BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

MANUAL DE PRACTICAS DEL

LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA II

AUTORES:
M. en C. REYNA DEL CONSUELO ALMIRAY PINZÓN
M.E.C. ANA BERTHA ESCOBEDO LOPEZ
M. en C. GLORIA LEÓN TELLO
M. en C. MARÍA SUSANA PERÉZ FERNÁNDEZ
M. en C. PATRICIA GUADALUPE SUÁREZ ALBORES
2013

1
 ÍNDICE

Práctica No. 1 Infecciones gastrointestinales (Coprocultivo) 3

Práctica No. 2 Infecciones de las vias urinarias (Urocultivo) 9

Práctica No. 3 Sensibilidad a los antimicrobianos método de Kirby-Bauer 16

(antibiograma)

Práctica No. 4 Infecciones de vías respiratorias altas (Exudado faríngeo y 21

nasofaríngeo)

Práctica No. 5 Infecciones de vías respiratorias bajas (Cultivo de esputo) 26

Práctica No. 6 Búsqueda e identificación de Mycobacterium tuberculosis 32

Práctica No. 7 Infecciones oculares 39

Práctica No. 8 Infecciones óticas 42

Práctica No. 9 Infecciones del aparato genital (Exudado cervico vaginal y exudado 45
uretral)

Práctica No. 10 Cultivo de heridas 551

Práctica No. 11 Diagnóstico de enfermedades meníngeas (Cultivo de LCR) 55

Práctica No. 12 Hemocultivo 60

2
 BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA No. 1
INFECCIONES GASTROINTESTINALES
COPROCULTIVO
Introducción
El estudio de las bacterias responsables de cuadros clínicos gastrointestinales se realiza
fundamentalmente mediante el cultivo de la materia fecal (coprocultivo). Las enfermedades
diarreicas agudas representan una de las principales causa de defunción en nuestro país.
Las vías gastrointestinales son el hábitat natural de una extensa variedad de
microorganismos, la mayoría de las bacterias de la flora entérica residente corresponden a
miembros de la familia Enterobacteriaceae (E.coli, Proteus etc.) aunque también son
abundantes Enterococcus faecalis, diversas especies de Staphylococcus, Mycobacterium y
especies anaerobias. Siendo de mayor relevancia diagnóstica las enterobacterias patógenas como:
Shigella, Salmonella, Yersinia, Escherichia coli, esta última aunque se considera parte de la
flora algunos serotipos denominados enteropatógenos son capaces de producir gastroenteritis,
principalmente en lactantes en forma de brotes epidémicos. Además de otros géneros de
importancia médica como Vibrio, Campylobacter y Helicobacter que pertenecen a otras familias.
El objetivo principal de realizar el coprocultivo es que éste sirva como apoyo al
diagnóstico clínico en caso de gastroenteritis.

Objetivo
El alumno aprenderá la técnica para la realización del coprocultivo así como conocerá las
diferentes pruebas bioquímicas que se utilizan para la identificación de los patógenos intestinales.

3
Material
Placas de Petri con Agar Mac Solución salina isotónica en tubos de
Conkey 13x100 con 2mL.
Placas de Petri con Agar S.S. Tubos con medio: TSI, LIA, MIO,
Placas de Petri con Agar, XLD urea de Christensen, citrato de
Placas de Petri con Agar Sulfito de Simmons para pruebas bioquímicas
Bismuto Solución de Iodo
Placas de Petri con Agar Entérico de Juego de colorantes de Gram.
Hecktoen. Portaobjetos
Placas de Petri con Agar EMB Cubreobjetos
Placas de Petri con Agar Campy- Colorante de Azul de Metileno
BAP Gradillas
Placas de Petri con Agar TCBS. Aceite de inmersión.
Placas de Petri con Agar Gelosa Frasco con benzal
sangre de Carnero. Algodón
Caldo selenito o tetrationato en tubos Taxos de oxidasa
de 13x100 con 2 mL. Tubos con caldo soya tripticasa
Agua peptonada Alcalina (APA) a Baño maría
pH 9. Marcador de vidrio.
Buffer de PBS

4
Desarrollo
Toma y transporte de muestra para coprocultivo
Las muestras se deberán obtener al inicio del cuadro clínico antes de iniciar el tratamiento
antimicrobiano.
1. La muestra de heces se puede tomar directamente en un frasco limpio de boca ancha y
con tapa hermética de preferencia debe usarse estéril y desechable, cuando se trata de
lactantes la muestra se toma directamente del recto usando sonda K31 conectada a una
jeringa estéril, e introduciéndole solución salina isotónica. Si la muestra se toma en el
mismo laboratorio donde se va a procesar el aislamiento, no es necesario usar medio de
transporte hay que sembrar de inmediato.
2. En estudios de campo o cuando el laboratorio no está cercano, la muestra se toma con
un hisopo que debe quedar bien impregnado de materia fecal. El hisopo se coloca en un
medio de transporte como el de Cary-Blair o el de Stuart-Amies.
3. Sólo en ocasiones extremas se puede refrigerar la muestra.

Procesamiento de la muestra
1. Hacer la observación directa de las heces, si presenta moco, sangre o si son líquidas,
pastosas o de diferente color.
 2. La tinción de Gram en frotes de materia fecal es importante para corroborar la presencia
de Campylobacter en sus formas vibriónicas y helicoidales, la presencia de células
indicativas de inflamación, eritrocitos, etc.
3. La materia fecal se siembra directamente con un asa y la cantidad de muestra depende del
tipo de medio de cultivo utilizado. El método usado es por la técnica de estría cruzada
esterilizándola en cada sección de la placa y separando la estría.
4. Las placas se incuban a 37° C durante 18 a 24 h
5. Al mismo tiempo de sembrar las placas, sembrar un tubo de enriquecimiento con muestra
fecal usando una cantidad pesada de inóculo, como caldo tetrationato o caldo selenito. Si
se sospecha de Vibrio sembrar un tubo con agua peptonada alcalina (APA), incubar a
37°C de 12 a 18 h y posteriormente sembrar en un medio selectivo.
6. 7.- Del tubo de enriquecimiento después de incubado se siembran medios selectivos y
diferenciales y se identifican las colonias de interés.

DIAGRAMA DE TRABAJO

Heces

Enriquecimiento

SSI al 0.5%
Caldo tetrationato
o
Caldo selenito
Agar Mac Conkey
Agar EMB
Azul de metileno Agar SS
Agar ENDO Agar verde Brillante
Agar XLD Agar sulfito de bismuto
Agar tergitol 7 Agar XLD

Identificación
bioquímica
 IDENTIFICACIÓN DE Vibrio cholerae

Reporte del coprocultivo

Realizar un informe del estudio para el médico incluyendo los siguientes datos:
1. Nombre completo del Paciente.
2. Edad y sexo del mismo.
3. Tipo de cultivo.
4. Si la muestra contenía microorganismos de la flora normal, o las bacterias patógenas a nivel
intestinal.
5. Las características principales de la muestra.
6. Sus observaciones con las diferentes tinciones.
7. Si existe algún comentario se le realiza al médico con sus respectivas sugerencias.
8. Firma del responsable.

Cuestionario
1. Menciona la flora que podemos encontrar normalmente en una muestra de heces.
2. Cuáles son los principales patógenos que podemos encontrar en este tipo de muestra.
3. En una muestra sólida, ¿qué bacteria buscamos principalmente?
4. ¿Qué factores intervienen para que un microorganismo pueda causar una infección
gastrointestinal?
5. ¿Qué bacterias producen enterotoxinas?
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LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

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PRÁCTICA No.2
INFECCIONES DE VÍAS URINARIAS
UROCULTIVO

Introducción
Las infecciones de las vías urinarias son muy frecuentes y presentan una marcada resistencia al
tratamiento y muchas de ellas con tendencia a redicivar especialmente en las personas del sexo
femenino, considerándose riesgosas porque pueden evolucionar a enfermedades renales graves,
como pielonefritis, presentándose en algunos casos de manera asintomática, o como enfermedad
aguda o crónica.
Las infecciones agudas son causadas generalmente por un solo microorganismo, mientras
que las crónicas por varios microorganismos. Las bacterias que con mayor frecuencia se aislan de
la orina de pacientes son E. coli, Staphylococcus, Proteus, Enterococcus faecalis, Salmonella,
Pseudomonas, Mycobacterium, ocasionalmente Neisseria gonorroheae o Candida albicans.

Objetivo
El alumno aprenderá las diferentes tomas de muestra de la orina, así como la técnica para su
cultivo.

Material
Placas de Petri con Agar Mac Conkey.
Placas de Petri con Agar Sal y Manitol.
Placas de Petri con Agar sangre de carnero
Placas de Petri con Agar Thayer Martin.
Placas de Petri con Agar de DNAsa.
Tubos con medio de Biggy
Tubos con medios: TSI, LIA, MIO, Urea y Citrato para pruebas bioquímicas
Asa calibrada.
Juego de colorantes de Gram
Taxos de catalasa, oxidasa, PN, ESD. Bacitracina 0.04 U
Portaobjetos y cubreobjetos.
Placas estériles.
Pipetas estériles.
Tubos estériles.
Solución Salina Isotónica.
Matraz con Agar Nutritivo estéril.
Cuenta colonias.

Desarrollo
Toma de muestra
La muestra idónea es la primera micción de la mañana, ya que permite la multiplicación de
bacterias durante la noche.
Técnicas para mujeres
1. La paciente debe quitarse la ropa interior.
2. Se lavará las manos cuidadosamente con agua y jabón, las enjuagará con agua y las secará
con una toalla limpia.
3. Se separarán los labios mayores y menores, y los mantendrá separados en todo momento
hasta que se haya recogido la orina.
4. Con una gasa enjabonada se lava bien la vulva pasándola de delante hacia atrás, se
repetirá el proceso un total de 4 veces.
5. Enjuagar cuidadosamente con agua hervida para eliminar los restos de jabón.
6. Se indicará a la paciente que orine desechando los 20-25 primeros mililitros, tras lo cual y
sin interrumpir la micción, se recogerá el resto de la orina en el recipiente.
7. El frasco de boca ancha y estéril debe sujetarse para que no tenga contacto con pierna,
vulva o ropa de la paciente. Los dedos no deben tocar el borde del frasco o su superficie
interior.
Técnica para hombres
1. Lavado de las manos con agua y jabón.
2. Retraer completamente el prepucio, que se mantendrá así en todo momento, hasta que se
haya recogido la orina.
3. Limpiar el glande con jabón neutro.

4. Eliminar los restos de jabón enjuagándolo con agua hervida.

5. Se pedirá al paciente que orine desechando los primeros 20-25 mililitros y sin interrumpir
la micción, recoger el resto de la orina en el recipiente estéril.

Técnica para niños

1. En niños y niñas mayores la orina se recoge de forma similar a los adultos.
2. En niños y niñas más pequeños, la orina se recogerá en colectores o bolsas estériles
especialmente diseñadas para ellos de la siguiente forma:
a) Lavado cuidadoso de los genitales y área perineal igual que en los adultos.
b) Colocar la bolsa de plástico o el colector.
c) Vigilar la bolsa cada 30 minutos y tan pronto como el niño haya orinado, deben
retirarse y enviarse al laboratorio para su procesamiento.
d) Si la micción no se ha realizado en una hora, se repite la operación colocando una
nueva bolsa.

Otros pacientes
1. En pacientes ingresados con imposibilidad de recoger la muestra por sí mismos, se
realizará sondaje vesical por personal sanitario experto con las medidas asépticas
oportunas.

2. Orina de pacientes con catéter permanente.

a) Se limpiará el catéter con una gasa humedecida en alcohol o solución yodada.
Dejar secar unos minutos.
b) Pinchar directamente con la aguja el catéter, por la zona desinfectada, aspirando
entre 3-5 mL.
 c) Para su transporte puede enviarse en la jeringa o pasar la orina a un recipiente
estéril. Si no puede llevarse al laboratorio, se debe refrigerar a 4ºC.
d) Como regla general se considera que la muestra de sonda vesical no es una
muestra adecuada y que está justificado rechazar su procesamiento.

Aspiración suprapúbica
1. Este tipo de procedimiento solo puede ser realizado por personal médico. Se usa para obtener
el diagnóstico exacto en los recién nacidos y en los niños pequeños, es una forma de
demostrar el origen de la infección de la vejiga y la bacteriuria con microorganismos que se
originan más allá de la vejiga, así como la búsqueda de bacterias anaerobias.
2. Hacer una punción directa en la vejiga a través de la pared abdominal con aguja y jeringa.
3. Este tipo de métodos se considera muy agresivo.

Transporte de la muestra
La orina debe llegar al laboratorio en el plazo de una hora. Cuando esto no sea posible debe
refrigerarse a 4ºC durante un tiempo máximo de 24 horas. El laboratorio debe controlar el
transporte, garantizándose que las muestras han sido refrigeradas desde el momento de su toma,
siendo admisible, si no puede garantizarse el transporte correcto, la utilización de algún
conservante (ácido bórico al 2% o el sistema comercial con bórico-formiato).

Volumen mínimo de la muestra.

Es suficiente un volumen de orina de 5-10 mL, ver tabla

Recomendaciones sobre el volumen de orina

VOLUMEN
DETERMINACION COMENTARIOS
(mL)
Bacteria 0,5-1 Primera orina de la mañana.
Hongos >20 Primera orina de la mañana.
Mycobacterias >20 Primera orina de la mañana tres días consecutivos.
Aspirado suprapúbico, enviar en un sistema de transporte
Anaerobios 1
para anaerobios
Primera orina de la mañana, enviar con hielo y
Virus 10-15
transportar al laboratorio inmediatamente.
Parásitos. Orina de 24 horas.

Método del asa calibrada 10-3

1. Se basa en el uso del asa calibrada para inocular un volumen conocido de orina en la placa.
2. Agitar la orina, y tomar una asada de orina con el asa calibrada procurando que solo entre la
rueda y se descarga en línea rectas en el centro de la placa y se estría.
3. Se incuban las placas a 37ºC por 24 h.
4. Contar el número de colonias que se desarrollan en las placas y se calcula las unidades
formadoras de colonias por mL (UFC/mL).
5. Se identifica el microorganismo según sus características.

Método de dilución con pipeta

1. Se coloca 0.1 mL de orina en 9.9 mL de solución salina isotónica (dilución 102) se
homogeneiza el tubo perfectamente.
2. Con una pipeta estéril se toman 0.1 mL de esta dilución y se transfiere a un segundo tubo
conteniendo 9.9 mL de solución salina isotónica (dilución 104).
3. Se toman 0.1 mL de cada uno de los tubos y se depositan en placas de medios de cultivo
seleccionados.
4. La suspensión bacteriana se extiende rotando las placas suavemente, se incuba a 37ºC de 18-
24 h.
5. Se cuenta el número de colonias de acuerdo al factor de dilución correspondiente.

Método de vaciado en placa

1. Se coloca 1 mL de cada una de las diluciones arriba mencionadas dentro de cajas de Petri
estériles.
2. Se agrega el medio de cultivo fundido y enfriado a 45ºC se rota suavemente la placa para
que se homogeneice perfectamente y se deja solidificar el medio.
3. Se incuban las placas a 37ºC de 18-24 h.
4. Se cuenta el número de colonias.
5. De acuerdo al factor de dilución se calcula las UFC/mL.

DIAGRAMA DE TRABAJO

Primera micción
matutina
Chorro medio

Agar Mac Conkey

Agar sangre de carnero
asa calibrada 10-3
Cent. 2000g/10 min
Sedimento Identificación
Cuantificación bioquímica
No. de colonias X 1000
No. de UFC/mL

Thayer Martin
(N. gonorrhoeae)
Agar Biggy
(Candida albicans)
Reporte
Una parte importante del urocultivo es la interpretación del resultado. El criterio de 100,000 o
más microorganismos por mL de orina para el diagnóstico de la bacteriuria significativa es
primariamente de índole operacional, cuando se emplea el método del vaciado aséptico para
recoger las muestras. Actualmente se utiliza el criterio de Kass para detectar una bacteriuria
verdadera.
La bacteriuria verdadera se caracteriza usualmente por cuentas que exceden sobradamente el
1’000,000 de colonias por mL menos de 10,000 UFC/ mL se considera negativo. Sin embargo, es
muy importante el criterio del médico de acuerdo al estado clínico de su paciente.

El reporte deberá contener los siguientes datos:

Nombre del Paciente
Edad
Sexo
Fecha
Hora de la toma de muestra
Nombre del médico
Tipo de estudio:
Resultado:
P/e: Se aíslo E. coli 650,000 UFC/mL.
Negativo a las 48 h de incubación
Firma del Responsable.

Cuestionario
1. Menciona a partir de qué área del aparato urinario es estéril.
2. Escribe los microorganismos que podemos encontrar como microflora residente en la
uretra.
3. ¿Qué es la bacteriuria?
4. ¿Por qué es importante realizar cultivos cuantitativos en una muestra de orina?
5. ¿Por qué la orina debe procesarse lo más pronto posible?
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LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

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PRACTICA No. 3
SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS METODO DE KIRBY-BAUER
ANTIBIOGRAMA

Introducción
En los últimos años, las bacterias resistentes a los antimicrobianos, han causado varios brotes de
infecciones que produjeron muchas muertes. Por ello es necesario establecer programas
nacionales e internacionales de vigilancia de la resistencia de las bacterias a los antibióticos,
utilizando pruebas de sensibilidad fidedignas que proporcionen datos comparables. La
información microbiológica y epidemiológica disponible ayudará a los clínicos a seleccionar el
agente microbiano más apropiado para tratar cada infección.

Plantear la necesidad de saber cuál es el antimicrobiano que se debe utilizar para eliminar
el microorganismo que está provocando la infección, es de suma importancia en pacientes cuyas
terapias antimicrobianas han tenido poco éxito, principalmente en pacientes hospitalizados.
Para esto es necesario conocer:
1. La susceptibilidad del microorganismo “in vitro”
2. La relación de susceptibilidad entre el microorganismo y las bacterias de la misma especie.
3. Las propiedades farmacológicas de los antimicrobianos, incluyendo su toxicidad,
distribución, absorción y excreción.
4. Experiencia clínica en el tratamiento
5. Historia natural del proceso patológico.
6. El estado inmune del huésped
 El papel que juega el laboratorio es de suma importancia, ya que al determinar la
susceptibilidad de los microorganismos “in vitro”, dará una pauta a seguir sobre cuál debe ser el
antimicrobiano que se debe usar, sin dejar de considerar las diferencias en su actividad in vitro.
Para este tipo de estudios existen varios métodos como son:
1. Dilución seriada en tubo
2. Dilución seriada en placa.
3. Difusión en discos de papel filtro
4. Sistemas automatizados
La selección del método, va a depender de:
1. Número de pruebas que se procesen diariamente.
2. Tipo de microorganismo que se trata, del sitio que se aislé, tipo de patogenicidad, etc.
3. Equipo automatizado que se cuente.

Objetivo
Que el alumno realice la técnica de difusión en disco de Kirby-Bauer para determinar la
susceptibilidad del patógeno “in vitro” ante determinados antimicrobianos

DIFUSIÓN EN DISCOS DE PAPEL FILTRO (Modificado de la FDA y la NCCLS del

método original de Bauer, Kirby. Sherris y Turck 1966).
Utilizando discos de papel filtro con diferentes concentraciones del antimicrobiano, sé obtiene
diámetros en la zona de inhibición proporcionales a la concentración. Para seguir este método es
indispensable:
1. Efectuar el antibiograma a microorganismos de crecimiento rápido, por lo que no se
deberá emplear en organismos de crecimiento lento, anaerobios obligados.
2. Siempre se realizará con cultivos puros y con cepas control.
3. El medio empleado es el de Mueller-Hinton cuyo pH final deberá ser 7.2 a 7.4.
4. Los microorganismos control utilizados para realizar esta técnica son: Staphylococcus
aureus (ATCC 25923) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)
5. Verificar la calidad de los discos así como su fecha de caducidad.
 6. Para probar la susceptibilidad de Haemophylus y Streptococcus se utiliza el medio
suplementado con sangre de carnero.

Material
1. Placas con medio de Mueller Hinton de 15 cm de diámetro
2. Placas con medio de Mueller Hinton con sangre de carnero
3. Tubos con 4 ml de caldo Mueller Hinton
4. Hisopos estériles
5. Pinzas
6. Sensidiscos para Grampositivos y Gramnegativos
7. Cepas control
8. Regla transparente
9. Alcohol
10.Tubo del Nefelómetro de McFarland al 0.5%
11.Solución salina isotónica estéril.

Desarrollo
1. Con un asa en punta se tocan 4 ó 5 colonias morfológicamente iguales y se inoculan en un
tubo con caldo Mueller Hinton.
2. Incubar a 35ºC hasta que aparezca una leve turbidez (2 a 5 h).
3. Se ajusta la turbidez tomando como referencia el tubo 0.5 del Nefelómetro de McFarland.
4. Se introduce el hisopo en el caldo de tal forma que se humedezca con la suspensión
bacteriana, se le quita el exceso de caldo en las paredes del tubo.
5. Sembrar el microorganismo en la placa de Mueller Hinton en tres direcciones para sembrar
uniformemente. Al final se pasa el hisopo en el borde de la placa.
6. Colocar los sensidiscos distribuidos en forma uniforme o en su defecto usando un dispensador
automático, con una presión ligera.
7. Incubar la placa de Petri en forma invertida durante 18 h a 35ºC.
8. Se mide los halos de inhibición con la regla.
9. La interpretación de los diámetros de las zonas de inhibición de las cepas se hace en base a las
tablas entregadas por el fabricante.
Diagrama de procedimientos
Reporte
1. Se informa la actividad de los antibióticos contra los microorganismos empleados.
2. Si la cepa es de microorganismos resistentes a la penicilina se debe probar su comportamiento
a otros antibióticos.
3. Sí el paciente es sensible a la penicilina se debe usar eritromicina y la tetraciclinas como otra
alternativa.
4. Se reporta el nombre de la bacteria con su género y especie así como su comportamiento al
antibiograma.
Cuestionario
1. Describe las diferentes técnicas que se utilizan para la realización de los antibiogramas.
2. ¿A qué microorganismo le realizas el antibiograma?
3. ¿Cuál es la técnica que utilizaste en la práctica y qué nombre recibe?
4. ¿Qué medio de cultivo utilizaste para esta técnica?
5. ¿Por qué se calibra la muestra a una turbidez de 0.5 y a cuántas bacterias equivale?
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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA No. 4
TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR
EXUDADO FARÍNGEO Y NASOFARÍNGEO

Introducción
El estudio del exudado faríngeo y nasofaríngeo es importante para el diagnóstico de ciertas
infecciones consideradas dentro de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el
mundo. Dentro de las principales bacterias patógenas causantes de infección están los
estreptococos.

También es muy importante conocer la flora normal en las vías respiratorias altas y bajas
para un buen reporte, ya que la orofaringe es un sitio expuesto y se debe distinguir a los
patógenos de los comensales con ayuda del cultivo.

El exudado faríngeo y nasofaríngeo son las muestras más empleadas para el estudio
bacteriológico de una infección de vías respiratorias superiores y es requisito importante que sean
tomadas en forma adecuada para garantizar resultados confiables y correctos.

Objetivo
Que el alumno aprenda a tomar la muestra para el aislamiento de bacterias de importancia médica
de vías respiratorias altas

Toma y transporte de la muestra

Es muy importante la toma de la muestra al inicio del cuadro clínico antes de empezar cualquier
tratamiento.
1. Es importante indicarle al paciente que debe venir al laboratorio sin aseo bucal.
2. Sin haber ingerido ningún tipo de alimento.
3. No debe haber ingerido ningún antimicrobiano.
4. Se inclina la cabeza del paciente hacia atrás y se revisa con una lámpara la zona afectada
5. Se empuja la lenguas hacia abajo con un abatelenguas estéril que permita mejor visión.
6. Se introduce un hisopo hacia las amígdalas, se frota suavemente la zona afectada.
7. Hay que evitar tocar la lengua, los dientes o la mucosa.

EXUDADO NASOFARINGEO

En la muestra indicada para la investigación de Bordetella pertussis se puede tomar por

exudado o aspirado
1. Utilizar solamente hisopos de Dacrón o rayón con base de plástico o alambre
flexible. NO utilizar hisopos de alginato de calcio o con palillo de madera.
2. Introducir el hisopo por una de las narinas, aproximadamente 10 cm cuidando tocar solo
el extremo posterior del mango del hisopo y evitar tocar solo los cornetes.
3. Una vez tocado el fondo de la nasofaringe se frota suavemente y con movimiento rápido.
Aspirado:
1.- Desinfectar el lugar de la punción con povidona.
2.- Introducir una aguja en el antrum maxilar por debajo del cornete inferior, o en el seno frontal
por debajo del marco supraorbital del ojo.
3.- Aspirar el líquido del seno. Cuando no se obtenga líquido, aplicar 1 mL de suero salino estéril
y aspirarlo nuevamente.
4.-Inyectar una parte de la muestra en un medio de transporte para anaerobios y enviar el resto en
un contenedor estéril o en la propia jeringa.

Transporte de la muestra
1. En caso que la muestra no se vaya a procesar de inmediato se deberá depositar en medio de
transporte.
2. Es importante que el médico nos indique en base al cuadro clínico de que proceso infecciosos
se sospecha, para conocer los requerimientos de cada una de las bacterias y sembrar las
muestras inmediatamente.

Material
1. Placas de Petri con. Gelosa sangre de carnero al 5%
2. Placas de Petri con medio de Sal y Manitol
3. Placas de Petri con Mac Conkey
4. Placas de Petri con medio de Thayer-Martin.
5. Placas de Petri con medio de Agar hemina bacitracina extracto de levadura (GHBL).
6. Placas de Petri con medio de Biggy
7. Tubos con medios TSI, LIA, MIO.CS. y Urea para pruebas bioquímicas
8. Tubos con caldo Soya Tripticasa
9. Matraz con 15 ml de agar de Soya tripticasa
10.Hisopos estériles
11.Abatelenguas estériles
12.Colorantes de Gram
13.Frasco con cloro
14.Sensidiscos de Bacitracina de 0.04 U
15.Sensidiscos de Optoquina
16.Sensidiscos de Novobiocina
17.Tubos con agar bilis esculina
18.Tubos de Caldo soya tripticasa con 6.5 % NaCl

Desarrollo
Es importante seguir el diagrama de trabajo que se indica en esta práctica. Aunque el uso
de agar sangre de carnero es obligado para la búsqueda de Streptococcus hemolítico.
1. Se toma la muestra como ya se indicó anteriormente, se siembra en los medios: agar sangre de
carnero, Thayer Martin, Sal y Manitol etc.
2. Se incuban 24 h a 37ºC
3. Hacer frotes y teñir por técnica de Gram, Ziehl Neelsen, Giemsa para investigar asociación
con fusoespirilar.
4. Sí en las tinciones se sospecha de Corynebacterium diphteriae se debe seguir un diagrama de
trabajo específico para su identificación así como el aviso inmediato a las autoridades de la
S.S.A.
5. Se debe leer todas las placas y se identifica a los microorganismos patógenos.
Es importante en niños menores de cinco años la investigación de Haemophilus influenzae.
Es de gran trascendencia epidemiológica determinar la presencia de portadores de Neisseria
meningitidis.
Otro problema importante son los casos de Bordetella pertussis es importante sembrar las
muestras en medio de Bordet-Gengou y seguir un diagrama específico para su identificación
así como la notificación de los casos a la S.S.A.

Reporte
El reporte al médico es de acuerdo a nuestros resultados, es importante tomar en cuenta la edad y
sexo del paciente.
1. Se aisló Flora Normal
2. Se identificó el siguiente microorganismo, se pone género y especie
3. Es posible encontrar más de un microorganismo patógeno en un cultivo
4. De preferencia a estas muestras se les realiza antibiograma, si tiene más de una bacteria
patógena a cada una se les realiza su antibiograma

DIAGRAMA DE TRABAJO

Medio de
transporte Stuart

Caldo estreptosel
Agar Biggy

Agar sangre de
carnero Agar sangre de
Candida albicans (CGP, BGN) carnero

GHBEL
(H. influenzae)
Colonias β-hemolíticas

Pruebas de identificación

Cuestionario

1.- ¿Cuál es la importancia de realizar un cultivo faríngeo?

2.- ¿Qué indicaciones le das al paciente para una correcta toma de muestra?
3.- Menciona la flora normal de faringe.
4.- Menciona a los principales patógenos que podemos encontrar como posibles productores de
una faringitis.
5.- ¿Cuál es la importancia de buscar a Streptococcus pyogenes?
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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA No. 5
INFECCIONES DE VÍAS RESPIRATORIAS BAJAS
(CULTIVO DE EXPECTORACIÓN)

Introducción
Las infecciones de las vías respiratorias inferiores son causa importante de enfermedad y muerte
a nivel nacional. Siendo la tuberculosis en sus diferentes cuadros agudos, una de las más
frecuentes, se presentan tanto en gente joven y anciana, así como en pacientes inmunodeficientes
y a consecuencia principalmente del uso del tabaco.

De los principales agentes bacterianos asociados a neumonías sobresalen en primer

término Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae; bacterias
del tipo anaerobio tienen un papel importante en algunas muestras, por lo que se recomienda la
búsqueda de Chlamydia pneumoniae y Mycoplasma pneumoniae que se asocia con neumonías
atípicas, Francisella tularensis, E.coli, Ps aeruginosa, levaduras del tipo de Candida albicans.

En las condiciones habituales de la clínica diaria, la expectoración no es una muestra

representativa de la situación existente en el tracto respiratorio inferior por su mezcla con
secreciones procedentes de todo el árbol traqueo-bronquial y con la flora saprófita de la
orofaringe. No obstante es un método fácil y rápido cuya utilidad o relación entre resultado
obtenido y verdadera etiología depende en gran medida de su correcta obtención, control de
calidad antes de iniciar su procesamiento, tipo de agente que se pretenda detectar y valoración
adecuada del resultado.
Objetivo

Que el alumno conozca la metodología para el manejo e identificación de los agentes etiológicos
de las vías respiratorias bajas a partir de esputo y otros productos .

Toma de muestra
1.- Enjuagar la boca con agua destilada estéril o solución salina.
2.- Obtener el esputo tras una expectoración profunda, preferentemente matinal.
3.- De no producirse expectoración espontánea, puede inducirse el esputo con nebulizaciones de
suero fisiológico estéril (15 mL durante 10 minutos), siendo útil además realizar un drenaje
postural o fisioterapia respiratoria.

LAVADO O CEPILLADO BRONQUIAL

1. Este tipo de muestras solo son tomadas por un médico en condiciones asépticas.
2. Evitar la contaminación con la flora de la cavidad oral.
3. Se recomienda solo en pacientes hospitalizados con SIDA, Cáncer o enfermedad obstructiva
crónica (EPOC).
4. La muestra se debe procesar de inmediato una vez llegada al laboratorio.
Volumen mínimo

De 2 a 10 mL, si es posible.

Transporte y conservación
Envío inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas). Si no es posible, conservar en
refrigeración 4ºC.

Observaciones

1.- Es preferible realizar la toma antes de instaurar el tratamiento antibiótico.

2.- No es útil para anaerobios.
3.- No son inoculables las secreciones de sospechosa procedencia.
4. - La expectoración debe rechazarse hasta obtener un esputo de calidad suficiente (mas de 25
leucocitos polimorfonucleares por campo 100x, y de 10 células epiteliales por campo 100x).

Material
1. Placas de Agar sangre de carnero.
2. Placas de Agar de Mac Conkey.
3. Placas de Agar Cetrimida.
4. Placas de Agar de Sal y Manitol.
5. Placas de Agar de Thayer Martin.
6. Placas de Agar Levinthal.
7. Placas de gelosa sangre en base Columbia con ácido nalidíxico y colistina.
8. Tubos con medio de Biggy
9. Tubos con medios TSI, UREA, CS, LIA y MIO para pruebas bioquímicas
10. Portaobjetos
11. Cubreobjetos
12. Microscopio
13. Juego de colorantes de Gram.
14. Tinta China
15. Aceite de inmersión
16. Taxos de optoquina y bacitracina de 0.04 U y 10 U
17. Tubos estériles de plástico desechable.
18. Pipetas Pasteur estériles
19. Centrífuga.

Desarrollo
Todas las muestras de cepillado bronquial o de esputo se deben trabajar con las siguientes
medidas de seguridad: Uso de campana de seguridad, guantes desechables, cubrebocas y lentes
protectores o en su defecto mascarillas.

Selección de la muestra
1. La muestra se examina microscópicamente para identificar la presencia de sangre y material
purulento así como el color de la misma.
2. Se toma de la porción más purulenta o con restos de sangre y a partir de esta porción se hace
una tinción de Ziehl-Neelsen, tinción de Gram y el examen en fresco el cual una vez puesto el
cubreobjetos se presiona de tal forma que la muestra se distribuya.
3. Observar todo el porta-objetos para determinar la distribución de las células tipo.
4. Se examina por la óptica de Normarsky. Hay que seleccionar 10 campos representativos y en
ellos se cuentan el número y proporción de leucocitos y de células epiteliales de descamación.
Según los resultados se clasifican de acuerdo a Welch y Kelly
 CLASIFICACIÓN DEL ESPUTO SEGÚN WELCH Y KELLY

Clase de Grupo Células Leucocitos

Welch-Kelly Normansky Epiteliales

I 0 <25 <25
1 >25 <10
2 >25 10-25

II 3 >25 >25

III 4 10-25 >25

5 <10 >25
6 <25 >25

Tomado de: Welch DF.kellMT.J.Clin.Microbiol 1979, 9:520-524

5. Las muestras que sean de clase III serán cultivadas.

6. Las muestras que sean de clase I y II se rechazan, no se deben cultivar.
Nota. Es muy importante indicar el porqué del rechazo de la muestra al médico y solicitar una
nueva muestra y se envía con la siguiente leyenda. “La muestra no fue aceptada para el cultivo
debido a la presencia de más de 25 células epiteliales por campo microscópico (100x).
7. Inocular la porción sobrante del material purulento en los medios de cultivo adecuados por
estría cruzada, no olvidar hacer picadura en las placas de gelosa sangre de carnero para
certificar la hemólisis.
8. Incubar las placas con sangre a 35-37 ºC en atmósfera parcial de CO2.
9. Se identifican las bacterias de acuerdo a su género y especie.

Reporte
1. Proporcionar un informe preliminar después de la observación de los cultivos.
2. La flora normal presente en el cultivo no debe ser identificada ni reportada.
3. Si no se observan microorganismos al término de la incubación y la identificación de los
microorganismos patógenos ya se realizó .se debe enviar el informe final con fecha y firma del
responsable. Se debe informar el cultivo p/e Negativo a búsqueda de S. pyogenes.
4. Si no hay crecimiento después de dos días el informe final es el siguiente: No hubo
crecimiento bacteriano a las 48 h de incubación.
 En el laboratorio se debe contar con pruebas rápidas para la identificación de antígenos que
ayudan al médico para establecer una terapia antimicrobiana adecuada y en el menor tiempo
posible.
En paciente con fibrosis quística o en huéspedes comprometidos es semejante; sin embargo, es
importante reportar todos los microorganismos independientemente la cantidad en que se
encuentra, y es muy importante realizarles el antibiograma aunque el médico no lo solicite.

DIAGRAMA DE TRABAJO

Muestra
(Esputo)

Examen en fresco BAAR

Tinción de Gram

Agar Gelosa Sangre

Agar Gelosa Chocolate
Agar Mac Conkey
Agar Sal y Manitol
Agar Biggy

37 °C /CO2 24 – 48 h

Pruebas de identificación

Cuestionario
1.- ¿Qué características debe tener una muestra de expectoración para poderla procesar?
2.- ¿Qué microorganismos pueden afectar las vías respiratorias bajas?
3.- ¿Cuál es el principal microorganismo que buscamos en una expectoración?
4.- ¿Mencione otras técnicas que se pueden utilizar para identificar a Streptococcus pneumoniae?
5.- ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Ziehl-Neelsen?
 BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA No. 6
BÚSQUEDA E IDENTIFICACIÓN DE
Mycobacterium tuberculosis

Introducción
La tuberculosis en nuestro país, es actualmente uno de los problemas más importantes de salud en
los últimos 5 años y su resurgimiento se da a partir de la epidemia de VIH que ataca a todo el
mundo.
El diagnóstico de las micobacterias se puede realizar en diferentes productos biológicos
como son: esputo, orina, lavado gástrico, raspado laríngeo, lavado o cepillado bronquial, materia
fecal, sangre menstrual, heridas.

Objetivo:
Que el alumno conozca el manejo de las diferentes muestras para el aislamiento de
Mycobacterium tuberculosis

Toma de muestra
Una parte muy importante para un buen resultado es la toma de muestra la cual deben cubrir
algunos requisitos indispensables como son:
1. Calidad de la muestra.
2. Cantidad.
3. Envase estéril y desechable.

EXPECTORACIÓN
1. La muestra debe ser de preferencia la primera de la mañana.
2. La muestra que son enviadas al laboratorio de preferencia se le agrega carbonato de sodio que
tiene la finalidad de disminuir el crecimiento de la flora asociada, y disminuir el mal olor.
3. En caso de niños se puede usar el hisopo laríngeo o nasofaríngeo.
4. No olvidar usar frasco estéril biodegradable de boca ancha.

ORINA

1. Se debe obtener en un frasco estéril y de boca ancha, después de lavado estricto de genitales.
2. Se puede usar orina de 24 h o la primera de la mañana.
3. En este tipo de muestras es posible que el médico lo solicite en forma seriada.

LAVADO GASTRICO
1. Este tipo de muestras solo las efectúa un médico
2. Se utiliza una sonda gástrica estéril y desechable
3. El contenido del lavado gástrico se pone en un frasco estéril
4. Se trabaja el sedimento.
5. Este tipo de muestras se deben trabajar el mismo día que se toman
LAVADO O CEPILLADO BRONQUIAL y PLEURAL.
1. Este tipo de muestras es tomado por el médico en sala de operaciones bajo condiciones de
asepsia.
2. Este tipo de muestras se reciben en un frasco estéril con un volumen de acuerdo al aseo que le
realizaron al paciente.
3. Se deben procesar el mismo día que se reciben.
4. Se trabaja con el sedimento de la misma.

Material que se utiliza para el lavado o cepillado bronquial

HECES
1. Se recibe la muestra en un frasco estéril y desechable.
2. Se prepara una suspensión gruesa de materia fecal y solución salina.
3. Se agrega un volumen igual de éter. Se agita y se centrifuga a 3000 rpm/5 min.
4. Se elimina el sobrenadante.
5. Se utiliza la capa gelatinosa
6. Se realiza la tinción de BAAR.
7. El resto de la materia fecal se trata con NaOH al 4% se siguen los pasos igual que el esputo.

LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO.
1. Este tipo de muestras las obtiene el médico en forma aséptica
2. Se reciben en tubos estériles.
3. Se centrifuga la muestra
4. Del sedimento se realizan las tinciones y se siembra
5. La muestra se debe trabajar en forma inmediata el día que se recibe

TEJIDOS
1. Se recibe en un frasco estéril de boca ancha.
2. Se toman fragmentos de tejidos y se trituran en un mortero estéril
3. Se hacen frotes delgados
4. Las demás muestra se siembra en forma directa.

Material
1. Tubos estériles de tapón de rosca de plástico biodegradable con capacidad de 40 ml guantes
desechables
2. Cubrebocas o en su defecto mascarilla
3. Frascos estériles
4. Agitador vortex
5. Equipo de Ziehl-Neelsen
6. Equipo de Auramina Rodamina
7. NaOH al 4%
8. Pipetas Pasteur estériles
9. Frasco con fenol al 10%
10.Pinzas
11.Tubos con medio de Lowenstein - Jensen
12.Microscopio
13.Aceite de inmersión
14.Portaobjetos.

Desarrollo
BACILOSCOPIA DIRECTA DEL ESPUTO
1. Hacer un frote de la porción purulenta, se puede usar un aplicador de madera.
2. Extender la muestra en forma uniforme.
3. El aplicador se desecha dentro del frasco de la muestra.
4. Se deja secar el frote al aire.
5. Se fija al calor.
6. Se tiñe por la técnica que se tenga para la búsqueda de BAAR.

INTERPRETACION.
El número de bacilos es de suma importancia ya que se relacionan con el grado de infectividad
del paciente. La lectura se realiza como lo muestra el esquema de tal forma que se observa toda la
preparación.

Informe de las baciloscopias para BAAR

No. de bacilos Reporte de Resultados

Negativo No se observan BAAR en 100 campos
De 1 a 9 BAAR Informar el número de bacilos en 100 campos
Positivo + Menos de un bacilo x campo observados en 100 campos
Positivo ++ De 1 a 10 bacilos por campo en promedio en 50 campos observados
Positivo +++ Más de 10 bacilos por campo en 20 campos observados
Tomado de International 4 Union Againts Tuberculosis 1977
CONCENTRACION Y CULTIVO DEL ESPUTO
Dado las características de las muestras es importante seguir estas indicaciones para prepararlas y
poder así sembrarlas en el medio selectivo.

Método de Petroff modificado

1. Se toman 2 mL del esputo y se transfieren a un tubo de tapón de rosca de plástico desechable y
se mezclan con un volumen igual de NaOH al 4% con rojo de fenol.
2. El tubo se agita en un vortex durante 20 seg. Se incuba a 37º C por 15 min.
3. Se centrifuga a 3,000 r.p.m. durante 15 min. (Por ningún motivo se debe abrir la centrifuga si
no se ha detenido completamente).
4. Se decanta cuidadosamente el sobrenadante.
5. El sedimento se neutraliza con HCl 1N o con H2SO4 al 8%. El procedimiento de
neutralización debe ser muy cuidadoso de tal forma que el pH final no sea inferior a 6.5 , ni
superior a 7.2.
6. Se siembra 7 o 8 gotas del sedimento con pipeta Pasteur estéril en dos tubos con medio de
Lowenstein-Jensen.
7. El sedimento se toma con pipeta Pasteur y se hacen dos frotes que se tiñen con los métodos
existentes en el laboratorio para la búsqueda de BAAR puede ser la tinción de Ziehl - Neelsen
o de auramina rodamina.
8. Los tubos se deben incubar a 37ºC ,dejándolos en posición horizontal con la tapa floja durante
24 a 48 hasta que se evapore el inóculo .Posteriormente se ajusta la tapa con fuerza para evitar
que la muestra se evapore , se incuba durante 60 días.
9. Semanalmente se revisan los tubos hasta la octava semana. Sí no hay desarrollo se informa
como negativo. Un cultivo se da como negativo después de 60 días de incubación.
10.Si hay crecimiento, se identifica a M. tuberculosis las características del crecimiento son
masas pequeñas, de superficie mate y consistencia cérea. Tiñe diferentes tonos desde amarillo
muy pálido hasta anaranjado rojizo.
11.Los resultados se informan ya que se haya identificado con las pruebas especiales para el
género y la especie.
TRATAMIENTO DE LA ORINA
1. Se recibe la muestra en un frasco estéril de boca ancha de preferencia la primera orina de la
mañana.
2. Se centrifuga la muestra a 3000 r.p.m. por 30 min.
3. Decantar el sobrenadante y depositarlo en el frasco original, cuidar de limpiar la boca del tubo
con fenol al 10%. Se hace el frote del sedimento.
4. El resto del sedimento se trata con NaOH al 4%, Agregando una cantidad semejante al
sedimento.
5. Se deja 15 min a 37ºC
6. Se siguen los mismos pasos que para la técnica del esputo para sembrar el sedimento con
pipeta Pasteur estéril.
7. Se realiza del sedimento la baciloscopia.
Reporte
En caso de tener BAAR se reportan como se indicó en la tabla, es importante correlacionarlo
con el cultivo.

Cuestionario
1. ¿Importancia médica de Mycobacterium tuberculosis?
2. En la búsqueda de Mycobacterium tuberculosis para su cultivo ¿qué tratamiento debes
darle a la muestra?
3. ¿En qué condiciones debes trabajar a Mycobacterium tuberculosis y por qué?
4. Menciona algún medio selectivo para Mycobacterium tuberculosis, cuánto tiempo
necesita incubarse y qué pruebas necesitas hacer para su identificación.
5. Menciona un método diferente al cultivo convencional para diagnosticar tuberculosis
 BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA No. 7
INFECCIONES OCULARES

Introducción
Las infecciones oculares se manifiestan comúnmente por el constante lagrimeo. Los
microorganismos aislados con mayor frecuencia dependen de la edad del paciente y su localidad.
Considerándose dentro de los pacientes de mayor riesgo a los recién nacidos por las posibles
secuelas irreversibles que pueden originarse en ellos.

Objetivo
Que el alumno conozca la metodología para el manejo de este tipo de muestra e identifique las
bacterias que atacan principalmente este sitio

Toma de muestra cultivo ocular

1.- Indicar al paciente que debe abstenerse de aplicar soluciones antisépticas en ambos ojos.
2.- Con un hisopo mojado en suero fisiológico frotar sobre la conjuntiva.
3.- Identificar de que ojo procede la muestra.
4.- El transporte deberá ser inmediato. Cuando no sea posible, se colocarán los hisopos en medio
de transporte tipo Stuart-Amies, que se mantendrá a temperatura ambiente. Para Chlamydia se
utilizará un medio de transporte específico ("2-SP").
Material
1. Hisopos estériles de alginato de calcio o de dacron.
2. Guantes estériles y desechables,
3. Placas de Gelosa sangre de carnero.
4. Placas de sal y manitol.
5. Placas de agar Mac Conkey.
6. Placas de Thayer -Martin.
7. Placas con medio de Levinthal ó Agar chocolate
8. Placas con Agar DNAsa
9. Tubos con Biggy.
10.Tubos con medios:TSI, LIA, MIO, Citrato y Urea para pruebas bioquímicas
11.. Reactivo de oxidasa.
12.Taxos de optoquina y bacitracina.
13.Equipo para búsqueda de Chlamydia.

Desarrollo
1. La muestra se toma del sito de daño y se siembra en los medios de cultivo indicados.
2. Es importante incubar las placas en las condiciones que requieran.
3. Cualquier crecimiento se le debe efectuar la tinción de Gram.
4. Se identifica el crecimiento según el diagrama.
5. Para búsqueda de Chlamydia se realiza por medio de tinciones o en su defecto por métodos de
inmunofluorescencia.
Reporte
Debido al tipo de muestra es importante reportar cualquier bacteria identificada para su
tratamiento inmediato.
1. Se reporta el resultado teniendo cuidado de indicar de que ojo procede la identificación.
2. Es importante realizar el antibiograma en este tipo de muestra

DIAGRAMA DE TRABAJO

Muestra

Tinción de Gram
Medio de
transporte Stuart
Inocular :
Agar sangre
Agar chocolate
Agar sal y manitol
Agar Mac Conkey
Agar Dextrosa Sabouraud

Pruebas de identificación

Cuestionario
1. Esquematiza la anatomía del ojo.
2. Menciona las diferentes técnicas que se utilizan para la toma de muestra según el
problema que se presenta en el ojo.
3. ¿Qué flora podemos encontrar en el ojo?
4. ¿Cuáles son los principales patógenos que podemos aislar?
5. ¿Qué indicaciones le das al paciente para la toma de muestra?
 BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

Práctica No. 8

INFECCIONES ÓTICAS

Introducción
Dentro de las infecciones que pueden generar complicaciones más frecuentes están la de los
oídos ya sean por su forma crónica o aguda. El cuadro inicial puede asociarse a infecciones
respiratorias mal cuidadas, en niños por la introducción de objetos extraños p/e botones, frijoles
etc.

Objetivo
Que el alumno conozca la metodología para el manejo de este tipo de muestra, e identifique las
bacterias que pueden causar daño en oído

Toma de muestra.
1. Se le indica al paciente que se abstenga de aplicarse gotas de antimicrobianos.
2. Se introduce el hisopo teniendo cuidado de no lastimar, indicando el paciente hasta donde
soporta el hisopo.
3. Se diferencia los tubos del oído derecho e izquierdo.
4. En las infecciones crónicas se limpia el oído con solución de cloruro de benzalconio 1:1000
para eliminar la flora contaminante.
5. Cuando se trata de perforaciones del tímpano debe ser tomada por el otorrinolaringólogo
Material
1. Guantes estériles desechables.
2. Hisopos delgados de alginato de calcio o de dacron.
3. Gasas estériles.
4. Placas de gelosa sangre de carnero.
5. Placas de Sal y Manitol.
6. Placas de Mac Conkey
7. Placas de agar de Levinthal
8. Placas con agar DNAsa
9. Tubos con medios TSI, LIA, MIO, CS y Urea.
10.Taxos de optoquina
11.Taxos con bacitracina.
12.Tubos con Biggy
13.Colorantes de Gram
14.Tubos con O/F con glucosa al 1%
15.Reactivo para catalasa
16.Reactivo para oxidasa.

Desarrollo
Después de la toma de muestra es importante sembrarla en los medios de cultivos indicados y en
forma inmediata. Cualquier crecimiento se le debe efectuar la tinción de Gram y reportarla. La
identificación se realiza en base al diagrama.

Reporte
En el reporte al médico se debe indicar:
1. El resultado por separado de cada oído
2. Como se encontraba este cuando se le tomo la muestra.
3. Si se encontró algún objeto extraño.
4. Es importante realizarle el antibiograma en caso de que el cultivo se encuentre positivo.
5. Sí no se aísla ningún microorganismo se reporta como negativo a las 72 h de incubación.

DIAGRAMA DE TRABAJO

Muestra

Medio de
transporte Stuart
Inocular :
Agar sangre
Agar chocolate
Agar sal y manitol
Agar Mac Conkey
Agar Dextrosa
Sabouraud/Biggy

Pruebas de identificación

Cuestionario
1.- Esquematiza la anatomía del oído.
2.- De las diferentes partes del oído, menciona que flora podemos encontrar en cada una de ellas.
3.- ¿Cuáles son los principales patógenos que puedes encontrar en el oído?
4.- Menciona las diferentes técnicas que utilizas para la toma de muestra .
5.- ¿Qué indicaciones le das al paciente para la toma de muestra de oído?
 BENÉMERITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA No.9
INFECCIONES DEL APARATO GENITAL
(EXUDADO CERVICO VAGINAL, VULVAR Y URETRAL)

Introducción
Las enfermedades de transmisión sexual (ETS) son un problema importante en Salud Pública.
Los principales agentes asociados a las ETS incluyen virus, bacterias, hongos, protozoarios y
ectoparásitos, los cuales están involucrados en varios síndromes, por lo que la participación del
laboratorio en el diagnóstico es relevante. Sin embargo los microrganismos también pueden
introducirse en el aparato genital ya sea instrumentación, es decir, presencia de aparatos extraños
al cuerpo los cuales pueden causar inflamación o irritación y favorecer la infección. Además la
madre puede contagiar al niño durante el embarazo o durante el parto.

En general, la identificación de las bacterias productoras de ETS no siempre es a través de

cultivos, en algunos casos se requiere de técnicas inmunológicas. Como el caso de Treponema
pallidum ya que no existe ningún medio sintético para su aislamiento; o Chlamydia trachomatis
que por ser una bacteria intracelular obligada requiere de células vivas para su multiplicación, de
tinciones especiales o bien técnicas de hibridación para su identificación.

Las infecciones agudas pueden extenderse por continuidad en el aparato genital y originar
secuelas graves en tanto que la infección puede tener características metastásicas y transmitirse
por vía sanguínea a otros órganos y tejidos.

Objetivo
Aprenderá a tomar una muestra de aparato genital y a procesarla en el laboratorio

Desarrollo
Este tipo de muestras requiere de condiciones especiales en cada caso y se deben tomar en
cuenta, las siguientes recomendaciones:
1.- Es importante tomarlas cuando la sintomatología existe y obligatoriamente en los contactos
de la pareja sexual.
2.- El paciente no debe estar en tratamiento antimicrobiano.
3.- Es importante que se cuente con el material adecuado como son. hisopos de alginato de calcio,
de dacrón o tratados con soluciones amortiguadoras.
4.- Este tipo de muestras se deben sembrar en los medios de cultivo adecuados y en forma
inmediata.
5.- En caso de no tener los medios se debe utilizar medios de transporte y crecimiento.
6.- Existen casos de mujeres y en hombres donde es necesario muestrear otros sitios anatómicos,
sobre todo en los pacientes que refieren contacto oro-genital, ano-genital y oro-anal.

Exudado vaginal
1.- Con la paciente en posición ginecológica se introducirá un espéculo "sin lubricante" (si es
necesario para lubricar utilizar agua templada).
2.- Recoger la muestra bajo visión directa, con un hisopo, de la zona con mayor exudado, o en su
defecto, del fondo del saco vaginal posterior e introducirlo a un medio de transporte Stuart-Amies
(figura xx).
3.- Repetir la operación con un segundo hisopo, hacer un extendido sobre un portaobjetos y
colocar el hisopo en un tubo con SSI, para la posterior observación en fresco.
4.- Retirar el espejo y de la secreción que quedó en el espéculo medir pH y hacer la reacción de
aminas con KOH al 10%, se reporta positiva si desprende un olor característico a “pescado” el
cual se debe a aminas volátiles.
5.- Cuando se sospeche la infección por Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis
Mycoplasma hominis o Ureaplasma urealtycum, deberá enviarse muestra endocervical.
6.- Mantener la muestra a temperatura ambiente, o preferentemente, en estufa 35-37ºC hasta su
procesamiento, que deberá ser antes de 3-6 horas.
 Figura .Toma de muestra vaginal

Observación en fresco

Las observaciones en fresco son de gran utilidad sobre todo en mujeres en las cuales existe
secreción vaginal y en el caso de tricomoniasis, vaginosis bacteriana y candidiasis, así como en
la tricomoniasis en pacientes masculinos.

1. La muestra es recolectada en un tubo con solución salina isotónica.

2. Se toma una gota de esta muestra y se coloca en un portaobjetos y se cubre con un
cubreobjetos.
3. Se observa al microscopio en objetivo de 40x y con poca iluminación.
4. Se reporta si se observan Trichomonas vaginalis, levaduras, células clave, leucocitos y
lactobacilos.

Desarrollo
Exudado uretral
1. Limpiar cuidadosamente la mucosa circundante con gasas estériles.
2. Introducir un hisopo uretral fino suavemente con un movimiento de rotación hasta
penetrar unos 2 cm dentro de la uretra (3-5 cm para la investigación de Chlamydia
trachomatis). (figura) 3.- Repetir operación con un segundo hisopo.
3. Un hisopo será destinado al examen microscópico y el otro para al cultivo
4. La muestra deberá procesarse como máximo en un plazo de 6-12 h.
 5. Cuando no haya suficiente exudado, puede estimularse mediante un masaje suave
prostático-vesicular.

Aislamiento

Las muestras se deben sembrar directamente en el medio de cultivo en forma adecuada. En el

caso de Thayer - Martin se debe sembrar en forma de Z con el hisopo proveniente de la toma de
muestra de cérvix y posteriormente se estría con el asa en el laboratorio.
Las placas de agar sangre carnero, de Thayer Martin y de agar chocolate se incuban en atmósfera
parcial de CO2 a 37ºC. Después del tiempo de incubación se deben revisar las placas y es
importante realizarles la tinción de Gram a los crecimientos. De acuerdo al crecimiento se
efectúan las pruebas de identificación como se muestra en el diagrama.

Figura .Toma de muestra uretral

DIAGRAMA DE TRABAJO

Tinción de Gram
Medio de
transporte
Thayer-Martin Stuart
V
Agar Mac Conkey
Agar Sangre de
Carnero Biggy
Neisseria
gonorrhoeae

Agar Chocolate
Enterobacterias
Agar Sangre Candida albicans
Humana

Streptococcus
Gardnerella vaginalis Staphylococcus Identificación
bioquímica

Solución salina
isotónica

Observación en
fresco

Trichomonas
vaginalis
Reporte
En el reporte se deberá informarle al médico lo siguiente:
1.- Edad del paciente.
2.- Sexo.
3.- Tipo de muestra.
4.- Fecha en el que se realizó el estudio
5.- Características del endocervix: si hay úlceras, cantidad de flujo, olor, etc.
6.- pH Vaginal
7.- Tinción de Gram.
8.- Examen en fresco
9.- Resultado del cultivo
10.- Antibiograma (en caso de haberlo realizado)
Búsqueda de Chlamydia trachomatis.
Búsqueda de Treponema pallidum.
Firma del responsable.

Cuestionario
1. ¿Qué indicaciones debes darle al paciente para la toma de muestra cérvico vaginal?
2. ¿Para qué utilizas el tubo con solución salina y otro con medio Stuart?
3. ¿Cuál es la importancia de determinar el pH vaginal?
4. ¿En qué consiste la prueba del KOH y para qué es útil?
5. Menciona cuáles son los microorganismos que podemos encontrar como flora normal en
vagina.
 BENÉMERITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA No. 10
CULTIVO DE HERIDAS

Introducción
Uno de los fenómenos que se observan con más frecuencia en las enfermedades infecciosas es la
formación de un exudado purulento a raíz de la invasión bacteriana de una cavidad, tejido u
órgano del cuerpo. Clínicamente puede ir desde un sencillo o inocuo “grano” hasta uno o varios
abscesos con múltiples bolsas de pus. El exudado está constituido por microorganismos
invasores, leucocitos, principalmente polimorfonucleares y una mezcla de humores orgánicos y
fibrina. En algunos casos, el exudado puede recubrir la superficie del órgano, en otros, el exudado
puede estar tabicado por capas de fibrina y una red de células tisulares (ántrax). Incluso hay casos
en que el exudado proviene de una herida abierta, que por ello suelta líquido espeso o pus.

Uno de los principales problemas de pacientes fracturados, quemados u operados que se

encuentran en unidades hospitalarias son las infecciones que pueden adquirir en estos
nosocomios. En este tipo de infecciones pueden estar involucrados muchas bacterias, hongos y
virus diferentes, además estas infecciones pueden estar involucrados uno o más agentes causales.
Dada la diversidad de agentes etiológicos y la complejidad de estas infecciones, el médico a
menudo describe al microbiólogo el aspecto de la lesión para ayudar en el diagnóstico.

Objetivo
Aprenderá a tomar una muestra de herida y a procesarla en el laboratorio

Desarrollo
Toma de muestra de lesiones en la piel
1. Lavar cuidadosamente la superficie de la herida.
2. Recoger el pus mediante jeringa y aguja, aspirando preferentemente de zonas profundas.
 3. Cuando la muestra sea insuficiente, instilar suero o solución de Ringer lactato y aspirarlo
nuevamente en la jeringa. Para muestras líquidas se recomienda intentar obtener de 1-10
cm³.
4. Cuando los procedimientos anteriores no sean factibles podrá efectuarse un frotis de las
partes profundas de la herida con un hisopo.
5. La muestra se puede enviar en la misma jeringa de la extracción, debidamente
identificada si puede procesarse antes de 2 horas y si no usar medio de transporte.

Toma de muestra de exantemas

1. Aspirar directamente con jeringa y aguja el contenido de las lesiones. Cuando no sea
suficiente, colocar una pequeña cantidad de suero salino estéril y aspirarlo.

Toma de muestra de abscesos cerrados

1. Desinfectar la piel. Limpiar la zona con alcohol, de forma concéntrica comenzando por el
centro. Abarcar una zona de unos 10 cm.
2. Repetir la operación con povidona. En pacientes con hipersensibilidad al iodo, en lugar de
povidona se utilizará alcohol dos veces consecutivas.
3. Dejar secar al menos 1 minuto para que la povidona ejerza su acción antiséptica.
4. Realizar una punción-aspiración del absceso con jeringa y aguja.
5. Introducir una pequeña parte de la muestra en el medio de transporte para anaerobios.
6. Desinfectar la superficie de goma del tapón con povidona e inyectar con la misma jeringa,
parte de la muestra. No deberán utilizarse nunca los medios que hayan adquirido una
coloración azul.
7. Dejar el resto de la muestra en la jeringa y remitirla así, o bien, traspasarla a un
contenedor estéril.

Toma de muestra de fistulas

1. Limpiar cuidadosamente la superficie cutánea con alcohol y luego con povidona. Aspirar
el exudado de la parte profunda de la fístula con jeringa y aguja aproximadamente de 1 a
5 mL.
Procesamiento de la muestra
1. Realizar tinciones de Gram y Ziehl -Neelsen .
2. A partir de la muestra sembrar diferentes medios de cultivo de acuerdo al diagrama
3. En el medio de tioglicolato se eliminará el oxígeno, hirviendo durante 10 min. .
4. Todo el material se incuba a 37ºC durante 24 a 48 h
5. Las placas se deben revisar y a cualquier crecimiento se efectúa la tinción de Gram, se
procede a identificar de acuerdo al género y especie
6. Es importante que en este tipo de muestras se realice el antibiograma.

REPORTE

En este tipo de muestras se debe reportar la tinción de Gram directa lo más pronto posible para
iniciar tratamiento.

Se reporta el crecimiento como positivo en caso de cualquier crecimiento y negativo cuando no

existe crecimiento.
DIAGRAMA DE TRABAJO

Muestra

Hisopo Jeringa

Tinción de
Gram

Tioglicolato
Agar Mac Conkey
Agar Sangre de Carnero
Agar Chocolate
Agar Sal y Manitol Anaerobios
Agar Biggy

Pruebas de identificación
Cuestionario
1. ¿De qué microorganismos se encuentra constituida la flora normal de piel?
2. Menciona las diversas maneras en que podemos causarnos una herida y qué probables
microorganismos podríamos aislar.
3. Escribe los pasos a seguir para la toma de una muestra de una herida infectada.
4. ¿En qué casos es recomendable el cultivo de un tejido y cuál es el método utilizado?
5. En la búsqueda de anaerobios ¿qué microorganismos buscarías y que medios utilizarías
para su cultivo?
 BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA No. 11
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES MENÍNGEAS
CULTIVO DE LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)

Introducción
Aunque desde hace mucho tiempo se daba por hecho que la función primordial del líquido
cefalorraquídeo (LCR) era la de protección del sistema nervioso central (SNC) y la regulación de
su volumen, en 1926 Cushing propuso la idea de que el LCR representaba la “tercera
circulación”. Desde entonces se ha confirmado y ampliado su proposición.
Cushing plantea que el LCR constituye por sí mismo el medio interno del SNC, ya que lo
provee de la matriz acuosa de los componentes exactamente necesarios para su adecuado
funcionamiento, por otro lado, actúa como linfa cerebral ya que su continua circulación permite
la remoción permanente de materiales nocivos y de desecho.
Aún más recientemente, se ha comprobado el papel que juega el LCR en el transporte a
través del encéfalo mediante diversas moléculas activas como hormonas y aminas de acción
neutral.
Dentro de las patologías que más comúnmente se presentan a este nivel está la meningitis,
que es la inflamación de las membranas que recubren el SNC, es decir, las delgadas membranas
que cubren totalmente al cerebro y la médula espinal y una de sus causas puede ser por infección,
básicamente debido a que los microorganismos responsables de esta forma clínica pueden
alcanzar al SNC a través de la vía hematógena (bacteriemia o septicemia) o invadir directamente
el cerebro (otitis, fracturas de cráneo, etc.).
El diagnóstico del SNC se apoya en el examen integral del LCR en esta tarea, tanto el
médico como el químico son responsables de la utilidad del examen. El médico desde la toma de
la muestra, la medición de la presión intracerebral, entre otras y el químico como realizador
directo de los análisis citoquímicos y microbiológicos del LCR.

Objetivo
El alumno conocerá la metodología a seguir para la realización del cultivo del LCR.

Material
1. Placas con gelosa sangre de carnero.
2. Placas con agar de Mac Conkey ,
3. Placas con Agar de Sal y Manitol
4. Placas con Medio de Thayer- Martin (sin inhibidor).
5. Tubos con medio de Lowenstein-Jensen
6. Tubos con TSI, LIA, MIO, Citrato. Urea para pruebas bioquímicas
7. Tubos con base de CTA conteniendo glucosa, sacarosa, maltosa, fructuosa al 1%.
8. Portaobjetos.
9. Cubreobjetos.
10.Aceite de Inmersión.
11.Tinta china (Marca Pelikan)
12.Equipo de tinción de Gram
13.Taxos de bacitracina y optoquina.
14.Reactivo de Kovacs.
15.Pipetas Pasteur estéril.
16.Centrífuga.

Metodología
Toma de muestra
El LCR se obtendrá antes de instaurar cualquier terapéutica antibiótica.
LCR obtenido por punción lumbar:
1. Se localiza la zona elegida para la punción lumbar mediante palpación de los espacios
intervertebrales una vez colocado el paciente en la posición adecuada.
 2. Se desinfecta con alcohol al 70% una zona de 10 cm de diámetro en el área elegida, la
aplicación del desinfectante se hace de forma concéntrica del centro a la periferia. Se
repite la operación con povidona yodada que se deja secar durante un minuto.
3. Realizar la punción entre los espacios intervertebrales L3-L4, LA-L5 o L5-S1, siguiendo
las normas de la más estricta asepsia (ver fig.9).
4. Al llegar al espacio subaracnoideo retirar el estilete y dejar salir libremente el líquido
cefalorraquídeo que se recogerá en tres tubos sin conservantes con tapón de rosca.
Generalmente el primer tubo para el estudio bioquímico, el segundo para el estudio
microbiológico y el tercero para investigación de células (este suele ser el más transparente
aunque la punción haya sido traumática). No obstante, el tubo más turbio se enviará a
Microbiología.

Fig. 9. Toma de muestra de LCR

Volumen mínimo
1. Para el estudio bacteriológico rutinario es suficiente 1 mL, aunque es preferible disponer
de volúmenes superiores.
2. Para hongos o micobacterias se necesitan al menos 2 mL adicionales más por cada uno de
los estudios, siendo deseable llegar a los 10 mL.
3. Para estudio de virus se necesita al menos 1 o 2 mL más.

Transporte
El producto debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues alguno de los agentes etiológicos
como S. pneumoniae, pueden lisarse rápidamente a partir de una hora tras su recogida. Si no es
posible se mantendrá en estufa a 35-37ºC y una parte se incubará en un frasco de hemocultivo
que se mantendrá en idénticas condiciones hasta su procesamiento en el laboratorio. Si no se
dispone de estufas se mantendrá a temperatura ambiente. Nunca deberá refrigerarse pues se
puede afectar la viabilidad de N. meningitidis y H. influenzae.
En el LCR no se estudian rutinariamente anaerobios. En caso de solicitar una
investigación se enviará en un medio de transporte de líquidos para estudio de anaerobios o en
hemocultivo de anaerobios.
Las muestras para el estudio de virus se enviarán en hielo, si el envío se retrasa más de 24
horas, se deberá de conservar a -70ºC.

Observaciones
Como la meningitis suele surgir por un proceso bacterémico se solicitarán simultáneamente
hemocultivos, pudiendo ser así mismo estudiadas las posibles lesiones metastásicas cutáneas.
Es necesario que el médico señale claramente las investigaciones solicitadas (bacterias
habituales, micobacterias, anaerobios, hongos o virus).

Diagrama de trabajo

LCR

Centrifugar 10-20 min.

1000-1500 r.p.m.

Sedimento Tinciones

Agar Mac Conkey

Agar Gelosa Sangre
Agar Gelosa Chocolate
Agar Sal y Manitol
Agar Biggy
Agar Lowenstein-Jensen

Pruebas de identificación
Cuestionario
1. Describe las características físicas y químicas de un LCR normal.
2. ¿Cuáles son los valores del LCR en caso de existir alguna alteración dependiendo del
microorganismo presente?
3. Indica las tinciones que se le pueden realizar al LCR para su pronto diagnóstico.
4. ¿Qué técnicas se utilizan para el cultivo del LCR?
5. ¿Cuáles son los principales patógenos que puedes encontrar en el LCR?
 BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA No. 12
HEMOCULTIVO
Introducción
El cultivo de sangre o hemocultivo es uno de los estudios más solicitados en el laboratorio clínico
ya que de alguna manera apoya el diagnóstico de las infecciones sistémicas que presentan en su
evolución una etapa de bacteriemia o septicemia.
La presencia de microorganismos en la sangre refleja una infección activa y diseminada
en los tejidos. Esta situación puede originarse por:
a) BACTERIEMIA: Es un término que denota la presencia de bacterias en sangre, este
puede ser transitorio como un resultado de un fenómeno común como por ejemplo el
cepillarse los dientes, en la evolución de algunas enfermedades, en infecciones de vías
urinarias o en infecciones de heridas. La bacteriemia persistente o recurrente, es la
presencia continua de una bacteria en la sangre e implica un fenómeno, que en algunas
enfermedades da manifestaciones clínicas.
b) SEPTICEMIA: Se caracteriza por la presencia de bacterias en sangre y tejidos
acompañado por ataque al estado general, las bacterias se están multiplicando en forma
activa y liberando toxinas, originando manifestaciones clínicas de diversa magnitud (local
o sistémica).
c) PIEMIA: Formación de diversos abscesos de tipo purulento de origen bacteriano.

En pacientes inmunocomprometidos como son recién nacidos, personas de la tercera edad,

así como inmunosuprimidos se pueden presentar focos sépticos y poner en peligro su vida.
 Una de las características de este tipo de infecciones es la aparición de un cuadro febril en
el huésped acompañado como consecuencia de la liberación del pirógeno endógeno por los
fagocitos, posterior a la ingestión de material tóxico, endotoxinas, productos de degradación
tisular, pirógeno exógeno.

Objetivos
1. El alumno aprenderá los pasos a seguir para realizar la toma de muestra de la sangre.
2. El alumno conocerá los diferentes medios de cultivo utilizados para realizar un
hemocultivo.
3. El alumno desarrollará el procedimiento para llevar a cabo un hemocultivo, así como el
aislamiento e identificación del patógeno.

Material
1. Medio bifásico Ruiz Castañeda (frasco para hemocultivo)
2. Jeringas estériles y desechables de 5 o 10 mL
3. Agujas estériles calibre 21.
4. Torniquete y torundas con alcohol
5. Frasco con tintura de Iodo
6. Equipo de tinción de Gram
7. Placas de gelosa sangre de carnero
8. Placas de agar de Mac Conkey
9. Placas de Sal y Manitol.
10.Placas de Thayer- Martin.
11.Pruebas bioquímicas: TSI , MIO , LIA, citrato y urea
12.Microscopio.
13.Sensidiscos de Bacitracina y Optoquina.
14.Taxos de oxidasa

Metodología
Toma de muestra y transporte
Este tipo de muestra está indicado en casos de fiebre, hipotermia, sensación de enfriamiento,
escalosfríos, postración, hipotensión, fiebre prolongada e intermitente con soplo cardiaco
perceptible. Es importante la toma de muestra cuando el paciente se encuentra al inicio del
periodo febril, antes de llegar al pico. El número e intervalos de los cultivos dependen del cuadro
clínico del paciente así como de su gravedad.
Es importante saber el tipo de frasco para Hemocultivo que se puede actualmente usar ya
que muchas de ellas contienen sustancia que anulan la acción de los antimicrobianos así como el
complemento y la fagocitosis.
Puede usarse médula ósea lo que aumentaría las posibilidades de obtener un buen diagnóstico.
1. Se selecciona el sitio de toma de muestra, debe evitarse tomar muestras de catéter
intraarteriales o intravenosos permanentes a menos que la sangre no pueda obtenerse por
venopunción.
2. El sitio de venopunción debe limpiarse vigorosamente con torundas impregnadas de etanol al
70% o con tintura de iodo en alcohol.
3. Hay que esperar que seque sin soplar.
4. Por ningún motivo se debe tocar el sitio después de que fue desinfectado.
5. Los frascos para hemocultivo o tubos de cultivo se deben limpiar del tapón con alcohol-iodo.
6. Se inserta la aguja en la vena y se extrae la sangre, el volumen depende de la edad y marca de
la botella usada. El volumen recomendado es: Niños de 1 a 3 mL, adultos de 5 ml en adelante.
7. Una vez tomada la sangre, se inyecta a la botella con una aguja nueva. Se debe mezclar bien
en forma homogénea para evitar que se coagule.
8. La botella inoculada se mantiene horizontalmente con la parte sólida hacia abajo durante 20
minutos.
9. Se incuba la botella a 37ºC durante 6 semanas. En forma vertical.
Fig. Toma de muestra sanguínea

Actualmente existen diversas opciones para cultivar la sangre estas pueden ser:

Hemocultivo líquido
1. Se toma la muestra como se indicó anteriormente, se le añade suficiente volumen de tal
manera que alcance una proporción de 1:10 de sangre a medio.
2. Se incuba a 37ºC en condiciones aerobias.
3. Se hace una inspección de las botellas cuando menos una vez al día durante 3 días y luego 2 a
3 veces por semana hasta completar 21 días.

Botella de Cultivo Bifásico.

Se emplea la botella de Ruíz Castañeda modificada o medios bifásicos comerciales. (Ver Fig. 10)
1. Se toma la muestra de sangre como se indicó anteriormente.
2. Se inocula la sangre en la botella e incubar a 37ºC durante 7 días o dejar hasta 45 días en caso
que se sospeche de Brucella.
3. Incubar en atmósfera de CO2 al 5 - 10%.
4. Se inspeccionan los frascos a diario y se buscan colonias en la superficie del medio como
señal de un cultivo positivo.
5. En caso de cultivo positivo hay que realizar la tinción de Gram.
6. Se realizan las resiembras en los medios indicados.
7. En ausencia de crecimiento visible se efectúan resiembras a las 48 h, y luego cada semana
hasta completar los 21 días, aunque puede continuar por 45 días, y sólo después de este tiempo
se puede descartar y considerar negativo.

Botellas Bactec Botellas BacT/Alert

Fig. 10
Método de Lisis
1. Se toman los tubos que contienen sustancias hemolizantes.
2. Se concentran los microorganismos por centrifugación a 3000 rpm durante 30 min.
3. Se inocula el sedimento en las diferentes placas de cultivo.

Método de Fluorescencia
1. Se toma la muestra como se indicó anteriormente.
2. Se inoculan las botellas de acuerdo al tipo de paciente, este tipo de botellas tiene medios de
cultivo para bacterias aerobias, anaerobias y hongos., están adicionados de resina cuyo
objetivo principal es capturar él o los antimicrobianos que pueden estar presentes en la
muestra.
3. Se incuban en un aparato especial (Bactec 9050) que se mantiene a 37ºC y rotando
suavemente.
4. En cuanto se presenta desarrollo bacteriano, el equipo cuenta con un sensor de fluorescencia
la que se va aumentando por el incremento de CO2 producido por el propio metabolismo
bacteriano; esto lo realiza cada 10 min. Una alarma avisa al químico, la posición de la botella
con producción de CO2.
5. Se realizan las resiembras en los medios ya descritos.

Reporte
Es poco frecuente encontrarse dos o más especies bacterianas diferentes en un cultivo de sangre,
en la mayoría de los casos se trata de alguna contaminación y esto sucede principalmente por una
mala toma de muestra.
Sí no hay crecimiento a los 45 días, hay que dar como negativo el cultivo y se desecha la botella.
En el caso de haber crecimiento se identifica al agente etiológico con las pruebas requeridas por
el mismo.
Es importante mantener informado al médico cómo va el Hemocultivo de sus pacientes,
principalmente si se encuentran en salas de terapia intensiva.
DIAGRAMA DE TRABAJO

Sangre

Botella para hemocultivo

Incubar 37°C/ 15-20 días o más

Tinción de
Gram

Agar Mac Conkey

Agar Sangre
Agar Chocolate
Agar Sal y Manitol
Agar Biggy
Agar Lowestein-Jensen

Pruebas de identificación

Cuestionario
1. Menciona otra técnica para la toma de muestra de sangre para su cultivo.
2. ¿Por qué es importante tomar la muestra de sangre en el pico febril?
3. ¿Sería normal encontrar dos o más bacterias en un hemocultivo?
4. ¿Por qué se recomienda cultivar la sangre en un medio bifásico y en qué consiste éste?
5. El aislamiento de Staphylococcus epidermidis en un hemocultivo, ¿sería clínicamente
importante?
BIBLIOGRAFÍA

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