Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Rheinisch-
Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Diplom-Chemiker
Carsten Griebel
aus
Niebüll
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.
Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum vom 01.04.1998 bis zum 28.02.2002 am
Institut für Organische Chemie der Rheinisch Westfälischen Technischen
Hochschule Aachen unter Anleitung von Prof. Dr. H.-J. Gais angefertigt.
„Wenn wir wüßten, was wir tun,
würden wir das nicht Forschung nennen.“
(Albert Einstein)
Danksagung
Ich möchte mich an dieser Stelle bei allen Mitarbeitern des Instituts für Organische Chemie
der RWTH Aachen bedanken. Besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. H.-J. Gais für die
engagierte Unterstützung und Betreuung dieser Arbeit, die interessanten und anregenden
Diskussionen sowie für die Bereitstellung der ausgezeichneten Arbeitsbedingungen. Allen
Arbeitskreismitgliedern danke ich für die angenehme und freundschaftliche
Arbeitsatmosphäre, die stete Diskussionsbereitschaft sowie für die gute Zusammenarbeit.
Für die hilfreichen Anregungen bei der Fertigstellung der vorliegenden Arbeit danke ich
Herrn Dipl.-Chem. Stefan Koep.
Bei Frau Ing. Cornelia Vermeeren möchte ich mich besonders für die Lösung einer Vielzahl
von Trennproblemen und für ihre stete Hilfsbereitschaft bedanken. Besonderer Dank gebührt
auch Frau Magdalena Grosch und Frau Ursula Ripkens für die durchgeführten HPLC-
Trennungen.
Für die Ausführung von analytischen Aufgaben möchte ich mich bei Frau Dittrich, Frau
Glensk, Frau Kuyper, Frau Müller, und Herrn Dr. Runsink bedanken und für die Abwicklung
organisatorischer Aufgaben bei Frau Bertrand, Frau Renardy, Herrn Dr. Bettray und Herrn
Dr. Geibel.
Meiner Forschungspraktikantin Frau Dipl.-Chem. Martina Mennicken danke ich für ihre
präparative Unterstützung und engagierte Mitarbeit.
Ein großer Dank gebührt auch den Mitarbeitern der Grünenthal GmbH, die mich hilfsbereit
unterstützt haben. Im besonderen möchte ich Herrn Dr. Helmut Buschmann für seine
engagierte Unterstützung dieser Arbeit danken, ebenso Herrn Heinz-Günter Döteberg, Herrn
Dr. Michael Finkam, Herrn Dr. Bernd Sundermann, Herrn Dr. Oswald Zimmer und nicht
zuletzt denjenigen Mitarbeitern, die es ermöglicht haben, daß mir die benötigten Substanzen
zur Verfügung gestellt werden konnten.
Ganz besonders möchte ich mich herzlich bei meiner Familie und meinen Freunden
bedanken, die mich während meiner Promotionszeit unterstützt haben.
Teile dieser Arbeit wurden auszugsweise publiziert in:
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VIII
2 THEORETISCHER TEIL 13
2.1 Darstellung und Charakterisierung der MPEG/PLE-Katalysator Präparation 13
2.2 Darstellung der racemischen Tramadol-Analoga 16
2.2.1 Synthesewege der von GRÜNENTHAL bereitgestellten Substanzen 24
2.3 Vorbemerkungen zu Enzym-Katalyse 26
2.3.1 Kinetische Racematspaltungen 26
2.3.1.1 Der E-Wert 29
2.3.2 Auswahl geeigneter Enzyme und Reaktionsmedien 35
2.3.2.1 Auswahl der verwendeten Substrate und Reaktionsbedingungen in der
enzymatischen Hydrolyse 38
2.3.2.2 Auswahl der verwendeten Acyldonoren und Reaktionsbedingungen in der
enzymatischen Transacylierung 39
2.4 Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von Tramadol-Analoga 42
2.4.1 Substrate auf Basis aromatischer Hydroxylfunktionen 42
2.4.1.1 Enzym-katalysierte Hydrolysen des (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylamino-
methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) 49
2.4.1.2 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylamino-
methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 59
2.4.1.3 Enzym-katalysierte Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) 63
2.4.1.4 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-
1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 73
2.4.1.5 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethyl-
amino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) 75
2.4.2 Substrate auf Basis sekundärer Hydroxylfunktionen 77
2.4.2.1 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino-
methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 82
2.4.2.2 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-
1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 93
2.4.2.3 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-
4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 104
VERZEICHNISSE II
3.6.8.5 Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen
Einphasensystem 237
3.6.8.6 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasen-
system 237
3.6.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-
1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 238
3.6.9.1 Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit
Isopropenylacetat 238
3.6.9.2 BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 238
3.6.9.3 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 239
3.6.9.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat 241
3.6.9.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 242
3.6.9.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 243
3.6.10 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-
4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 244
3.6.10.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter Verwendung
verschiedener Lipasen im wäßrigen Einphasensystem 244
3.6.10.2 Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrig-organischen
Zweiphasensystem 245
3.6.10.3 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrigen Einphasen-
system 246
3.6.11 Versuche zur Enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethyl-
aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 246
3.6.11.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter
Verwendung verschiedener Lipasen 246
3.6.11.2 Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 247
3.6.11.3 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Zusatz
von Triethylamin 248
3.6.12 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino-
methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 249
3.6.12.1 CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 249
3.6.12.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 249
3.6.12.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 250
3.6.12.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrig-organischen Zweiphasen-
system 250
3.6.13 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylamino-
methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 251
3.6.13.1 Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen
Einphasensystem 251
3.6.13.2 Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen-
system 252
VII VERZEICHNISSE
4 LITERATUR 272
VERZEICHNISSE VIII
Abkürzungsverzeichnis
AAV Allgemeine Arbeitsvorschrift
Abb. Abbildung
AChE Acetylcholinesterase
abs. absolut
APT attached proton test
Äq. Äquivalent
BSA Rinderserum-Albumin (bovine serum albumin)
BCL Burkholderia cepacia Lipase
c Umsatz (conversion)
d Duplett
d Tag
dest. Wasser vollentmineralisiertes Wasser
CAL-B Candida antarctica Lipase, Typ B
CE Cholesterolesterase
CRL Candida rugosa Lipase
CVL Chromobacterium viscosum Lipase
Da Dalton
DC Dünnschichtchromatographie
DCM Dichlormethan
DiBAl-H Diisobutylaluminiumhydrid
E-Wert Selektivitätsparameter nach Chen und Sih
(Enantiomeric Ratio)
ee Enantiomerenüberschuß (enantiomeric excess)
EE Essigsäureethylester
Et Ethyl
EtOH Ethanol
GC Gaschromatographie
ges. gesättigt
h Stunde
HLE Pferdeleber-Esterase (horse liver esterase)
HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie
HV Hochvakuum
J Kopplungskonstante
IX VERZEICHNISSE
KOtBu Kalium-tert-butylat
log P-Wert Logarithmus des Verteilungskoeffizienten eines
Lösungsmittels zwischen Oktanol und Wasser
m Multiplett
MeOH Methanol
Min. Minuten
MPEG Polyethylenglykolmonomethylether
MPEG/PLE Colyophilisat aus Schweineleber-Esterase und Poly-
ethylenglykolmonomethylether
MTBE tert-Butyl-methylether
MW Molekulargewicht
n. b. nicht bestimmt
NMR Kernmagnetische Resonanzspektroskopie (nuclear
magnetic resonance)
PLE Schweineleber-Esterase (porcine liver esterase)
PLE/BSA/MPEG Colyophilisat aus Schweineleber-Esterase, Poly-
ethylenglykolmonomethylether und Rinderserum-
Albumin
PPL Schweinepankreaslipase (porcine pancreatic lipase)
ppm parts per million
Pr Propyl
PrOH Propanol
Rf Retentionsfaktor (ratio of fronts)
Rfl. Rückfluß
RT Raumtemperatur
s Singulett
Smp. Schmelzpunkt
TEA Triethylamin
TMS Tetramethylsilan
t Triplett
tR Retentionszeit
U Aktivitätseinheit (Units)
wfr. Wasserfrei
1 Einleitung und Zielsetzung
Enzyme aus der Klasse der Hydrolasen (Lipasen, Proteasen u. a.) sind für
technische Anwendungen besonders interessant, da sie in großer Zahl kommerziell
erhältlich sind4, zur Entfaltung ihrer katalytischen Aktivität keine teuren und eventuell
zu regenerierenden Cofaktoren benötigen und ein breites Substratspektrum
akzeptieren.5,6,7,8 Lipasen werden zur Modifizierung von Fetten, zur Synthese von
Estern und zur kinetischen Racematspaltung eingesetzt.9,10,11 Hierbei ist die
Stabilisierung und effektive Immobilisierung der Enzyme zur Erhöhung der
Betriebsstabilität, zur leichten Abtrennung und zur Wiederverwendung bei der
absatzweisen Reaktionsführung von besonderer Bedeutung.9 Als aktuelle Methoden
zur Stabilisierung von Enzymen sind vor allem die von der Firma ALTUS entwickelte
Quervernetzung von Enzymkristallen (CLECs)12,13 und das von REETZ et al.
entwickelte Verfahren zum Einschluß von Enzymen in hydrophobe Sol-Gele14,15 zu
nennen. Alternativen zur Immobilisierung von Enzymen auf unlöslichen Trägern
stellen Systeme zur Enzymrückhaltung wie Enzym-Membran-Reaktoren (EMR)16,17
oder die von der Firma SEPRACORE entwickelten Hohlfasermodule18,19 dar.
Der Einsatz von nicht-wäßrigen Reaktionsmedien eröffnet der Enzymkatalyse den
Zugang zu einer Vielzahl von neuartigen Anwendungen.20,21 In Zukunft wird auch der
Einsatz von Enzymen, die durch Mutationen optimiert wurden, eine wichtige Rolle
spielen. Solche Mutationen können zufällig eingeführt werden, so daß in einem
anschließenden Selektionsverfahren dann Enzyme mit verbesserten Eigenschaften
identifiziert werden können (directed evolution).22 Mutationen können auch gezielt
vorgenommen werden, nachdem anhand der Proteinstruktur Aminosäuren
identifiziert wurden, deren Austausch verbesserte Eigenschaften erwarten läßt.23
2 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG
Die Wirkstoffsynthese in der medizinischen Chemie ist ein ideales Einsatzgebiet für
biokatalytische Methoden.10,24 Viele Wirkstoffe sind chiral, und es muß mit
unterschiedlicher biologischer Aktivität der Enantiomeren gerechnet werden.25 Ein
Racemat wird daher als Gemisch zweier Wirkstoffe behandelt. Nur wenn beide
Enantiomere annähernd identische Wirkung aufweisen oder synergistische Effekte
zwischen den beiden Wirkstoffe bestehen, kann ein Racemat als Medikament
zugelassen werden. Ausnahmen sind Substanzen, die unter physiologischen
Bedingungen racemisieren oder Substanzen die metabolisch deracemisiert werden,
wie beispielsweise das Ibuprofen: (R)-Ibuprofen wird unter physiologischen
Bedingungen in das ungefähr viermal wirksamere (S)-Ibuprofen umgewandelt.26
1522 Wirkstoffe
Die Behandlung von Schmerzen hat in der Medizin eine große Bedeutung. Es
besteht zur Zeit noch ein weltweiter Bedarf an gut wirksamen Schmerztherapien für
eine patientengerechte und zielorientierte Behandlung. Zentralwirksame Opioide38,
die auch als stark wirksame (morphinartige) Analgetikaa bezeichnet werden, werden
seit langem in der Schmerztherapie eingesetzt, obwohl sie ein dem Morphin
ähnliches Wirkungsprofil haben. Sie rufen eine Reihe von Nebenwirkungen wie
Sucht, Abhängigkeit, Atemdepression, gastro-intestinale Hemmwirkung und
39
Obstipation in unterschiedlicher Stärke hervor. Die moderne Analgesieforschung ist
a
algos (griech.) = Schmerz
4 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG
Morphinc (1, s. Abb. 1.2) ist eines der wenigen Beispiele eines Naturstoffs, der auch
heute noch in seiner ursprünglichen Form in der Therapie eingesetzt wird.48
SERTÜRNER isolierte 1806 das Morphin erstmals aus Opium. Die Klärung der Struktur
des Morphins, an der viele Forscher beteiligt waren, hat über 120 Jahre gedauert.
Die 1925 von ROBINSON und GULLAND angegebene Strukturformel wurde 1952 von
GATES und TSCHUDI bestätigt, denen die Totalsynthese des Morphins und damit auch
die Klärung der Stereochemie gelang. Diese vielstufige Synthese hat allerdings keine
praktische Bedeutung erlangt, da Morphin bis heute aus Opium gewonnen wird.49
b
Endo-Morphine
c
Morpheus = griech. Gott des Schlafs
OPIOIDE ANALGETIKA 5
R1O
OH
O H O
N CH3 Me
N
R2O OH
Morphin (1): R1 = R2 = H 1
Codein (2): R1 = Me, R2 = H
Heroin (3): R1 = R2 = Acetyl
Abb. 1.2: Morphin in einer konventionellen Darstellung nach Robinson (links) und
in einer Stereoformel (rechts).
Morphin stellt den Prototyp und auch den Standard der stark wirksamen Analgetika
zur Behandlung heftiger akuter und chronischer Schmerzen dar.50 Auf der Suche
nach analgetisch wirksamen Verbindungen ist die Struktur des Morphins vielfältig
variiert worden. Dabei zeigte sich, daß auch sehr weit abgewandelte Derivate typisch
morphinartige Eigenschaften besitzen können.51 Die Forschung auf dem
Morphingebiet zeigt weiter, wie aus einem komplexen Naturstoff durch systematische
Strukturvariation leichter herzustellende, strukturell einfache Analoga mit identischer
Wirkung, zum Teil sogar mit höherer Spezifität der Wirkung, gewonnen werden.26
Erste Abwandlungsprodukte wie Codein, der Methylether von 1, oder Heroin, das
Diacetylderivat von 1, waren ebenfalls Naturstoffe. Codein ist zwar schwächer
wirksam als Morphin, weist aber auch ein geringeres Suchtpotential auf. Für Heroin
trifft das Gegenteil zu, es weist ein sehr großes Suchtpotential auf.26
CH3
O O
CH3 N O
O CH3
CH3
N H 3C N
N
CH3 CH3
4 (-)-5 6
Pethidin Levomethadon Fentanyl
Abb. 1.3: Verschiedene opioide Wirkstoffe.
Pethidin52 (4, s. Abb. 1.3), das erste vollsynthetische Schmerzmittel vom Morphintyp,
wurde 1939 von EISLEB bei der Suche nach krampflösenden Wirkstoffen durch
6 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG
Fentanyl (6, s. Abb. 1.3), das ebenfalls synthetisch hergestellt wird, ist eines der am
stärksten wirksamen Analgetika, das etwa 100mal stärker wirksam ist als Morphin.
Es wirkt hauptsächlich über den µ-Rezeptorsubtyp.47 Fentanyl wird wegen seiner
relativ kurzen Wirkungsdauer von etwa 30 Minuten ebenfalls in der
Neuroleptanalgesie eingesetzt. Darunter versteht man ein Verfahren bei dem ein
Neuroleptikum gleichzeitig mit einem stark wirksamen Analgetikum injiziert und
dadurch ein Zustand induziert wird, bei dem der Patient sediert und angstfrei ist. So
können kleinere Eingriffe (wie beispielsweise Endoskopien) vorgenommen werden,
bei denen das Erwachen ohne Desorientierung vor sich geht und eine postoperative
Analgesie gewährleistet ist.41,44,55 Fentanyl und dessen Derivate mit einem hohen
Mißbrauchspotential („Designer Drogen“)56 zeigen die typischen Nebenwirkungen
starker µ-Opioide und führen zu einer physischen Abhängigkeit, ähnlich wie beim
Morphin.
Tramadol57 (rac-7, s. Abb. 1.4) nimmt unter den stark wirksamen Analgetika eine
Sonderstellung ein, da dieser Wirkstoff eine starke Schmerzhemmung ohne die für
Opioide typischen Nebenwirkungen hervorruft.58 Das Suchtpotential ist so gering43,
das dieser Wirkstoff nicht unter Kontrollmaßnahmen von Narkotika fällt, in
Deutschland das Betäubungsmittelgesetz. Tramadol, das 1976 von der GRÜNENTHAL
GmbH in die Schmerztherapie eingeführt wurde, wird von der WORLD HEALTH
ORGANISATION (WHO) auf Stufe zwei der Schmerztherapie krebskranker Patienten
empfohlen.59 Tramadol wird weltweit vermarktet und ist eines der wichtigsten
zentralwirksamen Schmerzmittel.59
OH OH
(S)
(R)
OCH3 H3CO
(R) (S)
H3C N N CH3
CH3 H3C
(+)-(1R,2R)-Tramadol (−)-(1S,2S)-Tramadol
Abb. 1.4: Die Enantiomere des Tramadols ((+)-7, (−)-7).
OH
OH
O
H3C HO
CH3
N N
OH
CH3
(−)-1 (+)-8
Abb. 1.5: Strukturelle Ähnlichkeit zwischen Morphin und (+)-O-Desmethyltramadol.
Sowohl für Opioide als auch für Endorphine und Enkephaline, die an diesen
Rezeptoren eine analgetische Wirkung auslösen, sind intensive Untersuchungen zur
Struktur-Aktivitäts-Beziehung durchgeführt worden.26,57,64 Demnach ist für ein aktives
Molekül ein in 1-Stellung arylsubstituiertes Cycloalkangrundgerüst, welches in 2-
Stellung aminoalkyliert ist, essentiell. Bei systematischen Variationen des Tramadol-
grundgerüsts stellte die GRÜNENTHAL GmbH fest, daß eine meta-Hydroxyfunktion am
Phenylring zur stärksten analgetischen Wirkung führt und daß die agonistische
Wirkung an die Dimethylaminogruppe gebunden ist. Bei Variationen der Ringgröße
hat sich der Sechsring als optimal herausgestellt.57 Eine freie Hydroxyfunktion am
quarternären Zentrum erweist sich außerdem als günstig, da die analgetische
Wirkung durch Substitution mit Chlor oder Wasserstoff verringert wird, bei
Veresterung geht sie völlig verloren.57
Daß sich das Agonist/Antagonist-Verhältnis eines Moleküls über die Stickstoff-
substitution beeinflussen läßt, zeigt sich im Naloxon (9) und Naltrexon (10) (s. Abb.
1.6, S. 9). Hier ist unter anderem ein N-Methylrest gegen einen Allyl- oder einen
Methylencyclopropyl-Rest ersetzt worden: beide Verbindungen sind dadurch Opioid-
Antagonisten. Des weiteren ist die räumliche Anordnung dieser Gruppen für die
Analgesiewirkung entscheidend. Allerdings kann eine vollständige Struktur-Aktivitäts-
Beziehung immer noch nicht aufgestellt werden.38
TRAMADOL UND ANALGETISCH AKTIVE ANALOGA 9
HO HO
O OH O OH
N N
CH2
O O
Naloxon (9) Naltrexon (10)
Abb. 1.6: Opioid-Antagonisten.
1) TMSCl, TEA
O
O CH3 2) ClCH2OEt O
N N
H OTMS CH3
57 % RMgBr
H3CO
OH
H3CO
(H3C)2N 1) MeOTf OH
2) TEA O
N
rac-7, de = 92 % CH3
Abb. 1.7: Festphasensynthese von Tramadol nach GRIGG et al.
O
O O O O
O O
OCH3 OCH3
N N
H
OCH3
67 % (H3C)2N CH2I
1.3 Zielsetzung
Bei der Racematspaltung von Tramadol und seinen Derivaten durch Kristallisation
diastereomerer Salze konnten bisher noch keine allgemeinen Richtlinien zur
Prädiktivität entwickelt werden, da schon geringe strukturelle Variationen häufig zu
einem nicht vorhersagbaren Verhalten in der Umsetzung mit den
Kristallisationsreagenzien führen. Präparative chromatographische HPLC an chiraler
stationärer Phase ist nur bedingt zur Bereitstellung kleiner Substanzmengen (1 bis
10 g) geeignet.
12 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, in Zusammenarbeit mit der GRÜNENTHAL
GmbH beide Enantiomere von Tramadol-Analoga durch eine Hydrolasen-katalysierte
kinetische Racematspaltung enantiomerenrein darzustellen. Mögliche
Funktionalitäten von Substraten auf Tramadol-Basis, die als Angriffspunkt für eine
Hydrolasen-katalysierte Reaktion dienen können, sind in Abb. 1.10 dargestellt.
Es ist bekannt, das native PLE im Gegensatz zu Lipasen nur eine sehr geringe
Aktivität im organischen Medium aufweist. Für einige Lipasen ist gezeigt worden, daß
durch Zusatz von Proteinen oder amphiphilen Verbindungen wie Polyethylenglycol
sie vor Änderung ihrer Konformation und somit Verminderung ihrer katalytischen
Aktivität geschützt werden können. GAIS et al. konnten dieses Konzept auf die PLE
erweitern und zeigen, daß eine Aktivierung durch Methoxypolyethylenglycol (MPEG)
möglich ist.81,82,83 Die besten Erfolge wurden hier durch Colyophilisierung von PLE
mit MPEG erzielt, wobei eine aufwendige kovalente Modifizierung des Enzyms nicht
notwendig ist.84 Durch die gemeinsame Gefriertrocknung von PLE und MPEG
werden vermutlich nicht-kovalente Komplexe zwischen Enzym und Polymer gebildet,
die, sofern sie nicht durch Lösungsmitteleinflüsse zerstört werden, zu einer
Aktivitätssteigerung führen. Das MPEG kann weiterhin geringe Mengen Wasser, die
für die katalytische Aktivität des Enzyms benötigt werden und auf der Oberfläche des
Enzyms gebunden sind, bereitstellen.
Die Standardaktivität von PLE wird im Rahmen dieser Arbeit durch Hydrolyse von
0.25 M Buttersäureethylester fein emulgiert in 0.1 M Phosphatpufferlösung pH 8.0
bei Raumtemperatur bestimmt.86 Um eine direkte Vergleichbarkeit von Standard-
aktivitäten der PLE oder anderen Enzymen zu erhalten, muß gewährleistet sein, daß
diese unter einheitlichen Bedingungen gemessen werden. Häufig variieren aber die
Reaktionsbedingungen bei verschiedenen Quellen. HORGAN et al. berichten
14 THEORETISCHER TEIL
Der Wassergehalt von MPEG/PLE ist bereits durch zwei Methoden bestimmt
worden. Nach der ersten Methode wird MPEG/PLE bei 2.5·10-4 mbar und 120 ºC für
12 Stunden getrocknet und anschließend der Wassergehalt durch den
Gewichtsverlust ermittelt. Hiernach wurde ein Wassergehalt der MPEG/PLE
(colyophilisiert bei 0.009 mbar, RT für 48 h) von 1 – 2 % bestimmt.84 Die zweite
Methode stellt die Karl-Fischer-Titration der MPEG/PLE dar. Bei der Karl-Fischer-
Titration besteht die Möglichkeit von Fehlern in der Wassergehaltsbestimmung
dadurch, daß fest gebundenes Wasser teilweise zu langsam abgegeben wird und
DARSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER MPEG/PLE-KATALYSATOR PRÄPARATION 15
daß es zu Reaktionen von funktionellen Gruppen des Proteins mit dem Reagenz
kommen kann.89 Nach dieser Methode wurde der Wassergehalt einer vergleichbaren
MPEG/PLE Probe (colyophilisiert bei 0.009 mbar, RT für 48 h) zu 1.2 % bestimmt.
Bei einer Verlängerung der Trocknungsdauer auf 72 h sank der Wassergehalt auf
0.6 %.85 Aufgrund der unterschiedlichen Temperaturen, die bei der Gefriertrocknung
unterschiedlicher Chargen herrschen, können die so erhaltenen Werte aber nur ein
grober Anhaltspunkt sein.90
Diese Ergebnisse zeigen, daß durch den MPEG/PLE Katalysator keine erheblichen
Wassermengen in die Reaktionslösung eingebracht werden. Der in dem Katalysator
vorhandene Wassergehalt wird wahrscheinlich sogar vom Protein benötigt.
16 THEORETISCHER TEIL
Innerhalb der Zusammenarbeit mit der GRÜNENTHAL GmbH wurden Vorstufen zu den
Substraten zur Verfügung gestellt, so daß alle in dieser Arbeit eingesetzten
Verbindungen durch Standardreaktionen aus den zur Verfügung stehenden
Verbindungen zugänglich waren. Auf die einzelnen bei GRÜNENTHAL durchgeführten
Syntheseschritte zur Darstellung der bereitgestellten Substanzen wird in Kapitel 2.2.1
näher eingegangen.
Zur Freisetzung der racemischen Basen aus ihren Hydrochloriden werden diese in
einer Emulsion aus dest. Wasser und Dichlormethan suspendiert. Nach Zugabe von
äquivalenten Mengen Natronlauge können die freien Basen nahezu quantitativ (97 -
98 % Ausbeute) extrahiert werden (s. AAV 1, S. 176).91
DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 17
(±)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-
propyl)-phenol (rac-11):
Freisetzen der Base aus
OH
dem Hydrochlorid.
OH
Me2N
(±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexan-1,3-diol (rac-12):
Freisetzen der Base aus
OH
dem Hydrochlorid.
OMe
HO
Me2N
(±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexan-1,3-diol (rac-13):
Freisetzen der Base aus
OH OH
dem Hydrochlorid.
OMe
Me2N
(±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexan-1,4-diol (rac-14):
Freisetzen der Base aus
OH
dem Hydrochlorid.
OMe
HO
Me2N
Das phenolische Substrat rac-8 und das zur Synthese des Esters rac-21 benötigte
3-(6-Dimethylamino-methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-20) wurden aus
rac-7 und rac-13 dargestellt, in denen die phenolische Hydroxylgruppe noch als
Methylether vorliegt. Eine bekannte Methode zur Etherspaltung bei Verbindungen
18 THEORETISCHER TEIL
des Tramadoltyps, die starke Basen wie Natrium- oder Kaliumhydrid in Gegenwart
von Thiophenol und Diethylenglycol verwendet92, ergibt jedoch O-Desmethyltramadol
(rac-8) aus rac-7 nur in unbefriedigenden Ausbeuten.91 Zur Etablierung der
phenolischen Hydroxylgruppe wurden daher die Methylether rac-7 und rac-13 durch
Reaktion mit Diisobutylaluminiumhydrid (DiBAl-H) in Toluol unter Rückfluß in guten
bis sehr guten Ausbeuten (88 - 93 %) demethyliert.91 Eine Dealkylierung am
Stickstoff war in keinem Fall zu beobachten.
(±)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15): Pyridin katalysierte
(±)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16): Pyridin katalysierte
(±)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy-
1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17): Pyridin katalysierte
(±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-
Darstellung des Alkoholats
3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18):
aus 12⋅HCl mit KOtBu und
O OH
OMe Acylierung mit Buttersäure-
Pr O
chlorid bei RT.
Me2N
(±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-
3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19): Darstellung des Alkoholats
O aus 13 mit KOtBu und
Acylierung mit Buttersäure-
Pr O OH
OMe chlorid bei –10 ºC.
Me2N
(±)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
Darstellung des Alkoholats
4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22):
aus 14⋅HCl mit KOtBu und
OH
OMe Acylierung mit Buttersäure-
Pr O chlorid bei RT.
Me2N
O
(±)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
Darstellung des Alkoholats
4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23):
aus 14⋅HCl mit KOtBu und
OH
OMe Acylierung mit Hexansäure-
C5H11 O chlorid bei RT.
Me2N
O
20 THEORETISCHER TEIL
(±)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
Darstellung des Alkoholats
4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24):
aus 14⋅HCl mit KOtBu und
OH
OMe Acylierung mit Essigsäure-
Me O chlorid bei RT.
Me2N
O
(±)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylamino-
methyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester
Pyridin katalysierte
(rac-25):
O O Veresterung von 13 mit
Pr O O Pr Buttersäureanhydrid.
OMe
Me2N
Allgemein verliefen die Veresterungen mit guten Ausbeuten. Als Nebenreaktion trat
in manchen Fällen in einem geringen Ausmaß eine unerwünschte Acylierung der
tertiären Hydroxylgruppe auf. Lediglich bei der Veresterung von rac-13 mit
Buttersäurechlorid in Gegenwart von Kalium-tert-butylat bei Raumtemperatur ist
diese Nebenreaktion so groß, daß als Hauptprodukt der Diester rac-25 nahezu
quantitativ (96 % Ausbeute) anfällt. Ein Absenken der Reaktionstemperatur auf
-10 ºC liefert aber neben nicht umgesetztem Edukt schon bevorzugt den Monoester
der sekundären Hydroxylgruppe, rac-19, in 58 %iger Ausbeute. Ebenfalls nicht zu
vernachlässigen war die Bildung eines Diesters bei der Darstellung von rac-24. In
diesem Fall ist nach chromatographischer Aufreinigung eine Mischung von
Monoacetat und Diacetat im Verhältnis 4 : 1 (Verhältnis der Signale der Protonen der
Methoxygruppe im 1H-NMR) erhalten worden, die sich nicht weiter auftrennen ließ
und somit in weiteren Reaktionen als Mischung eingesetzt worden ist. Bei einer
erneuten Synthese von rac-24, sollte daher versucht werden die
Reaktionstemperatur herabzusenken, um einer Bildung des Diesters entgegen-
zuwirken.
DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 21
Zur Synthese des Phenylesters rac-21, wurde eine Methode zur selektiven
Acylierung der phenolischen OH-Gruppe in Anwesenheit einer sekundären benötigt.
Bei einer zunächst versuchten Acylierung von rac-20 mit einem Säurechlorid unter
Phasentransferkatalyse mit Tetrabutylammoniumbromid, wie von ILLI beschrieben93,
konnte lediglich das eingesetzte Edukt zurückgewonnen werden. RICE et al. gelang
bei Untersuchungen zu substituierten 3,14-Dihydroxy-17-methyl-4,5α-epoxy-
morphinanen die selektive Acylierung einer phenolischen OH-Gruppe in Anwesenheit
sekundärer Hydroxylgruppen nach einer modifizierten Methode von WELSH94 et al.95
Analog zu der von RICE beschriebenen Prozedur wurde rac-20 mit 10 Äquivalenten
Buttersäureanhydrid in Gegenwart eines Überschusses an wäßriger NaHCO3-
Lösung in sehr guter Ausbeute (93 %) zu rac-21 umgesetzt.
Es zeigte sich, daß bei pH 7.0 innerhalb von 2 Stunden noch tolerierbare Mengen an
Hydrolyseprodukt detektiert worden sind. Bei pH 8.0 wurde allerdings eine merkliche
Autohydrolyse von bereits 1 % nach 2 Stunden und 15 % nach 16 Stunden
beobachtet. Eine Enzym-katalysierte Reaktion erscheint bei diesem pH-Wert wenig
sinnvoll.
Die Hydrolysestabilität des Esters rac-24 wurde in wäßriger Phosphatpufferlösung
(pH 7.5) mit Aceton (16 %Vol) als Cosolvens überprüft. Nach vier Tagen bei
Raumtemperatur konnten 2 % Hydrolyseprodukt detektiert werden. Da der ein-
gesetzte Ester rac-24 noch das Diacetat rac-14 als nicht zu entfernende
Verunreinigung enthält, wurde auf eine detaillierte Untersuchung zur Hydrolyse-
beständigkeit, wie beispielsweise bei verschiedenen pH-Werten verzichtet.
OH
OMe
Pr O
Me2N
O
rac-22
OH
OMe
HO
Me2N
rac-14
Me2N OH
OMe
O
O
Pr (−)-22
OH
OMe
Pr O
Me2N
Me2N OH
O
(+)-22 OMe
HO
(−)-14
OH
OMe
HO
Me2N
(+)-14
Dies ermöglichte es, daß Proben direkt aus der Reaktionsmischung, nach
Abtrennung der hochmolekularen Proteine durch Filtration, ohne weitere
24 THEORETISCHER TEIL
Aufarbeitung analysiert werden konnten. Mittels dieser effektiven Analytik ließen sich
detaillierte Informationen über den gesamten Reaktionsverlauf einer enzymatischen
Reaktion unter Einsatz geringer Substanz- und vor allem Enzymmengen gewinnen.
Die von der GRÜNENTHAL GmbH verwendeten Synthesewege zur Darstellung der
cyclohexanoiden Ausgangsmaterialien rac-14⋅HCl97, rac-12⋅HCl98 und rac-13⋅HCl
basieren auf der in Kap. 1.2 beschriebenen Tramadol-Syntheseroute, so daß viele
Erfahrungen aus diesem Produktionsprozeß in die Reaktionen eingebracht werden
konnten.
OH OH
OMe NaBH4 OMe
HO
O Me2N Me2N
rac-27 rac-14
Abb. 2.3: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-14.
rac-27 und rac-28 erhalten wurden. Die Ketone rac-27 und rac-28 wurden
anschließend mit Natriumborhydrid zu den gewünschten Alkoholen reduziert. Im
Falle der Reduktion des Ketons rac-27 konnte unter optimierten Bedingungen das
gewünschte (1RS,2RS,4SR)-konfigurierte 1,4-Diol rac-14 erhalten werden. Eine
Bildung des (1RS,2RS,4RS)-konfigurierten Epimers konnte nicht beobachtet werden.
Im Falle der Reduktion des Ketons rac-28 wurde eine Epimerenmischung aus
(1RS,3SR,6RS)-konfigurierten 1,3-Diol rac-12 und dem (1RS,3RS,6RS)-
konfigurierten Diol rac-13 erhalten, die anschließend getrennt worden sind. Auf
diesem Weg war es möglich beide in dieser Arbeit eingesetzte Epimere aus einer
Reaktion zu erhalten (Abb. 2.4).
1) CH3
O
H 2C N Cl 1) Trennung der
O OH
CH3 Diastereomeren
O OMe
2) 2) H Me2N
O
BrMg OMe
26 rac-28
OH OH OH
NaBH4 OMe OMe
HO +
Me2N Me2N
32 % 45 %
rac-12 rac-13
Abb. 2.4: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-12 und
rac-13.
26 THEORETISCHER TEIL
2.5). Die Bildung des Acylenzyms ist eine Gleichgewichtsreaktion und stellt eine
Umesterung zwischen dem Enzym und dem eingesetzten Ester dar.
O O O O
H R1 OR2
R1 OR2 R1 O + R2OH
O
Ser Ser Ser
O O O O
R1 OR3 H
R1 O + R3OH R1 OR3
O
(D) (E) (F)
Abb. 2.6: Katalysemechanismus bei Hydrolasen (ping-pong Mechanismus).
Kinetische Dynamische-kinetische
Racematspaltung Racematspaltung Desymmetrisierung
schnell schnell
R P R P schnell P
kR kR
+ + krac + A +
langsam langsam
S Q S Q langsam Q
kS kS
Produkt: 50 % P + 50 % S Produkt: 100 % P Produkt: 100 % P
Abb. 2.8: Abhängigkeit der ee-Werte von Substraten (S) und Produkten (P) bei drei
kinetischen Racematspaltungen mit verschieden Selektivitäten.
30 THEORETISCHER TEIL
Aus Abb. 2.8 geht hervor, daß das Substrat (S) bei einer kinetischen Racemat-
spaltung prinzipiell immer bei hinreichend großen Umsätzen auf Kosten der
Ausbeute enantiomerenrein erhalten werden kann. Das Produkt (P) hingegen kann
nur bei sehr selektiven Reaktionen mit E-Werten größer als 100 nahezu
enantiomerenrein erhalten werden.
Zur Bestimmung von E müssen zwei der drei Variablen: Umsatz, ee-Wert des
Substrates und ee-Wert des Produkts bekannt sein und in eine der aufgeführten
Formeln eingesetzt werden6,107,108:
ln [(1− c)(1− ee S )]
Formel 2.2: E= , für c > 50 %
ln [(1− c)(1+ ee S )]
1− ee S ee P (1− ee S )
ln ln (ee + ee )
1 + (eeS /ee P ) S
E= =
P
Formel 2.3:
1 + ee S ee P (1+ ee S )
ln ln
1 + (eeS /ee P ) ee P + ee S )
Häufig ist in der Praxis die Bestimmung von Enantiomerenüberschüssen genauer als
die Bestimmung des Umsatzes, bei der das Verhältnis zweier verschiedener Stoffe
VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 31
wie Ester und Alkohol bestimmt werden muß, in diesen Fällen ist zur Berechnung
von E Formel 2.3 die geeignetste.6 Im Rahmen dieser Arbeit wurde generell darauf
verzichtet E-Werte basierend auf Umsatzbestimmungen zu berechnen. Vielmehr
wurden alle E-Werte mittels Enantiomerenüberschüssen des Substrats und des
Produkts nach Formel 2.3 berechnet.
Bei der Definition von E wird vorausgesetzt, daß eine Michaelis-Menten Kinetik als
Reaktionsmechanismus vorliegt, daß die Reaktion irreversibel ist, daß keine
Produktinhibierung vorliegt, daß nur eine Katalysatorspezies vorliegt und daß die
Reaktionslösung homogen ist.6,106,106,112 Auf diese Voraussetzungen soll im
folgenden näher eingegangen werden:
b) Reversibilität:
Allgemein wird davon ausgegangen, daß enzymatische Hydrolysen aufgrund der
hohen Konzentration des Lösungsmittels Wasser (55.5 M) irreversibel verlaufen. Bei
enzymatischen Transacylierungen unter Einsatz von Enolestern mit hinreichend
hohem Überschuß des Acyldonors und geringen Wassergehalten spielt eine
Rückreaktion des gebildeten Esters ebenfalls keine Rolle.107 Der gebildete Ester
kann prinzipiell allerdings als Acyldondor fungieren, wodurch der zweite Teilschritt
der Transacylierung reversibel wird.115 Ebenfalls können geringe Mengen Wasser zu
32 THEORETISCHER TEIL
Abb. 2.9: Abhängigkeit der ee-Werte a) des Produkts und b) des Substrats bei
reversiblen kinetischen Racematspaltungen mit E = 100 für verschiedene
Gleichgewichtskonstanten K (K = a: 0, b: 0.1, c: 0.5, d: 1, e: 5).
ANTHONSEN et al. haben einen einfachen Weg zur Bestimmung E und K entwickelt,
indem sie in einem regressiven mathematischen Verfahren über eine Serie von eeS-
und eeP-Werten eine Fit E-Wert Funktion berechnen.117
begünstigen kann119. In verdünnten Lösungen sind diese Effekte jedoch als gering
einzuschätzen.112b)
CAL-A CAL-B
Molekulargewicht122 45 kD 33 kD
pH-Optimum123 7 7
ee S
Formel 2.5: Umsatz ber =
ee S + ee P
Im allgemeinen werden für enzymatische Reaktionen E-Werte nach CHEN und SIH
zur übergreifenden Vergleichbarkeit angegeben, ohne explizit anzugeben, ob die
kinetischen Voraussetzungen erfüllt sind. Von STRAATHOF et al. wird sogar generell
die Gültigkeit der Formel 2.1 und Formel 2.2 für Reaktionen nach einem bi-bi-
Mechanismus bestritten.103 Vor diesem Hintergrund sollen im Rahmen dieser Arbeit
verschiedene enzymatische Hydrolysen und Transacylierungen möglichst einfach
untereinander verglichen werden. Obwohl nicht alle Voraussetzung für die formale
Gültigkeit der Formeln zur Berechnung von E erfüllt sind, werden in dieser Arbeit
E-Werte nach CHEN und SIH zu einer einfachen und übersichtlichen Vergleichbarkeit
angegeben, da eine Angabe von ee-Werten über den Umsatz wenig sinnvoll
erscheint und außerdem keine Untersuchungen zur Kinetik durchgeführt werden
sollen.
Für präparative Zwecke interessant und somit das angestrebte Ziel in dieser Arbeit
sind kinetische Racematspaltungen mit einem E-Wert größer 20, denn sie können in
der Synthese genutzt werden (Abb. 2.10).6,110 Aus den Kurven für die Abhängigkeit
der ee-Werte vom Umsatz kann man bestimmen, bei welchem Umsatz eine Reaktion
abzubrechen ist, um Produkt oder Substrat mit möglichst hohem Enanantiomeren-
überschuß und möglichst großer Ausbeute zu erhalten (Abb. 2.10).
VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 35
Abb. 2.10: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (S) und Produkt (P) in einer
kinetischen Racematspaltung bei einer Selektivität von E = 21.
Eingezeichnet ist ein Umsatz von 63 %, ab dem das Substrat (S)
enantiomerenrein vorliegt.
Es ist wohlbekannt, daß Lipasen sowohl in wässrigen als auch in unpolaren Medien
katalytisch aktiv sind und eine breite Palette auch nicht natürlicher Substrate
akzeptieren. Dies liegt an der Flexibilität der Proteinkette, die eine Vielzahl von
Konformationen annehmen kann, um Substrate aufzunehmen, weshalb Lipasen
auch als „induced fit“ Enzyme bezeichnet werden. Jedoch macht diese Eigenschaft
eine Vorhersage der stereochemischen Wechselwirkung von Enzym und Substrat
schwierig. Viele Enzyme zeigen im wäßrigen Ein- oder Zweiphasensystem ihre
größte katalytische Aktivität, da sie im wässerigen Medium ihrem optimalen
pH-Bereich und ihrer optimale Solvatation ausgesetzt sind.133 Aufgrund der erhöhten
Flexibilität von Enzymen im wässerigen Medium können Substrate akzeptiert
werden, die im organischen Medium nur unzureichend umgesetzt werden. Verlaufen
Hydrolysen jedoch mit schlechter Enantioselektivität, so sollte die Enzymkatalyse auf
die entsprechende Transacylierung im organischen Medium erweitert werden. Im
organischen Medium haben hydrophobe Verbindungen eine erhöhte Löslichkeit, so
daß hier Substrate eingesetzt werden können, die nicht im wässerigen Milieu
umgesetzt werden können. Eine Umsetzung hydrolyselabiler Verbindungen ist ein
weiterer Vorteil.
Zusätzlich verhalten sich Hydrolyse und Transacylierung unter dem Blickpunkt der
asymmetrischen Synthese enantiokomplementär, so daß durch einen Wechsel des
Reaktionsmediums ebenfalls beide Enantiomere dargestellt werden können.
Im Rahmen dieser Arbeit sollen daher beide Möglichkeiten des Reaktionsmediums
der enzymatischen Racematspaltung untersucht werden, um eine möglichst breite
Grundlage zur Gewinnung von enantiomeren Tramadol-Analoga zu schaffen.
38 THEORETISCHER TEIL
O O O O O O
N
C3H7 O CF3 C7H15 S O O
29 30 31
Enolester:
O O O O OEt
O O O O
32 33 34 35
Abb. 2.11: Beispiele für gebräuchliche Klassen von aktivierten Acyldonoren zur
irreversiblen enzymatischen Transacylierung.
Die bedeutensten aktivierten Acyldonoren sind Enolester, wie Vinylacetat (32) oder
Isopropenylacetat (34). Der aus Enolestern entstehende Alkohol tautomerisiert zur
Carbonylverbindung, wodurch das Gleichgewicht der Transacylierung auf der Seite
der Produkte liegt. Die meisten Lipasen tolerieren die Anwesenheit von Acetaldehyd.
CRL bildet hier eine bekannte Ausnahme 139,140,141. Neuere Untersuchungen gehen
von einer Reaktion des Acetaldehyds mit Lysin-Resten des Proteins unter Bildung
einer Schiff´schen Base aus, wodurch eine positive Ladung von der
Proteinoberfläche entfernet wird und zur Deaktivierung des Enzyms führt (Abb.
2.12).140,142,143,144,145 Als Alternative bieten sich hier die Acylierungsmittel
Isopropenylacetat (34) und 1-Ethoxyvinylacetat142,146 (35) an, da die aus diesen
Reagentien gebildeten Alkohole zu den weniger reaktiven Verbindungen Aceton bzw.
Essigsäureethylester tautomerisieren. 1-Ethoxyvinylester sind allerdings schwer
zugänglich.
40 THEORETISCHER TEIL
O
Lys NH3 Lys N
- H3O
Abb. 2.12: Deaktivierung von Proteinen durch Acetaldehyd.
Da nur ein kleiner Teil der bekannten Wirkstoffe eine sekundären Hydroxyfunktion
enthält, ist der weitaus größere Anteil kein klassisches Substrat für die bisher
etablierten enzymatischen Racematspaltungen. Viele Wirkstoffe haben zwar eine
Aminofunktion mittels derer eine Aminoacylasen-katalysierte Racematspaltung
durchgeführt werden könnte154, die Aminogruppe kann aber wie im Beispiel von
rac-7 einer solchen Reaktion unzugänglich sein. Ein neuerer Ansatz, der bereits in
eigenen Vorarbeiten verfolgt wurde80, ist die in Wirkstoffen weitaus häufigere
phenolische Hydroxylgruppe in einer Hydrolasen-katalysierten Racematspaltung zu
nutzen. Dieser Ansatz bietet neue Herausforderungen, da die Distanz zu
vorhandenen Chiralitätszentren beträchtlich erhöht ist.
O Acetyl- O
R esterase R
N O O N O R NH2
H pH 7.0, H
O 45 ºC O
R = Lipoprotein
Ein gut untersuchtes Substrat mit axialer Chiralität ist das 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diol
(rac-36) bzw. dessen Ester. MIYANO et al. beschrieben 1987 die Schweinepankreas-
lipase katalysierte Hydrolyse eines Divaleriansäureesters (rac-37a) mit sehr guter
Selektivität (Abb. 2.14).160 Die Hydrolyse eines solchen Diesters bezieht zwei Stufen
enzymatischer Racematspaltungen ein. Solche zweistufigen Hydrolysen lassen in
der Theorie einen höheren ee-Wert der Produkte als einstufige Reaktionen
erwarten161. Der als primäres Produkt entstehende Monoester konnte nur in geringen
Mengen nachgewiesen werden, da er umgehend vom Enzym weiter umgesetzt wird.
Wird ein Monoester direkt als Substrat eingesetzt, verläuft eine Lipasen-katalysierte
Hydrolyse ebenfalls mit hoher Selektivität (E > 100).162,163 Einer Schweineleber-
Esterasen-katalysierten Hydrolyse ist das entsprechende Butyrat rac-37b nicht
zugänglich164. Des weiteren konnte von INAGAKI et al. demonstriert werden, daß das
1,1´-Binaphthalin-2,2´-diol (rac-36) auch direkt als Substrat in eine Lipasen-
katalysierte Transacylierung eingesetzt werden kann, die mit guter Selektivität
verläuft (E > 60) und auf der Stufe des monoacylierten Produkts stehen bleibt.162
Allerdings zeigte die von INAGAKI et al. eingesetzte Lipase aus Pseudomonas sp. eine
zu den bisherigen eingesetzten Lipasen entgegengesetzte Enantiopräferenz. WANG
et al. war es zuvor nicht gelungen rac-36 mit verschiedenen Lipasen sowie der
Cholesterolesterase zu acylieren.165
O O
O R Enzym OH O R
+
O R H2O OH O R
O O
rac-37 a = nBu (−)-(aS)-36 (+)-(aR)-37 a
b = nPr b
Abb. 2.14: Enzymatische Hydrolyse von Estern des 1,1´-Binaphthalin-2,2´-diols.
44 THEORETISCHER TEIL
AcO HO AcO
MeO Lipase MeO MeO
NMe NMe NMe
H2O gesättigtes H + H
n organisches n n
Lösungsmittel
MeO MeO MeO
OMe OMe OMe
(S) (R)
Abb. 2.15: Enzymatische Hydrolyse von racemischen Essigsäure-1-(3,4-dimethoxy-
phenyl)-tetrahydroisoquinolinylestern.
ACHIWA et al. stellten einen neuen Zugang zu (R)-α-Tocopherol vor, indem sie eine
am aromatischen Ring demethylierte Vorstufe in eine Lipasen-katalysierte kinetische
Racematspaltung einsetzten (Abb. 2.16). Auch hier war die Selektivität der Hydrolyse
des phenolischen Esters, wahrscheinlich ebenfalls aufgrund des entfernten
stereogenen Zentrums, gering (E ≤ 10).168 Eine enzymatische Hydrolyse der am
aromatischen Ring permethylierten Verbindung, dem α-Tocopherol, war aufgrund
von sterischen Hinderungen nicht möglich. Von ZAMMATTIO et al. wird die Lipasen-
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 45
AcO HO AcO
CRL R
+
O R H 2O O O R
(S) (R)
R=
Abb. 2.16: Lipase-katalysierte kinetische Racematspaltung von Tocolacetat.
Höhere Selektivitäten mit E-Werten von 24 bis 60 beobachten HUTCHINSON et al. bei
der PLE-katalysierten Hydrolyse von phenolischen Estern bei denen das
Chiralitätszentrum im Säureanteil des Moleküls und somit näher an der vom Enzym
angegriffenen Bindung lokalisiert ist (Abb. 2.17 rechts).170 Interessanterweise wurde
hier aus Löslichkeitsgründen nicht das freie Amin sondern das Hydrochlorid der Base
als Substrat eingesetzt.
AcO O O N(CH2CH2OCH3)2
⋅HCl
R1 O R2
O n
OMe
n = 1,2 R1 = H, Me, R2 = Et, nPr
Abb. 2.17: Racemische Substrate mit aromatischer Hydroxylgruppe, die in
Hydrolasen-katalysierte kinetische Racematspaltungen eingesetzt
worden sind.
Ebenfalls sehr gute Selektivitäten konnten LIU et al. in der enzymatischen Hydrolyse
eines phenolischen Esters mit dem Chiralitätszentrum im phenolischen Teil des
Moleküls erzielen. Sie erzielten E-Wert bis zu 60 bei der Cholesterolesterasen-
katalysierten Hydrolyse von Essigsäureestern des Lasofoxifene (Abb. 2.18).171
46 THEORETISCHER TEIL
N
O
CE
+
H2O
AcO HO AcO
(5R,6S) (5S,6R)
Lasofoxifene
Abb. 2.18: CE-katalysierte kinetische Racematspaltung zur Darstellung von
Lasofoxifene.
In eigenen Vorarbeiten wurde das O-Desmethyltramadol (rac-8, M1) als Substrat mit
aromatischer Hydroxylgruppe für eine Enzym-katalysierte Racematspaltung
ausgewählt. Das O-Desmethyltramadol, ein Hauptmetabolit des Wirkstoffs Tramadol,
und seine einzelnen Enantiomere sind für die Pharmakokinetik des Tramadols von
Bedeutung. Zudem bieten die Enantiomere dieser Verbindung nach Methylierung
Zugang zu den Enantiomeren des Tramadols.
OH
O Pr
OH PLE
O Me2N O
Pr
Phosphatpuffer-
Lösung (pH 8.0) (+)-15
Me2N O +
10 % Cosolvens
rac-15 Me2N OH
RT
OH
(−)-8
Abb. 2.19: PLE-katalysierte Hydrolyse von (±)-Buttersäure-3-(2-dimethylamino-
methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15).
Reaktionsbedingungen E-Wert
Aceton ist ein übliches Cosolvens in der PLE-katalysierten Hydrolyse von Estern.5
Häufig kann ein aktivitäts- und selektivitätssteigernder Einfluß des Acetons auf die
PLE-Katalyse beobachtet werden. So berichten beispielsweise TAMM et al. von
einem Anstieg der Selektivität in einigen Fällen der PLE-katalysierten
Desymmetrisierung, wenn sie statt keinem 10 % Aceton als Cosolvens
verwendeten.173 PIETZSCH et al. untersuchten den Einfluß der Konzentration des
Cosolvens Aceton auf die Aktivität von PLE unter Standardaktivitätstest-
bedingungen.174 Sie beobachten bei einer Konzentration von 3 – 5 % Aceton eine
Aktivitätssteigerung der PLE von 75 % im Vergleich zur Aktivität der PLE ohne
Cosolvens. Sie berichten ebenfalls von einer Steigerung der Selektivität in der PLE-
50 THEORETISCHER TEIL
Tabelle 2.7: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 unter Zusatz von
10 % Aceton als Cosolvens (3.3 U/ml; Phosphatpuffer, pH 8.0)
5 Min 52 % 27 % 46 % 4
Aus Tabelle 2.7 geht hervor, daß Aceton als Cosolvens im Vergleich zu den
Cosolventien tert-Butanol und Methanol (Tabelle 2.6) zu einer weiteren Steigerung
der Aktivität der PLE führt, da die Reaktionsgeschwindigkeit erheblich zunimmt.
Dieser Einfluß auf die Reaktionsgeschwindigkeit geht allerdings mit Einbußen in der
Selektivität der Reaktion einher. Die Selektivität ist so gering, daß keine weiteren
Versuche in der Enzym-katalysierten Hydrolyse von Substraten mit aromatischer
Hydroxylgruppe mit Aceton als Cosolvens unternommen wurden. Für andere
Substrate, bei denen die Selektivität der enzymatischen Hydrolyse hoch genug ist,
kann sich die Verwendung von Aceton als Cosolvens zu einer Steigerung der
Reaktionsgeschwindigkeit anbieten.
LINTZ et al. erhielten ebenfalls zum Teil sehr schlechte Ausbeuten bei der Extraktion
des O-Desmethyltramadols (rac-8) bei nicht kontinuierlicher Weise (Tabelle 2.8).63
Chloroform 5% 7% 88 % 70 %
Essigsäureethylester 6% 28 % 72 % n. b.
Nach kontinuierlicher Extraktion lassen sich das gebildete Phenol (−)-8 und der nicht
umgesetzte Ester (+)-15 durch Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1) an
Kieselgel trennen. Das (1S,2S)-konfigurierte Phenol (−)-8 konnte so in 49 %
Ausbeute mit einem ee-Wert von 76 % und der (1R,2R)-konfigurierte, nicht
umgesetzte Ester (+)-15 in 47 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 62 % erhalten
werden (Tabelle 2.9, S. 52).
Zur Angabe der Ausbeuten ist zu beachten, daß aufgrund des erreichten Umsatzes
von 52 % die maximal erreichbare Ausbeute des Phenols 52 % und die des Esters
48 % beträgt.
Die Selektivität der Reaktion läßt sich entsprechend durch einen E-Wert von 13
beschreiben. Der theoretische Verlauf der ee-Werte von Substrat und Produkt über
den Umsatz der Reaktion ist in Abb. 2.20 dargestellt. Aus ihr geht hervor, daß ab
einem Umsatz von ca. 70 % der nicht umgesetzte Ester (+)-15 enantiomerenrein
vorliegt. Um die präparativen Möglichkeiten der Enzym-katalysierten kinetischen
Racematspaltung zu demonstrieren, wurde daher in einem weiteren Versuch in
einem präparativen Maßstab (+)-15 enantiomerenrein dargestellt.
52 THEORETISCHER TEIL
Abb. 2.20: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (+)-15 (S) und Produkt (−)-8 (P)
bei einer Selektivität von E = 13.
Dazu wurden dieselben Reaktionsbedingungen wie zuvor gewählt, nur diesmal die
Reaktion nicht bei einem Umsatz von 50 % abgebrochen, sondern erst, wie aus Abb.
2.20 bestimmt, bei einem Umsatz von ca. 80 % (Tabelle 2.9 ). Der nicht umgesetzte
Ester (+)-15 konnte nach Aufarbeitung so in einer Ausbeute von 10 %
enantiomerenrein erhalten werden. Hiermit wurden sich die prinzipielle Möglichkeit
einer kinetischen Racematspaltung zu nutze gemacht, daß das nicht umgesetzte
Substrat selbst bei einer relativ schlechten Selektivität der Reaktion bei genügend
hohem Umsatz, und somit auf kosten der Ausbeute, enantiomerenrein erhalten
werden kann.
Tabelle 2.9: PLE-katalysierte Hydrolysen des Esters rac-15 im 3.5 mmol Maßstab
(6.5 U/ml; Phosphatpuffer, pH 8.0; 10 % tert-Butanol)
2h 52 % 62 % 47 % 76 % 49 % 13
3h 85 % ≥ 98 % 10 % 27 % 64 % 7
geringen Löslichkeit des Esters rac-15, bei einem pH-Wert von 8.0, die
Substratkonzentration nicht mehr wesentlich erhöht werden kann. Häufig stellen
geringe Löslichkeiten von Substraten in Prozessen, die im wäßrigen Medium
durchgeführt werden, eine Limitierung der Substratkonzentration dar, obwohl es auch
einige hervorstechende Beispiele mit sehr hohen Substratkonzentrationen in
biokatalytischen Prozessen gibt.175
Auffällig in Tabelle 2.9 ist auch, daß der ermittelte E-Wert für beide Reaktionen unter
gleichen Reaktionsbedingungen mit steigendem Umsatz fällt, da dieser nach den in
Kap. 2.3.1.1 gemachten Voraussetzungen für eine gegebene Reaktion konstant sein
sollte. Eine Änderung des E-Werts im Verlauf der Reaktion stellt in der Regel eine
Abweichungen von den gemachten Voraussetzungen dar. Eine Möglichkeit zur
Erklärung dieses Verhaltens ist, daß die Vorraussetzung daß nur ein Enzym (aktives
Zentrum) an der Reaktion beteiligt ist, nicht erfüllt ist. Der E-Wert stellt in diesem Fall
ein gewichtetes Mittel aller Biokatalysatoren, die mit dem Substrat reagieren, dar.
PLE besteht aus mehreren Isoenzymen, die alle in der Hydrolyse von rac-15 beteiligt
sein können und unterschiedliche Aktivitäten und Selektivitäten zeigen. Ähnlich
haben PIETZSCH et al. auch schon zur Erklärung von schwankenden E-Werten in der
PLE-katalysierten Hydrolysen von Allen-Derivaten argumentiert.174
Reaktion zu Optimieren, da hier die Aussicht durch eine weitere Variation des
Cosolvens oder der Reaktionstemperatur zu einer gesteigerten Selektivität zu
kommen, als gering betrachtet wurde. Vielmehr wurde die Möglichkeit untersucht,
daß es eine oder sogar mehrere weitere Hydrolasen gibt, welche die Hydrolyse von
rac-15 mit einer höheren Selektivität katalysieren (Abb. 2.21).
OH
O Pr
OH Enzym
O Me2N O
Pr
Phosphatpuffer- (+)-15
Me2N O Lösung
+
10 % Cosolvens
rac-15 RT Me2N OH
OH
(−)-8
Abb. 2.21: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15.
Acetylcholinesterase
7.5 h 3% n. b. n. b. -
(AChE; 145 U/ml); pH 8.0
Candida antarctica Lipase
3.8 h 8% 3% 3% 1.1
(CAL; 0.8 U/ml)
Mucor miehei Lipase
19.5 h 25 % 11 % 30 % 2
(MML; 0.7 U/ml)
Horse liver esterase
4.0 h 31 % 17 % 51 % 4
(HLE; 0.3 U/ml)
Cholesterolesterase
24.0 h 90 % 72 % 39 % 5
(CE; 22 U/ml)
Porcine pancreatic Lipase
2.5 h 66 % 19 % 78 % 10
(PPL; 21 U/ml)
Burkholderia cepacia
22.0 h 35 % 75 % 67 % 11
Lipase (BCL; 15 U/ml)
Candida rugosa Lipase
3.0 h 64 % 98 % 45 % 10
(CRL; 3 U/ml)
Wie aus Tabelle 2.10 hervorgeht, wird die Hydrolyse des Esters rac-15 von den
meisten eingesetzten Hydrolasen mit einer ausreichend hohen Reaktions-
geschwindigkeit katalysiert.
In diesem Enzym-Screening zeigten alle katalytisch aktiven Enzyme die gleiche
Enantiopräferenz, es wurde, wie schon zuvor in der PLE-Katalyse beobachtet,
bevorzugt das (−)-Enantiomer des Esters zum aromatischen Alkohol umgesetzt.
Die Selektivitäten, die unter den Standardbedingungen des Enzym-Screenings
erreicht werden konnten, waren allerdings gering und für eine angestrebte
Racematspaltung im präparativen Maßstab zu niedrig. Nur drei Lipasen katalysieren
die Reaktion mit einer ähnlichen Selektivität wie die zuvor getestete PLE.
Von mehreren Autoren wird beschrieben, daß in Reaktionen mit Horse liver esterase
(HLE) als Katalysator geringfügig höhere ee-Werte als in der entsprechenden
Katalyse mit PLE erreicht werden können.176 In der Katalyse der Hydrolyse des
56 THEORETISCHER TEIL
Esters rac-15 konnte diese Beobachtung allerdings nicht bestätigt werden, da die in
der HLE-katalysierten Reaktion erzielte Selektivität geringer ist, als die der PLE
katalysierten Reaktion.
Eine höhere Selektivität, die eine in einem präparativ nutzbaren Rahmen
durchführbare Racematspaltung zulassen würde, war insgesamt nicht zu
beobachten. Ein weiteres Austesten von neuen Hydrolasen wurde nicht
durchgeführt, da die bisher getesteten Hydrolasen als repräsentativ betrachtet
wurden. Natürlich ist nicht auszuschließen, daß unter den kommerziell oder
andersseitig verfügbaren Enzymen welche sind, die eine höhere Selektivität zeigen,
doch sollte ein Enzym nach den in Kap. 2.3.2 (S. 35) gemachten Voraussetzungen
über einen langen Zeitraum in ähnlicher Präparation und Qualität kommerziell
verfügbar sein. Diese Voraussetzung wurde für weitere Enzyme nicht ohne weiteres
als erfüllt betrachtet.
Statt dessen wurde daraufhin versucht die Reaktionsbedingungen für eine Lipasen-
katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 zu optimieren.
Schon 1958 beschrieben SARDA und DESNUELLE das für Lipasen typische Phänomen
der „Grenzflächenaktivierung“.177 Lipasen haben im allgemeinen nur eine geringe
Aktivität gegenüber nichtassoziierten Substraten, die oberhalb der kritischen
Micellenkonzentration des Substrats steil ansteigt. Lipasen benötigen zur Aktivierung
also häufig aggregierte Moleküle, wie sie in einer Emulsion oder einer mizellaren
Lösung vorliegen. 1990 konnte durch Röntgenstrukturanalyse der beiden ersten
Lipasenstrukturen der Mechanismus aufgeklärt werden178: Die „Grenzflächen-
aktivierung“ der Lipasen beruht auf einem amphiphilen Peptidsegment, das wie ein
Deckel das aktive Zentrum des Enzyms bedeckt.179 Dieser scheint in Gegenwart
einer Grenzfläche im Zuge einer Konformationsänderung aufzuklappen und so dem
Substrat den Zugang zum aktiven Zentrum zu ermöglichen.180 Außerdem entsteht
beim Öffnen des Deckels eine große hydrophobe Fläche, an die das Substrat binden
kann.181 Allerdings zeigen nicht alle Lipasen diese Grenzflächenaktivierung.
Beispielsweise weist zwar die Candida antarctica Lipase (Typ B), deren
Tertiärstruktur bekannt ist, eine amphiphilen Deckelstruktur auf, aber keine Grenz-
flächenaktivierung.182
Um eine möglichst große Grenzfläche zu erhalten, wurde daher statt eines wäßrigen
Einphasensystems eine Emulsion aus Wasser und organischem Lösungsmittel, ein
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 57
Der vorhergehende Versuch wurde mit einer Candida rugosa Lipase durchgeführt,
die eine spezifische Aktivität von 2.4 U/mg hatte. Dieser Wert stellt für dieses Enzym
einen niedrigen dar und bedeutet, daß in dieser Enzym-Präparation neben der CRL
auch andere Enzyme und nicht katalytisch-aktive Proteine vorliegen, die auf die
Katalyse Einfluß nehmen können. Um einen etwaigen Einfluß anderer Proteine
auszuschließen oder wenigstens zu minimieren, wurde daraufhin eine weiter
aufgereinigte Präparation der Candida rugosa Lipase mit einer spezifischen Aktivität
von 37.0 U/mg in die Enzym-katalysierte Hydrolyse von rac-15 im wäßrig-
organischen Zweiphasensystem eingesetzt (Tabelle 2.11). Diese aufgereinigte
Candida rugosa Lipase ist ebenfalls kommerziell verfügbar.
58 THEORETISCHER TEIL
spezifische
Reaktionszeit Umsatz ee Ester (+)-15 ee Phenol (−)-8 E-Wert
Aktivität
Aus dieser Reaktion konnte das gebildete Phenol (−)-8 mit einem ee-Wert 90 % in
27 % Ausbeute und der nicht umgesetzte Ester (+)-15 mit ee-Wert 58 % in 58 %
Ausbeute isoliert werden. Die Selektivität dieser Reaktion kann mit einem E-Wert von
34 beschrieben werden. Diese weitere Erhöhung der Selektivität kann durch den
Ausschluß von Nebenaktivitäten in der Enzympräparation erklärt werden. In Abb.
2.22 ist der theoretische Verlauf der ee-Werte von Substrat und Produkt für diesen
E-Wert gegen den Umsatz aufgetragen.
Abb. 2.22: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (+)-15 (S) und Produkt (−)-8 (P)
bei einer Selektivität von E = 34.
Die erzielte Selektivität von E = 34 ist die höchste, die in einer Enzym-katalysierten
kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Anolga mit phenolischer Hydroxylgruppe
bisher erreicht worden ist. Sie liegt zudem in dem angestrebten Bereich von E ≥ 30.
Dies bedeutet, wie auch in Abb. 2.22 zu erkennen ist, daß ab einem Umsatz von ca.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 59
worden.91 Hierbei ist die Bestimmung der Absolutkonfiguration des (+)-8⋅HCl durch
Röntgenstrukuranalyse erfolgt.184
Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 15 und 16 erfolgte in Analogie
zu der des Phenols 8.
Neben den Effekten des Cosolvens auf die Enzym-katalysierte Hydrolyse von Estern
des O-Desmethyltramadols (rac-8), ist auch der Einfluß der Acylgruppe des
Substrats auf die Aktivität oder Selektivität der enzymatischen Reaktion von
Interesse.
Im allgemeinen stellt für Lipasen die einzige Limitierung hinsichtlich des akzeptierten
Substratspektrums ihre begrenzte Eignung für die Umsetzung raumerfüllender
Acylgruppen dar: gemäß dem Vorbild der Triglyceride werden lineare aliphatische
Acylgruppen besser umgesetzt als z.B. Arene.101,110,185
60 THEORETISCHER TEIL
Im Gegensatz zu Lipasen akzeptiert die PLE als Esterase keine stark hydrophoben
Substrate wie z.B. Triglyceride, sondern idealerweise wasserlösliche Ester. Daher
ergibt sich hinsichtlich der Substratstruktur für die PLE die Einschränkung kurzkettige
lineare aliphatische Acylgruppen einzusetzen. So werden Acetate von Alkoholen am
häufigsten von der PLE hydrolysiert. Längerkettige Acylgruppen werden nur in
Ausnahmefällen als Substrate akzeptiert.
Dieser Unterschied in dem Substratspektrum zeigt auch das sicherste Merkmal, um
eine Esterase als „Lipase“ zu klassifizieren: die Fähigkeit langkettige Glycerinester zu
hydrolysieren.101,185,186
wurde ein pH-Wert von 7.0 gewählt und zur Vergleichbarkeit mit den bisherigen
Ergebnissen als Reaktionsmedium das wäßrige Einphasensystem mit 10 % tert-
Butanol als Cosolvens. Als Enzyme wurden zunächst PLE und CRL aufgrund der
bisher mit diesen Enzymen erzielten Ergebnisse eingesetzt (Tabelle 2.13, Zeilen 1
und 2).
OH
O
OH Enzym
O Me2N O
Phosphatpuffer- (+)-16
Me2N O Lösung
+
10 % Cosolvens
rac-16 RT Me2N OH
OH
(−)-8
Abb. 2.23: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16.
Aus Tabelle 2.13 geht hervor, daß die CRL-katalysierte Reaktion wenig langsamer
verläuft, als die des entsprechenden Buttersäureesters rac-15 (Tabelle 2.10). Die
Selektivität der CRL-katalysierten Hydrolyse von rac-16, ausgedrückt in einem
E-Wert von 2, ist erheblich geringer als die Selektivität, die mit dem Ester rac-15 als
Substrat beobachtet wurde. Dies Ergebnis deutet darauf hin, daß langkettigere
Acylreste, wie in dem Ester rac-15 vorhanden, bevorzugt von dieser Lipase
umgesetzt werden. Auf eine Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem
als Reaktionsmedium wurde daraufhin verzichtet.
Die PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16 bei pH 7.0 verläuft mit ähnlicher
Reaktionsgeschwindigkeit wie die Hydrolyse des Buttersäureesters rac-15 bei pH 8.0
nur mit geringerer Selektivität. Die Aktivität des Enzyms PLE ist unter
standardisierten Aktivitätstestbedingungen allerdings auch bei pH 8.0 größer als bei
pH 7.0. Aus diesem Grund wurde auch eine PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16
bei pH 8.0 durchgeführt, obwohl das Substrat bei diesem pH-Wert entsprechend
hydrolyselabiler ist (Tabelle 2.13, Zeile 3).
62 THEORETISCHER TEIL
Bei pH 8.0 verläuft die PLE-katalysierte Hydrolyse von rac-16 entsprechend der
höheren Aktivität des Enzyms auch schneller als bei pH 7.0. Nach einer
Reaktionszeit von 0.75 h werden ca. 30 % Umsatz erreicht, bei pH 7.0 wurde zum
Erreichen des entsprechenden Umsatzes ca. 1 h länger benötigt.
Die kurze Reaktionszeit begünstigt einen höheren Enantiomerenüberschuß des
gebildeten Phenols (−)-8, da die Autohydrolyse von rac-16 vergleichsweise langsam
ist und somit bei kurzen Reaktionszeiten wenig racemisches Phenol entsteht (<1 %
in 1 h nach Tabelle 2.12). Somit ist auch trotz der geringen Hydrolysestabilität von
rac-16 eine relativ hohe Selektivität von E = 10 in dieser Reaktion möglich. Die
beobachtete Selektivität liegt im Rahmen der Selektivität, die auch schon in der PLE-
katalysierten Hydrolyse des entsprechenden Buttersäureesters rac-15 erzielt wurde
(Tabelle 2.6). Verglichen mit der Hydrolyse des Buttersäureesters rac-15 verläuft die
Hydrolyse des kurzkettigeren Acetats rac-16 aber mit einer höheren Aktivität. Dies
Ergebnis bestätigt die zuvor gemachte Aussage, daß Acetate aufgrund ihres kurzen
Acylrests und der damit erhöhten Polarität eine größere Ähnlichkeit mit den
natürlichen Substraten besitzen und somit die geeigneteren Substrate für die PLE-
katalysierte Hydrolyse sind.
Eine weitere Verlängerung der Acylgruppe über die C4-Säure hinaus, würde zwar zu
von Lipasen bevorzugteren Substraten führen, aber auch den Nachteil einer
ungünstigeren Bilanz für die enzymatische kinetische Racematspaltung beinhalten.
Aus anwendungsbezogener Sicht ist daher ein möglichst einfacher kurzer Acylrest zu
verwenden.
Oft haben auch aktivierte Ester wie Halogen- oder Methoxycarbonsäureester einen
günstigen aktivierenden Einfluß auf die Enzym-katalysierte Hydrolyse. Die
Darstellung eines Choressigsäureesters von O-Desmethyltramadol gelang aber
nicht, da diese Verbindung so reaktiv war, daß sie unter gaschromatographischen
und flüssigchromatographischen Bedingungen nicht stabil war.
Die Hydrolyse eines Esters von rac-8 zur Gewinnung der Enantiomeren setzt die
Darstellung dieser Verbindung voraus, was einen, wenn auch geringen, Aufwand
64 THEORETISCHER TEIL
darstellt. Einfacher wäre eine direkte enzymatische Acylierung von rac-8. Dies
vermag die Enzym-katalysierte Transacylierung im organischen Medium zu leisten.
Zudem kann auch in diesem Medium eine Racematspaltung von Verbindungen
gelingen, deren Ester hydrolyselabil sind. Auch haben im organischen Medium
hydrophobe Verbindungen eine erhöhte Löslichkeit, so daß hier Substrate eingesetzt
werden können, die sonst nicht im wässerigen Milieu umgesetzt werden können. Ein
weiterer interessanter Aspekt ist, daß in der enzymatischen Transacylierung
bevorzugt das Enantiomer acyliert wird, welches in der Umkehrreaktion der
enzymatischen Hydrolyse bevorzugt hydrolysiert wird. Somit sollte in der
enzymatischen Transacylierung von rac-8 bevorzugt das (−)-Enantiomer acyliert
werden, da in der hydrolytischen Reaktion (−)-8 gebildet worden ist (Abb. 2.21).
Neben dem (−)-Ester bleibt das nicht umgesetzte (+)-8 in der Reaktion als Produkt
zurück (Abb. 2.25). Enzym-katalysierte Transacylierung und Hydrolyse sind daher
unter dem Blickpunkt der Synthese enantiokomplementär.
Unter diesen Gesichtspunkten ist die Entwicklung einer Methodik zur enzymatischen
Transacylierung von rac-8, obwohl Bedingungen zu einer selektiven Enzym-
katalysierten Hydrolyse bekannt sind, durchaus von großem Interesse und auch
anwendungsbezogen.
Me2N OH
O Pr
OH MPEG/PLE
OH O
(−)-15
Vinylbutyrat +
Me2N Toluol OH
rac-8 RT OH
Me2N
(+)-8
Abb. 2.24: Versuch zur PLE-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8.
INAGAKI et al. führten die bereits auf S. 43 erwähnte enzymatische Acylierung des
1,1´-Binaphthalin-2,2´-diols (rac-36) mit 20 Äquiv. eines Vinylesters in Diisopropyl-
ether mit 10 % Aceton als Lösungsmittel mit guter Selektivität (E > 60) durch.162 Der
Zusatz an Aceton wurde benötigt, um das Substrat zu lösen, welches in reinem
Diisopropylether nur mäßig löslich war. Von einem Einfluß des Acetons auf die
Aktivität des Enzyms oder die Selektivität der Reaktion wird nicht berichtet.
Von diesen Reaktionsbedingungen ausgehend wurden für eine Enzym-katalysierte
Transacylierung des Substrats rac-8 2 Äquiv. Vinylpropionat als Acylierungsmittel
und das Lösungsmittel Diethylether als Reaktionsbedingungen ausgewählt (Abb.
2.25).
Me2N OH
O Et
OH Lipase
OH O
Vinylpropionat (−)-15
+
Me2N Diethylether
RT OH
rac-8 OH
Me2N
(+)-8
Reaktionsbedingungen Reaktions-
Enzym Umsatz
(Äquiv.) zeit
Keine der in Tabelle 2.14 eingesetzten Lipasen katalysiert die Transacylierung von
rac-8 unter den gewählten Reaktionsbedingungen. Da die Enzyme CRL, BCL und
PPL in der Hydrolyse von rac-15 eine hohe Aktivität und eine moderate Selektivität
zeigen, ist davon auszugehen, daß diese Enzyme auch in der Acylierung von rac-8
aktiv sein sollten. Dies deutet daraufhin, daß für das Enzymscreening in Tabelle 2.14
ungeeignet Reaktionsbedingungen gewählt wurden. Hiervon ausgehend wurde
daraufhin, um bessere Bedingungen zu finden, eine ausgewählte Lipase (PPL) mit
5 Äquiv. Vinylacetat in verschiedenen Lösungsmitteln eingesetzt (Tabelle 2.15).
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 67
Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)
Vinylacetat (5), 28 d 2%
Dichlormethan (H2O ges.)
Vinylacetat (5),
28 d 1%
Trichlormethan (H2O ges.)
Aus Tabelle 2.15 geht hervor, daß in den polaren Lösungsmitteln Dichlormethan und
Trichlormethan ebenfalls keine nennenswerte Acylierung zu beobachten ist. In
reinem Vinylacetat als Transacylierungsmittel und Lösungsmittel, was einem
Überschuß von 252 Äquiv. entspricht, ist eine geringe Enzym-katalysierte Bildung
des Acetats 16 nach 2 Wochen zu beobachten. Aufgrund des geringen Umsatzes
wurde keine Enantiomerenüberschußbestimmung durchgeführt. Die in Vinylacetat
als Solvens erzielte enzymatische Acylierung von O-Desmethyltramadol bestätigt die
zuvor gemachte Aussage, daß eine Acylierung von rac-8 unter geeigneten
Bedingungen möglich ist. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist aber extrem langsam. Es
wurden daher die beiden Lipasen BCL (Tabelle 2.16) und CRL (Tabelle 2.17 und
Tabelle 2.18), die in der Hydrolyse von rac-15 die größten Selektivitäten erreichten,
ebenfalls unter diesen Reaktionsbedingungen in die Transacylierung von rac-8
eingesetzt.
68 THEORETISCHER TEIL
Reaktionsbedingungen Nach
E-Wert
(Äquiv.) 28 d
Umsatz 3%
Vinylacetat (5), n. b.
ee Ester (−)-16 -
Diisopropylether
ee Phenol (+)-8 n. b.
Umsatz 18 %
Vinylacetat als Solvens ee Ester (−)-16 10 % 1.2
ee Phenol (+)-8 2%
Wie in der PPL-katalysierten Transacylierung von rac-8 wird auch mit dem Enzym
BCL eine Transacylierung mit Vinylacetat als Lösungsmittel beobachtet.
Entsprechend dem zuvor erzielten Ergebnis verläuft auch die BCL-katalysierte
Transacylierung mit einer geringen Reaktionsgeschwindigkeit. Ein Umsatz von 18 %
ist erst nach 3 Wochen zu beobachten (Tabelle 2.16). Es wird der (1S,2S)-
konfigurierte Ester (−)-16 mit einem ee-Wert von 10 % gebildet. Die Racemat-
spaltung verläuft allerdings unselektiv (E = 1.2).
Mit dem Enzym CRL wurden in der Hydrolyse von rac-15 die besten Ergebnisse
erzielt. In der enzymatischen Transacylierung ist, wie bei allen zuvor getesteten
Enzymen, kein nennenswerter Umsatz von rac-8 in den als Lösungsmittel
eingesetzten Ethern MTBE und Diisopropylether zu beobachten (Tabelle 2.17). In
Vinylacetat als Lösungsmittel ist ein Umsatz von 36 % nach 3 Wochen zu
beobachten. Die Verwendung des Acylierungsmittels nicht nur als Reagenz, sondern
auch als Solvens, führt somit bei allen eingesetzten Lipasen zu einer Acylierung des
Phenols rac-8, wenn auch mit relativ langsamer Reaktionsgeschwindigkeit. Die in
dieser Reaktion erzielte Selektivität ist zwar die bisher höchste, die zu beobachten
war, sie ist aber ausgedrückt in einem E-Wert von 3 als schlecht zu bewerten.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 69
Reaktionsbedingungen Nach
E-Wert
(Äquiv.) 28 d
Umsatz 2%
Vinylacetat (5), n. b.
ee Ester (−)-16 -
Diisopropylether
ee Phenol (+)-8 n. b.
Umsatz 8%
Vinylacetat (5), n. b.
ee Ester (−)-16 -
MTBE
ee Phenol (+)-8 n. b.
Umsatz 36 %
Vinylacetat als Solvens ee Ester (−)-16 38 % 3.0
ee Phenol (+)-8 21 %
Umsatz 66 %
Vinylacetat (5), 33 %
ee Ester (−)-16 2.5
Dichlormethan
ee Phenol (+)-8 26 %
Vinylbutyrat als Acylierungsmittel ist allerdings nicht wie zuvor im Falle des
Vinylacetats ein Umsatz zu beobachten. Die CRL-katalysierte Reaktion mit
Vinylbutyrat als Acylierungs- und Lösungsmittel hingegen verläuft mit einer ähnlichen
geringen Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität wie die Reaktion in Vinylacetat.
Eine Steigerung wie im Falle der sekundären Alkohole in der MPEG/PLE-Katalyse ist
nicht zu beobachten.
Reaktionsbedingungen nach
E-Wert
(Äquiv.) 17 d
Umsatz 4%
Vinylbutyrat (5), n. b.
ee Ester (−)-15 -
Dichlormethan
ee Phenol (+)-8 n. b.
Umsatz 15 %
Vinylbutyrat als Solvens ee Ester (−)-15 28 % 2
ee Phenol (+)-8 15 %
Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)
Vinylpropionat (5),
21 d 0%
Dichlormethan
Vinylpropionat (5),
21 d 0%
Trichlormethan
Daß die enzymatischen Hydrolysen mit hoher Selektivität katalysiert werden, die
Transacylierungen im organischen Medium jedoch nicht, kann gerade im Hinblick auf
die zusätzlich noch sehr langsame Reaktion dadurch erklärt werden, daß die
eingesetzten Enzyme im wäßrigen Medium flexibler sind. Eine Anpassung der
Struktur des aktiven Zentrums an unterschiedliche Strukturmerkmale des Substrats
bei der Bildung des Substrat-Enzym-Komplexes im Sinne eines „induced fit“ ist im
wäßrigen Milieu erleichtert, da Wassermoleküle als „molekulares Schmiermittel“
fungieren können.150,187,188 Auch kann die unterschiedliche Solvatation von
Reaktanden, hier gerade des sehr polaren Phenols, und von Übergangszuständen
72 THEORETISCHER TEIL
Die in der enzymatischen Transacylierung erzielten Ergebnisse sind auch unter dem
Blickpunkt zu sehen, daß die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Reaktionen
erst einen Anfang in der Untersuchung der enzymatischen Acylierung von Tramadol-
Analoga mit phenolischer Hydroxylgruppe darstellen. Umfassendere
Untersuchungen zu Reaktionsparametern wie Acylierungsreagenz (s. Kap. 2.3.2.2),
Lösungsmitteleinfluß und Wasseraktivität können Reaktionsbedingungen aufzeigen,
unter denen eine selektive Enzym-katalysierte Racematspaltung von phenolischen
Substraten wie rac-8 durchaus möglich ist.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 73
OH
OMe
Me2N
rac-38
Abb. 2.26: Racemisches 4-Dimethylamino-2-(3-methoxyphenyl)-3-methyl-butan-
2-ol, ein Entwicklungskandidat der GRÜNENTHAL GmbH mit offenkettiger
Struktur.
Die Struktur des rac-38 bietet ebenso wie das Tramadol keinen direkten Angriffs-
punkt für eine Enzym-katalysierte Racematspaltung. Nach O-Demethylierung steht
aber auch hier die aromatische Hydroxylgruppe zur Verfügung. Es sollte daher
versucht werden, eine Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung mit diesem
offenkettigem Phenol (rac-11) durchzuführen.
Me2N OH
O Pr
OH Enzym
O Pr O
Phosphatpuffer- 17
Me2N O Lösung
+
10 % Cosolvens OH
rac-17 RT OH
Me2N
11
Abb. 2.27: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17.
Die Ergebnisse der enzymatischen Hydrolysen von rac-17 sind in Tabelle 2.20
zusammengefaßt. Rac-17 wird von beiden eingesetzten Enzymen als Substrat
akzeptiert und beide Hydrolasen zeigen eine hohe Aktivität in der Hydrolyse des
Esters. Es ist allerdings nahezu keine Enantiomer-Differenzierung der beiden
Enzyme zu beobachten. Beide Reaktionen verlaufen unselektiv.
Schweineleber-Esterase
25 Min. 69 % 7% 1% 1.1
(PLE; 1.3 U/ml), pH 8.0
Candida rugosa Lipase
2.5 h 17 % 1% 3% 1.1
(CRL; 2.4 U/ml), pH 7.0
Der Grund für die mangelnde Selektivität der enzymatischen Reaktionen kann nur in
der Molekülstruktur des Substrates liegen. In Molekül rac-17 fehlt die geschlossenen
Ringstruktur des Tramadol-Moleküls, daher ist das Molekül und besonders die
Dimethylaminomethyl-Seitenkette viel flexibler. Von der angreifenden Seringruppe im
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 75
Me2N OH
OH
OH Enzym
OH
11
Vinyllaurat
Me2N Diethylether +
RT OH
rac-11 O C11H23
Me2N O
44
Abb. 2.28: Enzym-katalysierte Transacylierung des Phenols rac-11.
76 THEORETISCHER TEIL
Reaktionsbedingungen Reaktions-
Enzym Umsatz
(Äquiv.) zeit
Eine Enzym-katalysierte Acylierung von rac-11 wäre sicherlich unter den für das
O-Desmethyltramadol (rac-8) gefundenen Bedingungen möglich, doch wird auch hier
nach den bisherigen Ergebnissen sowohl in der Acylierung von rac-8 als auch in der
Hydrolyse von rac-17 keine Enantiomer-Differenzierung der Enzyme zu beobachten
sein.
Das offenkettige, phenolische Tramadol-Analogon rac-11 ist somit kein geeignetes
Substrat für eine Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung zur Darstellung von
Enantiomeren. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Flexibilität des
Moleküls vergleichen mit dem Tramadol-Molekül der Fall. Zur Darstellung der
Enantiomeren kann ausgehend von Verbindung 38 aber auf ein Verfahren zur
thermodynamischen oder klassischen Racematspaltung mit Weinsäurederivaten
zurückgegriffen werden.
OH OH OH
3 1 OMe 3 1 OMe
1,3-Diole: HO 6 6
Me2N Me2N
(±)-(1RS,3SR,6RS)-12 (±)-(1RS,3RS,6RS)-13
OH
1 OMe
1,4-Diol: HO 2
4 Me2N
(±)-(1RS,2RS,4SR)-14
Sekundäre Alkohole sind die idealen, fast klassischen Substrate für eine Hydrolasen-
katalysierte kinetische Racematspaltung. Aufgrund der Vielzahl der einsetzbaren
Enzyme und deren geringer Substratspezifität bei trotzdem hoher Selektivität hat
diese Methode eine große Anwendungsbreite erlangt. Gerade bei unterschiedlicher
78 THEORETISCHER TEIL
OH OH OH OH
R R OMe
N
OMe
39 40 rac-41 rac-42
R = Me, Ph, SPh R = H, Br, SPh
I, Br, Cl, CN
NHPh, NO2, N3
OTs, OMe, OAc
CH2SPh, CH2COPh, CO2Et
Alkohol kann mit 93 % ee und das erhaltene Acetat mit 94 % ee erhalten werden
(E = 110).194
CAL-B
NMe2 (Novozym 435) NMe2 NMe2
+
Vinylacetat
OH OCOR OH
Diethylether
(+)-(1R,2S) (−)-(1S,2R)
42 %, 98 % ee 34 %, 96 % ee
H
N O Ph NHCbz NHCbz
BCL
O +
Vinylacetat
OH 1,4-Dioxan OCOMe OH
(−)-(1R,2R) (+)-(1S,2S)
31 %, 99 % ee 63 %, 49 % ee
H
N O Ph NHCbz NHCbz
CAL
+
O Vinylacetat
OH MTBE OCOMe OH
(−)-(1R,2S) (+)-(1S,2R)
43 %, 96 % ee 43 %, 96 % ee
In diesem Fall ließ sich das entsprechende cis-konfigurierte Isomer in der CAL-
katalysierten Transacylierung mit hoher Aktivität und Selektivität umsetzten (Abb.
2.32).197 Racemische 2-Methylamino-cyclohexanole lassen sind ebenfalls unter
diesen Bedingungen mit sehr guten Ergebnissen in die enzymatische
Racematspaltung einsetzten, wenn die freie Valenz am Stickstoff mit einer
Butoxycarbonyl-Gruppe (Boc) geschützt wird.198
Von SEKAR et al. wurden Untersuchungen zur Umkehrreaktion im wäßrigen Medium
durchgeführt. Es wurden Acetate von N-Aryl-substituierten 2-Aminocyclohexanolen in
die PLE-katalysierten Hydrolyse eingesetzt, die ebenfalls hochselektiv verlaufen.199
46 %, 84 % ee 46 %, 85 % ee
Ph Ph Ph
CRL
OH OH OH
(±) - Phosphatpuffer- +
OAc Lösung (pH 7.5) OH OAc
H Cosolvens H H
(−)-(1S,2S) (+)-(1R,2R)
46 %, 27 % ee 46 %, 26 % ee
Me2N OH
OMe
O
O OH O
PLE
OMe Pr (−)-18
Pr O Phosphatpuffer-
+
Me2 N Lösung
10 % Cosolvens OH
rac-18 RT OMe
HO
Me2N
(+)-12
Abb. 2.34: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18.
Die PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 verlief mit hoher Aktivität des
Enzyms hinsichtlich der Hydrolyse des Substrates. So wurde nach 5.75 Stunden ein
Umsatz von ca. 40 % erreicht und anschließend die Reaktion durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach anschließender
Säulenchromatographie mit Essigsäureethylester und Methanol im Verhältnis 1 : 1
an Kieselgel konnte der 1R,3S,6R-konfigurierte Alkohol (+)-12 in 30 % Ausbeute mit
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 83
Tabelle 2.22: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 (1.6 U/ml; Phosphat-
puffer, pH 8.0; 10 % tert-Butanol)
5.75 h 86 % 47 % 94 % 30 % 89
Die beobachtete Selektivität der Reaktion läßt sich durch einen E-Wert von 89
ausdrücken. Die in der Hydrolyse des Esters rac-18 erzielte Selektivität ist direkt
sehr hoch. Wie aus Abb. 2.35 hervorgeht liegt der nicht umgesetzte Ester (−)-18 ab
einem Umsatz von ca. 53 % enantiomerenrein vor und kann daher in hohen
Ausbeuten erhalten werden. Auch der gebildete Alkohol (+)-12 kann bis zu einem
Umsatz von ca. 40 % in der enzymatischen Hydrolyse mit guten ee-Werten isoliert
werden.
Es ist daher möglich beide Enantiomere in guter Ausbeute und mit guten bis sehr
guten Enantiomerenüberschüssen zu erhalten. Je nachdem, welches Enantiomer
gewünscht ist, kann die Reaktion bei einem Umsatz von ca. 40 % gestopt und der
(+)-Alkohol isoliert werden. Oder die Reaktion wird erst bei einem Umsatz von ca.
55 % aufgearbeitet und der (−)-Ester mit hohen Enantiomerenüberschüssen
erhalten, der dann noch anschließend zum (−)-Alkohol hydrolysiert werden muß.
84 THEORETISCHER TEIL
Abb. 2.35: Abhängigkeit der ee-Werte von Substrat (−)-18 (S) und Produkt (+)-12
(P) bei einer Selektivität von E = 89.
Wie zu erwarten war, ist die zu erzielende Selektivität in der Hydrolyse eines Esters
von einem sekundären Alkohol, wie rac-18, höher als die Selektivität in der
Hydrolyse eines phenolischen Esters, wie z.B. bei rac-15.
PB Ser
HL: große, hydrophobe Tasche
HS HS: kleine, hydrophobe Tasche
HL
PF: vordere, polare Tasche
PB: hintere, polare Tasche
PF Ser: Serin-Rest
Abb. 2.36: Modell für das aktive Zentrum der PLE nach JONES et al.
Um die Substratspezifität der PLE hinsichtlich der Hydrolyse der Substrate rac-15
und rac-18 erklären zu können, sind im Abb. 2.37 in der oberen Reihe die bevorzugt
umgesetzten Enantiomeren zur Vereinfachung als Alkohole nochmals dargestellt.
Me2N OH OH
OH OMe
HO
(−)-8 (+)-12 Me2N
OH
OH
MeO
NMe2 OH NMe2
OH
In der unteren Reihe in Abb. 2.37 sind beide Moleküle so gedreht, daß die vom Serin
des Enzyms angegriffene Hydroxylgruppe in die Richtung des Serinrestes im
Kastenmodell nach JONES et al. zeigt. Die für die Selektivität der PLE notwendige
Dimethylaminomethyl-Gruppe80 beider Moleküle kann so in Wechselwirkung mit der
vorderen polaren Tasche treten. Der wenig flexible Cylohexylring mit dem Aromaten
befindet sich in der großen, hydrophoben Tasche. Die räumliche Anordnung dieser
Gruppen ist in beiden Molekülen gleich, was die Selektivität der PLE hinsichtlich
beider Moleküle zu erklären vermag.
86 THEORETISCHER TEIL
Die Candida rugosa Lipase zeigte in der Hydrolyse des Phenylesters rac-15 von
allen eingesetzten Enzymen die höchste Selektivität und auch größte Aktivität
hinsichtlich des Substrats. Zudem sind große, cyclische sekundäre Alkohole
Standardsubstrate für dieses Enzym (s. Kap. 2.3.2). Daher wurde rac-18 in die CRL-
katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.38). Als erstes Reaktionsmedium wurde
zum Vergleich mit der PLE-katalysierten Reaktion das wäßrige Einphasensystem
ausgewählt.
O OH
OMe
Pr O
O OH Me2N
CRL
OMe (+)-18
Pr O Phosphatpuffer-
Lösung +
Me2N
RT Me2N OH
rac-18 OMe
HO
(−)-12
Abb. 2.38: CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18.
Die CRL zeigt, verglichen mit der PLE, eine etwas größere Aktivität hinsichtlich des
Substrats rac-18. So wurde nach 4.75 Stunden ein Umsatz von ca. 49 % erreicht.
Nach Aufarbeitung und anschließender Säulenchromatographie mit Diisopropylether
und Methanol im Verhältnis 1 : 1 an Kieselgel konnte der 1S,3R,6S-konfigurierte
Alkohol (−)-12 in 41 % Ausbeute mit 95 % ee isoliert werden. Der 1R,3S,6R-
konfigurierte Ester (+)-18 konnte in 41 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 86 %
erhalten werden (Tabelle 2.23).
Bei der Chromatographie der Reaktionsprodukte sind die isolierten Ausbeuten in
dem Laufmittel Diisopropylether und Methanol ein wenig besser als in dem Laufmittel
Essigsäureethylester und Methanol.
Die Selektivität der CRL-katalysierten Hydrolyse im wäßrigen Einphasensystem läßt
sich zusammenfassend durch einen E-Wert von 133 ausdrücken. Sie verläuft damit
selektiver als die entsprechende PLE-katalysierte Reaktion.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 87
4.75 h 93 % 41 % 95 % 41 % 133
Aus den Drehwerten der Produkte geht hervor, daß die CRL interessanterweise eine
zur PLE entgegengesetzte Enantiopräferenz zeigt. Während in der PLE-katalysierten
Hydrolyse bevorzugt das (+)-Enantiomer hydrolysiert wird, setzt das Enzym CRL
bevorzugt das (−)-Enantiomer um.
Das die Enzyme PLE und CRL hinsichtlich eines Substrats wie rac-15 die gleiche
Enantiopräferenz zeigen und bei einem strukturell verwandten Substrat wie rac-18
eine entgegengesetzte, ist in ähnlicher Form ebenfalls von NAEMURA et al.
beobachtet worden. Wie aus Abb. 2.33 auf Seite 81 hervorgeht zeigen PLE und CRL
hinsichtlich des cis-1-Phenylcyclohexan-1,2-diol ebenfalls eine entgegengesetzte
Enantiopräferenz, wohingegen bei der entsprechenden trans-konfigurierten
Verbindung beide Enzyme das gleiche Enantiomer bevorzugt umsetzten (Abb.
2.39).200
OH OH
OH
OH
cis-konfiguriertes Racemat trans-konfiguriertes Racemat
entgegengesetzte Enantiopräferenz gleiche Enantiopräferenz
Abb. 2.39: Relative Enantiopräferenzen der Enzyme PLE und CRL hinsichtlich der
beiden isomeren 1-Phenylcyclohexan-1,2-diole.
Um eine möglichst große Grenzfläche zu erhalten, wurde die Reaktion in einer feinen
Emulsion aus Phosphatpuffer und tert-Butyl-methylether (MTBE) durchgeführt. Nach
ca. 6 Stunden wurde ein Umsatz von ca. 45 % beobachtet. Eine Verlängerung der
Reaktionszeit auf 72 Stunden führte zu keiner weiteren Hydrolyse. Die Reaktions-
lösung wurde dann aufgearbeitet und nach Chromatographie mit Diisopropylether
und Methanol im Verhältnis 1 : 1 an Kieselgel konnte der 1S,3R,6S-konfigurierte
Alkohol (−)-12 in 39 % Ausbeute enantiomerenrein (≥98 % ee) erhalten werden. Von
dem 1R,3S,6R-konfigurierte Ester (+)-18 konnte in 40 % Ausbeute auch ebenfalls die
enantiomerenreine Verbindung (≥98 % ee) erhalten werden (Tabelle 2.24). Die
Enantiomer-Differenzierung der Candida rugosa Lipase unter diesen Reaktions-
bedingungen ist also so hoch, daß das nicht favorisierte Enantiomer praktisch nicht
umgesetzt wird, selbst bei einer Verlängerung der Reaktionszeit auf 72 Stunden. Es
kann also eine nahezu perfekte kinetische Racematspaltung beobachtet werden,
was sich durch einen E-Wert von größer 200 ausdrückt. Ein Wechsel bei der
Katalyse mit CRL vom Ein- zum Zweiphasensystem führte wie schon beim
Phenylester rac-15 zu einer Steigerung der Selektivität in der enzymatischen
Hydrolyse.
Enzymkosten.206 Nachteil eines kontinuierlichen Verfahrens ist, daß der ee-Wert des
isolierten nicht umgesetzten Substrates bei gleichem Umsatz nicht so hoch ist, wie in
einem satzweisen Verfahren. Dies ist der Fall, da ein Teil des kontinuierlich
zugeführten racemischen Substrates wieder direkt den Reaktor verläßt und so den
ee-Wert der erhaltenen Produkte herabsenkt.207 Von RAKELS et al. ist der Verlauf des
ee-Wertes des nicht umgesetzten Substrates in einem satzweisen und einem
kontinuierlichen Reaktor über den Verlauf des Umsatzes für verschiedene E-Werte
theoretisch berechnet und aufgetragen worden (Abb. 2.40). Hierbei fällt auch auf,
daß in einem kontinuierlichen Verfahren selbst bei einer hohen Selektivität von
E = 100 gegen Ende der Reaktion der zurückbleibende Ester nicht enantiomerenrein
anfällt.
48 h ≥98 % 51 % 97 % 46 % >200
Tabelle 2.26: Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18
(CAL-B; Phosphatpuffer, pH 7.5; 10 % tert-Butanol)
45 h 0% - - -
Daraufhin wurde eine lyophilisierte Form der CAL-B, mit dem Handelsnamen
Chirazyme L2, in die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-18 eingesetzt. Aber
auch diese Enzympräparation zeigte eine relativ niedrige Aktivität in der
enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-18. So konnte in der Chirazyme L2-
katalysierten Reaktion lediglich ein Umsatz von 7 % zum Alkohol (−)-12 nach 46 %
Stunden beobachtet werden (Tabelle 2.27). Aufgrund der niedrigen Aktivität dieser
Lipasen im wäßrigen Medium wurden keine weiteren Versuche zu einer CAL-B-
katalysierten Hydrolyse von rac-18 unternommen.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 93
46 h 7% 8% n. b. -
Die Enantiomeren des Alkohols 12 sind bisher nicht in der Literatur beschrieben, so
daß zur Bestimmung der Absolutkonfiguration kein Drehwert zum Vergleich zur
Verfügung steht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Absolutkonfiguration der
Enantiomere des Alkohols 12 daher auf der Basis zugeordnet, daß alle bisher
hergestellten (αR,βR)-Tramadol-Analoga mit tertiärer Hydroxylgruppe eine positiven
Drehsinn des Drehwerts zeigen.184
Die Bestimmung der Absolutkonfigurationen der Ester 18, 46 und 47 erfolgte in
Analogie zu der des Alkohols 12.
Nachdem in der enzymatischen Hydrolyse von rac-18 sehr gute Ergebnisse erzielt
worden sind, wurde die Umkehrreaktion, die Enzym-katalysierte Transacylierung von
rac-12 im organischen Medium, ebenfalls untersucht.
Ein Verfahren zur enzymatischen Acylierung im organischen Medium neben dem
hydrolytischen Verfahren würde weiterhin den Vorteil bieten, hydrolyselabile oder
hydrophobe und daher im wäßrigen Milieu unlösliche Verbindungen einsetzten zu
können. Dieser Gesichtspunkt ist vor allem für zukünftige Tramadol-Analoga von
Bedeutung. Daher ist neben der enzymatischen Hydrolyse ebenfalls ein Verfahren
zur Enzym-katalysierten Acylierung von rac-12 untersucht worden (Abb. 2.41).
Begonnen wurden diese Untersuchungen mit der Burkholderia cepacia Lipase (BCL),
welche auch nach den in Kap. 2.3.2 gemachten Vorbemerkungen eine geeignete
Lipase zur Umsetzung sekundärer Alkohole sein sollte. So ist beispielsweise von
94 THEORETISCHER TEIL
Me2N OH
OMe
O
O
OH Lipase R (−)-Ester
OMe
HO Vinylester
+
Me2N organisches
Lösungsmittel OH
rac-12 RT OMe
HO
Me2N
(+)-12
Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)
Isopropenylacetat (6)
20 d 3%
Toluol
Daher wurde Vinylpropionat als Acyldonor gewählt, das eine etwas längere Alkylkette
trägt und somit für eine Lipase ein geeigneteres Acylierungsmittel darstellen sollte.
Des weiteren wurde die Enzymkonzentration in der Reaktionsmischung verdreifacht.
Die Lösungsmittel Toluol und Acylierungsreagenz wurden beibehalten. Unter diesen
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 95
Reaktions- Mittel
bedingungen 8d E-Wert 13 d E-Wert E-Wert
(Äquiv.)
Umsatz 11 % 12 %
Vinylpropionat (5),
ee Ester (−)-46 94 % 34 95 % 43 38
Toluol
ee Alkohol (+)-12 8% 12 %
Umsatz 5% n. b.
Vinylpropionat
ee Ester (−)-46 91 % 22 n. b. - 22
als Solvens
ee Alkohol (+)-12 4% n. b.
Nach den guten Ergebnissen in der Hydrolyse des korrespondierenden Esters wurde
daraufhin die Candida rugosa Lipasen-katalysierte Acylierung von rac-12 untersucht.
In drei verschiedenen parallelen Ansätzen wurde der Alkohol rac-12 in die CRL-
katalysierte Acylierung mit Vinylpropionat in den Lösungsmitteln Diisopropylether,
96 THEORETISCHER TEIL
Reaktionsbedingung 3d 6d 8d 11 d 16 d
(Äquiv.) (%) (%) (%) (%) (%)
Umsatz 0 2 2 3 -
Vinylpropionat (5),
ee Ester (−)-46 n. b. n. b. n. b. 90 -
Diisopropylether
ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. n. b. 2 -
Umsatz 37 57 58 58 -
Vinylpropionat (5),
ee Ester (−)-46 94 91 96 89 -
Toluol
ee Alkohol (+)-12 56 97 98 ≥98 -
Umsatz 23 41 48 53 58
Vinylpropionat 88 84 86 82 79
ee Ester (−)-46
als Solvens
ee Alkohol (+)-12 25 52 68 85 ≥90
In dem Solvens Diisopropylether ist die geringste Aktivität des Enzyms CRL
hinsichtlich des Substrats rac-12 zu erkennen. Entsprechend der Aktivität des
Enzyms im Lösungsmittel Diethylether ist auch die Selektivität mit E = 19 sehr gering
(Tabelle 2.31). Ether, wie auch der Diethylether im Falle der phenolischen Substrate
rac-8 und rac-11, sind damit nach den bisherigen Ergebnissen keine geeigneten
Lösungsmittel für eine Lipasen-katalysierte Transacylierung von Tramadol-Analoga.
Dies Ergebnis steht in Einklang mit den von JUNGEN gemachten Untersuchungen zur
MPEG/PLE-katalysierten Transacylierung racemischer Alkohole in verschiedenen
Lösungsmitteln. Im Lösungsmittel MTBE wurden durchweg niedrige Aktivitäten und
Selektivitäten erhalten.85
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 97
Im Falle der Lösungsmittel Toluol und Vinylpropionat ist die Aktivität der CRL viel
größer. So werden nach 6 Tagen Umsätze von 57 % bzw. 41 % erreicht. Das die
Reaktion im Lösungsmittel Toluol nach diesen 6 Tagen kaum noch voranschreitet,
kann durch die hohe Selektivität der Reaktion erklärt werden, da ab einem Umsatz
von 50 % die größte Menge des schneller reagierenden Enantiomers verbraucht ist
und sich die Reaktionsgeschwindigkeit dann nur noch nach dem langsamer
reagierenden Enantiomer richtet. Die hohe Selektivität der Reaktion wird durch einen
mittleren E-Wert von 109 belegt (Tabelle 2.31). Die Schwankungen des E-Werts, der
eigentlich über den gesamten Reaktionsverlauf konstant bleiben sollte, läßt sich
durch die Meßgenauigkeit der Bestimmung der ee-Werte erklären. Bei hohen
E-Werten führen schon sehr kleine Änderungen des ee-Werts zu Schwankungen im
E-Wert. Dies läßt sich auch am Verlauf der E-Werte in dem Lösungsmittel
Vinylpropionat erkennen. Da hier der E-Wert der Reaktion geringer ist, fallen die
Schwankungen innerhalb der Reaktionsdauer auch viel geringer aus. Insgesamt ist
die Selektivität der CRL-katalysierten Acylierung im Solvens Vinylpropionat mit einem
E-Wert von 23, trotz der akzeptablen Reaktionsgeschwindigkeit zu niedrig, um sie
präparativ interessant erscheinen zu lassen (Tabelle 2.31).
Reaktionsbedingungen
3d 6d 8d 11 d 16 d Mittel
(Äquiv.)
Vinylpropionat (5),
- - - 19 - 19
Diisopropylether
Vinylpropionat (5),
56 89 >200 89 - 109
Toluol
Vinylpropionat
19 19 26 27 25 23
als Solvens
Autoren wird in diesem Fall eine Steigerung der Aktivität und Selektivität der CRL
berichtet, wenn statt Vinylacetat Isopropenylacetat verwendet wird.139,141b),142,209
Dieser Argumentation folgend wurde Isopropenylacetat als Acylierungsreagenz in die
CRL-katalysierte Transacylierung von rac-12 eingesetzt. Als Lösungsmittel wurden
Toluol, das zu der höchsten Selektivität mit Vinylpropionat geführt hat, und
Isopropenylacetat verwendet (Tabelle 2.32).
Reaktionsbedingung
2d 5d 14 d 20 d
(Äquiv.)
Umsatz 19 % 34 % 47 % 58 %
Isopropenylacetat (6),
ee Ester (−)-47 n. b. ≥98 % 94 % 94 %
Toluol
ee Alkohol (+)-12 n. b. 60 % 70 % 88 %
Umsatz 3% 5% 13 % 16 %
Isopropenylacetat n. b. 10 % 24 % 24 %
ee Ester (−)-47
als Solvens
ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. 4% 6%
Im Lösungsmittel Toluol zeigt die CRL eine wesentlich höhere Aktivität als im
Acylierungsmittel als Solvens. Qualitativ deckt sich diese Beobachtung mit den
Ergebnissen, die mit dem Acylierungsreagenz Vinylpropionat erzielt wurden.
Allerdings ist die Reaktion in Isopropenylacetat sehr langsam, da nach fast
3 Wochen lediglich ein Umsatz von 16 % erreicht wurde. Die Reaktion verläuft mit
einem E-Wert von 2 außerdem nahezu unselektiv (Tabelle 2.33).
Die Selektivität der CRL-katalysierten Transacylierung mit Isopropenylacetat verläuft
in den ersten 5Tagen bis zu einem Umsatz von ca. 45% mit nahezu perfekter
Selektivität (E >200) und fällt danach ab. Die Reaktion im Lösungsmittel Toluol
verläuft mit Isopropenylacetat als Acylierungsmittel langsamer als mit Vinylpropionat.
Die in beiden Reaktionen im Mittel erzielten Selektivitäten sind im gleichen Rahmen
sehr gut. Dies deutet daraufhin, daß unter diesen Reaktionsbedingungen (Toluol,
Reaktionszeiten von 3 bis 5 Tagen) mit Vinylpropionat und Isopropenylacetat keine
Deaktivierung der CRL durch Acetaldehyd vorliegt.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 99
Reaktionsbedingungen
2d 5d 14 d 20 d Mittel
(Äquiv.)
Isopropenylacetat (6),
n. b. >200 67 94 120
Toluol
Isopropenylacetat
n. b. n. b. 2 2 2
als Solvens
O OH
OMe
R O
Me2N
OH PLE
OMe (+)-Ester
HO Vinylester +
Me2N organisches
Lösungsmittel Me2N OH
rac-12 OMe
RT HO
(−)-12
Abb. 2.42: PLE-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-12.
Native PLE zeigt im Gegensatz zu Lipasen allerdings praktisch keine Aktivität in der
Transacylierung von Alkoholen mit Vinylestern im organischen Medium. Es wurde
daher MPEG/PLE (vgl. Kap. 2.1) als Katalysatorpräparation in die Transacylierung
von rac-12 eingesetzt. Als Lösungsmittel wurde Toluol verwendet, da in diesem
Lösungsmittel die CRL eine hohe Aktivität zeigte, als Acylierungsmittel wurden
sowohl Vinylacetat als auch Isopropenylacetat eingesetzt (Tabelle 2.34).
100 THEORETISCHER TEIL
Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)
Vinylpropionat (5),
20 d 3%
Toluol
Isopropenylacetat (5),
20 d 0%
Toluol
Unter diesen Reaktionsbedingungen fand, wie schon zuvor beim Phenol rac-8, keine
PLE-katalysierte Reaktion in einem nennenswerten Umfang statt.
Um weitere Reaktionsmedien im Hinblick auf mögliche günstige Eigenschaften für
eine PLE/MPEG-katalysierte Reaktion von rac-12 zu testen, wurden drei weitere
Lösungsmittel untersucht. Mit Vinylpropionat als Acylierungsmittel wurde
Dichlormethan, MTBE und das Acylierungsmittel Vinylpropionat als Solventien in die
PLE/MPEG-katalysierte Acylierung von rac-12 eingesetzt (Tabelle 2.35). Außerdem
wurde in diesen Reaktionen die sechsfache Menge an Katalysator im Vergleich zu
den vorherigen Reaktionen eingesetzt.
Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)
Vinylpropionat (5),
21 d 2%
Dichlormethan
Vinylpropionat (5),
4d 1%
MTBE
Vinylpropionat (200) 21 d 3%
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 101
Für eine Acylierung von rac-12 wurde ein Colyophilisat aus PLE, BSA und MPEG
(PLE/BSA/MPEG) gewählt und eingesetzt, welches bei Standardsubstraten eine
hohe Aktivität im organischen Medium zeigt.83 Als Acylierungsmittel wurde
Vinylpropionat für die Reaktionen gewählt und diesmal das Lösungsmittel variiert. Es
wurden Dichlormethan und Toluol verwendet. Zum Lösungsmittel Toluol wurde
hierbei ein Wasserzusatz von 0.25 % gegeben (Tabelle 2.36).
geschwindigkeit bei einem Zusatz von 0.2 Vol% Wasser beobachtet worden.85 Daher
wurde für diesen Versuch mit dem Katalysator PLE/BSA/MPEG ein Wasserzusatz
von 0.25 % gewählt.
Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)
Im Laufe der Reaktionszeit änderte sich die Farbe des PLE/BSA-Katalysators von
weiß in ein dunkles rot-braun. Dies ist ein typisches Merkmal dafür, daß der Zusatz
BSA mit Carbonyl-Nebenprodukten reagiert. Diese Nebenprodukte können nur aus
der enzymatischen Hydrolyse des Vinylesters stammen. Eine derartige
Nebenreaktion in größerem Umfang ist ebenfalls von Ruppert84 wie auch anderen213
beobachtet worden.
O
+E
R1 OH
+ H2O A
O +E O
+ [R1-CO-E]
R1 O
B
+ R2-OH
O + H2O
O
R2 + E + R2-OH
R1 O R1 OH
C
Abb. 2.43: Hydrolyse des Acyldonors als Nebenreaktion der Transacylierung.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 103
In beiden Reaktionsansätzen konnte aber kein Umsatz in der Acylierung von rac-12
detektiert werden. Insgesamt deuten somit die erzielten Ergebnisse in den
Versuchen zur PLE-katalysierten Transacylierung darauf hin, daß Tramadol-Analoga,
sowohl mit aromatischer als auch mit sekundärer Hydroxylfunktion, keine geeigneten
Substrate für eine PLE-katalysierte Reaktion im organischen Medium darstellen.
104 THEORETISCHER TEIL
Der racemische Alkohol rac-13 ist eine pharmakologisch wirksame Verbindung, die
eine dem Tramadol ähnliche analgetische Aktivität besitzt. Das Hydrochlorid des
(±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diols (rac-13⋅HCl)
befindet sich in einem fortgeschrittenem Stadium der klinischen Entwicklung von der
GRÜNENTHAL GmbH. Die Verbindung zeigt ein solch gutes pharmakologisches Profil,
das eine direkte Vermarktung des Racemats ohne eine weitere Derivatisierung
erhofft werden kann (Abb. 2.44).184
OH OH
OMe ⋅HCl
Me2N
Abb. 2.44: Hydrochlorid von rac-13, dessen Vermarktung von der GRÜNENTHAL
GmbH angestrebt wird.
Die Substanz zeigte eine mittlere analgetische Aktivität in der Wirkstärke des
O-Desmethyltramadols (rac-8) bei außerordentlich hoher Bioverfügbarkeit. Dies stellt
einen Fortschritt gegenüber der bisherigen Therapie dar. Dazu ist die Halbwertszeit
im Körper dieser Substanz sowie die des O-Desmethyl-Metaboliten gegenüber
vergleichbaren Substanzen, wie dem Tramadol, verlängert.184
Der Wirkstoff rac-13⋅HCl zeigt, ähnlich wie das Tramadol, eine dreifaches Wirkprofil.
So existiert neben der µ-opioiden Wirkung auch Inhibierung der Wiederaufnahme der
Neurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5HT), was zu einer Inhibierung
der spinalen Schmerzleitung führt.184
Interessanterweise zeigen die Enantiomeren eine synergistische Wirkung, ähnlich
wie auch beim Tramadol, dies kann die weitere Entwicklung und später geplante
Vermarktung des Racemats ermöglichen. Trotzdem werden natürlich die einzelnen
Enantiomeren für eine pharmakologische Begutachtung benötigt.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 105
Pr O OH
O OMe
Pr O OH Me2N
Hydrolase
OMe 19
Phosphatpuffer-
+
Me2N Lösung Me2N
RT OH
rac-19 HO OMe
13
Abb. 2.45: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-19.
Um ein Enzym zu identifizieren, daß die enzymatische Hydrolyse des Esters rac-19
mit hoher Aktivität und Selektivität zu finden, wurden acht Hydrolasen unter den
bisherigen Standardbedingungen, wäßriges Einphasensystem (pH 7.0, pH 8.0 im
Falle der PLE) mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens, in die enzymatische Hydrolyse
des Esters rac-19 eingesetzt. Es konnte nach ein bis drei Tagen Reaktionszeit in
keinem Fall eine Hydrolyse des Substrates in einem nennenswerten Umfang
festgestellt werden (Tabelle 2.37). In allen Fällen konnte das eingesetzte Edukt
nahezu vollständig zurückerhalten werden (91 – 100 % Ausbeute).
106 THEORETISCHER TEIL
Cholesterolesterase
24 h 1%
(CE; 11.0 U/ml)
Candida rugosa Lipase
29 h 0%
(CRL; 4.6 U/ml)
Chirazyme L-2
45 h 0%
(CAL-B; 38.8 U/ml)
Burkholderia cepacia Lipase
45 h 0%
(BCL; 0.05 U/ml)
Burkholderia cepacia Lipase
46 h 0%
(BCL, 30 U/ml)
Porcine pancreatic Lipase
23 h 1%
(PPL; 16.8 U/ml)
Chromobacterium viscosum Lipase
69 h 0%
(CVL, 0.18 U/mg)
Schweineleber-Esterase
41 h 0%
(PLE, 6.5 U/ml), pH 8.0
69 h 1% n. b. n. b. -
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 107
Insgesamt stellen die hier eingesetzten Enzyme eine repräsentative Auswahl der
standardmäßig in der organischen Synthese eingesetzten Hydrolasen dar. Die in
Kap. 2.3.2 hervorgehobenen Enzyme sind ebenfalls in dieser Auswahl vertreten.
Daher ist es nicht wahrscheinlich, daß bei dem Versuch weitere Enzyme in die
Hydrolyse von rac-19 einzusetzen ein Enzym gefunden wird, daß diese Reaktion
katalysiert und zudem noch die in Kap. 2.3.2 gemachten Voraussetzungen erfüllt.
Da unter den zur Hydrolyse von rac-19 verwendeten Enzymen und Reaktions-
bedingungen die zuvor eingesetzten Tramadol-Analoga als Substrate akzeptiert
wurden, ist die Konsequenz, daß rac-19 kein geeignetes Substrat für eine
enzymatische Hydrolyse darstellt. Ein naheliegender Grund warum dieser 1,3-diaxial
substituierte Ester nicht von den getesteten Enzymen als Substrat akzeptiert wird,
kann der sterischen Anspruch der tertiären Hydroxylgruppe, die sich in direkter Nähe
zu der vom Enzym anzugreifenden Estergruppe befindet, sein.
Nachdem sich der 1,3-diaxial substituierte Ester rac-19 als kein geeignetes Substrat
für eine enzymatische Hydrolyse herausgestellt hatte, wurde die enzymatische
Transacylierung des Alkohols rac-13 auch in der Hoffnung untersucht, daß
zumindest der Alkohol aufgrund seines geringeren Raumbedarfs als Substrat
akzeptiert werden würde und einer enzymatischen Reaktion zugänglich ist (Abb.
2.46).
OH OH
OMe
OH OH Me2N
Lipase
OMe 13
Vinylester
+
Me2N organisches O
NMe2
Lösungsmittel
rac-13
RT R O OH OMe
19
Abb. 2.46: Enzymatische Transacylierung des Alkohols rac-13.
Obwohl es sich bei dem Grundkörper des Alkohols rac-13, ein substituiertes
Cyclohexan-1,3-diol, um eine für chirale Auxiliare interessante Zwischenstufe
handelt, sind bis heute nur wenige Publikationen zu einer enzymatischen
Racematspaltung erschienen.
Daß eine Acylierung von Cylohexan-1,3-diol selbst möglich ist, wurde bereits 1992
von BHATTACHARYA et al.214 sowie später 1996 MATTSON et al.215 gezeigt. Von beiden
ist jeweils die cis /trans-Mischung der Epimeren in die Hydrolasen katalysierte
Acylierung im organischen Medium eingesetzt worden. Von BHATTACHARYA et al.
wurde eine Mischung verschiedener Proteasen aus Streptomyces griseus (Pronase)
mit äquimolaren Mengen p-Nitrophenylacetat in Pyridin zur Acylierung verwendet. Es
wurde eine 1 : 1 Mischung der cis- und trans-kofigurierten Monoacetate in 42 %
Ausbeute erhalten. MATTSON et al. verwendeten immobilisierte Candida antarctica
Lipase Typ B (Novozym 435) mit S-Ethylthiooctanoat216 als Acylierungsmittel. Unter
diesen Reaktionsbedingungen konnte sogar eine Diacylierung beobachtet werden.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 109
Von GOTOR et al. ist ein Beispiel einer enzymatischen Acylierung eines höher
substituierten Cyclohexan-1,3-diol-Derivats veröffentlicht worden.217 Die von einer
Lipase aus Chromobacterium viscosum katalysierte Acylierung des (3S,5S)-
5-Ethynyl-4-methyl-cyclohex-4-ene-1,3-diols in Vinylacetat als Solvens verläuft mit
einer hohen Aktivität und führt mit 100 %Umsatz zu dem an 5 Position acylierten
Monoacetat (Abb. 2.47). Somit wird die am wenigsten sterisch gehinderte
Hydroxylgruppe acyliert.
CVL O
Vinylacetat
HO OH O OH
100 % Umsatz
Im Fall des Novozym 435 konnten Spuren des gewünschten Propionsäureesters von
13 detektiert werden. Daher wurde dies Enzym unter verschiedenen Reaktions-
bedingungen in die Transacylierung des Alkohols rac-13 eingesetzt. Es wurden
Dichlormethan und das Acylierungsmittel Vinylpropionat als Lösungsmittel verwendet
(Tabelle 2.40). Eine Enzym-katalysierte Reaktion war aber auch unter diesen
Bedingungen nicht zu beobachten.
Vinylpropionat (5),
1% 1%
Toluol
Vinylpropionat (5),
0% 0%
Dichlormethan
Vinylpropionat
1% 1%
als Solvens
Isopropenylacetat (5), 1% 1%
Toluol
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 111
Aus Tabelle 2.41 geht hervor, das eine Acylierung des Alkohols rac-13 nicht erreicht
werden kann. Weder das von GOTOR et al. beschriebene Enzym CVL katalysiert
diese Reaktion, noch führt der Zusatz Triethylamin zu einer Aktivierung der Enzyme
in einem zu wünschenden Umfang.
OH OH Lipase PS
R +
Vinylacetat
R
(1S,3S)
(1R,3R)
Lipase PS
R OH + OH R OAc
Vinylacetat
R
Benzol, 30 °C (−)-(1R,3S)
(1R,3S) (1S,3R)
Im Falle der von MATTSON et al. beschrieben Racematspaltung einer Mischung von
cis- und trans-Cyclohexan-1,3-diol, war das zurückbleibende, am langsamsten
reagierende Isomer ebenfalls (+)-(1S,3S)-konfiguriert.215
Im Falle der enzymatischen Racematspaltung von N-substituierten cis-
2-Aminocylhexanolen, konnte von GOTOR et al. ebenfalls keine CAL-B-katalysierte
Acylierung beobachtet werden, wenn die Hydroxylgruppe axial fixiert war.197 Eine
entsprechende Acylierung des trans-konfigurierten Epimers verlief hochselektiv.196
Der Unterschied in der Reaktivität beider Substrate wurde von den Autoren ebenfalls
durch die geometrische Anordnung der axialen Hydroxylgruppe erklärt.
Nachdem sich gezeigt hatte, daß weder der 1,3-diaxial substituierte Ester rac-19
noch der korespondierende Alkohol rac-13 aufgrund der geometrischen Anordnung
der Hydroxylgruppe als Substrat in eine Enzym-katalysierte Racematspaltung
eingesetzt werden können, wurde nach einer geeigneten Modifizierung des Alkohols
rac-13 gesucht, um ihn einer enzymatischen Reaktion zugänglich zu machen.
Pr O OH Hydrolase OH OH
OMe OMe
Phosphatpuffer-
Me2N Lösung Me2N
rac-19 13
Eine erste Alternative zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-19 ist die
Möglichkeit den Alkohol rac-13 in ein cyclisches Carbonat (rac-48) unter Einbindung
der tertiären Hydroxylgruppe zu überführen und anschließend eine enzymatische
Racematspaltung dieser Verbindung durchzuführen (Abb. 2.50). Das solche
cyclischen Carbonate als Substrate in eine Hydrolasen-katalysierte Reaktion
eingesetzt werden können, ist bereits von MATSUMOTO et al. sowie GUIBE-JAMPEL et
al. demonstriert worden.220
OH OH O O
OMe OMe Hydrolase
Phosphatpuffer-
Me2N Me2N Lösung
rac-13 rac-48
Von BURK et al. wird eine effiziente Methode zur Überführung von 1,3-Diolen in
cyclische Carbonate beschrieben. Nachdem es ihnen nicht gelang ein 1,3-Diol mit
114 THEORETISCHER TEIL
0.5 Äquiv. O
Triphosgen
OH OH O O
10 Äquiv. Pyridin
OMe (⋅HCl) OMe
Abb. 2.51: Versuch zur Darstellung des Carbonats rac-48 durch Acylierung mit
Triphosgen.
Rac-13 wurde sowohl als Hydrochlorid als auch als freie Base in diese Reaktion
eingesetzt. Aufgrund der Giftigkeit des während der Reaktion freigesetzten Phosgens
wurde keine Reaktionskontrolle durchgeführt. Nach Chromatographie der erhaltenen
Reaktionsmischungen konnten neben dem zurückgewonnenen Edukt nur jeweils
nicht näher charakterisierte Zersetzungsprodukte erhalten werden. Dies ist wahr-
scheinlich darauf zurückzuführen, daß aufgrund der hohen Reaktivität des
Triphosgens bzw. Phosgens eine Acylierung am Stickstoff als Nebenreaktion auftritt.
Die am Stickstoff acylierte Spezies kann anschließend eine N-Dealkylierung
eingehen. Diese Nebenreaktion wurde versucht zu unterdrücken, indem rac-13 als
Hydrochlorid eingesetzt wurde.
Eine Prozedur zur Überführung von rac-13 in das cyclische Carbonat unter milderen
Reaktionsbedingungen wurde von KUTNEY et al. beschrieben. Sie beschreiben die
Überführung eines cyclischen 1,2-diols in das entsprechende Carbonat unter
Verwendung von 1-1´-Carbonyldiimidazol in Toluol.223 Daraufhin wurde versucht
rac-13 mittels dieses Reagenzes unter den von KUTNEY et al. publizierten
Bedingungen in rac-48 zu überführen (Abb. 2.52).
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 115
O
4 Äquiv.
OH OH O O
OMe 1,1´-Carbonyldiimidazol OMe
Abb. 2.52: Versuch zur Darstellung des Carbonats rac-48 durch Acylierung mit
1,1´-Carbonyldiimidazol.
Rac-13 wurde wieder sowohl als Hydrochlorid als auch als freie Base eingesetzt. Die
Reaktion wurde abgebrochen nachdem jeweils kein Edukt mehr detektiert werden
konnte. Die rohen Produktmischungen wurden mittels Massenspektroskopie
untersucht und es konnte ein Fragment mit einer Masse von 305 detektiert werden,
dem M+ von rac-48 zugeordnet wurde. Nach Chromatographie (EE : MeOH = 2 : 1
über Kieselgel) konnte allerdings keine gewünschtes Produkt erhalten werden. Da
das Vorhandensein von 48 in der rohen Produktmischung nachgewiesen wurde, ist
zu vermuten, daß das Carbonat 48 unter den Bedingungen der Chromatographie
nicht stabil ist. Es wird daher angenommen, daß selbst wenn rac-48 ohne
Chromatographie dargestellt werden könnte, es aufgrund seiner mangelnden
Stabilität kein geeignetes Substrat für eine enzymatische Hydrolyse darstellt.
Diese Route zur Darstellung der einzelnen Enantiomeren von 13 mittels eines
cyclischen Carbonats (rac-48) als Substrat für eine enzymatische Racematspaltung,
wurde daraufhin nicht weiter verfolgt.
OH OH OH OH
OMe DiBAl-H OH
Toluol
Me2N Rückfluß Me2N
rac-13 rac-20, 88 %
Abb. 2.53: Darstellung des Phenols rac-20 durch O-Demethylierung mit DiBAl-H.
Zur selektiven Darstellung des Phenylesters rac-21 erfolgte nach einer Methode von
RICE et al (s. Kap. 2.2, S. 16).95 Dazu wurde das Phenol rac-20 mit 10 Äquivalenten
Buttersäureanhydrid in Gegenwart eines Überschusses an wäßriger NaHCO3-
Lösung in sehr guter Ausbeute (93 %) zu rac-21 umgesetzt (Abb. 2.54).
OH OH OH OH
OH NaHCO3-Lösung O Pr
10 Äquiv. Buttersäure-
Me2N Me2N O
anhydrid
rac-20 RT, 30 Min. rac-21, 93 %
Mit rac-21 steht nun ein Substrat zur Verfügung, das nach den Untersuchungen zur
enzymatischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga mit aromatischer
Hydroxylgruppe als Substrat akzeptiert werden sollte. Der Ester rac-21 wurde
daraufhin in die Enzym-katalysierte Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.55).
OH OH
O Pr
OH OH Enzym Me2N O
O Pr
Phosphatpuffer- (+)-21
Me2N O Lösung
+
RT Me2N
rac-21 OH
HO OH
(−)-20
Cholesterolesterase
16.8 h 64 % 71 % 11 % 2
(CE; 3.3 U/ml) pH 7.0
Schweineleber-Esterase
3.3 h 82 % 20 % 6% 1.3
(PLE; 4.9 U/ml), pH 8.0
Candida rugosa Lipase
18.5 h 40 % 31 % 17 % 2
(CRL; 4.6 U/ml), pH 7.0
Aus Tabelle 2.42 geht hervor, daß der Phenylester rac-21 im Gegensatz zu dem
Ester der sekundären Hydroxylgruppe (rac-19) ein Substrat für eine enzymatische
Racematspaltung ist. Alle drei eingesetzten Enzyme zeigen eine hohe Aktivität in der
Hydrolyse dieses Esters. Die Aktivität der getesteten Enzyme ist im Bereich der
Aktivität hinsichtlich des Esters rac-15. Die unter diesen Standardbedingungen eines
Enzymscreenings erzielte Selektivitäten sind allerdings für alle Enzym sehr schlecht.
Im Rahmen der Untersuchungen zum Phenylesters rac-15 wurden unter gleichen
Bedingungen höhere Selektivitäten in der CRL- und PLE-katalysierten Hydrolyse
erzielt. Die höchste Selektivität in der Hydrolyse des Phenylesters rac-15 wurde in
der CRL-katalysierten Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem
beobachtet. Daher wurde der Phenylester rac-21 ebenfalls in die CRL-katalysierte
Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem eingesetzt (Tabelle 2.43).
118 THEORETISCHER TEIL
46 h 57 % 89 % 28 % 5
Die unter diesen Bedingungen erzielte Selektivität, ausgedrückt in einem E-Wert von
5, ist zwar höher als die, die im wäßrigen Einphasensystem beobachtet wurde, sie ist
allerdings für eine kinetische Racematspaltung dieses Esters zu gering.
Somit ist wie im Falle des Esters rac-15 auch mit dem Esters rac-21 in der CRL-
katalysierte Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasensystem die höchste
Selektivität beobachtet worden. Insgesamt konnte die prinzipielle Möglichkeit zu
einer Enzym-katalysierten Racematspaltung des 1,3-diaxial substituierten Alkohols
rac-13 aufgezeigt werden und so wiederum die Anwendbarkeit der Methode einer
Enzym-katalysierten Racematspaltung von phenolischen Estern demonstriert
werden.
Die bisher in der enzymatischen Hydrolyse des Phenylesters rac-21 erzielte
Selektivität ist mit einem E-Wert von 5 sehr gering. Allerdings wurden in den ersten
Versuchen zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-15 auch ähnlich niedrige
Selektivitäten beobachtet, die dann optimiert werden konnten. Daher kann eine
Optimierung der Reaktionsbedingungen (Enzym, Cosolvens, Kettenlänge des Esters
u.a.) hier möglicherweise auch zu einer Steigerung der Selektivität führen.
F OH
OMe ⋅HCl
O
Me2N
(+)-50⋅HCl
Diese Substanz zeigt eine sehr starke analgetische Aktivität, die über die von
Morphin hinausgeht. Somit könnte ein Einsatz in der Therapie gegen sehr starke
Schmerzen erfolgen. Aufgrund einer sehr hohen Wirkstärke von (+)-50 ist hierzu nur
die Verabreichung geringster Mengen nötig. Dabei ist auch eine orale Einnahme
möglich, was einen Fortschritt zu der bisherigen Therapie darstellt. Eine weitere
Verbesserung ist, daß die häufig als Nebenwirkung auftretende Atemdepression
gegenüber vergleichbaren Wirkstoffen, wie dem Morphin, vermindert ist.184
Interessanterweise zeigt dieser Wirkstoff, wie das Tramadol, eine µ-opioide und eine
nicht-opioide Wirkung. Doch während beim Tramadol die Inhibierung der
Wiederaufnahme der Neurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5HT)
hauptsächlich über das (−)-Enantiomer erfolgt, zeigt in diesem Falle das (+)-50
neben der µ-opioiden Wirkung auch die Wirkung der Wiederaufnahmehemmung.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 121
Das Wirkprofil des Racemats Tramadol konnte somit in einem Enantiomer eines
neuen Wirkstoffs vereint werden.184
Das entsprechende (−)-Enantiomer zeigt ebenfalls eine analgetische Aktivität, die
aber nicht an die Wirkstärke von (+)-50 heranreicht. Zudem verursacht es starke
Nebenwirkungen (Herz-Kreislauf-Beschwerden), die im Falle des (+)-50 weniger
stark ausgeprägt sind. Durch die Fluor-Substitution am Aromaten wird eine
verlangsamte Metabolisierung im Körper erreicht.184 Erst kürzlich ist über das nicht
fluorsubstituierte (+)-4-Benzyloxytramadol ist mit ausgewählten pharmakologischen
Daten berichtet worden.46i) Diese zeigen ebenfalls eine im Vergleich zum Tramadol
gesteigerte Affinität zum µ–Opioidrezeptor.
Obwohl in diesem Fall die Verwendung eines einzelnen Enantiomers geplant ist,
werden natürlich beide einzelnen Enantiomeren für eine pharmakologische
Begutachtung benötigt.
Wie der isomere Alkohol rac-12 ist auch rac-14 aufgrund der equatorial
angeordneten sekundären Hydroxylgruppe ein Substrat, daß sich für eine
Hydrolasen-katalysierte Racematspaltung anbietet. Ausgehend von den bisherigen
Ergebnissen zur enzymatischen Hydrolyse von Tramadol-Analoga wurde wiederum
das Butyrat als Acylrest gewählt und unter den bisherigen Standardbedingungen,
wäßriges Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens, in die enzymatische
Hydrolyse eingesetzt (Abb. 2.57).
OH
OMe
Pr O
Me2N
O
OH (+)-22
Enzym
OMe
Pr O Phosphatpuffer-
Me2N Lösung +
O 10 % Cosolvens
rac-22 Me2N OH
RT OMe
HO
(−)-14
Abb. 2.57: Enzym-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22.
122 THEORETISCHER TEIL
Als erstes Enzym wurde die Lipase aus Burkholderia cepacia als Katalysator in die
enzymatische Hydrolyse des Esters rac-22 eingesetzt (Tabelle 2.44). Nach
22 Stunden Reaktionszeit konnte kein Produkt mittels DC-Reaktionskontrolle
detektiert werden, daraufhin wurde die Reaktionstemperatur auf 35 ºC für die
restliche Reaktionszeit erhöht. Nach insgesamt 48 Stunden Reaktionszeit konnte
immer noch kein Umsatz beobachtet werden, daraufhin wurde die Reaktion
abgebrochen. In der BCL-katalysierten Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit
Vinylpropionat wurde ebenfalls eine nur geringe Aktivität dieses Enzyms festgestellt
(Tabelle 2.29). Eine Erklärung könnte sich aus dem aktiven Zentrum dieser Lipase
ergeben: von KAZLAUSKAS et al. wurden die aktiven Zentren verschiedener Lipasen
untersucht, hierbei zeigte sich, daß die BCL226 verglichen mit der CRL227 über eine
viel schmalere Tasche zur Bindung des Alkohols verfügt.228 Dies mag der Grund
dafür sein, daß dies Enzym die relativ großen Moleküle der Tramadol-Analoga nur
mit geringer Aktivität akzeptiert.
Tabelle 2.44: Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 (20 U/ml;
Phosphatpuffer, pH 7.5; 10 % tert-Butanol)
Burkholderia cepacia
48 h 0% n. b. n. b. -
Lipase
Novozym 435
10 d 35 % 67 % 85 % 24
(CAL-B)
Chirazyme L2
45 h 7% 9% ≥98 % >200
(CAL-B, 58 U/ml)
Eine höhere Aktivität in der Candida antarctica Lipase des Esters rac-22 wurde von
einer lyophilisierten Form unter dem Namen Chirazyme L2 erwartet (Tabelle 2.45).
Allerdings konnte nach 45 Stunden lediglich ein Umsatz von 7 % erzielt werden. Ein
Umsatz, der in der gleichen Zeit auch in der Novozym 435-katalysierten Hydrolyse
des Esters rac-18 erreicht worden war. Eine Verlängerung der Reaktionszeit würde
sicherlich zu höheren Umsätzen führen, aber eine Reaktionszeit von bis zu 10 Tagen
erscheint für einen möglichen zukünftigen Produktionsprozeß nicht zweckmäßig.
Interessanterweise ist die Selektivität dieser Reaktion bis zum erreichten Umsatz
außerordentlich hoch. Es wurde praktisch nur der (−)-Ester hydrolysiert. Diese hohe
Selektivität wird als E > 200 ausgedrückt. Bei einem höheren Umsatz wäre dieser
E-Wert aussagekräftiger, da bei niedrigen Umsätzen kleine Schwankungen in der
Bestimmung des ee-Werts des Alkohols zu hohen Schwankungen im E-Wert führen
können, außerdem kann es bei Abweichungen von den Voraussetzungen zum E-
Wert zu einem Abfall der Selektivität mit Fortschreiten der Reaktion kommen.
Die Candida rugosa Lipase hat in der Hydrolyse von rac-18 und Transacylierung von
rac-12 sehr gute Aktivitäten und Selektivitäten gezeigt. Zunächst wurde die CRL in
die Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem mit 10 % tert-
Butanol als Cosolvens eingesetzt (Tabelle 2.46). Nach 24 Stunden konnte bei einem
Umsatz von 27 % ein ee-Wert von 92 % im Alkohol (−)-14 bei einem ee-Wert im
Ester von 38 % erzielt werden. Dies entspricht einem E-Wert von 34. Wie schon bei
der Hydrolyse des Esters rac-18 wird von dem Enzym CRL, wie zuvor auch von der
CAL-B, das (−)-Enantiomer des Substrats bevorzugt umgesetzt. Die erzielte
Selektivität ist niedriger als die, die in der Hydrolyse der isomeren Verbindung rac-18
124 THEORETISCHER TEIL
erzielt wurde. Für eine Hydrolyse in einem größeren präparativen Maßstab wäre die
Selektivität aber hoch genug. In Abb. 2.22 auf S. 58 ist die Abhängigkeit der ee-
Werte von Substrat (+)-22 und Produkt (−)-14 bei einer Selektivität von E = 34
dargestellt. Aus dieser Abbildung geht hervor, daß ab einem Umsatz von ca. 60 %
der nicht umgesetzte Ester enantiomerenrein vorliegt.
Einphasensystem
(Phosphatpuffer, pH 7.0; 24 h 27 % 38 % 92 % 34
10 % tert-Butanol)
Zweiphasensystem
(Phosphatpuffer, pH 7.5; 5d 34 % 37 % 69 % 8
MTBE; 1 : 1)
HO
HO H H
M L M L
Im Fall des Esters 22 wird von der CRL bevorzugt das (−)-(1R,2S,4S)-konfigurierte
Enantiomer umgesetzt. Dies läßt sich mit dem KAZLAUSKAS Modell in Einklang
bringen (Abb. 2.59). Zum Vergleich sind in Abb. 2.59 neben dem Alkohol (−)-14 die
von der CRL bevorzugten Enantiomere (−)-41193 und (+)-42194 abgebildet. Auf alle
drei Enantiomere läßt sich das Selektivitätsmodell nach KAZLAUSKAS et al. anwenden.
OH OH OH
OMe
NMe2 N
OMe
OH
MeO
(−)-14 (−)-41 (+)-42
Me2N OH
OMe
HO
(−)-14
Abb. 2.59: Von der CRL entsprechend dem von KAZLAUSKAS et al. entwickelten
Modell bevorzugt umgesetzte Enantiomere.
126 THEORETISCHER TEIL
In weiteren Untersuchungen zur Candida rugosa Lipase wurde das aktive Zentrum
dieses Enzyms von KAZLAUSKAS et al. mit dem anderer verglichen.228 Das aktive
Zentrum der CRL wird durch eine weite Öffnung beschrieben, die es ermöglicht auch
große sekundäre Alkohole als Substrate zu akzeptieren.227 Des weiteren ist eine
tunnelartige Tasche in direkter Nähe zum aktiven Zentrum, die den Acylrest
aufnehmen kann. Im Vergleich zu dem aktiven Zentrum der CRL verfügt die CE über
eine ähnliche weite Öffnung, die es diesem Enzym ermöglicht ebenfalls große
sekundäre Alkohole umzusetzen.232
Diese Betrachtungen führten zu der Überlegung die Cholesterolesterase in die
enzymatische Hydrolyse des Esters rac-22 einzusetzen (Abb. 2.60).
OH
OMe
Pr O
Me2N
O
OH CE
OMe (+)-22
Pr O Phosphatpuffer-
Me2N Lösung (pH 7.0) +
O 10 % Cosolvens Me2N OH
rac-22 RT OMe
HO
(−)-14
Abb. 2.60: CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22.
Für eine Selektivität von E > 200 hätte er enantiomerenrein vorliegen müssen. Die
Selektivität der Reaktion bei einem Umsatz von 38 % läßt sich daher auch nur mit
einem E-Wert von 55 beschreiben. Ein geringer Abfall der Selektivität der Reaktion
bei höheren Umsätzen wurde auch schon in der PLE-katalysierten Hydrolyse von
rac-15 beobachtet (Tabelle 2.9, S 52). Eine Änderung des E-Werts im Verlauf der
Reaktion stellt in der Regel eine Abweichungen von den gemachten
Voraussetzungen zum E-Wert dar. Bei sehr hohen Selektivitäten ist außerdem zu
beachten, daß geringe Schwankungen im gemessenen ee-Wert zu einen großen
Differenz im E-Wert führt.
Die CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 wurde daraufhin wiederholt und mit
dem bereits vorgestellten Verfahren zur Gewinnung der Produkte durch Extraktion
bei verschiedenen pH-Werten aufgearbeitet. Zum Aufarbeitung der Reaktion nach
22.5 Stunden wurde die Reaktionslösung mit Diethylether bei pH 7 extrahiert. Es
konnte (+)-22 in 53 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 91 % isoliert werden.
Nachdem die verbliebene wäßrige Phase durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10
eingestellt wurde, konnte (−)-14 in 45 % Ausbeute mit einem ee-Wert von 91 % durch
Extraktion mit Dichlormethan erhalten werden (Tabelle 2.48).
128 THEORETISCHER TEIL
22.5 h 91 % 53 % 91 % 45 % 67
Es konnte eine Selektivität von 67 bei einem Umsatz von ca. 46 % beobachtet
werden. Sowohl der nicht umgesetzte Ester (+)-22 als auch der Alkohol (−)-14 liegen
mit einem ee-Wert von 91 % vor. Dies Ergebnis stellt eine gute Ausgangsbasis zur
Gewinnung der einzelnen Enantiomeren von 14 dar. Würde die Reaktion früher
abgebrochen, kann der Alkohol (−)-14 mit hohen ee-Werten erhalten werden (vgl.
Tabelle 2.47). Würde man die Reaktion später bei einem Umsatz größer 50 %
abbrechen, könnte der enantiomerenreine Ester (+)-22 erhalten werden.
Mit dieser präparativen Reaktion konnte demonstriert werden, daß die CE-
katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 ein geeignetes Verfahren zur Darstellung
der Enantiomeren von 14 darstellt. In der Katalyse mit dem Enzym wurde die
höchste Selektivität in der Hydrolyse des Esters rac-22 beobachtet. Somit stellt
dieses Enzym einen interessanten Katalysator nicht nur in der Racematspaltung von
Tramadol-Analoga dar.
Die CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 in Form seines Hydrochlorids wurde
mit der gleichen Substratkonzentration (0.014 mol/l) durchgeführt, die auch bei der
Verwendung der freien Base als Substrat gewählt wurde (Tabelle 2.49). Das
Hydrochlorid des Esters zeigte keinerlei Schwierigkeiten bei der Löslichkeit im
wäßrigen Milieu. Ein Cosolvens wäre zur Löslichkeitsvermittlung nicht notwendig,
wurde aber zur besseren Vergleichbarkeit mit den zuvor durchgeführten Katalysen
mit dem Enzym beibehalten. Eine um ein vielfaches höhere Substratkonzentration
wäre wahrscheinlich durch die Verwendung des Hydrochlorids des Substrats
möglich. Dies wurde aber zunächst nicht untersucht.
19.5 h 43 % 86 % 94 % 89
Eine Darstellung von (+)-14 zur Synthese des gewünschten Produkts (+)-50 durch
eine CE-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids des Esters rac-22 stellt zwar eine
technisch durchführbare Reaktion dar, ist allerdings umständlich, da der nicht
umgesetzte Ester (+)-22 erst noch in einem zusätzlichen Reaktionsschritt hydrolysiert
werden müßte. Einfacher wäre eine enzymatische Hydrolyse die direkt zu (+)-14 als
Produkt führen würde.
Da im Falle des Substrats rac-18 die Enzyme CRL und PLE eine entgegengesetzte
Enantiopräferenz zeigten, wurde diese Eigenschaft der Katalysatoren ebenfalls für
130 THEORETISCHER TEIL
das Substrat rac-22 erhofft, denn dies würde zu dem Ziel eines Hydrolyseproduktes
(+)-14 in der PLE-katalysierten Hydrolyse führen.
Daher wurde der Ester rac-22 anschließend als Substrat in die PLE-katalysierte
Hydrolyse im wäßrigen Einphasensystem mit 10 % tert-Butanol als Cosolvens
eingesetzt (Abb. 2.61). Das Ergebnis dieser Reaktion ist in Tabelle 2.50 zusammen-
gefaßt.
Me2N OH
OMe
Pr O
O (−)-22
OH PLE
OMe
Pr O Phosphatpuffer-
+
Me2N Lösung (pH 8.0)
O 10 % Cosolvens OH
rac-22 OMe
RT
HO
Me2N
(+)-14
Abb. 2.61: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22.
Die Aktivität der PLE hinsichtlich der Hydrolyse des Substrats rac-22 ist niedriger als
in der Hydrolyse des isomeren Esters rac-18. Die gleiche Verschiebung in der
Aktivität hinsichtlich dieser beiden Substrate konnte zuvor schon in der Katalyse der
CRL beobachtet werden. Interessanterweise erfolgt die PLE-katalysierte Hydrolyse
des Esters rac-22 mit einem E-Wert von 34. Die gleiche Selektivität wurde zuvor
auch in der CRL-katalysierten Hydrolyse beobachtet. Somit ist die Selektivität dieser
Reaktion zwar gut, bleibt aber hinter der Selektivität der Katalyse der CE zurück.
16.5 h 18 % 22 % 93 % 34
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 131
Zur Visualisierung der Enantiopräferenz der PLE wurden in Abb. 2.62 die bevorzugt
umgesetzten Enantiomere (+)-12 und (+)-14 dem Kastenmodell nach JONES et al.
angepaßt dargestellt.
OH
OH
MeO MeO
OH NMe2 OH NMe2
(+)-12 (+)-14
OH OH
OMe OMe
HO HO
Me2N Me2N
Abb. 2.62: Von der PLE entsprechend dem Kastenmodell nach JONES et al.
bevorzugt umgesetzte Enantiomere.
Wie aus Abb. 2.62 hervorgeht, zeigt die Hydroxylgruppe des Moleküls (+)-12 genau
in Richtung der Hydroxylgruppe am Serin-Rest, dagegen zeigt die Hydroxylgruppe
von (+)-14 ein wenig von dem Serin-Rest weg in eine andere Richtung. Dies kann die
132 THEORETISCHER TEIL
Ursache für die Unterschiedliche Aktivität des Enzym hinsichtlich der beiden
Substrate sein und erklären, warum rac-18 schneller als rac-22 umgesetzt wird. In
beiden Molekülen zeigen die Dimethylaminomethylgruppen in Richtung der vorderen,
polaren Tasche.
Tabelle 2.51: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 unter Zusatz
von 16 % Aceton als Cosolvens mit extraktiver Aufarbeitung
(1.6 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.014 M Substrat)
42 h 27 % 74 % 97 % 23 % 85
Die Reaktion wurde nach einer Reaktionszeit von 42 Stunden bei einem Umsatz von
ca. 24 % abgebrochen und nach der Methode der Extraktion bei verschiedenen
pH-Werten aufgearbeitet. Wie zuvor sind die isolierten Ausbeuten sehr gut, da die
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 133
Tabelle 2.52: Log P-Werte (Wasser / Cyclohexan) für rac-14 und rac-22 bei
verschiedenen pH-Werten
pH rac-14 rac-22
Die Selektivität der Chirazyme E1 Präparation in der Hydrolyse des Esters rac-22 ist
sehr hoch. Der Alkohol (+)-14 konnte mit einem ee-Wert von 97 % und der Ester
(−)-22 mit einem ee-Wert von 27 erhalten werden. Insgesamt ist also die Selektivität
mit einem E-Wert von 85 größer als die der PLE-katalysierten Reaktion.
Damit stellt das Isoenzym-angreicherte Chirazyme E1 einen geeigneteren
Katalysator als die gesamte Isoenzym-Mischung PLE dar. Zudem scheint dieses
Ergebnis die von MATTSON et al. gemachte Aussage, daß die einzelnen Isoenzyme
signifikante Unterschiede hinsichtlich der Selektivität zeigen, zu belegen. Da
allerdings im Rahmen dieser Arbeit keine Untersuchungen zur Zusammensetzung
der einzelnen Enzym-Katalysatoren und ihrer Selektivität gemacht wurden, konnte
dieser Gesichtspunkt nicht weiter vertieft werden.
Im Hinblick auf eine mögliche Anwendung dieses Verfahrens wurde der Esters
rac-22 auch in Form des Hydrochlorids dieser Verbindung in die Chirazyme E1-
katalysierte Hydrolyse unter Verwendung von 16 % Aceton als Cosolvens eingesetzt.
Der Verlauf des Umsatzes sowie der ee-Werte von Substrat und Produkt ist durch
Entnahme einzelner Proben über einen Zeitraum von 23 Stunden verfolgt worden
(Abb. 2.63). Es ist zu erkennen, daß bis zu einem Umsatz von 12 % der Alkohol
134 THEORETISCHER TEIL
(+)-14 nahezu enantiomerenrein vorliegt (E > 200) und daß danach der ee-Wert fällt.
Entsprechend dem Gegebenheiten einer kinetischen Racematspaltung steigt der
ee-Wert des Esters (−)-22 mit dem Umsatz. Nach 22.5 Stunden liegt der Alkohol mit
einem ee-Wert von 95 % und der Ester mit einem ee-Wert von 28 % vor, dies
entspricht einem E-Wert von 50 (Tabelle 3.50, obere Zeile). Danach wurde die
Reaktionsmischung mit der Methode der Extraktion bei unterschiedlichen pH-Werten
aufgearbeitet (Tabelle 3.50, untere Zeile).
100
90
E = 50
80
70
ee-Wert (%)
60 ee-Wert Ester
ee-Wert Alkohol
50
40
30 E = 50
20
10
0
0 5 10 15 20
Umsatz (%)
Abb. 2.63: Verlauf der ee-Werte von Alkohol (+)-14 und Ester (−)-22 in der
Wie aus Tabelle 2.53 hervorgeht, konnte der Alkhohl nur mit einem ee-Wert von
91 % erhalten werden und somit ergibt sich ein E-Wert von 27. Da der ee-Wert des
Alkohols nach 22.5 Stunden in der Reaktionslösung noch bei 95 % lag und bei der
Extraktion des Alkohols (+)-14 noch Reste des zuvor nur unvollständig extrahierten
Esters (−)-22 erhalten wurden, ist anzunehmen, daß der Abfall in dem ee-Wert des
Alkohols während der Aufarbeitung erniedrigt worden ist. Während der Extraktion bei
pH 10 sind vermutlich Teile des (−)-Ester zum (−)-Alkohol hydrolysiert, was einen
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 135
Abfall des ee-Wertes von (+)-14 zur Folge hat. Somit beschreibt der aus der
Reaktionslösung bestimmte E-Wert von 50 die Selektivität der kinetischen
Racematspaltung zutreffender. Die im Vergleich zur Hydrolyse der freien Base des
Esters rac-22 geringere Selektivität läßt sich durch die geänderten Reaktions-
bedingungen erklären. In der Hydrolyse des Hydrochlorids wurde eine
Substratkonzentration von 0.200 mol/l gewählt, die um ein vielfaches höher ist, als
die in der Hydrolyse der freien Base mit 0.014 mol/l. Um eine vergleichbare
Reaktionsgeschwindigkeit in der Hydrolyse des Hydrochlorids zu erreichen, ist die
Enzymmenge um etwa den gleichen Faktor von 1.6 U/ml auf 22.8 U/ml erhöht
worden. Aus Tabelle 2.51 und Tabelle 2.53 läßt sich abschätzen, daß die
Reaktionsgeschwindigkeit tatsächlich in etwa gleich groß ist. Insgesamt hat die
Erhöhung der Substrat- und Enzymkonzentration zu einer kleinen Verringerung der
Selektivität in der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse geführt.
Da das Hydrochlorid des Esters rac-22 auch in der Konzentration von 0.231 mol/l
ohne den Zusatz von Aceton als Cosolvens gut löslich ist, entsteht die Frage, ob
überhaupt ein Cosolvens in der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse von
rac-22⋅HCl notwendig ist. Um diese Fragestellung zu untersuchen, wurden zwei
parallele Reaktionen durchgeführt. In einer Reaktion wurde unter sonst identischen
Bedingungen (22.8 U/ml Chirazyme E1; Phosphatpuffer, pH 7.0; 0.200 M
rac-22⋅HCl) 16 % Aceton als Cosolvens verwendet, in der anderen kein Cosolvens.
Aus beiden Reaktionen wurden Proben entnommen, die dann extrahiert und
analysiert wurden. Die Reaktionsgeschwindigkeiten der Reaktionen lassen sich in
Abb. 2.64 erkennen, in welcher der Verlauf des Umsatzes über die Zeit dargestellt
136 THEORETISCHER TEIL
ist. Beide Zeit-Umsatz Kurven zeigen nach ca. 50 Stunden Reaktionszeit einen
Rückgang im Umsatz. Dies wurde durch einen systematischen Fehler,
wahrscheinlich bei der Extraktion der Probe oder durch eine weitere Temperatur-
schwankung, verursacht. Es ist deutlich zu erkennen, daß die Reaktion ohne Zusatz
von Aceton als Cosolvens mit höherer Reaktionsgeschwindigkeit verläuft.
Beispielsweise wird in der Katalyse ohne Cosolvens bereits nach 7.5 Stunden ein
Umsatz von 21 % erreicht. Zum Vergleich wird dieser Umsatz in der Katalyse mit
Aceton als Cosolvens erst nach 175 Stunden (1 Woche) beobachtet. Dieser
Unterschied in der Aktivität des Enzyms wird wahrscheinlich durch eine Inhibition des
Enzyms durch das Cosolvens Aceton verursacht.
45
40 E = 31 E = 27 E = 27
Umsatz = 41 %
E =157
35
E = 30
30 mit 16 % Aceton als Cosolvens
Umsatz (%)
ohne Cosolvens
25
E > 200
20
E > 200
15 E > 200 Umsatz = 21 %
10
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Reaktionszeit (h)
Abb. 2.64: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse von rac-22⋅HCl mit und ohne
Zusatz von 16 % Aceton als Cosolvens.
Im Hinblick auf einen technisch durchführbaren enzymatischen Prozeß stellt sich die
Frage, ob eine Veresterung von rac-14 mit der Buttersäurechlorid zur Darstellung
von rac-22 unter dem Aspekt einer möglichen Geruchsbelästigung realisierbar ist.
Die technische Durchführbarkeit dieser Reaktion und der anschließenden
enzymatischen Hydrolyse ist in jedem Fall gegeben.184
Aufgrund dieser Vorbehalte wurde die Möglichkeit einer Variation des Acylrestes des
Substrats in Erwägung gezogen. In Vorversuchen zeigte sich, daß Valerian-
säurechlorid ebenfalls sehr penetrant unangenehm riecht und somit auch nicht in
Frage kommt. Aus wirtschaftlicher Sicht läßt sich eine Verlängerung des Acylrestes
bis zur Hexansäure (C6) vertreten. Eine Verkürzung des Acylrestes ist ebenfalls eine
weitere Möglichkeit. Aufgrund der schlechten Erfahrungen in der Synthese des
Acetats rac-24 wurde dieser Ansatz zunächst aber nicht verfolgt, sondern vielmehr
das Capronat von rac-14 dargestellt und dessen Eigenschaften als Substrat in der
PLE-katalysierten Hydrolyse untersucht (Abb. 2.65).
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 139
Me2N OH
OMe
C5H11 O
O
(−)-23
OH Chirazyme E1
OMe
C5H11 O Phosphatpuffer-
+
Me2N Lösung (pH 7.0)
O 16 % Cosolvens OH
rac-23 RT OMe
HO
Me2N
(+)-14
Abb. 2.65: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23.
d
capra (lat.) = Ziege.
140 THEORETISCHER TEIL
Tabelle 2.54: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-23 unter Zusatz
von 16 % Aceton als Cosolvens (3.1 U/ml; Phosphatpuffer, pH 7.0)
24 h 92 % 54 % 77 % 46 % 24
Der zu beobachtende Einfluß des Acylrests auf die Selektivität der Enzym-
katalysierte Hydrolyse ist ebenfalls eine Nachteil der Verwendung des Substrats
rac-23. Da das Enzym Schweineleber-Esterase bevorzugt kurzkettige wasserlösliche
Ester wie Acetate hydrolysiert, stellt das Substrat rac-23 durch seinen großen
Acylrest ein eher ungeeignetes Substrat dar.
Me2N OH
OMe
Pr O
O
OH (−)-22
Chirazyme E1
OMe
Pr O Phosphatpuffer-
Me2N Lösung (pH 7.0) +
O
⋅HCl 16 % Aceton OH
RT OMe
rac-22⋅HCl HO
Me2N
(+)-14
Abb. 2.66: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl.
Des weiteren wurde als Substrat in der enzymatischen Hydrolyse nicht mehr die freie
Base des Esters rac-22 eingesetzt, da diese in höheren Konzentrationen nicht mehr
im wässrigen Medium löslich ist. Stattdessen wurde das Hydrochlorid der Verbindung
eingesetzt, welches eine sehr viel größere Löslichkeit hat. Die Isoenzym-
angereicherte PLE-Präparation Chirazyme E1 wurde als Katalysator wegen der
Enantiopräferenz für das (+)-Enantiomer eingesetzt, so daß der benötigte (+)-Alkohol
direkt als Reaktionsprodukt erhalten wird. Weiterhin verfügt das Chirazyme E1
gegenüber der PLE über eine höhere Selektivität hinsichtlich des Substrates rac-22.
Auch stellt allgemein eine lyophilisierte Form des Enzyms, wie beim Chirazyme E1,
einen einfach zu handhabenden Katalysator dar.
Ebenfalls wurde Aceton als Cosolvens verwendet. In der GRÜNENTHAL GmbH konnte
eine deutliche Abhängigkeit des ee-Wertes des gebildeten Alkohols (+)-14 von der
zugesetzten Menge an Aceton beobachtet werden (Tabelle 2.55).184
142 THEORETISCHER TEIL
16 % 94 % 56 % 96 % 44 % 174
9% 98 % 51 % 90 % 49 % 86
0% 98 % 50 % 73 % 50 % 28
Eine geringe Steigerung der Selektivität der Reaktion läßt sich beobachten, wenn
man nach der Hälfte der Reaktionszeit nochmals Enzym zugibt.
Hiermit konnte gezeigt werden, daß eine enzymatische Laborsynthese, wie sie im
Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde, in eine Multigramm-Maßstab zur Darstellung
erster Kilogramm-Mengen übertragen werden kann. Als besonders wirkungsvoll ist
dabei die Aufarbeitung durch Extraktion bei verschiedenen pH-Werten zu betrachten.
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 143
Sie stellt einen Schlüsselschritt für die Aufarbeitung der enzymatische Hydrolyse dar.
Diese Methode hat sich im Halbkilogramm-Maßstab in der GRÜNENTHAL GmbH
etabliert und würde sich auch in einen späteren Produktionsprozeß einsetzten
lassen.
Eine alternative Möglichkeit zu einer effizienten Trennung von Ester und Alkohohl bei
einer enzymatischen Racematspaltung stellt die von THEIL et al. vorgestellte
Extraktion nach Lipasen-katalysierter Fluoracylierung dar.235 Dies Verfahren basiert
auf der Verteilung zwischen organischer und fluoriger Phase und erlaubt eine
Isolierung der Produkte aus dem Reaktionsgemisch, die auch in einem industriellen
Großmaßstab angewendet werden kann.
O
CAL-B
OH CF3(CF2)7(CH2)2CO2CH2CF3 O (CF2)7CF3 OH
+
Ph MeCN, Rt Ph Ph
O (CF2)7CF3 OH
Ph Ph
47 %, 98 % ee 48 %, > 98 % ee
fluorige Phase (n-C6F14) org. Phase (MeOH)
Nachdem mit der Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 bereits
ein Verfahren zur Darstellung des Alkohols (+)-14 und damit zur Synthese des
gewünschten Produkts (+)-50 zur Verfügung steht, wurde die Enzym-katalysierte
Transacylierung von rac-14 unter dem Aspekt untersucht, eine Möglichkeit zur
Racematspaltung neuer hydrophober und daher im wäßrigen Milieu unlöslicher
Tramadol-Analoga zu schaffen. Ein Verfahren zur enzymatischen Acylierung im
organischen Medium bietet neben dem bereits etablierten hydrolytischen Verfahren
den Vorteil alternativer Reaktionsbedingungen. Da in der Lipasen-katalysierten
Hydrolyse bevorzugt (−)-14 gebildet wurde, wird in der Umkehrrektion, der Enzym-
katalysierte Transacylierung von rac-14 im organischen Medium, ebenfalls (−)-14
bevorzugt acyliert und es kann wie in der PLE-katalysierten Hydrolyse das
gewünschte (+)-Enantiomer des Alkohols als Produkt isoliert werden (Abb. 2.68).
Me2N OH
OMe
R O
O
(−)-Ester
OH Lipase
OMe
HO Vinylester
organisches +
Me2N
Lösungsmittel OH
rac-14
RT OMe
HO
Me2N
(+)-14
Zunächst wurde die Candida rugosa Lipase als Katalysator in die Transacylierung
des Alkohols rac-14 eingesetzt. Als Acyldonoren wurden Vinylacetat und
Isopropenylacetat in Toluol und Acyldonor als Lösungsmittel verwendet. Die
Ergebnisse dieser Reaktionen sind in Tabelle 2.57 zusammengefaßt. Wie schon
zuvor in der CRL-katalysierten Hydrolyse der korrespondierenden Ester rac-22 und
rac-18 zu beobachten war, ist die Aktivität der CRL hinsichtlich des Alkohols rac-12
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 145
Reaktionsbedingungen nach
E-Wert
(Äquiv.) 16 d
Umsatz 18 %
Vinylacetat (6),
ee Ester (−)-24 44 % 5
Toluol
ee Alkohol (+)-14 72 %
Umsatz 11 %
Vinylacetat
ee Ester (−)-24 47 % 4
als Solvens
ee Alkohol (+)-14 48 %
Umsatz 25 %
Isopropenylacetat (6),
ee Ester (−)-24 68 % 14
Toluol
ee Alkohol (+)-14 87 %
Umsatz 12 %
Isopropenylacetat
ee Ester (−)-24 77 % 10
als Solvens
ee Alkohol (+)-14 35 %
Eine in der jüngeren Literatur häufig mit großem Erfolg zur Acylierung sekundärer
Alkohole verwendete Enzympräparation ist das Novozym 435, welches eine auf
einem makroporösen Acrylharz immobilisierte Candida antarctica Lipase Typ B ist.126
Daraufhin wurde das Novozym 435 in die Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit
Vinylacetat in den Lösungsmitteln Toluol und Dichlormethan eingesetzt (Tabelle
146 THEORETISCHER TEIL
2.58). Die Aktivität dieses Enzyms hinsichtlich des Substrats rac-14 ist verglichen mit
den zuvor durchgeführten enzymatischen Transacylierung außerordentlich hoch.
Bereits nach 48 Stunden werden Umsätze von 70 % bzw. 79 % erreicht. Die
Selektivität in beiden Reaktionen ist auch sehr hoch. In dem polaren Lösungsmittel
Dichlormethan wird ein E-Wert von 99 erzielt.
Reaktionsbedingungen nach
E-Wert
(Äquiv.) 48 h
Umsatz 70 %
Vinylacetat (6),
ee Ester (−)-24 90 % 38
Toluol
ee Alkohol (+)-14 67 %
Umsatz 79 %
Vinylacetat (6),
ee Ester (−)-24 90 % 99
Dichlormethan
ee Alkohol (+)-14 ≥98 %
sowohl zu einer Erniedrigung der Aktivität des Enzyms hinsichtlich des Substrats
rac-14 als auch zu einer Erniedrigung der Selektivität der Reaktion. Von RUPPERT84
und JUNGEN85 wurde zuvor eine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit und der
Selektivität der PLE-katalysierten Transacylierung geschildert. Dieses konnte nicht
auf die CAL-B katalysierte Transacylierung übertragen werden. Ein anzunehmender
Grund hierfür ist eine aufgrund der hohen Aktivität des Enzym verstärkte Hydrolyse
des Acyldonors als Nebenreaktion. Diese „Nebenaktivität“ des Enzyms führt zu dem
scheinbar geringeren Umsatz hinsichtlich des umgesetzten Substrats rac-14.
Reaktionsbedingungen nach
E-Wert
(Äquiv.) 24 h
Umsatz 51 %
Vinylpropionat (5),
ee Ester (−)-45 92 % 89
Toluol
ee Alkohol (+)-14 95 %
Umsatz 35 %
Vinylpropionat (5),
ee Ester (−)-45 89 % 30
Toluol
mit Zusatz von H2O (0.2 %) ee Alkohol (+)-14 56 %
Umsatz 50 %
Vinylpropionat (5),
ee Ester (−)-45 98 % >200
Dichlormethan
ee Alkohol (+)-14 86 %
Umsatz 52 %
Vinylpropionat
ee Ester (−)-45 97 % 192
als Solvens
ee Alkohol (+)-14 88 %
In der Reaktion des achiralen Acylierungsreagenzes mit dem Enzym wird der
Acyl/Enzym-Komplex gebildet. Da sich im diesem Komplex die Acylgruppe direkt im
aktiven Zentrum befindet, beeinflußt die Struktur des Carbonsäureteils des
Enolesters die Steuerung der Enantiomeren-Diskriminierung beim Angriff des
chiralen Nucleophils (Abb. 2.69).237 Untersuchungen zum Einfluß der Kettenlänge
von Enolestern auf das Ergebnis von Transacylierungen lassen den Schluß zu, daß
die optimale Kettenlänge sowohl vom verwendeten Enzym als auch von der Struktur
des Substratalkohols abhängt. Dies macht eine individuelle Optimierung der
enzymatischen Transacylierung für jedes Substrat notwendig.
Abb. 2.69: Einfluß des Acyldonors auf die Steuerung der Enantiomeren-
Diskriminierung eines Enzyms.237a)
Insgesamt stellt die Novozym 435 katalysierte Transacylierung von rac-14 eine
interessante Alternative zur Gewinnung der Enantiomeren von 14 dar. Aktivität und
Selektivität des Enzyms sind hervorragend. Um das vorhandene Potential dieses
Katalysators zu erschließen, wurde die Katalysatormenge halbiert und der Einfluß
auf die Transacylierung in den Lösungsmitteln Toluol und Vinylpropionat untersucht
(Tabelle 2.60). Zusätzlich wurde in einer weiteren Reaktion ein Zusatz von
Triethylamin zum Lösungsmittel Toluol gemacht. Interessanterweise zeigten alle
Reaktion, mit Ausnahme der Reaktion unter Zusatz von Triethylamin, nach ca.
48 Stunden eine milchige Trübung. Wie aus Tabelle 2.60 hervorgeht, erreichen alle
drei Reaktionen nach 7.6 Stunden einen Umsatz von ca. 50 % und bleiben nahezu
bei diesem Umsatz bis zum Reaktionsende nach 47.75 Stunden stehen. Da die
Reaktionsgeschwindigkeit des langsamer reagierenden Enantiomers im Vergleich zu
dem des schneller reagierenden vernachlässigbar gering ist, spricht dies für eine
hohe Enantiomeren-Diskriminierung des Enzyms. Entsprechend sind die E-Werte
aller drei Reaktionen auch hoch (Tabelle 2.61).
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 149
Reaktionsbedingungen
7.6 h 23.3 h 47.75 h
(Äquiv.)
Umsatz 51 % 53 % 53 %
Vinylpropionat (5),
ee Ester (−)-45 88 % 91 % 91 %
Toluol
ee Alkohol (+)-14 91 % 98 % ≥98 %
Umsatz 50 % 53 % 52 %
Vinylpropionat
ee Ester (−)-45 92 % 93 % 92 %
als Solvens
ee Alkohol (+)-14 93 % ≥98 % ≥98 %
Der erzielte E-Wert im Lösungsmittel mit nur 5 mg Katalysator entspricht dem der mit
10 mg erhalten wurde. Somit ist hier eine Reduzierung der Katalysatormenge
problemlos möglich. In Vinylpropionat als Solvens ist der erzielte E-Wert zwar ein
wenig geringer als mit der doppelten Katalysatormenge, aber noch in der zuvor
erzielten Größenordnung, so daß hier eine Reduzierung der Enzymmenge noch
vertretbar ist.
150 THEORETISCHER TEIL
Reaktionsbedingungen
7.6 h 23.3 h 47.75 h Mittel
(Äquiv.)
Vinylpropionat (5),
49 97 111 84
Toluol
Vinylpropionat
81 144 125 119
als Solvens
Vinylpropionat (5),
125 144 111 131
Triethylamin (0.25), Toluol
Selektivität ist höher als die, die mit Vinylacetat und Vinylpropionat in Toluol
beobachtet wurde. Es empfiehlt sich auch in der Novozym 435-katalysierten
Transacylierung die Verwendung von Isopropenylacetat als Acylierungsmittel.
Reaktionsbedingungen Nach
E-Wert
(Äquiv.) 24 h
Umsatz 51 %
Isopropenylacetat (5),
ee Ester (−)-24 94 % 170
Toluol
ee Alkohol (+)-14 ≥98 %
Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)
Vinylpropionat (5),
20 d 2%
Toluol
Isopropenylacetat (5),
20 d 0%
Toluol
Für eine Acylierung von rac-14 wurde auch das Colyophilisat aus PLE, BSA und
MPEG (PLE/BSA/MPEG) eingesetzt, welches bei Standardsubstraten eine hohe
Aktivität im organischen Medium zeigt.83 In der PLE/BSA/MPEG-katalysierten
152 THEORETISCHER TEIL
Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat in Toluol wurde eine stark
erhöhte Katalysatorkonzentration verwendet (Tabelle 2.64). Die Farbe des PLE/BSA-
Katalysators änderte sich im Laufe der Reaktionszeit von weiß in ein dunkles rot-
braun. Dies belegt die enzymatische Hydrolyse des Acylierungsmittels zu Carbonyl-
Nebenprodukten wie Essigsäure. Eine enzymatische Acylierung des Substrates
rac-14 war allerdings auch mit dieser stark erhöhten Katalysatormenge nicht
möglich.
Reaktionsbedingungen
Reaktionszeit Umsatz
(Äquiv.)
Vinylacetat (5),
11 d 0%
Toluol
47.75 h 2% ≥98 % 3% -
der Regel eine hohe Aktivität des Enzyms CAL-B beobachtet, so daß die
Reaktionszeiten denen der Hydrolyse im wäßrigen Milieu entsprechen. Die mit dieser
Enzympräparation erzielten Selektivitäten sind sehr hoch. Somit ist die enzymatische
Transacylierung durchaus geeignet, die Bereitstellung enantiomerenreiner
Verbindungen in einem größeren Maßstab zu leisten. Gerade für unpolare Substrate,
die nicht im wässrigen Medium löslich sind, sind die Bedingungen der Enzym-
katalysierten Transacylierung ideal geeignet, eine Racematspaltung durchzuführen.
So konnte beispielsweise die GRÜNENTHAL GmbH eine kinetische Racematspaltung
eines neuen Tramadol-Analogons (rac-52 in Abb. 2.70) aufbauend auf den im
Rahmen dieser Arbeit erreichten Ergebnissen erzielen. Das in Abb. 2.70 dargestellte
Naphtyl-Derivat zu rac-14 ist im wäßrigen Milieu in Form eines Buttersäureesters
unlöslich und es konnte keine PLE-katalysierte Hydrolyse beobachtet werden. Im
organischen Medium konnte allerdings unter den vorgestellten
Reaktionsbedingungen eine effiziente CAL-B-katalysierte Racematspaltung zur
Darstellung des gewünschten (+)-Enantiomers erreicht werden.184
Me2N OH
OMe
R O
OH O
CAL-B (−)-Ester
OMe
HO Vinylester
organisches +
Me2N OH
Lösungsmittel OMe
rac-52 RT HO
Me2N
(+)-52
Tertiäre Alkohole und deren Ester sind wahrscheinlich aufgrund von sterischen
Hinderungen im allgemeinen keine Substrate für Hydrolasen-katalysierte
Racematspaltungen. Bis heute sind nur einige wenige Beispiele für Hydrolasen-
katalysierte Umsetzungen dieser Substrate bekannt.134,238,239,240
O´HAGEN et al. konnten 1992 zeigen, daß aktivierte Ester tertiärer Alkohole, die eine
Acetylengruppe am stereogenen Zentrum enthalten, von der Candida rugosa Lipase
akzeptiert und mit mittleren Selektivitäten hydrolysiert werden. Erklärt wurde dies
dadurch, daß die Acetylengruppe in der Lage ist die Bindungsstelle des
Wasserstoffs, im Falle von sekundären Alkoholen, zu belegen.238 Daß die
Schweineleber-Esterase ebenfalls Ester tertiärer Alkohole, die eine Acetylengruppe
am stereogenen Zentrum tragen, mit hoher Selektivität hydrolysiert, zeigten COOPE et
al. am Beispiel eines tertiären Buttersäureesters des Quinuclidinols unter Zusatz von
Methanol als Cosolvens.134 KONIGSBERGER et al. erweiterten diese Substratgruppe
um aktivierte Ester von Trifluormetlyl-substituierten Cyanhydrinen, die mit sehr guten
Selektivitäten von der CRL umgesetzt wurden.239
Pr O
O OMe
Pr O PLE Me2N
OMe 43
Phosphatpuffer-
Lösung (pH 8.0) +
Me2N OH
10 % Cosolvens OMe
rac-43 RT
Me2N
7
Abb. 2.71: Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-43.
Diese Ergebnisse legen nahe, daß Ester der tertiären Hydroxylgruppe vom Tramadol
keine Substrate für das Enzym PLE sind, da sie sterisch sehr anspruchsvoll und
elektronisch nicht aktiviert sind.
O O
Pr O O Pr
O O OMe
Pr O O Pr Enzym Me2N
OMe 25
Phosphatpuffer-
Me2N Lösung +
10 % Cosolvens
rac-25 O
RT
Pr O OH
OMe
Me2N
19
Abb. 2.72: Versuch zur enzymatischen Hydrolyse des Esters rac-25.
Cholesterolesterase Phosphatpufferlösung,
25 h 0%
(CE; 13.1 U/ml) pH 7.0; 10 % tert-Butanol
Schweineleber-Esterase Phosphatpufferlösung,
42 h 1%
(PLE; 4.9 U/ml) pH 7.0; 16 % Aceton
ENZYM-KATALYSIERTE KINETISCHE RACEMATSPALTUNGEN 157
Wie aber in Tabelle 2.66 zu ersehen ist, konnte mit allen drei Enzymen, unter den
jeweiligen Bedingungen, keine Hydrolyse des Diesters rac-25 beobachtet werden. In
allen Reaktionen wurde die eingesetzte Menge Esters rac-25 nach Extraktion
nahezu vollständig zurückerhalten werden. Ein Ergebnis, das nach den Resultaten in
der Hydrolyse des Esters rac-43 und dem Kenntnisstand der Literatur erwartet
werden konnte.
Der Diester rac-25 ist somit aufgrund von sterischen Hinderungen keine Substrat für
eine Hydrolasen-katalysierte Racematspaltung. Im Umkehrschluß bedeutet dies aber
auch, daß keine Enzym-katalysierte Acylierung der tertiären Hydroxylgruppe zu
erwarten ist. Daß die tertiäre Hydroxylgruppe in der Transacylierung nicht interferiert,
ist eine wichtige Voraussetzung dafür, daß die hydroxysubstituierten Tramadol-
Analoga direkt in Enzym-katalysierte Racematspaltung eingesetzt werden können.
Von FANG et al. ist, um der sterischen Hinderung von tertiären Alkoholen zu
begegnen und sie so einer Enzym-katalysierten Reaktion leichter zugänglich zu
machen, eine einfache Modifikation durchgeführt worden. Die tertiären Alkohole
wurden zunächst in die entsprechenden ß-Alkoxy Alkohole überführt und
anschließend deren primäre Alkoholfunktionalität von Lipasen mit zufriedenstellender
Aktivität und mäßiger Selektivität acyliert (Abb. 2.73).241 Diese Modifikation könnte
zur enzymatischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga eingesetzt werden, bei
denen nur eine tertiäre Hydroxylgruppe für eine Hydrolasen-katalysierte Reaktion zur
Verfügung steht.
OH BSL oder O
OH O O
CRL oder
O
PPL
Isopropenyl-
acetat
MTBE 33-78 % ee
E = 2.5 - 9.4
Abb. 2.73: Enzymatische Racematspaltung von modifizierten tertiären Alkoholen.
158 THEORETISCHER TEIL
2.5 Zusammenfassung
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Methoden zur Enzym-katalysierten
kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga. Unter Nutzung dieser
Methoden sollten beide Enantiomere von neuen Molekülen auf Tramadol-Basis
dargestellt werden.
Als zweite Gruppe von Verbindungen wurden Tramadol-Analoga untersucht, die eine
zusätzliche sekundäre Hydroxylgruppe im Cyclohexylgerüst tragen. Zu diesen
Verbindungen gehören aktuelle, analgetisch aktive Entwicklungskandidaten der
GRÜNENTHAL GmbH, wie z.B. das Hydrochlorid des enantiomerenreinen para-
Fluorbenzylethers (+)-50.
OH Me2N OH
OMe OMe
HO
Me2N O OH HO
(+)-12 PLE OMe CRL (−)-12
+ Pr O
O +
Me2N OH Me2N OH
OMe OMe
rac-18 Pr O
O
O Me2N
Pr (−)-18 (+)-18
Einen einfachen Zugang zu dem enantiomeren Alkohol (+)-12 ermöglicht die PLE-
katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 (E = 89). Da das Enzym PLE eine zur CRL
entgegengesetzte Enantiopräferenz zeigt, wird der Alkohol (+)-12 erhalten werden
(Abb. 2.74). Somit ermöglicht eine geeignete Wahl des Enzym die Darstellung beider
enantiomerer Alkohole mit hohen ee-Werten.
Auch in der alternativen enzymatischen Reaktionsführung im organischen Medium,
der Lipasen-katalysierten Acylierung, verläuft die CRL-katalysierten Transacylierung
des Alkohols rac-12 mit überaus hoher Selektivität (E = 120). Die erzielten
Ergebnisse zeigen, daß die Enzym-katalysierte Transacylierung im organischen
Medium des Alkohols rac-12 eine interessante Alternative, auch in einem präparative
Maßstab, zur Hydrolyse im wäßrigen Medium darzustellen in der Lage ist.
OH OH
Me2N
OMe OMe
Pr O Pr O
Me2N
O (−)-22 O
(+)-22
OH
PLE OMe CRL +
+ Pr O CE
Me2N OH
OH Me2N
O OMe
OMe rac-22
HO HO
Me2N
(+)-14 (−)-14
Insgesamt konnte gezeigt werden, daß sich mit Ausnahme des 1,3-diaxial
substituierten 6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diols
(rac-13) Cyclohexanol-Tramadol-Analoga nahezu ideal in der Enzym-katalysierten
Racematspaltung verhalten. Bei der Verbindung 13 sind wahrscheinlich sterische
Hinderungen des Moleküls für die nicht Reaktivität verantwortlich, die aber als
spezielle Ausnahme dieser Verbindung zu betrachten sind. Die Enzym-katalysierte
Hydrolyse von Cyclohexanol-Tramadol-Analoga stellt ein effizientes Verfahren zur
Synthese enantiomerenreiner Verbindungen dar. Bei diesem Verfahren konnte eine
einfache und effiziente Aufarbeitung durch Extraktion von Ester und Alkohol bei
verschiedenen pH-Werten etabliert werden. Es wurde aufgezeigt, daß beide
Enantiomere der gewünschten Verbindung je nach Wahl des geeigneten Enzyms
durch Enzym-katalysierte Racematspaltung dargestellt werden können.
• Durch die Wahl der Butyratgruppe als Acylrest kann in enzymatischen Hydrolysen
ein geeignetes Substrat geschaffen werden, welches sowohl von Lipasen als auch
Esterasen mit guter Selektivität umgesetzt wird.
• Als eine einfache, effiziente und ökonomische Methode zur Aufarbeitung von
enzymatischen Hydrolysen konnte die Extraktion von Ester und Alkohol bei
verschiedenen pH-Werten etabliert werden, wodurch auf aufwendige
chromatographische Trennverfahren verzichtet werden kann.
• Es konnte gezeigt werden, daß im besonderen die Enzyme PLE, CRL und CAL-B
zu einer kinetischen Racematspaltung von Tramadol-Analoga geeignet sind. Sie
zeigen eine hohe Aktivität und Selektivität. Zudem sind diese Enzyme gut
untersucht und über einen größeren Zeitraum in ähnlicher Präparation und Qualität
kommerziell verfügbar.
2.6 Ausblick
OH OH
OMe OMe
H2N H2N
Me2N Me2N
Aus Arbeiten von GOTOR et al. geht hierzu hervor, daß es allgemein möglich ist,
Amine als Substrate in CAL-B-katalysierten Transacylierungen hochselektiv zu
acylieren.242 Auch N-selektive Lipasen-katalysierte Acylierungen von cyclischen
Aminoalkoholen sind ebenfalls von GOTOR et al. beschrieben worden.243
Unter dem Gesichtspunkt der Etablierung eines präparativen Verfahrens zur Enzym-
katalysierten Transacylierung im organischen Medium, nicht nur von Tramadol-
Analoga, wäre die Entwicklung einer Methode zur Aufarbeitung der Reaktion, welche
auf chromatographische oder destillative Trennschritte verzichtet, von großem
Vorteil.
3 Experimenteller Teil
ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 165
Chemische Strukturen
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Gaschromatographie (GC)
Umsatz- und Reinheitsbestimmungen wurden mit Kapillar-GC-Geräten von VARIAN
(Varian 3800 mit 2 Split/Splitness-Injektionssystem), CHROMPACK (CP 9000) und
CARLO ERBA (Mega 5360) durchgeführt. Die Peakdetektion erfolgte über einen
Flammenionisationsdetektor (FID) bei einer Detektionstemperatur von 330 ºC. Es
wurden folgende Bedingungen gewählt:
CP-Sil-8
Säulenlänge: 30 m
Innerer Säulendurchmesser: 0.32 mm
Filmdicke: 0.25 µm
Trägergas und -druck: H2, 75 kPa (Varian 3800) bzw. 100 kPa (Mega 5360)
166 EXPERIMENTELLER TEIL
Die in der vorliegenden Arbeit angegebenen Werte wurden unter Annahme eines
Fehlerbereichs von 0.5 % auf ganze Zahlen gerundet. Abgeleitete Größen wurden
mit den Originaldaten berechnet.
CP-Chirasil-Dex-CB (CHROMPACK)
Säulenspezifikation: Permethyl-β-Cyclodextrin
Säulenlänge: 25 m
Innendurchmesser: 0.25 mm
Filmdicke: 0.25 µm
Trägergas und -druck: H2, 100 kPa
Lipodex-γ-6-Me (MACHEREY-NAGEL)
Säulenspezifikation: 2,3-O-Dipentyl-6-O-methyl-γ-Cyclodextrin
Säulenlänge: 25 m
Innendurchmesser: 0.25 mm
Filmdicke: 0.15 µm
Trägergas und -druck: H2, 100 kPa
ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 167
Lipodex-E (MACHEREY-NAGEL)
Säulenspezifikation: Octakis-(2,6-di-O-pentyl-3-O-butyryl)-γ-
Cyclodextrin
Säulenlänge: 25 m
Innendurchmesser: 0.25 mm
Filmdicke: 0.15 µm
Trägergas und -druck: H2, 100 kPa
Massenspektroskopie (MS)
Gerät: Varian MAT 212 S, Erfassung mit Varian MAT SS 200. Falls nicht anders
vermerkt, wurde als Standardbedingung Elektronenionisation (EI, 70 eV) oder
chemische Ionisation (CI, Methan, 100 eV) verwendet. Die Angabe von Massen der
Fragmentionen (m/z) erfolgte als dimensionslose Zahl. Es wurden nur Signale mit
hoher Intensität oder besonders charakteristische Signale aufgeführt.
GC-MS-Analysen
Geräte: Gaschromatograph: Varian Modell 3700, Massenspektrometer: Varian MAT
112 S. Ionisation: 70 eV (EI) oder MeOH, 40 eV (CI).
Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
Geräte zur analytischen HPLC: Millipore Waters 600E Systemcontroller; UV/VIS-
Detektion (λ = 190-400 nm) mit einem Waters 996 Photodiode Array Detektor; RI-
Detektion mit einem Waters 410 Differential Refraktometer; Waters 510 Pumpen;
RP-Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm).
Geräte zur präparativen HPLC: Merck Novaprep 200; UV-Detektion (λ = 273 nm);
RP-Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm,
Filmdicke 10 µm) und eine VARIAN Anlage mit UV-Detektion (λ = 273 nm); RP-
Säule 18 der Firma MERCK (Säulenlänge 250 mm, Innendurchmesser 25 mm,
Filmdicke 10 µm) oder RP-Select B-LiChrosor b® der Firma MERCK (Säulenlänge
250 mm, Innendurchmesser 25 mm, Filmdicke 7 µm).
Geräte zur analytischen HPLC an chiraler stationärer Phase: Millipore Waters 600 E
Systemcontroller; UV/VIS-Detektion (λ = 190-400 nm) mit einem Waters 996
Photodiode Array Detektor; Waters 510 Pumpen; Chiralcel OD-Vorsäule; Chiralcel
168 EXPERIMENTELLER TEIL
NMR-Spektroskopie
Geräte: Varian VXR 300 (300 MHz, 75 MHz), Varian Gemini 300 (300 MHz,
75. MHz), Varian Inova 400 (400 MHz, 100 MHz), Varian Unity (500 MHz, 125. MHz).
Alle Spektren wurden bei 20 ºC aufgenommen. Als interner Standard diente
Tetramethylsilan (TMS). Chemische Verschiebungen δ wurden in ppm bezogen auf
TMS (δ = 0.00 ppm) und Kopplungskonstanten J in Hz angegeben. Die Aufspaltungs-
muster wurden generell nach erster Ordnung interpretiert, wobei folgende
Abkürzungen zur Beschreibung benutzt wurden: s = Singulett; d = Dublett; t =
Triplett; q = Quartett; m = Multiplett; dm = Multiplett eines Dubletts; tm = Multiplett
eines Tripletts; br = breit.
13
Die C-NMR-Spektren sind 1H-breitband-entkoppelt. Die Substitutionsmuster der
13
C-NMR-Signale wurden den J-modulierten Spinecho-Spektren (APT) und mit u = C,
CH2 und d = CH, CH3 angegeben. Zur genauen Zuordnung wurden HETCOR-
Spektren gemessen.
FT-Infrarotspektroskopie (IR)
Gerät: Perkin-Elmer FTIR 1760 S.
Die Proben wurden als KBr-Presslinge (KBr) oder als kapillare Filme (kapillar)
präpariert. Die Spektren wurden im Bereich von 4000 – 700 cm-1 aufgenommen. Die
Elementaranalyse
Gerät: Heraeus CHNO-Rapid. Eine Substanzprobe wurde für ∆C,H,N <0.4 % als
authentisch betrachtet.
ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 169
Polarimetrie
Gerät: Perkin-Elmer-Polarimeter PE 241. Die Messung der Drehwerte erfolgte bei
20 ºC in einer Mikroküvette (Länge 10 cm) mit der Natriumdoppellinie (λ = 589.0 und
Autotitrator
Gerät: STAT-Titrino 718 der Firma METROHM. Das Gerät wurde im pH-STAT Modus
mit NaOH-Maßlösungen (1 N und 0.1 N) der Firma MERCK betrieben.
Ultrafiltration
Gerät: Ultrafiltrationszelle Amicon Modell 2800 mit einer Membran PM 30
(Ausschlußgrenze: >30 kDa) von MILLIPORE.
Gefriertrocknung
Gerät: Christ Alpha 2-4.
Schmelzpunkte
Gerät: Büchi-Schmelzpunktapparatur SMP-20.
Die Schmelzpunkte wurden unkorrigiert angegeben.
Siedepunkte
Die Siedepunkte wurden unkorrigiert angegeben.
Dünnschichtchromatographie
Es wurden DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 der Firma MERCK mit einer Schichtdicke
von 0.25 mm verwendet. Die Detektion erfolgte durch UV-Fluoreszenzlöschung bei
λ = 254 nm sowie durch Anfärben mit einer Lösung aus Eisessig / dest. H2O / konz.
H2SO4 / p-Anisaldehyd (in einem Volumenverhältnis von 75 : 2 : 1.5 : 1) und an-
schließendem Erhitzen.
Präparative Säulenchromatographie
Es wurde Kieselgel 60, 0.062 - 0.100 mm, der Firma MERCK verwendet.
170 EXPERIMENTELLER TEIL
Methanol
Die Trocknung erfolgte, indem Methanol mit Magnesium-Spänen zur Reaktion
gebracht und anschließend destilliert wurde.
Diisopropylether
Die Entfernung von Peroxiden aus Diisopropylether sowie dessen Vortrocknung
wurde durch Säulenfiltration über basischem Aluminiumoxid erreicht. Dies erfolgte
vor jedem Gebrauch, zusätzlich wurde vor jedem Gebrauch und insbesondere vor
jedem Einengen mit essigsaurer Kaliumiodidlösung auf Peroxide getestet.e
Transacylierungsreagenzien
Essigsäure-vinylester (Vinylacetat), Essigsäure-isopropenylester (Isopropenylacetat)
und Propionsäure-vinylester (Vinylpropionat) wurden über NaCO3 destilliert, um
Spuren von Säure zu entfernen, bevor sie in die Enzym-katalysierte Transacylierung
eingesetzt wurden.
e
Autorenkollektiv, Organikum, 17. Aufl., VEB-Verlag Berlin 1988.
ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 171
Bei der Einordnung der Lipasen ergeben sich einige taxonomische Besonderheiten.
Mehrere Lipasen wurden nach Klonierung und Sequenzierung neu identifiziert und
klassifiziert. So wurde 1992 die Candida cylindracea Lipase neu zur Candida rugosa
Lipase, 1995 die Pseudomonas cepacia Lipase neu zur Burkholderia cepacia Lipase
und die Mucor miehei Lipase neu zur Rhizomucor miehei Lipase klassifiziert.6,101
Zudem ergab die Klonierung und Sequenzierung der Lipasen aus Rhizopus arrhizus
und Rhizopus niveus eine nahezu 100% Identität dieser Enzyme.101 Ein
unterschiedliches Substratspektrum dieser Enzyme ist somit nicht zu erwarten.
Um eine einheitliche Nomenklatur zu Verwenden, werden die Enzyme
dementsprechend in dieser Arbeit durchgehend nach ihrer aktuellen Klassifizierung
benannt und nicht ungedingt so, wie sie bezogen wurden.
Des weiteren werden in dieser Arbeit auch einige von Herstellern eingeführte
Eigennamen von Proteinen verwendet, um bestimmte Eigenschaften dieser
Enzympräparationen zu verdeutlichen. So wird im folgenden der Begriff
Chirazyme E1 statt PLE verwendet, um zu zeigen, daß es sich um lyophilisierte PLE
der Fraktion 1 handelt. Ebenso soll der verwendete Begriff Novozym 435
ALLGEMEINE VORBEMERKUNGEN 173
Aktivitätsangaben verschiedener Proteine in dieser Arbeit beziehen sich auf die vom
Hersteller angegebenen Methode der Aktivitätsbestimmung. Aktivitätsbestimmungen
mit Tramadolderivaten als Substrat wurden nicht durchgeführt.
Alle Proteine wurden für nicht länger als 6 Monate bei 2 ºC gelagert.
O O
PLE
+
O Rt, pH 8 OH OH
Die Proteinmenge wurde im Falle der MPEG/PLE direkt eingewogen, im Falle der
PLE/(NH4)2SO4-Suspension mit einer Eppendorf-Pipette (Genauigkeit: 100 µl
±0.8 %) abgemessen.
Enzympräparation Standardaktivität
Zur Freisetzung der Base aus ihrem Hydrochlorid wurde dieses in einer Emulsion
aus Wasser (0.5 ml/mmol) und Dichlormethan (0.4 ml/mmol) suspendiert. Unter
Rühren wurde langsam 40 %ige Natronlauge (0.13 bis 0.20 ml/mmol) zugetropft und
für ca. 30 Min. nachgerührt bis der gesamte Feststoff reagiert hatte. Nach
Phasentrennung wurde dreimal mit Dichlormethan (jeweils 1 ml/mmol)
nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat
getrocknet. Nach Einengen im Rotationsverdampfer wurde die freie Base in der
Regel als farbloses, Sirup ähnliches Öl erhalten, das vorsichtig im Hochvakuum von
Lösungsmittelresten befreit wurde. Alle freien Basen haben die Eigenschaft bei der
Entfernung von Lösungsmittelresten unter vermindertem Druck stark zu schäumen,
daher ist diese Operation mit besonderer Sorgfalt und gegebenenfalls unter gelindem
Erwärmen zur Erhöhung der Viskosität der Lösung durchzuführen.
Zu einer Mischung von 1.2 Äq. Säureanhydrid und 0.1 Äq. Pyridin in Dichlormethan
wurde unter Rühren das Phenol gegeben. Die Reaktionslösung wurde für 2 - 3 Tage
bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem durch DC-Kontrolle kein Edukt mehr
detektiert werden konnte, wurde die Reaktionsmischung über Nacht mit
ges. NaHCO3-Lösung gerührt, um überschüssiges Säureanhydrid zu hydrolysieren.
Nach Phasentrennung wurde dreimal mit Diethylether (2 ml/mmol) nachextrahiert.
Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet, im
Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum von Lösungsmittelresten
befreit.
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 177
Das Hydrochlorid oder die freie Base des sekundären Alkohols wurde in abs.
Tetrahydrofuran oder Diethylether (3.15 ml/mmol) suspendiert. Anschließend wurden
bei der angegebenen Temperatur vorsichtig 2.5 Äq. Kalium-tert-butylat im Falle des
Hydrochlorids oder 1.0 Äq. Kalium-tert-butylat im Falle der freien Base zugegeben
(exotherme Reaktion, gegebenenfalls Kühlen). Es entstand in allen Fällen eine klare,
schwach gelbe bis dunkelgelbe Lösung. Danach wurde noch eine halbe Stunde
nachgerührt und anschließend unter Eiskühlung bei 5 ºC über einen Zeitraum von
10 Min. 1.0 - 1.5 Äq. Säurechlorid in Tetrahydrofuran oder Diethylether
(0.47 ml/mmol) zugetropft. Zur Vervollständigung der Reaktion wurde die Lösung
noch eine Stunde bei der angegeben Reaktionstemperatur gerührt und danach über
Nacht bei Raumtemperatur. Anschließend wurde die hellgelbe Reaktionslösung mit
einem Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 20 Stunden kräftig gerührt, um
überschüssiges Säurechlorid zu hydrolysieren. Nach Phasentrennung wurde dreimal
mit Dichlormethan (1.25 ml/mmol) nachextrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen wurden über NaSO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer
wurde der Ester als farbloses bis gelbliches, sirupöses Öl erhalten, das im
Hochvakuum von Lösungsmittelresten befreit wurde.
Die Base wird in einer Mischung aus trockenem Aceton (1.40 ml/mmol) und Ethanol
(0.28 ml/mmol) gelöst. Anschließend wird zur Vermeidung von Nebenreaktionen, wie
Eliminierungen, schonend durch Zugabe von 1 Äq. Wasser und 1 Äq.
Trimethylchlorsilan das Hydrochlorid ausgefällt, abfiltriert und im Hochvakuum
getrocknet.
178 EXPERIMENTELLER TEIL
Die Base rac-7 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden
10 g (33.3 mmol) rac-7⋅HCl in 16 ml dest. Wasser und 12 ml Dichlormethan
suspendiert und mit 4.4 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung
wurden 8.70 g (33.0 mmol, 99 %) rac-7 als farbloser Sirup erhalten.
OH
10
5 6 1 9 11
O
3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
7.2 (s, 1 H, 10-H), 7.0 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 12-H), 6.8 (dm, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 3.8 (s,
3 H, 15-H), 2.4 (dd, 3J=4 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 7´-H), 2.1 - 2.0 (m, 7 H, 8-H, 7-H), 1.9 -
1.5 (m, 8 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H).
13
C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 159.5 ppm [u] (C-11), 152.0 [u] (C-9), 128.9 [d]
(C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.2 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 76.9 [u] (C-1), 61.6 [u]
(C-7), 55.2 [d] (C-15), 47.7 [d] (C-8), 44.8 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.9
[u] (C-4), 22.3 [u] (C-5).
13
Die Zuordnung der C-NMR-Signale war durch einen Vergleich mit Literaturdaten
eindeutig möglich.245
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 179
Zu 5.2 g (19.8 mmol) rac-7, gelöst in 9 ml abs. Toluol, wurden bei Raumtemperatur
40 ml 20 %ige Diisobutylaluminiumhydrid-Lösung (39.6 mmol) in abs. Toluol
zugetropft, wobei es zu einer leicht exothermen Reaktion und einer Gasentwicklung
kam. Anschließend wurde für 15 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlung auf
Raumtemperatur wurden unter Eiskühlung 11.3 ml Ethanol so zugetropft, daß eine
Innentemperatur von 15 ºC nicht überschritten wurde. Danach wurde 15 Min.
nachgerührt. Ebenfalls unter Eiskühlung wurden daraufhin 11.3 ml eines
Ethanol/Wasser-Gemisches (1 : 1) wieder so zugetropft, daß eine Innentemperatur
von 15 ºC nicht überschritten wurde. Anschließend wurde die Reaktionslösung mit
ca. 20 ml Toluol verdünnt und danach noch eine Stunde bei Raumtemperatur
nachgerührt. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert und mit fünf Volumenteilen
Essigsäureethylester bei 60°ºC für 30 Min. nachextrahiert. Nach Filtration wurden die
vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet und am
Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 4.592 g
(18.4 mmol, 93 %) eines farblosen Öls erhalten, welches farblose Kristalle mit einem
Schmelzpunkt von 139 ºC bildete.
OH
10
5 6 1 9 11
OH
3 7
4 2 14
N 12
13
8
1 H, 13-H), 6.8 (m, 2 H, 12-H, 14-H), 2.4 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 14 Hz, 1 H, 7´-H), 2.2 -
1.4 (m, 15 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H).
13
C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 157.0 ppm [u] (C-11), 151.0 [u] (C-9), 129.4 [d]
(C-13), 116.0 [d] (C-14), 113.3 [d] (C-12), 113.0 [d] (C-10), 78.3 [u] (C-1), 61.7 [u]
(C-7), 47.6 [d] (C-8), 44.4 [u] (C-2), 41.0 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.7 [u] (C-4), 22.2
[u] (C-5).
180 EXPERIMENTELLER TEIL
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 249 (M+, 18), 121 (3), 58 (100), 45 (6).
MS (CI, Isobutan, 100 eV) m/z (%):306 ([M + C4H9]+, 4), 250 ([M + H]+, 100), 249 (M+,
10).
IR (KBr): ∼
ν = 3201 (s), 2985 (s), 2863 (s), 2834 (s), 2789 (s), 2425 (w), 1280 (s),
1252 (m), 1215 (s), 1166 (m), 1118 (m), 1098 (m), 1079 (m), 1033 (w), 10006 (w),
988 (s), 963 (m), 905 (w), 865 (m), 846 (m), 763 (m), 707 (m) cm-1.
C 72.25 71.98
H 9.30 9.10
N 5.62 5.56
Die Base rac-11 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden
OH
8
1 7 9
4 OH
3 5
2 12
N 10
11
6
3
J = 8 Hz, 1 H, 11-H), 6.82 (d, 3J = 8 Hz, 1 H, 10-H/12-H), 6.61 (dd, 3J = 8 Hz, 4J =
2 Hz, 1 H, 10-H/12-H), 2.67 (dd, 3J = 11 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H´), 2.31 (s, 6 H, 6-H),
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 181
2.23 (dd, 3J = 3 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H), 2.06 (m, 1 H, 2-H), 1.49 (s, 3 H, 4-H), 0.65
(d, 3J = 7 Hz, 3 H, 3-H).
C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 156.5 ppm [u] (C-9), 149.4 [u] (C-7), 128.5 [d]
13
(C-11), 117.2 [d] (C-12), 113.9 [d] (C-10), 113.7 [d] (C-8), 78.4 [u] (C-1), 64.1 [u]
(C-5), 45.6 [d] (C-6), 40.1 [d] (C-2), 21.8 [d] (C-4), 14.8 [d] (C-3).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 223 (M+, 10), 181 (3), 138 (3), 121 (11), 107 (6), 95 (4), 93
(10), 91 (5), 86 (69), 77 (9), 71 (18), 65 (14), 58 (100), 45 (62).
IR (KBr): ∼
ν = 3225 (s), 2981 (s), 2955 (s), 2884 (s), 2838 (s), 2802 (s), 2653 (s),
2567 (m), 1615 (m), 1585 (s), 1507 (s), 1485 (s), 1467 (s), 1282 (s), 1255 (s), 1240
(s), 1260 (s), 1176 (m), 1162 (w), 1123 (s), 1103 (w), 1077 (w), 876 (s), 841 (s), 793
(s), 743 (m), 707 (s), 688 (w), 545 (w), 531 (w), 487 (w) cm-1.
C 69.92 69.73
H 9.48 9.56
N 6.27 6.23
Die Base rac-12 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden
OH
5 10
6 1 9 11
HO O
3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
3
J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.75 (ddd, 3J = 9 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 4.12 (m,
1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H, 15-H), 2.50 – 2.75 (br s, 1 H, 1-OH), 2.38 (dd, 2J = 14 Hz,
3
J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.25 – 1.20 (m, 14 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.6 [u] (C-11), 150.7 [u] (C-9), 129.1 [d] (C-13),
117.2 [d] (C-14), 111.6 [d] (C-12), 110.8 [d] (C-10), 78.6 [u] (C-1), 67.5 [d] (C-5), 60.7
[u] (C-7), 55.2 [d] (C-15), 50.0 [u] (C-6), 47.8 [d] (C-8), 44.3 [d] (C-2), 35.7 [u] (C-4),
26.3 [u] (C-3).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 64), 234 (5), 135 (11), 107 (4), 84 (3) 58 (100).
IR (in CHCl3): ∼
ν = 3371 (s), 3079 (s), 2945 (s), 2860 (s), 2831 (s), 2784 (s), 1600 (s),
1583 (s), 1484 (s), 1463 (s), 1432 (s), 1365 (m), 1315 (m), 1287 (s), 1255 (s), 1206
(m), 1158 (s), 1096 (s), 1074 (s), 1048 (s), 1012 (m), 979 (m), 959 (m), 861 (m), 844
(m), 829 (w), 782 (s), 756 (s), 730 (m), 704 (s), 666 (m), 569 (w) cm-1.
C 68.79 68.44
H 9.02 9.38
N 5.01 4.93
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 183
Die Base rac-13 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden
2.422 g (7.7 mmol) rac-13⋅HCl in 10 ml dest. Wasser und 30 ml Dichlormethan
suspendiert und mit ca. 1.5 ml 40 %iger NaOH-Lösung versetzt. Nach Aufarbeitung
wurden 2.092 g (7.5 mmol, 98 %) rac-13 als weißer Feststoff mit einem
Schmelzpunkt von 106 ºC erhalten.
OH OH
10
5 6 1 9 11
O
3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
13-H), 7.09 (s, 1 H, 10-H), 6.99 (s, 1 H, 14-H), 6.75 (m, 1 H, 12-H), 5.15 (s, 1 H,
5-OH), 4.06 (s, 1 H, 5-H), 3.82 (s, 3 H, 15-H), 2.47 (m, 2 H, 7-H, 3-H), 2.15 (d, 1 H,
7-H´), 2.12 (s, 6 H, 8-H), 2.05 (m, 1 H, 4-H), 1.97 (ddd, 4J = 2.75 Hz, 3J = 2.75 Hz,
2
J = 14.6 Hz, 1 H, 6-H), 1.92 (m, 1 H, 2-H), 1.75 (dd, 1 H, 2J = 14.6 Hz, 3J = 3.05 Hz,
6-H´), 1.60 – 1.65 (m, 2 H, 4-H´, 3-H´).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.6 ppm [u] (C-11), 150.2 [u] (C-9), 129.1 [d]
(C-13), 117.0 [d] (C-14), 111.5 [d] (C-12), 110.8 [d] (C-10), 79.0 [u] (C-1), 67.0 [d]
(C-5), 61.3 [u] (C-7), 55.1 [d] (C-15), 47.8 [d] (C-8), 44.9 [u] (C-6), 44.0 [d] (C-2), 33.6
[u] (C-4), 21.8 [u] (C-3).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 17), 135 (5), 58 (100), 45 (4).
IR (KBr): ∼
ν = 3375 (s), 3046 (m), 2969 (s), 2942 (s), 2874 (s), 2826 (s), 1598 (s),
1488 (s), 1461 (s), 1438 (s), 1406 (w), 1377 (w), 1326 (m), 1285 (s), 1263 (s), 1246
(s), 1206 (m), 1177 (m), 1158 (s), 1113 (m), 1083 (w), 1044 (s), 1011 (m), 986 (m),
971 (m), 956 (m), 926 (w), 883 (s), 852 (s), 835 (m) 789 (s), 706 (s), 597 (m) cm-1.
184 EXPERIMENTELLER TEIL
C 68.79 68.65
H 9.02 9.25
N 5.01 4.93
Die Base rac-14 wurde nach AAV 1 aus ihrem Hydrochlorid freigesetzt, dazu wurden
OH
10
5 6 1 9 11
O
HO 3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
10-H), 7.01 (s, 1 H, 12-H), 6.78 (ddd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 3.81
(s, 3 H, 15-H), 3.75 (m, 1 H, 4-H), 2.7 - 2.9 (br s, OH), 2.42 (dd, 2J = 14 Hz,
3
J = 4.5 Hz, 1 H, 7-H´), 2.22 – 1.60 (m, 14 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.7 ppm [u] (C-11), 151.0 [u] (C-9), 129.3 [d]
(C-13), 117.5 [d] (C-14), 111.7 [d] (C-12), 111.3 [d] (C-10), 76.2 [u] (C-1), 71.2 [d]
(C-4), 61.5 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.5 [d] (C-2), 39.7 [u] (C-6), 37.2
[u] (C-3), 31.9 [u] (C-5).
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 185
IR (KBr): ∼
ν = 3391 (s), 2945 (s), 2860 (s), 2829 (s), 2781 (s), 1604 (s), 1584 (s),
1483 (s), 1464 (s), 1431 8s), 1369 (w), 1287 (s), 1253 (s), 1167 (m), 1135 8w), 1074
(m), 1041 (s), 990 (s), 960 (m), 853 (w), 828 (w), 782 (m), 703 (m) cm-1.
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 279 (M+, 11), 234 (2), 135 (2), 58 (100), 45 (2).
C 68.79 68.82
H 9.02 8.81
N 5.01 4.99
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 2.00 g (8.0 mmol) rac-8 mit einer
Mischung aus 1.52 g (9.6 mmol) Buttersäureanhydrid und 0.06 g (0.8 mmol) Pyridin
in 20 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und Säulenchromatographie
(EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf(rac-15)= 0.31; Rf (rac-8) = 0.10) wurden
2.401 g (7.5 mmol, 94 %) eines weiß-grauen kristallinen Feststoffs mit einem
Schmelzpunkt von 54 ºC erhalten.
OH 10
5 6 1 9 11 16 18
O 15
7 17
4 3 2 14
N 12
O
13
8
2 H, 12-H, 14-H), 2.5 (t, 3J = 5 Hz, 2 H, 16-H), 2.4 (dd, 3J = 4 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H,
186 EXPERIMENTELLER TEIL
7´-H), 2.1 - 1.4 (m, 17 H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H), 1.4 - 1.2 (m, 1 H, 2-H),
1.0 (t, 3J = 5 Hz, 3 H, 18-H).
C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 172.1 ppm [u] (C-15), 152.2 [u] (C-11), 150.8 [u]
13
(C-9), 128.8 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 119.0 [d] (C-12), 118.6 [d] (C-10), 76.9 [u]
(C-1), 61.5 [u] (C-7), 47.7 [d] (C-8), 44.7 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 36.2 [u] (C-16), 27.9
[u] (C-3), 26.8 [u] (C-4), 22.2 [u] (C-5), 18.4 [u] (C-17), 13.7 [d] (C-18).
IR (KBr): ∼
ν = 3400 (w), 3091 (m), 2975 (s) 2945, 2856 (s), 2829 (s), 1755 (s), 1608
(m), 1588 (m), 1461 (m), 1445 (m), 1434 (s), 1417 (s), 1383 (m), 1156 (s), 1156 (s),
1096 (s), 808 (m), 708 (m) cm-1.
C 71.44 71.03
H 9.15 9.19
N 4.38 4.35
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 2.490 g (10.0 mmol) rac-8 mit
einer Mischung aus 1.318 g (12.9 mmol) Essigsäureanhydrid und 0.08 g (1.0 mmol)
Pyridin in 40 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf(rac-16)= 0.26;
Rf (rac-8) = 0.10) wurden 2.881 g (9.9 mmol, 99 %) eines weißen kristallinen
Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von 84 ºC erhalten.
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 187
OH
10
5 6 1 9 11
O 15 16
7
4 3 2 14
N 12
O
13
8
13
C-NMR (75.4 MHz, CDCl3): δ = 169.3 ppm [u] (C-15), 152.0 [u] (C-11), 150.5 [u]
(C-9), 128.7 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 118.9 [d] (C-12), 118.4 [d] (C-10), 77.3 [u]
(C-1), 61.5 [u] (C-7), 47.7 [d] (C-8), 44.7 [d] (C-2), 41.3 [u] (C-6), 27.9 [u] (C-3), 26.8
[u] (C-4), 22.2 [u] (C-5), 21.1 [d] (C-16).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 291 (M+, 31), 121 (3), 58 (100) 45 (8).
IR (KBr): ∼
ν = 3076 (w), 3007 (w), 2981 (w), 2947 (s), 2924 (s), 2856 (m), 2828 (m),
2786 (m), 1755 (s), 1609 (w), 1588 (w), 1482 (w), 1459 (m), 1436 (m), 1377 (m),
1293 (w), 1268 (w), 1213 (s), 1154 (m), 1140 (w), 1094 (w), 1085 (w), 1022 (m), 991
(m), 965 (m), 938 (w), 889 (w), 839 (w), 806 (w), 784 (w), 710 (w) cm-1.
C 70.07 69.91
H 8.65 8.13
N 4.81 4.71
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 2, dazu wurden 1.786 g (8.0 mmol) rac-11 mit
einer Mischung aus 1.52 g (9.6 mmol) Buttersäureanhydrid und 0.06 g (0.8 mmol)
Pyridin in 20 ml Dichlormethan umgesetzt. Nach Aufarbeitung und
188 EXPERIMENTELLER TEIL
OH 8
1 7 9 14 16
4 O 13
5
3 2 12 15
N 10 O
11
6
6.87 (m, 1 H, 11-H), 2.57 (dd, 3J = 11 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H´), 2.44 (t, 3J = 7 Hz,
2 H, 14-H), 2.22 (s, 6 H, 6-H), 2.14 (dd, 3J = 3 Hz, 2J = 13 Hz, 1 H, 5-H), 1.94 (m, 1 H,
2-H), 1.69 (m, 2 H, 15-H), 1.40 (s, 3 H, 4-H), 0.96 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 16-H), 0.70 (d, 3J
= 7 Hz, 3 H, 3-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 170.8 ppm [u] (C-13), 149.5 [u] (C-9), 149.3 [u] (C-
7), 127.3 [d] (C-11), 122.0 [d] (C-12), 118.3 [d] (C-10), 118.1 [d] (C-8), 76.2 [u] (C-1),
63.0 [u] (C-5), 44.7 [d] (C-6), 39.3 [d] (C-2), 35.2 [u] (C-14), 20.9 [d] (C-4), 17.4 [u]
(C-15), 14.8 [d] (C-3), 12.6 [d] (C-16).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 293 (M+, 4), 86 (7), 84 (12), 71 (4), 58 (100), 45 (7).
IR (kapillar): ∼
ν = 2971 (s), 2877 (m), 2827 (m), 2784 (m), 1759 (s), 1608 (m), 1586
(m), 1466 (s), 1370 (m), 1236 (m), 1153 (s), 1098 (w), 1080 (w), 1029 (m), 947 (m),
838 (w), 704 (m) cm-1.
C 69.59 69.52
H 9.28 8.93
N 4.77 4.67
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 189
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 3.265 g
(10.3 mmol) rac-12⋅HCl, gelöst in 33 ml abs. THF, mit 2.950 g (26.3 mmol) Kalium-
tert-butylat über einen Zeitraum von 10 Min. mit 1.66 ml (1.703 g, 16.0 mmol)
Buttersäurechlorid, gelöst in 3 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1:1 über Kieselgel,
Rf (rac-18) = 0.41; Rf (rac-12) = 0.18) wurden 2.915 g (8.3 mmol, 81 %) eines klaren
sirupösen Öls erhalten.
O OH
18 10
5 6 1 9 11
19 16 O O
17 3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
10-H), 7.03 (s, 1 H, 12-H), 6.75 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 5.21 (m, 1 H,
5-H), 3.82 (s, 3 H, 15-H), 2.42 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.30 – 1.40 (m,
18 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 0.91 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.8 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.6 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 78.4 [u]
(C-1), 71.1 [d] (C-5), 60.5 [u] (C-7), 55.1 [d] (C-15), 47.7 [d] (C-8), 46.0 [u] (C-6), 44.1
[d] (C-2), 36.4 [u] (C-17), 32.2 [u] (C-4), 25.9 [u] (C-3), 18.5 [u] (C-18), 13.6 [d]
(C-19).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 350 ([M+H]+, 9), 349 (M+, 38), 262 (7), 135 (8), 58 (100), 45
(3).
IR (kapillar): ∼
ν = 2947 (s), 2864 (m), 2831 (s), 2784 (m), 1730 (s), 1600 (m), 1583
(m), 1484 (s), 1462 (s), 1432 (m), 1383 (m), 1358 (m), 1306 (m), 1288 (s), 1256 (s),
190 EXPERIMENTELLER TEIL
1186 (s), 1093 (m), 1048 (s), 1018 (m), 978 (m), 963 (m), 864 (w), 847 (w), 784 (m),
756 (m) 704 (w) cm-1.
C 68.74 68.44
H 8.94 8.77
N 4.01 4.30
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei –10 ºC, dazu wurden 3.50 g (12.5 mmol)
rac-13, gelöst in 102 ml abs. Diethylether und auf –10 ºC gekühlt, mit 1.408 g
(12.5 mmol) Kalium-tert-butylat und 1.203 g (11.3 mmol) Buttersäurechlorid, gelöst in
8 ml abs. Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 4.235 g eines gelben,
öligen Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie (Diisopropyl-
ether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.29) wurden 1.904 g (5.4 mmol, 44 %)
rac-19 als sirupöses Öl und 1.787 g einer Mischfraktion aus rac-13 (Rf = 0.16) und
rac-19 erhalten. Nach erneuter Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH =
1 : 1 über Kieselgel) wurden weitere 0.593 g (1.7 mmol, 14 %) rac-19 und 0.582 g
Mischfraktion erhalten.
O
18
19 16 O OH
17 10
5 6 1 9 11
O
3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.7 ppm [u] (C-16), 159.7 [u] (C-11), 149.0 [u]
13
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.7 [d] (C-14), 112.0 [d] (C-12), 111.6 [d] (C-10), 76.1 [u]
(C-1), 70.5 [d] (C-5), 61.1 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 46.6 [d] (C-8), 43.4 [u] (C-6), 43.0
[d] (C-2), 37.0 [u] (C-17), 29.6 [u] (C-4), 22.4 [u] (C-3), 18.9 [u] (C-18), 14.0 [d]
(C-19).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 16), 135 (6), 58 (100).
IR (kapillar): ∼
ν = 3584 (m), 3079 (s), 2944 (m), 2873 (m), 2766 (m), 1733 (s), 1601
(m), 1584 (m), 1485 (m), 1461 (s), 1432 (m), 1381 (w), 1287 (s) 1255 (s), 1201 (s),
1188 (s), 1166 (s), 1104 (m), 1088 (m), 1049 (m), 985 (w), 960 (w) 860 (w), 825 (w),
782 (w), 734 (w), 702 (w) cm-1.
C 68.74 68.35
H 8.94 9.08
N 4.01 4.30
OH OH
10
5 6 1 9 11
OH
3 7
4 2 14
N 12
13
8
1 H, 11-OH), 6.98 (s, 1 H, 10-H), 6.80 (s, 1 H, 14-H), 6.64 (dd, 1 H, 3J = 8 Hz,
4
J = 2 Hz, 12-H), 6.0 – 6.1 (br s, 2 H, 1-OH, 5-OH), 4.05 (m, 1 H, 5-H), 2.50 – 1.45
(m, 15 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 157.0 ppm [u] (C-11), 150.0 [u] (C-9), 129.6 [d]
(C-13), 116.3 [d] (C-14), 113.9 [d] (C-10), 112.5 [d] (C-12), 79.4 [u] (C-1), 67.8 [d]
(C-5), 61.6 [u] (C-7), 48.1 [d] (C-8), 45.1 [u] (C-6), 44.1 [d] (C-2), 33.6 [u] (C-4), 22.3
[u] (C-3).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 16), 135 (6), 58 (100).
IR (kapillar): ∼
ν = 3584 (m), 3079 (s), 2944 (m), 2873 (m), 2766 (m), 1733 (s), 1601
(m), 1584 (m), 1485 (m), 1461 (s), 1432 (m), 1381 (w), 1287 (s) 1255 (s), 1201 (s),
1188 (s), 1166 (s), 1104 (m), 1088 (m), 1049 (m), 985 (w), 960 (w) 860 (w), 825 (w),
782 (w), 734 (w), 702 (w) cm-1.
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 193
1.190 g (4.5 mmol) rac-20 wurde zu einer Lösung aus 50 ml dest. Wasser und 6.42 g
NaHCO3 (76.4 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Nach einer Stunde hatte sich
eine klare Lösung gebildet, zu der innerhalb von 15 Minuten tropfenweise 6.65 ml
(6.40 g, 40.5 mmol) Buttersäureanhydrid unter starker Gasentwicklung gegeben
wurden. Anschließend wurde noch 15 Min. bei Raumtemperatur zur
Vervollständigung der Reaktion gerührt und danach dreimal mit jeweils 15 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4
getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 1.446 g braunes,
sirupöses Rohprodukt erhalten. Nach Säulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1
über Kieselgel, Rf = 0.33; Rf (rac-13) = 0.26) konnten 1.417 g (4.2 mmol, 93 %)
rac-21 als schwach hellbrauner Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 79 ºC erhalten
werden.
OH OH
10
5 6 1 9 11 16 18
O 15
3 7 17
4 2 14
N 12
O
13
8
H), 7.09 (m, 1 H, -H), 6.88 (dd, 3J = 9 Hz, 4J = 2 Hz, 1 H, -H), 4.01 (mt, 3J = 3 Hz,
1 H, 5-H), 2.5 – 1.5 (m, 19 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 16-H, 17-H), 0.97 (t,
3
J = 7 Hz, 3 H, 18-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.2 ppm [u] (C-15), 151.0 [u] (C-11), 150.3 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 122.2 [d] (C-14), 119.7 [d] (C-12), 118.7 [d] (C-10), 78.7 [u]
(C-1), 67.2 [d] (C-5), 61.4 [u] (C-7), 47.5 [d] (C-8), 46.1 [u] (C-6), 44.0 [d] (C-2), 36.5
[u] (C-16), 33.6 [u] (C-4), 22.1 [u] (C-3), 18.8 [u] (C-17), 14.0 [d] (C-18).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 265 (M+, 14), 121 (3), 58 (100) 45 (6).
194 EXPERIMENTELLER TEIL
IR (KBr): ∼
ν = 3371 (m), 3169 (s9, 2946 (s), 2830 (s), 2786 (m), 1615 (m) 1585 (m),
1481 (s), 1424 (s), 1369 (w), 1352 (m), 1305 (m), 1293 (s), 1278 (s) 1251 (s), 1221
(m), 1165 (m), 1108 (s), 1075 (s), 1033 (m), 1007 (m), 984 (s), 952 (s), 904 (m), 874
(m), 863 (m), 841 (s), 782 (s), 734 (m), 703 (s), 579 (w), 469 (w) cm-1.
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 2.761 g
(8.7 mmol) rac-14⋅HCl, gelöst in 28 ml abs. THF, mit 1.500 g (13.4 mmol) Kalium-
tert-butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 1.410 ml (1.447 g, 13.6 mmol)
Buttersäurechlorid, gelöst in 2 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.39;
Rf (rac-14) = 0.14) wurden 2.396 g (6.9 mmol, 79 %) eines klaren sirupösen Öls
erhalten.
OH
10
5 6 1 9 11
17 O
19 16 O 3 7 15
4 2 14
18
N 12
13
O 8
10-H), 6.93 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (ddd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 4J = 1 Hz, 1 H, 14-H), 4.78
(m, 1 H, 4-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.35 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.25 –
1.50 (m, 18 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 0.89 (t, 3J = 7 Hz, 3 H,
19-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.5 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.8 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.1 [d] (C-10), 76.1 [u]
(C-1), 73.3 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.4 [d] (C-2), 39.4
[u] (C-6), 36.9 [u] (C-17), 33.3 [u] (C-3), 27.9 [u] (C-5), 18.9 [u] (C-18), 14.0 [d]
(C-19).
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 195
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 349 (M+, 8), 135 (2), 58 (100), 45 (3).
IR (kapillar): ∼
ν = 3077 (w), 2960 (s), 2873 (m), 2831 (m), 2783 (m) 1728 (s), 1601
(m), 1583 (m), 1483 (s), 1462 (s), 1432 8s), 1384 (m), 1356 (w), 1287 (s), 1254 (s),
1184 (s), 1093 (m), 1047 (s), 1013 (s), 997 (s), 964 (w), 784 (m), 703 (m) cm-1.
C 68.74 68.68
H 8.94 9.01
N 4.01 4.43
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei 0 ºC, dazu wurden 1.700 g (5.4 mmol)
rac-14⋅HCl, gelöst in 20 ml abs. Diethylether auf 0 ºC gekühlt, mit 1.510 g
(13.45 mmol) Kalium-tert-butylat und mit 1.090 g (8.1 mmol) Hexansäurechlorid,
gelöst in 2.6 ml abs. Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 2.370 g eines
gelben, zähflüssigen Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie
(Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.57; Rf (rac-14) = 0.19) und
anschließender präparativer HPLC (EE : MeOH = 1 : 1 über RP-Säule 18) konnten
1.562 g (4.1 mmol, 77 %) rac-23 als trübes, sirupöses Öl erhalten werden, welches
nach NMR- und GC-Analytik noch Spuren des Diesters der Hexansäure und rac-14
enthielt.
OH
10
5 6 1 9 11
21 19 17 O
16 O 3 7 15
4 2 14
20 18
N 12
13
O 8
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.19 ppm (t, 3J = 8 Hz, 1 H, 13-H), 7.05 (s, 1 H,
1
10-H), 6.93 (s, 1 H, 14-H), 6.70 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 2.5 Hz, 1 H, 12-H), 6.08 (br s,
1 H, 1-OH), 4.78 (m, 1 H, 4-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.4 – 1.5 (m, 19 H, 2-H, 3-H, 5-H,
6-H, 7-H, 8-H, 17-H, 18-H), 1.25 (m, 4 H, 19-H, 20-H), 0.83 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 21-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 173.7 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.6 [u]
(C-9), 129.4 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.9 [d] (C-12), 111.2 [d] (C-10), 76.0 [u]
(C-1), 73.2 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 47.9 [d] (C-8), 43.2 [d] (C-2), 39.4
[u] (C-6), 34.9 [u] (C-17) 33.3 [u] (C-3), 31.6 [u] (C-19), 27.9 [u] (C-5), 25.1 [u] (C-18),
22.7 [u] (C-20), 14.3 [d] (C-21).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 377 (M+, 10), 135 (3), 58 (100).
MS (CI, Isobutan, 100 eV) m/z (%): 434 ([M + C4H9]+, 3), 378 ([M + H]+, 100), 262 (4).
IR (kapillar): ∼
ν = 2955 (s), 2861 (s), 2832 (m), 2783 (m), 1729 (s), 1601 (m),1583
(m), 1484 (s), 1464 (s), 1432 (s), 1380 (m), 1355 (m), 1317 (m), 1288 (s), 1251 (s),
1176 (s), 1137 (m), 1097 (m), 1049 (m), 1034 (s), 1014 (s), 783 (m), 736 (w), 703 (m)
cm-1.
C 69.99 70.15
H 9.34 9.49
N 3.71 3.61
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 197
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei 0 ºC, dazu wurden 1.700 g (5.4 mmol)
rac-14⋅HCl, gelöst in 20 ml Diethylether auf 0 ºC gekühlt, mit 1.510 g (13.45 mmol)
Kalium-tert-butylat und mit 0.630 g (8.0 mmol) Essigsäurechlorid, gelöst in 2.6 ml
Diethylether, versetzt. Nach Aufarbeitung wurden 1.816 g eines gelben, öligen
Rohprodukts erhalten. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH =
1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.46; Rf (rac-14) = 0.19) wurden 1.292 g einer gelblich
öligen Mischung aus rac-24 und eines Diesters (Rf = 0.51) aus rac-14 und
Essigsäure (Verhältnis nach den Signalen der Protonen der Methoxygruppe (15-H)
im 1H-NMR: 4 : 1) erhalten. Ein Versuch zur weiteren Aufreinigung durch präparative
HPLC (Acetonitril : Wasser = 3 : 1 über RP-Select B-LiChrosor b-Säule) führte zur
Zersetzung von rac-24. Eine weitere Aufreinigung von rac-24 war somit nicht
möglich. Im folgenden wurde daher die nach Säulenchromatographie erhaltene
Mischung eingesetzt.
OH
10
5 6 1 9 11
O
17 16 O 3 7 15
4 2 14
N 12
13
O 8
10-H), 6.90 (s, 1 H, 12-H), 6.70 (md, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 4.77 (m, 1 H, 4-H), 3.75
(s, 3 H, 15-H), 2.34 (md, 2J = 14 Hz, 1 H, 7-H´), 2.30 – 1.45 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 5-H,
6-H, 7-H, 8-H, 17-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 170.9 ppm [u] (C-16), 159.8 [u] (C-11), 150.8 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.8 [d] (C-12), 111.1 [d] (C-10), 76.0 [u]
(C-1), 73.7 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.2 [d] (C-8), 43.3 [d] (C-2), 39.4
[u] (C-6), 33.3 [u] (C-3), 27.9 [u] (C-5), 21.8 [d] (C-17).
198 EXPERIMENTELLER TEIL
Zu einer Mischung von 1.750 g (6.3 mmol) rac-13 und 0.250 g (0.5 mmol) Pyridin in
5 ml Dichlormethan wurden unter Rühren 1.090 g (6.9 mmol) Buttersäureanhydrid
gegeben. In einer schwach exothermen Reaktion verfärbte sich die Reaktionslösung
hierbei schwach gelb. Die Reaktionslösung wurde für 26 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt, bis durch DC-Kontrolle kein Edukt mehr detektiert werden
konnte. Anschließend wurde die schwach gelbe Reaktionslösung mit einem
Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 20 Stunden kräftig gerührt. Nach
Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml Dichlormethan extrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen wurden mit dest. Wasser gewaschen und über
NaSO4 getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurde ein gelbliches,
Sirup ähnliches Öl erhalten, das im Hochvakuum von Pyridinresten befreit wurde.
Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel,
Rf = 0.48) wurden 1.916 g (4.6 mmol, 67 %) rac-25 erhalten.
O O
18 22
21
16 O O 20 23
19 17
1 10
5 6 9 11
O
3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
10-H, 12-H, 14-H), 5.18 (m, 1 H, 5-H), 3.80 (s, 3 H), 15-H), 3.09 (dd, 2J = 15 Hz,
4
J = 3 Hz, 1 H, 6-H´), 2.46 – 2.30 (m, 4 H, 6-H, 7-H´,17-H/21-H), 2.22 (t, 3J = 7 Hz,
2 H, 17-H/21-H), 2.09 (s, 6 H, 8-H), 1.95 – 1.60 (m, H, 2-H, 3-H, 4-H, 7-H, 18-H,
22-H), 1.01 (t , 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H/23-H), 0.95 (t , 3J = 7 Hz, 3 H, 19-H/23-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.6 ppm [u] (C-16), 171.9 [u] (C-20), 159.1 [u]
(C-11), 143.0 [u] (C-9), 128.8 [d] (C-13), 117.9 [d] (C-14), 112.4 [d] (C-12), 111.4 [d]
(C-10), 84.0 [u] (C-1), 69.0 [d] (C-5), 59.0 [u] (C-7), 55.2 [d] (C-15), 45.8 [d] (C-8),
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 199
44.8 [d] (C-2), 37.5 [u] (C-17), 36.4 [u] (C-21), 28.8 [u] (C-4), 18.5 [u] (C-18), 18.2 [u]
(C-22), 13.9 [d] (C-19), 13.7 [d] (C-23).
MS (CI, Isobutan, DEP, 100 eV) m/z (%): 477 ([M + C4H9]+, 2), 420 ([M + H]+, 100),
375 (11), 355 (13), 332 (63), 287 (73), 275 (15), 199 (44), 187 (23), 113 (13), 97 (10),
85 (24), 83 (21), 81 (30), 79 (14), 71 (31).
IR (kapillar): ∼
ν = 2963 (s), 2943 (s), 2874 (m), 2819 (m), 2765 (m), 1733 (s), 1605
(m), 1585 (m), 1490 (m), 1461 (s), 1433 (s), 1382 (m), 1362 (m), 1292 (s), 1256 (s),
1191 (s), 1154 (s), 1097 (s), 1049 (m). 1029 (m), 991 (m), 973 (m),849 (w), 803 (w),
778 (w), 700 (w) cm-1.
Die Synthese von rac-25 erfolgte ebenfalls gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur in
THF mit einer Ausbeute von 96 %.
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g
(0.25 mmol) rac-12, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-
butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.031 g (0.39 mmol)
Essigsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.30;
Rf (rac-12) = 0.18) wurden 0.054 g (0.17 mmol, 68 %) eines klaren, gelblichen Öls
erhalten.
200 EXPERIMENTELLER TEIL
O OH
5 10
6 1 9 11
16 O O
17 7 15
3 14
4 2
N 12
13
8
10-H), 6.95 (d, 3J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.69 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 5.12
(m, 1 H, 5-H), 3.73 (s, 3 H, 15-H), 2.32 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.26 –
1.10 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 169.0 ppm [u] (C-16), 158.4 [u] (C-11), 149.1 [u]
(C-9), 127.9 [d] (C-13), 115.9 [d] (C-14), 110.3 [d] (C-12), 109.6 [d] (C-10), 77.0 [u]
(C-1), 69.9 [d] (C-5), 59.4 [u] (C-7), 54.1 [d] (C-15), 46.7 [d] (C-8), 44.9 [u] (C-6), 43.1
[d] (C-2), 31.2 [u] (C-4), 24.8 [u] (C-3), 20.3 [d] (C-17).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 321 (M+, 8), 135 (4), 86 (11), 84 (18), 58 (100), 47 (4).
IR (kapillar): ∼
ν = 2946 (m), 2830 (w),1730 (s),1601 (w), 1584 (w), 1483 (w), 1462
(m), 1431 (w), 1287 (m), 1250 (s), 1157 (w), 1034 (m), 785 (w), 733 (m) cm-1.
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g
(0.25 mmol) rac-12, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-
butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.036 g (0.39 mmol)
Propionsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.36;
Rf (rac-12) = 0.18) wurden 0.060 g (0.18 mmol, 71 %) eines klaren, schwach
gelblichen sirupösen Öls erhalten.
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 201
O OH
18 5 10
6 1 9 11
16 O O
17 3 7 15
4 2 14
N 12
13
8
10-H), 6.96 (d, 3J = 7 Hz, 1 H, 12-H), 6.69 (md, 3J = 8 Hz, 1 H, 14-H), 5.13 (m, 1 H,
5-H), 3.74 (s, 3 H, 15-H), 2.33 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.26 – 1.30 (m,
16 H, 2-H, 3-H, 4-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H), 1.01 (t, 3J = 8 Hz, 3 H, 18-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 172.7 ppm [u] (C-16), 159.4 [u] (C-11), 150.1 [u]
(C-9), 129.0 [d] (C-13), 117.0 [d] (C-14), 111.5 [d] (C-12), 110.7 [d] (C-10), 78.0 [u]
(C-1), 70.6 [d] (C-5), 60.9 [u] (C-7), 55.5 [d] (C-15), 48.2 [d] (C-8), 46.3 [u] (C-6), 44.5
[d] (C-2), 32.6 [u] (C-4), 38.3 [u] (C-17), 26.3 [u] (C-3), 9.6 [d] (C-18).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 335 (M+, 12), 279 (3), 135 (5), 84 (11), 58 (100).
IR (kapillar): ∼
ν = 2944 (s), 2862 (m), 2831 (m), 2783 (m), 1732 (s), 1601 (m), 1584
(m), 1483 (m), 1462 (s), 1429 (m), 1351 (w), 1286 (m), 1255 (s), 1193 (s), 1158 (m),
1083 (m), 1048 (m), 1023 (m), 785 (m), 732 (w), 702 (w) cm-1.
OH
10
5 6 1 9 11
O
17 16 O 3 7 15
4 2 14
N 12
O 8
13
10-H), 6.91 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 4.78 (m, 1 H, 4-
H), 3.71 (s, 3 H, 15-H), 2.33 (dd, 2J = 14 Hz, 3J = 4 Hz, 1 H, 7-H´), 2.20 – 1.55 (m,
17 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 8-H, 17-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 169.4 ppm [u] (C-16), 158.3 [u] (C-11), 149.3 [u]
(C-9), 127.9 [d] (C-13), 116.0 [d] (C-14), 110.5 [d] (C-12), 109.7 [d] (C-10), 74.6 [u]
(C-1), 72.2 [d] (C-4), 59.9 [u] (C-7), 54.0 [d] (C-15), 46.7 [d] (C-8), 41.9 [d] (C-2), 38.0
[u] (C-6), 31.9 [u] (C-3), 26.5 [u] (C-5), 20.4 [d] (C-17).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 322 (3), 321 (M+, 11), 135 (3), 118 (3), 86 (57), 84 (91), 58
(100), 49 (16), 47 (16).
IR (kapillar): ∼
ν = 2951 (s), 2862 (w), 2831 (m), 2781 (w), 1730 (s), 1602 (s), 1584
(s), 1483 (s), 1463 (s), 1431 (m), 1366 (m), 1317 (w), 1286 (s), 1252 (s), 1171 (m),
1094 (w), 1034 (s), 998 (m), 962 (w), 913 (m), 786 (m), 733 (s), 704 (m) cm-1.
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 203
Die Synthese erfolgte gemäß AAV 3 bei Raumtemperatur, dazu wurden 0.070 g
(0.25 mmol) rac-14, gelöst in 1 ml abs. THF, mit 0.072 g (0.64 mmol) Kalium-tert-
butylat und über einen Zeitraum von 10 Min. mit 0.036 g (0.39 mmol)
Propionsäurechlorid, gelöst in 0.01 ml abs. THF, versetzt. Nach Aufarbeitung und
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel, Rf = 0.33;
Rf (rac-14) = 0.14) wurden 0.055 g (0.16 mmol, 66 %) eines klaren, schwach
gelblichen sirupösen Öls erhalten.
OH
10
5 6 1 9 11
17 O
16 O 3 7 15
4 2 14
18 N 12
O 8
13
10-H), 6.93 (s, 1 H, 12-H), 6.68 (dd, 3J = 8 Hz, 4J = 3 Hz, 1 H, 14-H), 4.77 (m, 1 H, 4-
H), 3.72 (s, 3 H, 15-H), 2.50 – 1.55 (m, 17 H, 2-H, 3-H, 5-H, 6-H, 7-H, 7-H´, 8-H, 17-
H), 1.07 (t, 3J = 7 Hz, 3 H, 18-H).
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 174.2 ppm [u] (C-16), 159.7 [u] (C-11), 150.7 [u]
(C-9), 129.3 [d] (C-13), 117.4 [d] (C-14), 111.8 [d] (C-12), 111.0 [d] (C-10), 76.0 [u]
(C-1), 73.4 [d] (C-4), 61.3 [u] (C-7), 55.4 [d] (C-15), 48.1 [d] (C-8), 43.3 [d] (C-2), 39.4
[u] (C-6), 33.2 [u] (C-3), 28.2 [u] (C-17), 27.8 [u] (C-5), 9.5 [d] (C-18).
MS (EI, 70 eV) m/z (%): 335 (M+, 10), 135 (3), 86 (37), 84 (57), 58 (100), 49 (7).
IR (kapillar): ∼
ν = 2947 (s), 2861 (w), 2831 (m), 2782 (w), 1728 (s), 1602 (s), 1584
(s), 1483 (s), 1728 (s), 1602 (s), 1584 (s), 1483 (s), 1463 (s), 1430 (s), 1352 (w),
1287 (m), 1255 (m), 1193 (s), 1084 (s), 1047 (s), 1020 (s), 997 (m), 962 (w), 911 (w),
785 (m), 734 (s), 704 (m) cm-1.
204 EXPERIMENTELLER TEIL
3.3.5.1 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit Bis-
(trichlormethyl)-carbonat222,246
1.150 g (3.6 mmol) rac-13⋅HCl und 2.888 g (36.5 mmol) Pyridin wurden in 20 ml abs.
Dichlormethan gelöst und auf −76 ºC gekühlt. Zu der klaren Lösung wurde über
einen Zeitraum von 10 Min. bei −76 ºC eine Lösung von 0.520 g (1.75 mmol) Bis-
(trichlormethyl)-carbonatf (Triphosgen) in 8 ml abs. Dichlormethan mittels Spritzen-
technik gegeben. Anschließend wurde noch 1.5 Stunden bei −76 ºC gerührt, dabei
verfärbte sich die Lösung schwach gelb und es bildete sich ein weißer Feststoff.
Nachdem die Lösung über einen Zeitraum von 1 Stunde auf Raumtemperatur
erwärmt wurde, wurde ein Überschuß an ges. NaHCO3-Lösung zugegeben und für
weitere 10 Stunden gerührt. Nach Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4
getrocknet, und das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt. Es
konnten 1.284 g einer Rohmischung erhalten werden, welche noch Pyridin enthielt.
Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 über Kieselgel,
Rohmischung: Rf (Pyridin) = 0.68, Rf (1) = 0.34, Rf (2) = 0.28, Rf (rac-13) = 0.10)
konnte allerdings nur eine Mischung von nicht näher charakterisierten
Zersetzungsprodukten und 0.334 g rac-13 erhalten werden.
Ein analoger Versuch mit rac-13 als Edukt führte zum gleichen Ergebnis.
f
S. B. Damle, Safe handling of diphosgene and triphosgene, Chem. & Eng. News 1993, 71, 4.
DARSTELLUNG DER SUBSTRATE ZUR ENZYMATISCHEN RACEMATSPALTUNG 205
500 mg (1.8 mmol) rac-13 wurden in 15 ml abs. Toluol gelöst und mit 1.162 g
(7.2 mmol) 1,1´-Carbonyldiimidazol versetzt. Die Reaktionslösung wurde
anschließend für 5 Stunden unter Rückfluß erhitzt und danach für weitere
15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Reaktionslösung
mit einem Überschuß ges. NaHCO3-Lösung für weitere 10 Stunden kräftig gerührt.
Nach Phasentrennung wurde dreimal mit jeweils 15 ml Dichlormethan extrahiert. Die
vereinigten organischen Phasen wurden über NaSO4 getrocknet und das
Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt. Nach
Säulenchromatographie (EE : MeOH = 2 : 1 über Kieselgel) konnten drei nicht näher
charakterisierte Fraktionen (66 mg (Rf = 0.75); 15 mg (Rf = 0.75 und Rf = 0.47);
0.47 mg (Rf = 0.47)) erhalten werden und 138 mg einer Hauptfraktion (Rf = 0.30). Die
spektroskopischen Daten dieser Fraktion lassen folgende Struktur vermuten:
O
17
N N 16 O
1 10
5 6 9 11
19 18
O
4 3 15
2 12
14
13
Ar/Im), 7.15 (t, J = 8 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.97 (t, J = 1 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.87 (dd, J = 8 Hz,
J = 1 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.82 (t, J = 2 Hz, 1 H, Ar/Im), 6.71 (dd, J = 8 Hz J = 3 Hz, 1 H,
Ar/Im), 6.08 (m, 1 H, 2-H), 5.32 (m, 1 H, 5-H), 3.71 (s, 3 H, 15-H), 2.82 (dm,
J = 17 Hz, 1 H, Cy), 2.58 (dm, J = 17 Hz, 1 H, Cy), 2.33 (m, 2 H, Cy), 1.96 (m, 2 H,
Cy).
C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 159.8 ppm [u] (C-11), 148.4 [u] (C-9), 142.5 [u]
13
(C-1), 137.3 [n. b.] (C-2), 133.1 [u] (C-16), 130.8 [d] (C-17), 129.6 [d] (C-13), 124.1
[d] (C-17/19), 117.8 [d] (C-14), 117.3 [d] (C-17/19), 112.7 [d] (C-12), 111.3 [d] (C-10),
75.2 [d] (C-5), 55.5 [d] (C-15), 33.0 [u] (C-6), 26.9 [u] (C-4), 23.5 [u] (C-3).
Vor Säulenchromatographie: MS (EI, 70 eV) m/z (%): 305 (M+[rac-48], 22), 298
(M+[rac-49], 20), 186 (83), 121 (17), 58 (100).
Ein analoger Versuch mit rac-13⋅HCl als Edukt führte zum gleichen Ergebnis, hier
konnte allerdings neben rac-49 auch rac-13 in geringen Mengen isoliert werden.
ÜBERPRÜFUNG DER HYDROLYSESTABILITÄT DER ESTERSUBSTRATE 207
Der racemische Ester (ca. 0.1 bis 0.2 mmol) wurde in 1 ml (10 Vol%) des
organischen Cosolvens gelöst und unter kräftigem Rühren langsam zu 9 ml wäßriger
Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M) gegeben. Die Mischung wurde anschließend auf den
gewünschten pH-Wert eingestellt. Danach wurde die Reaktionslösung für
mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur ohne Enzym gerührt. Im Anschluß
wurde die Reaktionslösung mit Dichlormethan extrahiert, getrocknet, am
Rotationsverdampfer eingeengt und dünnschicht- und gaschromatographisch
untersucht.
Die Stabilität des Esters rac-15 gegen Autohydrolyse wurde bereits in eigenen
Vorarbeiten untersucht80.
3.4.3 Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und
rac-25
Die Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25
wurde in unabhängigen Versuchen nach AAV 5 überprüft. Dazu wurde die in Tabelle
3.1 angegebene Menge Substrat in 1 ml tert-Butanol und 9 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und über die in Tabelle 3.1 angegebene Zeit
bei Raumtemperatur gerührt. Nach Aufarbeitung konnte nur der jeweilige Ester nach
GC-Analytik nachgewiesen werden.
208 EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 3.2: Überprüfung der Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19,
rac-21, rac-22 und rac-25
rac-17 50 mg 24 h nein
rac-18 50 mg 46 h nein
rac-19 50 mg 65 h nein
rac-22 50 mg 46 h nein
rac-21 50 mg 24 h nein
rac-25 50 mg 95 h nein
Die Hydrolysestabilität des Esters rac-23 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurden
50 mg (0.16 mmol) rac-23 in 1.48 ml Aceton (16 %Vol) und 7.78 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und für vier Tage bei Raumtemperatur gerührt.
Nach Aufarbeitung konnte keine Hydrolyse durch GC-Analytik nachgewiesen
werden.
Die Hydrolysestabilität des Esters rac-16 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurden
in zwei verschiedenen parallelen Ansätzen jeweils 50 mg (0.17 mmol) rac-16 in 1 ml
tert-Butanol und 9 ml wäßriger Phosphatpufferlösung bei dem in Tabelle 3.3
angegeben pH-Wert gelöst und über die in Tabelle 3.3 angegebene Zeit bei
Raumtemperatur gerührt.
ÜBERPRÜFUNG DER HYDROLYSESTABILITÄT DER ESTERSUBSTRATE 209
Die Hydrolysestabilität des Esters rac-24 wurde nach AAV 5 überprüft. Dazu wurden
50 mg (0.16 mmol) rac-24 (enthält Diessigsäurester von rac-24) in 1.48 ml Aceton
(16 %Vol) und 7.78 ml wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und für vier
Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach Aufarbeitung konnten 40 mg einer
Mischung aus drei Komponenten erhalten werden: rac-14, rac-24 und
Diessigsäurester von rac-24. Nach GC-Analytik wies die Mischung 2 % rac-14 auf.
210 EXPERIMENTELLER TEIL
Temperatur- Retentionszeiten
Reaktionsmischung
programm (Min.)
Flow Retentionszeitena)
Verbindung Laufmittel-Verhältnis
(mL / Min.) (Min.)
Der racemische Ester (0.5 bis 2 mmol) wurde in 4 ml (10 Vol%) des organischen
Cosolvens gelöst und unter kräftigem Rühren langsam zu 36 ml wäßriger
Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M) gegeben. Dabei entstand häufig zuerst eine Trübung
durch Emulsionsbildung, die aber rasch verschwand und eine klare Lösung
hinterließ. Aufgrund der Basizität der Substrate wurde die Mischung anschließend
auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Danach wurde die Reaktionslösung für
24 Stunden ohne Enzym gerührt. Nachdem durch DC- und GC-Reaktionskontrolle
überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte,
wurde das Enzym zugegeben. Danach wurde der Ansatz bei Raumtemperatur über
den gesamten Reaktionszeitraum kräftig gerührt. Der pH-Wert der Reaktionslösung
wurde durch einen pH-STAT Autotitrator mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten.
Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurde über die gesamte Reaktionsdauer verfolgt.
Zur GC-Reaktionskontrolle wurden 0.5 ml-Proben entnommen. Die Proben wurden
mit ca. 0.5 ml dest. Wasser verdünnt und zweimal mit ca. 1.5 ml Dichlormethan
extrahiert. Die organische Phase wurde abgetrennt und zum Trocknen durch eine mit
Na2SO4 gefüllte Pasteurpipette gegeben. Zum Abbruch der Reaktion und zur
Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung in einem Perforator mit Dichlormethan für
ein bis zwei Tage kontinuierlich extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
wurden anschließend mit Na2SO4 getrocknet, im Rotationsverdampfer eingeengt und
unter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit.
Der racemische Ester (0.5 bis 1 mmol) wurde in 5 ml MTBE gelöst und unter
kräftigem Rühren langsam zu einer Emulsion aus 20 ml wäßriger Phosphatpuffer-
Lösung (0.1 M) und 15 ml MTBE gegeben. Es entstand in allen Fällen eine klare
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 215
Emulsion, die anschließend aufgrund der Basizität der Substrate auf den
gewünschten pH-Wert eingestellt wurde. Danach wurde die Reaktionslösung für
24 Stunden ohne Enzym gerührt. Nachdem durch DC- und GC-Reaktionskontrolle
überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte,
wurde das Enzym zugegeben. Danach wurde der Ansatz bei Raumtemperatur über
den gesamten Reaktionszeitraum heftig gerührt, so daß eine feine Emulsion
entstand. Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde durch einen pH-STAT Autotitrator
mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten. Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurde
über die gesamte Reaktionsdauer verfolgt. Zur GC-Reaktionskontrolle wurden
0.5 ml-Proben entnommen. Die Proben wurden mit ca. 0.5 ml dest. Wasser verdünnt
und dreimal mit ca. 1.5 ml Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde
abgetrennt und zum Trocknen durch eine mit Na2SO4 gefüllte Pasteurpipette
gegeben. Zum Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung wurde die
Reaktionslösung in einem Perforator mit Dichlormethan für 48 Stunden kontinuierlich
extrahiert. Anschließend wurde die organische Phase mit Na2SO4 getrocknet, im
Rotationsverdampfer eingeengt und unter vermindertem Druck von
Lösungsmittelresten befreit.
Das racemische Substrat (0.25 mmol) und das Acylierungsmittel wurden in 5 ml des
organischen Lösungsmittels gelöst. Die Reaktionslösung wurde für 24 Stunden ohne
Enzym bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem durch DC- und GC-
Reaktionskontrolle überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion
stattgefunden hatte, wurde das Enzym zugegeben und die Mischung für einige
Minuten kräftig gerührt, um das Enzym möglichst fein zu verteilen. Danach wurde der
Ansatz über den restlichen Reaktionszeitraum langsam gerührt. Zur GC-
Reaktionskontrolle wurden 500 µl-Proben entnommen und zur Abtrennung von
Proteinen und eventuell vorhandenem MPEG mit 1.5 ml Dichlormethan über eine mit
Na2SO4 und Celite gefüllte Pasteurpipette filtriert.
216 EXPERIMENTELLER TEIL
ln [1 − c(1+ eeP )]
Formel 3.2: E= , für c < 50 %
ln [1− c(1− ee P )]
ln [(1− c)(1− ee S )]
Formel 3.3: E= , für c > 50 %
ln [(1− c)(1+ ee S )]
ee S
Formel 3.4: Umsatz ber =
ee S + ee P
1− ee S ee P (1− ee S )
ln ln (ee + ee )
1 + (eeS /ee P ) S
E= =
P
Formel 3.5:
1 + ee S ee P (1+ ee S )
ln ln
1 + (eeS /ee P ) ee P + ee S )
Alle E-Werte in dieser Arbeit wurden aus dem ee-Wert des Substrats und dem
ee-Wert des Produkts berechnet. Dazu wurde Formel 3.5, die sich aus Formel 3.4
eingesetzt in Formel 3.2 oder Formel 3.3 ergibt, verwendet.6 Von einer Berechnung
des E-Werts aus dem gemessenen Umsatz und nur einem ee-Wert wurde
abgesehen.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 217
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml Aceton und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 100 µl (1.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die
Reaktion wurde nach 5 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.248 g einer Mischung aus Ester (+)-15
und Phenol (−)-8 erhalten werden.
Tabelle 3.7: PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 unter Zusatz von
Aceton als Cosolvens
5 Min 52 % 27 % 46 % 4
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
1.135 g (3.6 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml tert-Butanol und 72 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 400 µl (4.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die
Reaktion wurde nach 2 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 52 % durch
kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31;
Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.532 g (1.67 mmol, 47 %) (+)-15 und 0.428 g (1.72 mmol,
49 %) (−)-8 isoliert werden.
218 EXPERIMENTELLER TEIL
2h 62 % 47 % 47 % 49 % 13
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
1.120 g (3.5 mmol) des Esters rac-15 in 8 ml tert-Butanol und 72 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 400 µl (4.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die
Reaktion wurde nach 3 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 85 % durch
kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (CHCl3 : i-Propanol = 2 : 1 über Kieselgel, Rf ((−)-8) = 0.22;
Rf ((+)-15) = 0.01) konnten 0.560 g (2.25 mmol, 64 %) (−)-8 und 0.113 g (0.35 mmol,
10 %) (+)-15 isoliert werden.
(+)-15: [α ] 20
D
= + 10.74º (c = 0.7, MeOH)
(−)-8: [α ] 20
D
= − 3.43º (c = 1.5, MeOH)
3h ≥ 98 % 10 % 27 % 64 % 7
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 219
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 0.6 mg Acetylcholinesterase (AChE;
970 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 7.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.297 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol
(−)-8 erhalten werden.
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 10 mg Candida antarctica Lipase
(CAL; 3.2 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion
wurde nach 3.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.310 g einer Mischung aus Ester (+)-15
und Phenol (−)-8 erhalten werden.
3.75 h 8% 3% 3% 1.1
220 EXPERIMENTELLER TEIL
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 20 mg Lipase aus Mucor miehei
(1.3 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 19.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.245 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol
(−)-8 erhalten werden.
19.5 h 25 % 11 % 30 % 2.1
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Horse liver esterase (HLE;
0.74 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 4 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und
aufgearbeitet. Es konnten 0.284 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8
erhalten werden.
4h 31 % 17 % 51 % 4
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 221
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Cholesterolesterase (CE;
17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 24 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.231 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol
(−)-8 erhalten werden.
24 h 90 % 72 % 39 % 5
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Porcine pancreatic Lipase (PPL;
16.8 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 2.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.259 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol
(−)-8 erhalten werden.
2.5 h 66 % 19 % 78 % 10
222 EXPERIMENTELLER TEIL
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Burkholderia cepacia Lipase
(BCL, 40 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion
wurde nach 22 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.318 g einer Mischung aus Ester (+)-15
und Phenol (−)-8 erhalten werden.
22 h 35 % 75 % 67 % 11
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1 mmol) des Esters rac-15 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 50 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 3 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und
aufgearbeitet. Es konnten 0.284 g einer Mischung aus Ester (+)-15 und Phenol (−)-8
erhalten werden.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 223
3h 64 % 98 % 45 % 10
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.0, dazu wurden
0.316 g (1.0 mmol) des Esters rac-15 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 45 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 3.25 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 51 % durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31;
Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.203 g (0.64 mmol, 64 %) (+)-15 und 0.076 g (0.30 mmol,
30 %) (−)-8 isoliert werden.
(+)-15: [α ] 20
D
= + 17.90º (c = 1.3, MeOH)
(−)-8: [α ] 20
D
= − 11.45º (c = 2.0, MeOH)
3.25 h 75 % 64 % 85 % 30 % 27
224 EXPERIMENTELLER TEIL
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.0, dazu wurden
0.319 g (1.0 mmol) des Esters rac-15 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 3 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
37 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 5.25 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 33 % durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (EE : MeOH = 3 : 1 über Kieselgel, Rf ((+)-15) = 0.31;
Rf ((−)-8) = 0.10) konnten 0.186 g (0.58 mmol, 58 %) (+)-15 und 0.068 g (0.27 mmol,
27 %) (−)-8 isoliert werden.
5.25 h 58 % 58 % 90 % 27 % 34
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 40 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 7.25 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 225
und aufgearbeitet. Es konnten 0.286 g einer Mischung aus Ester (+)-16 und Phenol
(−)-8 erhalten werden.
7.25 h 45 % 4% 26 % 2
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 100 µl (1.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die
Reaktion wurde nach 1.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit
Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.179 g einer Mischung
aus Ester (+)-16 und Phenol (−)-8 erhalten werden.
1.75 h 36 % 35 % 52 % 4
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.291 g (1 mmol) des Esters rac-16 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 80 µl (0.8 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die
Reaktion wurde nach 45 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
226 EXPERIMENTELLER TEIL
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.229 g einer Mischung aus Ester (+)-16
und Phenol (−)-8 erhalten werden.
0.75 h 31 % 50 % 74 % 10
Reaktionsbedingungen 28 d E-Wert
Umsatz (GC) 3%
112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat
ee Ester (−)-16 n. b. -
5 ml Diisopropylether
ee Phenol (+)-8 n. b.
Umsatz (GC) 18 %
5.8 ml (63 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 10 % 1.2
ee Phenol (+)-8 2%
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 229
Reaktionsbedingungen 28 d E-Wert
Umsatz (GC) 2%
112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat
ee Ester (−)-16 n. b. -
5 ml Diisopropylether
ee Phenol (+)-8 n. b.
Umsatz (GC) 8%
112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat
ee Ester (−)-16 n. b. -
5 ml MTBE
ee Phenol (+)-8 n. b.
Umsatz (GC) 36 %
5.8 ml (63 mmol) Vinylacetat ee Ester (−)-16 38 % 3
ee Phenol (+)-8 21 %
Umsatz (GC) 66 %
112 mg (1.3 mmol) Vinylacetat
ee Ester (−)-16 33 % 2.5
5 ml Dichlormethan
ee Phenol (+)-8 26 %
230 EXPERIMENTELLER TEIL
Reaktionsbedingungen 17 d E-Wert
Umsatz (GC) 15 %
5 ml (39 mmol)
ee Ester (−)-15 28 % 2
Vinylbutyrat
ee Phenol (+)-8 15 %
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.147 g (0.5 mmol) des Esters rac-17 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 40 µl (0.4 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die
Reaktion wurde nach 25 Minuten durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.104 g einer Mischung aus Ester 17
und Phenol 11 erhalten werden.
25 Min. 69 % 7% 1% 1.1
232 EXPERIMENTELLER TEIL
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.147 g (0.5 mmol) des Esters rac-17 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 40 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
2.4 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 2.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.128 g einer Mischung aus Ester 17 und Phenol 11
erhalten werden.
2.5 h 17 % 1% 3% 1.1
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.174 g (0.50 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 50 µl (0.5 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war stark getrübt. Die
Reaktion wurde nach 5.75 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 40 % durch
kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (EE : MeOH : TEA = 50 : 50 : 1 an Kieselgel,
234 EXPERIMENTELLER TEIL
Rf ((−)-18) = 0.32; Rf ((+)-12) = 0.15) konnten 0.082 g (0.23 mmol, 47 %) (−)-18 und
0.042 g (0.15 mmol, 30 %) (+)-12 isoliert werden.
(−)-18: [α ] 20
D
= − 6.01º (c = 1.50, MeOH)
(+)-12: [α ] 20
D
= + 21.70º (c = 0.80, MeOH)
5.75 h 86 % 47 % 94 % 30 % 89
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.500 g (1.43 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
37 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war zu Beginn stark getrübt, am Ende der
Reaktionszeit klar und farblos. Die Reaktion wurde nach 4.75 Stunden bei Umsatz
(GC) von ca. 49 % durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Nach Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1 : 1 an
Kieselgel, Rf ((+)-18) = 0.36; Rf ((−)-12) = 0.18) konnten 0.216 g (0.62 mmol, 43 %)
(+)-18 und 0.162 g (0.58 mmol, 41 %) (−)-12 isoliert werden.
(+)-18: [α ] 20
D
= + 7.03º (c = 0.72, MeOH)
(−)-12: [α ] 20
D
= − 28.30º (c = 1.00, MeOH)
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 235
4.75 h 93 % 41 % 95 % 41 % 133
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.5, dazu wurden
0.349 g (1.0 mmol) des Esters rac-18 in 26 ml MTBE und 26 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 6 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
37 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 72 Stunden bei einem Umsatz (GC) von ca. 45 % durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Nach
Säulenchromatographie (Diisopropylether : MeOH = 1:1 an Kieselgel,
Rf ((+)-18) = 0.36; Rf ((−)-12) = 0.18) konnten 0.140 g (0.40 mmol, 40 %) (+)-18 und
0.110 g (0.39 mmol, 39 %) (−)-12 isoliert werden.
(+)-18: [α ] 20
D
= + 7.03º (c = 0.72, MeOH)
(−)-12: [α ] 20
D
= − 28.30º (c = 1.00, MeOH)
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 7 bei pH 7.2, dazu wurden
0.500 g (1.43 mmol) des Esters rac-18 in 25 ml MTBE und 25 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.2) gelöst und mit 13 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
25.9 U/mg) versetzt. Nach 48 Stunden bei einem Umsatz von ca. 50 % wurde zum
Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die Reaktionslösung zunächst einmal mit
40 ml MTBE extrahiert und anschließend dreimal mit je 30 ml Diethylether. Die
vereinigten organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet und im
Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.254 g (0.73 mmol, 50.8 %) farbloser,
öliger Ester (+)-18 mit einem ee-Wert von ≥98 % isoliert werden. Die verbliebene
wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck von
Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10 eingestellt.
Anschließend wurde viermal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und die
vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am
Rotationsverdampfer wurden 0.184 g (0.66 mmol, 46.1 %) Alkohol (−)-12 mit einem
ee-Wert von 97 % erhalten.
(+)-18: [α ] 20
D
= + 7.9º (c = 0.69, MeOH)
(−)-12: [α ] 20
D
= − 28.60º (c = 0.93, MeOH)
48 h ≥98 % 51 % 97 % 46 % >200
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 237
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.5, dazu wurden
0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 60 mg Novozym 435 (immobilisierte
CAL-B) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos, das immobilisierte
Enzym unlöslich. Die Reaktion wurde nach 45 Stunden durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.200 g
Ester rac-18 erhalten werden.
Tabelle 3.36: Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18
45 h 0% - - -
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.245 g (0.70 mmol) des Esters rac-18 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Chirazyme L-2 (CAL-B;
154 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 46 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.240 g einer Mischung aus Ester (+)-18 und Alkohol
(−)-12 erhalten werden.
46 h 7% 8% n. b. -
238 EXPERIMENTELLER TEIL
Reaktions- Mittel
8d E-Wert 13 d E-Wert
bedingung E-Wert
Umsatz (GC) 5% n. b.
5 ml (49.95 mmol)
ee Ester (−)-46 91 % 22 n. b. - 22
Vinylpropionat
ee Alkohol (+)-12 4% n. b.
3d 6d 8d 11 d 16 d
Reaktionsbedingung
(%) (%) (%) (%) (%)
Umsatz (GC) 23 41 48 53 58
5 ml (49.95 mmol) 88 84 86 82 79
ee Ester (−)-46
Vinylpropionat
ee Alkohol (+)-12 25 52 68 85 ≥90
Reaktionsbedingungen 3d 6d 8d 11 d 16 d Mittel
Reaktionsbedingung 2d 5d 14 d 20 d
Umsatz (GC) 3% 5% 13 % 16 %
5 ml (70 mmol) n. b. 10 % 24 % 24 %
ee Ester (−)-47
Isopropenylacetat
ee Alkohol (+)-12 n. b. n. b. 4% 6%
Reaktionsbedingungen 2d 5d 14 d 20 d Mittel
a) mit 7 mg MPEG/PLE
b) mit 45 mg PLE/MPEG
55 mg PLE/BSA/MPEG in 5 ml Dichlormethan 11 d 0%
45 mg PLE/BSA/MPEG, 12 µl H2O in 6 ml Toluol 11 d 0%
244 EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 3.47: Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter
Verwendung verschiedener Lipasen
Cholesterolesterase 25 mg 24 h 181 mg 1%
(CE; 17.5 U/mg)
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-19 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 10 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
37 U/mg) versetzt. Die Reaktion wurde nach 69 Stunden durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.184 g
Ester 19 erhalten werden.
246 EXPERIMENTELLER TEIL
69 h 1% n. b. n. b. -
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-19 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 200 µl (2.0 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die
Reaktion wurde nach 41 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.191 g Ester 19 erhalten werden.
41 h 0% - - -
Alkohols rac-13 mit 125 mg (1.25 mmol) Vinylpropionat und der in Tabelle 3.50
aufgeführten Menge Lipase in 5 ml Toluol versetzt.
Novozym 435
30 mg 2% 4%
(immobilisierte CAL-B)
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.170 g (0.51 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 7.5 mg Cholesterolesterase (CE;
17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 16.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.107 g einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol
(−)-20 erhalten werden.
16.75 h 64 % 71 % 11 % 2
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.184 g (0.55 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 150 µl (1.5 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die
Reaktion wurde nach 16.75 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit
Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.116 g einer Mischung
aus Ester (+)-21 und Phenol (−)-20 erhalten werden.
250 EXPERIMENTELLER TEIL
3.25 h 82 % 20 % 6% 1.3
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.170 g (0.51 mmol) des Esters rac-21 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
37 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 18.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.141 g einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol
(−)-20 erhalten werden.
18.5 h 40 % 31 % 17 % 2
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.162 g (0.48 mmol) des Esters rac-21 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 5 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
37 U/mg) versetzt. Die Reaktion wurde nach 46 Stunden durch kontinuierliche
Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.138 g
einer Mischung aus Ester (+)-21 und Phenol (−)-20 erhalten werden.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 251
46 h 57 % 89 % 28 % 5
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.5, dazu
wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 20 mg Burkholderia cepacia
Lipase (BCL, 40 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Da nach
22 Stunden Reaktionszeit noch kein Produkt mit DC-Reaktionskontrolle detektiert
werden konnte, wurden die Reaktionstemperatur auf 35 ºC für die restliche
Reaktionszeit erhöht. Nach insgesamt 48 Stunden Reaktionszeit wurde durch
kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es
konnten 0.187 g Ester rac-22 erhalten werden.
48 h 0% - - -
252 EXPERIMENTELLER TEIL
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 20 mg Novozym 435
(immobilisierte CAL-B) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos; das
immobilisierte Enzym unlöslich. Da nach 19 Stunden Reaktionszeit noch kein
Produkt mit DC-Reaktionskontrolle detektiert werden konnte, wurden weitere 40 mg
Novozym 435 zur Reaktionslösung gegeben. Nach insgesamt 10 Tagen
Reaktionszeit wurde durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.200 g Ester rac-22 erhalten werden.
10 d 35 % 67 % 85 % 24
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Chirazyme L-2 (CAL-
B; 154 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion wurde
nach 45 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
und aufgearbeitet. Es konnten 0.181 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol
(−)-14 erhalten werden.
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 253
45 h 7% 9% ≥98 % >200
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 7 mg Candida rugosa Lipase
(CRL; 25.9 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion
wurde nach 24 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.180 g einer Mischung aus Ester (+)-22
und Alkohol (−)-14 erhalten werden.
24 h 27 % 38 % 92 % 34
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 7 bei pH 7.5, dazu
wurden 0.350 g (1.0 mmol) des Esters rac-22 in 20 ml MTBE und 20 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.5) gelöst und mit 7 mg Candida rugosa Lipase (CRL;
25.9 U/mg) versetzt. Die Reaktionsemulsion war klar und farblos. Die Reaktion
wurde nach 5 Tagen durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen
254 EXPERIMENTELLER TEIL
und aufgearbeitet. Es konnten 0.226 g einer Mischung aus Ester (+)-22 und Alkohol
(−)-14 erhalten werden.
5d 34 % 37 % 69 % 8
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 15 mg Cholesterolesterase
(CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Zum Abbruch
der Reaktion nach 22.5 Stunden und zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung
dreimal mit je 40 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen
wurden mit Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten
0.105 g (0.30 mmol, 53 %) (+)-22 mit einem ee-Wert von 91 % isoliert werden. Die
verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem
Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3 auf pH 10
eingestellt. Anschließend wurde dreimal mit je 30 ml Dichlormethan extrahiert und
die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach Einengen am
Rotationsverdampfer wurden 0.071 g (0.25 mmol, 45 %) (−)-14 mit einem ee-Wert
von 91 % erhalten.
(+)-22: [α ] 20
D
= + 14.14º (c = 1.02, MeOH)
(−)-14: [α ] 20
D
= − 34.75º (c = 1.05, MeOH)
22.5 h 91 % 53 % 91 % 45 % 67
256 EXPERIMENTELLER TEIL
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß nach AAV 6 bei pH 7.0, dazu
wurden 0.221 g (0.57 mmol) des Esters rac-22⋅HCl in 4 ml tert-Butanol und 36 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung gelöst (pH 7.0) und mit 20 mg Cholesterolesterase
(CE; 17.5 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die Reaktion
wurde nach 19.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan
abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.166 g einer Mischung aus Ester (+)-22
und Alkohol (−)-14 erhalten werden.
19.5 h 43 % 86 % 94 % 89
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 8.0, dazu wurden
0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 4 ml tert-Butanol und 36 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 8.0) gelöst und mit 75 µl (0.8 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Die Reaktionslösung war klar und farblos. Die
Reaktion wurde nach 16.5 Stunden durch kontinuierliche Extraktion mit
Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es konnten 0.179 g einer Mischung
aus Ester (−)-22 und Alkohol (+)-14 erhalten werden.
16.5 h 18 % 22 % 93 % 34
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 257
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.200 g (0.57 mmol) des Esters rac-22 in 6.4 ml (16 Vol%) Aceton und 33.6 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 1.9 mg Chirazyme E1 (PLE,
Fraktion 1, 33.0 U/mg). Die Reaktionslösung war klar und farblos. Zum Abbruch der
Reaktion nach 42 Stunden, bei einem Umsatz von ca. 22 %, und zur Aufarbeitung
wurde die Reaktionslösung zunächst zweimal mit je 30-40 ml MTBE und
anschließend mit dreimal mit je 40 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen wurden mit Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer
eingeengt. Es konnten 0.147 g (0.42 mmol, 74 %) (−)-22 mit einem ee-Wert von
27 % isoliert werden. Die verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer
unter vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von
Na2CO3 auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml
Dichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4
getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.037 g (0.13 mmol,
23 %) (+)-14 mit einem ee-Wert von 97 % erhalten.
Tabelle 3.66: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 unter Zusatz
von Aceton als Cosolvens
42 h 27 % 74 % 97 % 23 % 85
258 EXPERIMENTELLER TEIL
1.00 g (2.59 mmol) rac-22⋅HCl wurden zu einer Mischung aus 2 ml (16 Vol%) Aceton
und 10.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung (0.1 M, pH 7.0) gegeben. Die Lösung
wurde anschließend auf pH 7.0 eingestellt. Nachdem durch GC-Reaktionskontrolle
überprüft worden war, daß keine nicht-enzymatische Reaktion stattgefunden hatte,
wurden 9 mg Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) zugegeben. Danach wurde
der Ansatz bei Raumtemperatur über den gesamten Reaktionszeitraum kräftig
gerührt. Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde durch einen pH-STAT Autotitrator
mit 1 N NaOH-Lösung konstant gehalten. Der Verbrauch an NaOH-Lösung wurde
über die gesamte Reaktionsdauer verfolgt. Zur HPLC-Reaktionskontrolle wurden
analog zur AAV 6 zehn 100 µl Proben entnommen. Nach 24 Stunden wurde zum
Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die Reaktionslösung zunächst viermal
mit je 30-40 ml MTBE extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit
Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.591 g
(1.69 mmol, 65 %) farbloser, öliger Ester (−)-22 mit einem ee-Wert von 28 % isoliert
werden. Die verbliebene wäßrige Phase wurde am Rotationsverdampfer unter
vermindertem Druck von Lösungsmittelresten befreit und durch Zugabe von Na2CO3
auf pH 10 eingestellt. Anschließend wurde fünfmal mit je 30 ml Dichlormethan
extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet. Nach
Einengen am Rotationsverdampfer wurden 0.165 g einer Mischung aus 82 %
(0.46 mmol, 18 %) Alkohol (+)-14 mit einem ee-Wert von 91 % und 18 % (0.10 mmol,
4 %) Ester (−)-22 (mit einem ee-Wert von 28 %) erhalten.
(−)-22: [α ] 20
D
= − 4.62º (c = 0.96, MeOH)
(+)-14: [α ] 20
D
= + 26.40º (c = 0.32, MeOH)
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 259
1h 2 2 ≥98 -
1.5 h 3 3 ≥98 -
3h 4 5 ≥98 -
4.25 h 7 7 ≥98 -
5.25 h 8 9 ≥98 -
7.25 h 10 11 ≥98 -
22.5 h 20 26 95 50
24 h 28 % 65 % 91 % 18 % 27
In zwei parallelen Versuchen wurde 1.00 g (2.59 mmol) rac-22⋅HCl einmal zu einer
Mischung aus 2 ml Aceton (16 Vol%) und 10.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung
(0.1 M, pH 7.25) und ein zweitesmal zu 12.8 ml wäßriger Phosphatpuffer-Lösung
(0.1 M) gegeben. Die Lösungen wurden anschließend auf pH 7.25 eingestellt.
Nachdem durch GC-Reaktionskontrolle überprüft worden war, daß keine nicht-
enzymatische Reaktion stattgefunden hatte, wurde zu beiden Versuchen jeweils
9 mg Chirazyme E1 (PLE, Fraktion 1, 33.0 U/mg) zugegeben. Danach wurden die
Ansätze über den gesamten Reaktionszeitraum kräftig gerührt. Aufgrund eines
technischen Defekts fiel die Temperatur nach 8 Stunden für die restliche
260 EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 3.69: Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse von rac-22⋅HCl mit und ohne
Zusatz von Aceton als Cosolvens
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.432 g (1.14 mmol) des Esters rac-23 in 6.4 ml (16 Vol%) Aceton und 33.6 ml
wäßriger Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 3.8 mg Chirazyme E1 (PLE,
Fraktion 1, 33.0 U/mg). Die Reaktionslösung war während der ersten Stunden der
Reaktion stark getrübt, in Laufe der Reaktion verschwand diese Trübung. Nach
24 Stunden wurde zum Abbruch der Reaktion und zur Aufarbeitung die
Reaktionslösung zunächst dreimal mit je 30-40 ml MTBE und dann dreimal mit je
25 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit
Na2SO4 getrocknet und im Rotationsverdampfer eingeengt. Es konnten 0.234 g
262 EXPERIMENTELLER TEIL
(−)-23: [α ] 20
D
= − 6.70º (c = 1.93, MeOH)
(+)-14: [α ] 20
D
= + 25.83º (c = 0.9, MeOH)
Tabelle 3.71: Chirazyme E1-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-23 unter Zusatz
von Aceton als Cosolvens
24 h 92 % 54 % 77 % 46 % 24
Reaktionsbedingungen 16 d E-Wert
Umsatz (GC) 11 %
5 ml (54 mmol)
ee Ester (−)-24 47 % 4
Vinylacetat
ee Alkohol (+)-14 48 %
Umsatz (GC) 12 %
5 ml (70 mmol)
ee Ester (−)-24 77 % 10
Isopropenylacetat
ee Alkohol (+)-14 35 %
Reaktionsbedingungen 48 h E-Wert
Reaktionsbedingungen 24 h E-Wert
Umsatz (HPLC) 52 %
5 ml (49.95 mmol)
ee Ester (−)-45 97 % 192
Vinylpropionat
ee Alkohol (+)-14 88 %
Umsatz (HPLC) 50 % 53 % 52 % 52 %
5 ml (49.95 mmol)
ee Ester (−)-45 92 % 93 % 92 % 92 %
Vinylpropionat
ee Alkohol (+)-14 93 % ≥98 % ≥98 % ≥98 %
Reaktionsbedingungen 24 h E-Wert
11 d 0% - - -
47.75 h 2% ≥98 % 3% -
ENZYM-KATALYSIERTE RACEMATSPALTUNGEN IM WÄßRIGEN UND ORGANISCHEN MEDIUM 269
Cholesterolesterase 30 mg 25 h 165 mg 0%
(CE; 17.5 U/mg)
Die Enzym-katalysierte Hydrolyse erfolgte gemäß AAV 6 bei pH 7.0, dazu wurden
0.200 g (0.48 mmol) des Esters rac-25 in 6 ml Aceton und 34 ml wäßriger
Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gelöst und mit 150 µl (1.5 mg) PLE/(NH4)2SO4-
Suspension (PLE, 130 U/mg) versetzt. Nach 42 Stunden wurde die Reaktion durch
kontinuierliche Extraktion mit Dichlormethan abgebrochen und aufgearbeitet. Es
konnten 0.199 g Ester 25 erhalten werden.
270 EXPERIMENTELLER TEIL
42 h 1% - - -
ANHANG ZUM EXPERIMENTELLEN TEIL 271
Mode STAT
Regelparameter Endpunkt pH 8.00
Regelbereich 0.5
Max. Rate 10.0 ml/Min.
Min. Rate 25.0 µl/Min.
Titrationsparameter Start V aus
Start 0s
Start pH aus
Startrate aus
Zeitintervall 60 s
Titrationsrichtung +
Meßeingang 1
Parameter
1
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BlascHKE et al. versuchten das Mandelat in Ethanol zu kristallisieren, konnten aber nur
einen Niederschlag erhalten, in dem von Meckler et al. beschriebenen Lösungsmittel-
gemisch aus Essigsäureethylester und Essigsäureisopropylester wurden Kristalle
erhalten.
c) G. R. Evans, P. D. Fernández, J. A. Henshilwood, S. Lloyd, C. Nicklin, Organic
Process Research & Development 2002, 6, 729.
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Transferbereichs 11, Stereoselektive Wirkstoffsynthese, am 08.01.1999.
79
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5 Lebenslauf
Schulausbildung:
08/1978 – 06/1982 Grundschule Emmelsbüll-Horsbüll
08/1982 – 07/1989 Friedrich-Paulsen-Schule Niebüll,
Gymnasium des Kreises Nordfriesland
08/1989 – 06/1991 Städtisches Mathematisch-Naturwissenschaftliches
Gymnasium Mönchengladbach
06/1991 Allgemeine Hochschulreife (Abitur)
Studium:
10/1991 – 03/1998 Diplomstudiengang Chemie an der Rheinisch-
Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
06/1994 Vordiplom
10/1997 – 03/1998 Diplomarbeit am Institut für Organische Chemie der
RWTH-Aachen unter Anleitung von Prof. Dr. H.-J. Gais mit
dem Titel:
„Enzymatische Racematspaltungen von phenolischen
Analgetika“
03/1998 Abschluß: Diplom-Chemiker
Promotion:
04/1998 – 02/2002 Dissertation bei Prof. Dr. H.-J. Gais am Institut für
Organische Chemie der RWTH-Aachen mit Thema:
„Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von
Tramadol–Analoga und deren industrielle Anwendbarkeit“
13.12.2002 Tag der mündlichen Prüfung