You are on page 1of 5

PRÁCTICA

03

Contenido y Estado de Oxidación


del Hierro en la Ferritina

Química Biológica
Grado en Química

Facultad de Ciencias. UNIVERSIDAD DE CÁDIZ


2 Contenido y Estado de Oxidación del Hierro en la
Ferritina

1.- Introducción teórica

El hierro es un elemento esencial para los organismos vivos, pero en


exceso es altamente tóxico. Los organismos vivos almacenan hierro para
abastecerse de una concentración adecuada, y al mismo tiempo para
protegerse frente a los efectos tóxicos por un exceso de hierro. La ferritina
constituye la principal forma de almacenamiento intracelular de hierro. La
ferritina es el “buffer” contra la deficiencia de este elemento: cuando el
contenido de hierro en sangre es bajo la ferritina puede liberar hierro
aumentando su concentración; si el contenido en sangre y tejidos del
cuerpo es muy elevado, la ferritina puede ayudar a almacenar ese hierro
que se encuentra en exceso.
La estructura de la ferritina consiste en una corteza proteica esférica
(apoferritina) compuesta por 24 subunidades de cadenas polipeptídicas (L
ligera o de menor masa y H pesada, con mayor masa) que originan una
cavidad hidrofílica con diámetro interno y externo de 8 y 12 nm
respectivamente. La disposición de las multisubunidades en la corteza
proteica genera la formación de canales, que conectan el exterior con la
cavidad. Concretamente 8 canales hidrofílicos de 4-5 Ǻ, parecen ser la
puerta de entrada-salida para difundir H2O, cationes metálicos y moléculas
hidrofílicas
¿Cómo almacena hierro la ferritina?
El Fe2+ es oxidado en los canales hidrofílicos y transportado hacia el
interior de la ferritina depositándose como un mineral de hierro que,
tradicionalmente se ha descrito como ferrihidrita, el cual se liga a la pared
interna de la esfera. Se pueden almacenar hasta 4500 átomos de hierro
aunque el valor normal suele ser de 2000 átomos.
¿Cómo libera el hierro la ferritina?
Se han propuesto dos modelos, no exclusivos, para la liberación de
hierro in vivo: reducción seguida de la movilización de Fe(II) o
complejación directa de Fe(III). El primero ha sido el estudiado más
exhaustivamente y considerado tradicionalmente como el mecanismo real.
Un problema por resolver aún es el conocer cuál es la estructura del
núcleo metálico de la ferritina. ¿Realmente es ferrihidrita o es una mezcla
de óxidos de hierro (uno de ellos ferrihidrita)? ¿Cuál es el proceso real de
eliminación del hierro in vivo?

2.-Procedimiento experimental de obtención de apoferritina por reducción


con ácido tioglicólico. Seguimiento por UV-vis de la eliminación de Fe(II) por
complejación con 2,2’bipiridilo. Ensayos cualitativos.

Apartado A:
El mineral de hierro (Fe3+) encapsulado en la ferritina puede ser eliminado
mediante reducción con ácido tioglicólico, lo que provoca una descomposición del
mineral de hierro y la consiguiente salida de Fe2+ de la apoferritina. Si la reacción
Contenido y Estado de Oxidación del Hierro en 3
la Ferritina

se lleva a cabo en presencia de 2,2’-bipiridilo, este Fe2+ va formando gradualmente


el complejo [Fe(Bipy)3]2+, de color rosa intenso . La formación del complejo puede
seguirse mediante espectroscopía visible.

Para ello, a 1ml de una disolución de ferritina de concentración 0.015mg/ml se le


añaden unos granos de 2,2’bipiridilo y 2ml de ácido tioglicólico (HS-CH2-
COOH)/acetato sódico. La mezcla se pasa inmediatamente a una cubeta de UV-
visible para hacer un estudio de la evolución de su espectro con el tiempo a 36.5 ̊C
(seguir las instrucciones del profesor respecto a la utilización del
espectrofotómetro). El espectrofotómetro que se empleará será un Cary 50 y los
espectros se registrarán entre 300 y 650 nm. La referencia a utilizar para la
adquisición de los espectros será una disolución análoga a la de medida en la que
en vez de añadir 2ml de ácido tioglicólico, se le añaden 2ml de NaCl 0.15M.

La cubeta anterior se mantendrá en el espectrofotómetro al menos durante 90


minutos. Durante ese tiempo, se realizarán los ensayos cualitativos que se indican
más adelante (apartado B). Una vez finalizado el registro de los espectros en
función del tiempo se dispondrá de un fichero de datos que se puede utilizar para
obtener información tanto sobre la cantidad de hierro liberado como sobre la
cinética del proceso de liberación. Para ello, debe tenerse en cuenta que el máximo
de absorbancia está en 520nm, y el valor de la absorbancia a esta longitud de
onda junto al valor de є520[Fe(Bipy)3]2+= 8158 nos permite conocer la concentración
4 Contenido y Estado de Oxidación del Hierro en la
Ferritina

de Fe(II) liberado a través de la ley de Beer-Lambert. Si el fichero obtenido no muestra


que haya acabado la formación del complejo Fe2+-bipy, deberá realizarse una
extrapolación de los datos para obtener el valor de la absorbancia. Dicha extrapolación
puede hacerse de manera más adecuada realizando un ajuste de los datos de absorbancia
en el máximo frente al tiempo. Para ello se usará la ecuación Dt= D∞+(D0-D∞)e-kt que
permite obtener el valor de la absorbancia final (D∞) y la constante de velocidad k. El
número de átomos de hierro por molécula de ferritina podría estimarse si se acepta
que según los datos disponibles en la bibliografía la fórmula molecular del núcleo de
hierro es [FeO(OH)]8[FeO(H2PO4)], con un peso molecular de 879.9g/mol (por cada
mol de Fe(III) el peso molecular del núcleo es 97.7g), y que el peso molecular de la
apoferritina es de 474000g/mol.

Apartado B:
Se realizarán los siguientes ensayos cualitativos para relacionar las observaciones
realizadas con las afirmaciones más aceptadas en la bibliografía sobre el estado de
oxidación III del Fe en la ferritina y su salida sólo como Fe(II) a su paso por los canales
que conectan al exterior la cavidad.

Se pone en una cubeta 0.5 ml de la disolución de ferritina 0.015mg/ml y 0.5 ml de


una disolución de KSCN 0.01M. Se completa hasta 3ml con H2O destilada. Se
registra el espectro UV-vis.

En otra cubeta se ponen 0.5 ml de una disolución de FeCl3 0.01M (Esta disolución
se prepara en medio ácido añadiendo unos mililitros de HCl comercial) y 0.5 ml de
la disolución de KSCN. Se completa hasta 3ml con H2O destilada. Se registra el
espectro UV-vis.

3.- Reactivos y otros productos químicos empleados:

• Ferritina de bazo de caballo Aldrich 44mg/ml . Se preparan 100ml de


una stock aprox. 0.15 mg/ml y por dilución una 0.015mg/ml ( se anota el
valor exacto de la concentración final). Estas disoluciones se preparan en
NaCl 0.15M.
• 100 ml de ácido tioglicólico 0.2M/acetato sódico 0.1M
• 2,2’-bipiridilo
• 100 ml FeCl3 0.01 M (se añaden 2 ml HCl en su preparación)
• 100 ml KSCN 0.01 M
Observación: Pregunte al profesor que disoluciones tiene que preparar,
pues debido a las pequeñas cantidades que hay que emplear, se pueden
compartir las disoluciones con otros compañeros.
Contenido y Estado de Oxidación del Hierro en 5
la Ferritina

4.- Material:

 2 Vasos de precipitados de 100 mL


 1 Pipeta de 1 ml y pipeteador
 1 Pipeta de 5 ml y pipeteador
 Varilla de vidrio para agitar
 1 Frasco lavador
 2 Matraces aforados de 100 ml
 1 Frasco lavador
 Pipetas Pasteur
 Espátula
 3 cubetas de plástico

Común:

 Un matraz de 500 ml
 Una pipeta de 10 ml y pipeteador

5.- Cuestiones sobre la práctica

a) Indique la longitud de onda del máximo de absorbancia y el valor de esta.


b) Calcule la concentración de Fe(II) liberado de la ferritina en la cubeta de
medida.
c) Calcule la constante de velocidad para la aparición del complejo de Fe2+ con
Bipy.
d) Calcule el número de átomos de Fe(III) por molécula de ferritina.
e) Sabiendo que el complejo de Fe3+ con SCN- es de color rojizo con un λmáx a
460 nm, intente dar una explicación a las observaciones realizadas en los
ensayos cualitativos teniendo en cuenta que en las dos cubetas tiene Fe3+.