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REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN Y SU

RECONOCIMIENTO POR MEDIO DE CROMATOGRAFIA


EN PAPEL

INTRODUCCION 5µL
𝑋 20𝜇𝑚𝑜𝑙 = 𝟎. 𝟏𝝁𝒎𝒐𝒍 𝒂. 𝒈𝒍𝒖𝒕á𝒎𝒊𝒄𝒐
1000 µ𝐿
La reacción de transaminación implica el paso reversible
de un grupo alfa amino de un aminoácido, al carbono 10 µL
alfa de un alfa-ceto ácido. Las enzimas que catalizan
esta reacción se denominan aminotransferasas o 10µL
transaminasas y utilizan al fosfato de piridoxal como 𝑋 20𝜇𝑚𝑜𝑙 = 𝟎. 𝟐𝝁𝒎𝒐𝒍 𝒂. 𝒈𝒍𝒖𝒕á𝒎𝒊𝒄𝒐
1000 µ𝐿
cofactor. Son enzimas ampliamente distribuidas en
numerosos tejidos y se localizan en la mitocondria y en 15 µL
el citosol.
15µL
La función de las transaminasas es la de recoger los 𝑋 20𝜇𝑚𝑜𝑙 = 𝟎. 𝟑𝝁𝒎𝒐𝒍 𝒂. 𝒈𝒍𝒖𝒕á𝒎𝒊𝒄𝒐
1000 µ𝐿
grupos alfa amino de la mayoría de los aminoácidos en
un solo aminoácido, el ácido glutámico, por lo que la
20 µL
mayoría de estas enzimas utilizan al alfa-cetoglutarato
como aceptor de los grupos amino. Algunas de las
20µL
transaminasas más importantes, son: la alanina 𝑋 20𝜇𝑚𝑜𝑙 = 𝟎. 𝟒𝝁𝒎𝒐𝒍 𝒂. 𝒈𝒍𝒖𝒕á𝒎𝒊𝒄𝒐
transaminasa-glutámico-pirúvica (TGP) y la aspártico 1000 µ𝐿
transaminasa-glutámico-oxalacetica (TGO). La determi-
nación de la actividad de estas transaminasas en el 25 µL
suero sanguíneo constituye un procedimiento de
diagnóstico importante en medicina, utilizado para 25µL
𝑋 20𝜇𝑚𝑜𝑙 = 𝟎. 𝟓𝝁𝒎𝒐𝒍 𝒂. 𝒈𝒍𝒖𝒕á𝒎𝒊𝒄𝒐
determinar la gravedad de los ataques cardiacos y 1000 µ𝐿
vigilar la recuperación del paciente, así como para poner
de manifiesto los efectos tóxicos de algunos productos µL A. Glutámico Absorbancia µmoles
químicos 5 -0.003 0.1
10 0.025 0.2
OBJETIVOS 15 0.071 0.3
20 0.103 0.4
Cuantificar la actividad de la transaminasa ALAT/TGP 25 0.180 0.5
presente en un extracto crudo de hígado empleando, un Testigo -0.006 0.11
método cromatográfico y otro espectrofotométrico. Problema 0.193 0.56

RESULTADOS
0.2
y = 0.444x - 0.058
µL A. Glutámico Sustancia Solvente Rf
5 29.2 49.5 0.589 0.15
10 28.8 49.5 0.581
ABSORBANCIA

15 28.7 49.5 0.579 0.1


20 29.2 49.5 0.589
25 29.2 49.5 0.589
Testigo ----- 49.5 ------ 0.05
Problema 21.9 49.5 0.442
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Calculo µmoles de ácido glutámico
-0.05
ΜMOLES A. GLÚTAMICO
5 µL
Gráfica 1: Absorbancia vs µmoles de ácido glutámico

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Calculo de los µmoles reales decir que se obtuvo ácido glutámico, en cambio la
mancha de nuestro testigo no se encontraba a una
µmoles reales = µmoles P - µmoles T distancia cercana a la del ácido glutámico, y esto es
correcto ya que cuando preparamos los tubos, al testigo
µmoles reales = 0.56 – 0.11 = 0.45 µmoles no se le adiciono ácido alfa-cetogluratico y por lo tanto la
reacción no nos daría ácido glutámico. También se
observan otras manchas de nuestro problema y testigo
Calculo de UAT a la misma distancia que la mancha de la solución de
alanina.
[ µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑔𝑙𝑢𝑡á𝑚𝑖𝑐𝑜]
UAT =
𝑔𝑟 ℎí𝑔𝑎𝑑𝑜 𝑋 1 ℎ𝑜𝑟𝑎 Posteriormente, se recortaron las manchas correspo-
ndientes a ácido glutámico en el cromatograma, se
[ 0.45 µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠] colocaron en tubos se ensaye y se les adiciono 1 mL de
UAT = = 10 butanol al 1%, se calentaron los tubos a 80°C por dos
(0.045 𝑔) (1 ℎ𝑜𝑟𝑎)
minutos, se enfriaron en un baño de hielo y se les
agrego 5 mL de acetona, por último se leyeron en el
DISCUSIONES espectrofotómetro los tubos, y se construyó la curva tipo
Al inicio del experimento, se prepararon 2 tubos, los con las absorbancias los tubos de 5, 10, 15, 20 y 25 µL
cuales serían el testigo y el problema, a ambos se les y con sus posteriores µmoles. Se obtuvieron con ayuda
adiciono 1 mL de preparación de transaminasa, 1 mL de la gráfica los µmoles de ácido glutámico para el
de regulador de fosfatos, 0.5 mL de alanina, se problema, que fue de 0.56 µmoles.
preincubaron los tubos a 37°C por 5 minutos.
Posteriormente se le adiciono al tubo testigo 0.5 mL de
agua y al tubo problema se le adiciono 0.5 mL de ácido CONCLUSIONES
alfa-cetogluratico, al tubo testigo no se le adiciono este
reactivo, por lo tanto se espera observar la reacción de  Se obtuvo acido glutámico a partir de la reacción
transaminación en el tubo problema y en el tubo testigo de transaminación entre la alanina y el α
no. Después se incubaron los tubos a 37°C durante 1 cetoglutarato.
hora con agitación, al finalizar la incubación se adiciono  Se pudo observar la reacción de transaminación
a ambos tubos 4 mL de alcohol 96°, al adicionar este debido a la obtención de transaminasa.
reactivo se detiene la reacción, ya que cambiamos la
constante dieléctrica y la enzima precipitar. Por último BIBLIOGRAFÍA
se centrifugaron los tubos 10 minutos a 2500 rpm, los
sobrenadantes se transfirieron a vasos de precipitados y
se calentaron casi a sequedad, posteriormente las 1. E. Conn Eric, “Bioquímica fundamental”,
muestras se disolvieron con 1mL de agua destilada. Universidad de California, Editorial Limusa, 2001,
México D.F.
Posteriormente se realizó la cromatografía en papel, se 2. Voet Donald, “Fundamentos de Bioquímica”,
colocaron en el cromatograma 8 puntos equidistantes, Editorial Médica Panamericana, 2ª Edición, 2007,
en los primeros 5 puntos se colocaron 5, 10, 15, 20 y 25 Madrid, España.
µL respectivamente de una solución de ácido glutámico
(con estos posteriormente se construyó la curva tipo), en
los puntos 6 y 7 se colocó 60 µL de la solución testigo y
problema respectivamente, por ultimo al punto 8 se le
coloco 5 µL de solución de alanina. Más tarde el
cromatograma se saturo durante 2 horas con el
disolvente etanol:metanol:agua:urea, se dejó desarrollar
cromatograma durante 18 horas aproximadamente. Al
sacar el cromatograma se calentó en la estufa a 70°C
hasta evaporar el disolvente. Posteriormente se revelo
el cromatograma por aspersión de una solución de
ninhidrina en etanol. Se observaron en el cromatograma
la formación de manchas color morado que se
encontraban a una distancia muy similar en el
cromatograma, estas manchas corresponden al acido
glutámico, y observamos que nuestra mancha problema
si se encontraba a la una distancia muy similar a la de
las aplicación del ácido glutámico, por lo tanto podemos
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