu wurden jeweils 0.070 g (0.25 mmol) des
Alkohols rac-14 unter den in Tabelle 3.78 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit
jeweils 7 mg MPEG/PLE (153 U/mg PLE) in 5 ml Toluol umgesetzt.

Tabelle 3.78: Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols


rac-14 in Toluol

Reaktionsbedingungen Reaktionszeit Umsatz (GC)

125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat 20 d 2%

125 mg (1.25 mmol) Isopropenylacetat 20 d 0%


268 EXPERIMENTELLER TEIL

3.6.15.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des


Alkohols rac-14

Die Enzym-katalysierte Transacylierung erfolgte gemäß AAV 8, dazu wurden 0.070 g


(0.25 mmol) des Alkohols rac-14 und 108 mg (1.25 mmol) Vinylacetat mit 60 mg
PLE/BSA/MPEG (148 U/mg PLE) in 6 ml Toluol umgesetzt. Es entstand eine klare
Lösung. Die Farbe des PLE/BSA-Katalysators änderte sich im Laufe der
Reaktionszeit von weiß in ein dunkles rot-braun.

Tabelle 3.79: Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des


Alkohols rac-14

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester (+)-45 ee Alkohol (−)-14 E

11 d 0% - - -

3.6.15.7 Versuch zur Chirazyme E1-katalysierte Transacylierungen des


Alkohols rac-14

Die Enzym-katalysierte Transacylierung erfolgte gemäß AAV 8, dazu wurden 0.070 g


(0.25 mmol) des Alkohols rac-14 und 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat mit 5 mg
Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) in 5 ml Toluol umgesetzt.

Tabelle 3.80: Versuch zur Chirazyme E1-katalysierten Transacylierung des


Alkohols rac-14

Reaktionszeit Umsatz (HPLC) ee Ester (+)-45 ee Alkohol (−)-14 E

47.75 h 2% ≥98 % 3% -
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 269

3.6.16 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-


Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-
phenyl)-cyclohexylester (rac-25)

3.6.16.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 im


wäßrigen Einphasensystem

Die Enzym-katalysierte Hydrolysen erfolgten gemäß AAV 6 in zwei verschiedenen


Ansätzen bei pH 7.0, dazu wurden jeweils 0.200 g (0.48 mmol) des Esters rac-25 in
4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit
der in Tabelle 3.81 angegebenen Mengen des jeweiligen Enzyms umgesetzt. Nach
der in Tabelle 3.81 angegebenen Reaktionszeit wurden die Reaktionen durch
kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet.

Tabelle 3.81: Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25

Enzym- Reaktions- Ausbeute Umsatz


Enzym
menge zeit Ester 25 (GC)

Cholesterolesterase 30 mg 25 h 165 mg 0%
(CE; 17.5 U/mg)

Candida rugosa Lipase 10 mg 44 h 195 mg 0%


(CRL; 37 U/mg)

3.6.16.2 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25

Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.200 g (0.48 mmol) des Esters rac-25 in 6 ml Aceton und 34 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 150 µl (1.5 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Nach 42 Stunden wurde die Reaktion durch
kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es
konnten 0.199 g Ester 25 erhalten werden.
270 EXPERIMENTELLER TEIL

Tabelle 3.82: Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25

Reaktionszeit Umsatz (GC) ee Ester 19 ee Alkohol 13 E

42 h 1% - - -
ANHANG ZUM EXPERIMENTELLEN TEIL 271

3.7 Anhang zum experimentellen Teil

3.7.1 Programm zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE durch


Verseifung von Buttersäureethylester

Mode STAT
Regelparameter Endpunkt pH 8.00
Regelbereich 0.5
Max. Rate 10.0 ml/Min.
Min. Rate 25.0 µl/Min.
Titrationsparameter Start V aus
Start 0s
Start pH aus
Startrate aus
Zeitintervall 60 s
Titrationsrichtung +
Meßeingang 1
Parameter

Abbruchbedingungen Stoppzeit abs. 7000 s


Stoppvolumen abs. 99.99 ml
Stopprate aus
Füllgeschwindigkeit max
Statistik Status aus
Auswertung U. Grenze 1 aus
Fix-V1 bis Fix-V9 alle 600 s (→ C51 bis C59)
Fix-Zeit 1 aus
Überwachung Alle Unterpunkte aus
Vorwahl Ident. abfragen aus
Einmass abfragen alle (→ C00)
Rate anzeigen aus
Aktivierpuls aus
c-fml C01=0.01
Formel RS1 = (C52 − C51) / (C00 ∗ C01) = 10 – 20 Min. [U]
Report Kurve, voll, Liste
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5 Lebenslauf

Name: Carsten Griebel


Geburtstag: 12.11.1971
Geburtsort: Niebüll
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand: ledig

Schulausbildung:
08/1978 – 06/1982 Grundschule Emmelsbüll-Horsbüll
08/1982 – 07/1989 Friedrich-Paulsen-Schule Niebüll,
Gymnasium des Kreises Nordfriesland
08/1989 – 06/1991 Städtisches Mathematisch-Naturwissenschaftliches
Gymnasium Mönchengladbach
06/1991 Allgemeine Hochschulreife (Abitur)

Studium:
10/1991 – 03/1998 Diplomstudiengang Chemie an der Rheinisch-
Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
06/1994 Vordiplom
10/1997 – 03/1998 Diplomarbeit am Institut für Organische Chemie der
RWTH-Aachen unter Anleitung von Prof. Dr. H.-J. Gais mit
dem Titel:
„Enzymatische Racematspaltungen von phenolischen
Analgetika“
03/1998 Abschluß: Diplom-Chemiker

Promotion:
04/1998 – 02/2002 Dissertation bei Prof. Dr. H.-J. Gais am Institut für
Organische Chemie der RWTH-Aachen mit Thema:
„Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von
Tramadol–Analoga und deren industrielle Anwendbarkeit“
13.12.2002 Tag der mündlichen Prüfung