SELECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS EN

PLASTOMAS DERIVADOS DEL GEN MUTADOR DE CLOROPLASTOS DE CEBADA.

Alejandra Landau; María José Diéguez; Noemí Colombo; Alberto R. Prina.
Instituto de Genética “Ewald A. Favret”, CNIA, INTA, Castelar, Argentina. E-mail: igenet@cnia.inta.gov.ar

INTRODUCCIÓN Fig 1.- Secuencia del gen 16S rRNA de arroz (Oryza sativa) Fig 2.- Secuencia del extremo 3’ del gen rps 12 de cebada (Hordeum
vulgare).
El genoma del cloroplasto (plastoma) es portador de genes de gran interés económico y presenta, por otro lado, numerosas ventajas como
91251 ATCCGCTTTG TCTACGAATA AGGAAGCTAT AAGTAATGCA ACTATGAATC
blanco para la transformación genética en cuanto a los niveles de expresión alcanzados, a que no hay detectados casos de silenciamiento, a la 961 CGGTTCTGTA AAGGGACAGT AAGGGTGACT TATCTGTCGA CTTTTCCACT ATCAACCCCA
91301 TCATGGAGAG TTCGATCCTG GCTCAGGATG AACGCTGGCG GCATGCTTAA
bioseguridad debido a su herencia materna en numerosas de las plantas cultivadas y a la posibilidad del reemplazo génico y el uso de
1021 AAAAACCCAA CTCTGCCTTA CGTAAAGTTG CCAGAGTACG ATTAACCTCT GGATTTGAAA
transcriptos policistrónicos. Previamente, se describió un genotipo mutador de cloroplastos en cebada que produciría una explosión de 91351 CACATGCAAG TCGAACGGGA AGTGGTGTTT CCAGTGGCGA ACGGGTGAGT

variabilidad genética en el genoma altamente conservativo del cloroplasto (Prina 1992). A partir de este material se seleccionaron mutantes 91401 AACGCGTAAG AACCTGCCCT TGGGAGGGGA ACAACAACTG GAAACGGTTG 1081 TCACTGCTTA TATACCTGGT ATTGGCCATA ATTTACAAGA ACATTCTGTA GTATTAGTAA

clorofílicas de herencia materna que han mostrado tener diferentes grados de estabilidad genética y algunas de las cuales se caracterizan 91451 CTAATACCCC GTAGGCTGAG GAGCAAAAGG AGAAATCCGC CCAAGGAGGG
por tener expresión termosensible, temporal y/o tejido-específica (Prina 1996). 91501 GCTCGCGTCT GATTAGCTAG TTGGTGAGGC AATAGCTTAC CAAGGCGATG (170 bp)
Para estudiar en forma más amplia el espectro de variabilidad inducida por el mutador de cloroplastos se han realizado selecciones de 91551 ATCAGTAGCT GGTCCGAGAG GATGATCAGC CACACTGGGA CTGAGACACG (219 bp)
tolerancia a herbicidas tóxicos del fotosistema II (atrazina, Prina et al., 1997 y Ríos et al., 1997, diurón y bromacil, Prina et al., 1996 y 2000) 91601 GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTGGG GAATTTTCCG CAATGGGCGA
y del fotosistema I (paraquat, Prina et al., 2000), habiéndose aislado dos mutantes derivadas del genotipo mutador con tolerancia conspicua al 91651 AAGCCTGACG GAGCAATGCC GCGTGGAGGT GGAAGGCCCA CGGGTCGTCA
herbicida atrazina que presentaron una mutación de punto en el gen cloroplástico psbA (Prina et al., 2000). Más recientemente, hemos
91701 ACTTCTTTTC TCGGAGAAGA AACAATGACG GTATCTGAGG AATAAGCATC
comenzado con experimentos de selección con antibióticos que afectan los ribosomas de tipo procariótico como los cloroplásticos
(estreptomicina, espectinomicina, eritromicina y kanamicina) sobre este genotipo de genética inestable y sobre familias derivadas que 91751 GGCTAACTCT GTGCCAGCAG CCGCGGTAAG ACAGAGGATG CAAGCGTTAT
1141 GAGGAGGAAG GGTTAAGGAT TTACCCGGTG TGAGATATCG CATTATTCGA GGAACCCTAG (190 bp)
1201 ATGCTGTCGC AGTAAAGAAT CGTCAACAAG GGCGTTCTAG TGCGTTGTAG ATTCTTATCC
1261 AAGACTTGTA TCATTTGATG ATGCCATGTG AATCGCTAGA AACATGTGAA GTGTATGGCT
1321 AACCCAATAA CGAAAGTTTC GTAAGGGGAC TGGAGCAGGC TACCATGAGA CAAAAGATCC
1381 TCTTTCTAAA GAGATTCGAT TCGGAACTCT TATATGTCCA AGGTCAATAT GGAAATTCTT (209 bp)
1441 TCAGAGGTTT TCCCTTACTT TGTCCGTGTC AACAAACAAT TCGAAATACC TCGACTTTTT
1501 CAGAACAGGT CCGAGTCAAA TAGCAATGAT TCGAAGCACT TCTTTTTCCA TTACACTATT

segregan plantas de diverso vigor que podrían estar afectadas en los ARNs o las proteínas ribosomales del cloroplasto. 91801 CCGGAATGAT TGGGCGTAAA GCGTCTGTAG GTGGCTTTTC AAGTCCGCCG 1561 TCGGAAACCT AAGGACTCGA TCGTATGGAT ATGGAAAATA CAGGATTTCC GATCCTAGCG

En este trabajo se presenta la estrategia de selección y caracterización molecular de mutantes resistentes a los antibióticos mencionados y 91851 TCAAATCCCA GGGCTCAACC CTGGACAGGC GGTGGAAACT ACCAAGCTGG 1621 GGAAGAGGAG GGAAACGGAT ACTCAATTTA AAGTGAGTAA ACAGAATTCC ATACTCGATC

los resultados preliminares obtenidos. 91901 AGTACGGTAG GGGCAGAGGG AATTTCCGGT GGAGCGGTGA AATGCATTGA (377 bp) 1681 TCATAGATCC CTATAGAATT CTGTGGAAAG CCGTATTCGA TGAAAGTCGT ATGTACGGCT

91951 GATCGGAAAG AACACCAACG GCGAAAGCAC TCTGCTGGGC CGACACTGAC (303 bp) 1741 TGGAGGGAGA TCTTTCCTAT CTTTCGAGAT CCACCCTACA ATATGGGGTC AAAAAGCCAA

92001 ACTGAGAGAC GAAAGCTAGG GGAGCAAATG GGATTAGAGA CCCCAGTAGT 1801 AAAAATAAGT GATTTTAGCC CTTATAAAAA GAAAACGGAT TCTTGAACCT CTTTCACGCT
MATERIALES Y MÉTODOS 1861 CATGTCACGT CGAGGTACTG CAGAAAAAAG AACTG
92051 CCTAGCCGTA AACGATGGAT ACTAGGTGCT GTGCGACTCG ACCCGTGCAG

Material vegetal: Se utilizaron semillas de familias derivadas del genotipo mutador de cloroplastos de la cebada (cpm/cpm Prina 1992) que
92101 TGCTGTAGCT AACGCGTTAA GTATCCCGCC TGGGGAGTAC GTTCGCAAGA
Referencias:
fueron seleccionadas previamente por presentar plantas de diverso vigor (familias pdv). También se usaron semillas de genotipo mutador sin 92151 ATGAAACTCA AAGGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG (187 bp)

selección previa. 92201 GTTTAATTCG ATGCAAAGCG AAGAACCTTA CCAGGGCTTG ACATGCCGCG TCGA = Taq I

Metodología: Las semillas se agitaron en soluciones acuosas de estreptomicina 100 mg/l, kanamicina 50 mg/l, espectinomicina 2 g/l y 92251 AATCCTCTTG AAAGAGAGGG GTGCCCTCGG GAACGCGGAC ACAGGTGGTG PRIMERS
eritromicina 350 mg/l, a 100 rpm durante aproximadamente 20 hs a temperatura ambiente. Luego se sembraron en hidroponia (método de 92301 CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GCCGTAAGGT GTTGGGTTAA GTCTCGCAAC [EXONES]
Myhill and Konzak 1967) con las mismas soluciones de antibióticos. Se crecieron en invernáculo o en cámara de cría a 150C con un fotoperíodo 92351 GAGCGCAACC CTCGTGTTTA GTTGCCACTA TGAGTTTGGA ACCCTGAACA Las zonas subrayadas corresponden a los sitios “hot spots”.
de 16 hs de luz. 92401 GACCGCCGGT GTTAAGCCGG AGGAAGGAGA GGATGAGGCC AAGTCATCAT (262 bp)
Entre paréntesis se muestra el tamaño de los fragmentos analizados.
Las extracciones de ADN total se realizaron por el micrométodo de Dellaporta (1994). Se amplificaron los fragmentos de ADNcp
92451 GCCCCTTATG CCCTGGGCGA CACACGTGCT ACAATGGGCG GGACAAAGGG
correspondientes al gen 16S rRNA, para el cual se utilizaron los primers de Sears et al.(1996), y los extremos 3’ y 5’ del gen que codifica para
92501 TCGCGATCTC GCGAGGGTGA GCTAACTCCA AAAACCCGTC CTCAGTTCGG (554 bp)
la rpS12, para los cuales se diseñaron primers específicos indicados en las fig.1 y 2 utilizando el programa Oligo. Los productos de PCR fueron
purificados mediante electroforesis en agarosa de bajo punto de fusión utilizando un kit comercial (Qiagen “gel extraction kit”). El fragmento 92551 ATTGCAGGCT GCAACTCGCC TGCATGAAGC AGGAATCGCT AGTAATCGCC

correspondiente al gen 16S rRNA fue digerido con dos enzimas de restricción, Sau 3AI o Mbo I y Hae III. El fragmento correspondiente al 92601 GGTCAGCCAT ACGGCGGTGA ATCCGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC (195 bp)
extremo 3’ del gen rps 12 fue digerido con Taq I. Los fragmentos de restricción de interés fueron aislados como se describió anteriormente. 92651 GTCACACTAT AGGAGCTGGC CATGTTTGAA GTCATTACCC TTAACCGTAA (154 bp)
Los mismos, incluyendo al extremo 5’ del gen rps 12 fueron analizados con la técnica de SSCP (Single Stranded Conformational Polymorphisms, 92701 GGAGGGGGAT GCCTAAGGCT AGGCTTGCGA CTGGAGTGAA GTCGTAACAA
Orita et al. 1994) en geles de MDE (FMC) a 15 V/cm overnight y revelados con NO3Ag según el método de Searles (com. pers.). 92751 GGTAGCCGTA CTGGAAGGTG CGGCTGGATC ACCTCCTTTT CAGGGAGAGC

Referencias: 1 2 3 4 5 6 7
GATC = Sau 3AI/Mbo I
GGCC = Hae III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 1. Resultados de los experimentos de selección
PRIMERS

Experimentos de selección: Las zonas subrayadas corresponden a los sitios “hot spots”.

Una parte de las selecciones se realizó con familias derivadas del Nº de plántulas Nº de Nº de Entre paréntesis se muestra el tamaño de los fragmentos analizados.

genotipo mutador que segregan plantas con diverso vigor (familias resistentes en S1 plántulas plántulas
Antibiótico
pdv), característica que se heredó maternalmente y que se Genotipo Familias resistentes resistentes
hipotetizó podría estar asociada a mutantes de ARNs o proteínas Control
Mutador pdv en S2 en S3
ribosomales. Este fenotipo no pudo ser homogeneizado pues
Estreptomicina 0/∼70 0/∼130 4/∼160 3/11 16/20
posiblemente la mutante homoplástica sólida sea letal. De ellas se
dispone de cantidades muy limitadas de semillas. Adicionalmente, se Kanamicina 0/∼70 0/∼130 6/∼160 1/15 1/2
utilizaron tambien semillas de genotipo mutador sin selección Espectinomicina 0/∼50 1/∼130 0/∼140 - -
previa. Eritromicina 0/∼50 1/∼130 0/∼140 - -
Los antibióticos estreptomicina, kanamicina, espectinomicina y
eritromicina afectan a los ribosomas de tipo procariótico, como es
el caso de los ribosomas cloroplásticos. Los tres primeros afectan Fig 8.- RFLP de los fragmentos amplificados de los
al 16S rRNA, y la eritromicina al 23S rRNA. La estreptomicina genes 16S rRNA y del extremo 3’ del rps 12 en
afecta también a la proteína ribosomal rpS12. Mutaciones en estos agarosa 3% TBE 0.5x. 1: 100 bp marker, 2: 16S rRNA
genes que confieren resistencia a estos antibióticos ya han sido del control digerido con MboI, 3: 16S rRNA de la
descriptas en otras especies (Galili et al. 1989, Harris et al. 1989, resistente digerido con MboI, 4: 16S rRNA del
Kavanagh et al.1994, To et al. 1992 y Yeh et al. 1994). Para control digerido con Hae III, 5: 16S rRNA de la
determinar las concentraciones de selección de los antibióticos se resistente digerido con Hae III, 6: 3’rps 12 del
realizaron dosimetrías con el control. control digerido con Taq I, 7: 3’rps 12 de la resistente
La cantidad de individuos resistentes a antibióticos obtenidos por digerido con Taq I.
selección directa se detalla en la tabla 1. Se obtuvieron posibles
mutantes resistentes a los cuatro antibióticos probados (tabla 1 y
figs. 3; 4; 5 y 6). Los resultados más relevantes corresponden a las
selecciones con estreptomicina, que en la 3ª generación mostró 16
plántulas resistentes sobre un total de 20.

Análisis molecular: Fig. 6.- Plántulas en hidroponia con

Una de las familias donde se habían seleccionado plántulas
resistentes a estreptomicina presentó estrías verdes sobre fondo
albino en presencia del antibiótico en la S2, lo que indica
heteroplastia para la mutación (fig. 7).
Se aisló el ADN total de las hojas que presentaban estas estrías y
de un control normal crecido en ausencia del antibiótico.
Los fragmentos correspondientes a los genes cloroplásticos del 16S
rRNA y a los extremos 5’ y 3’ del rps 12 fueron amplificados
mediante PCR y no se observó diferencia de tamaño entre el control
y la resistente. Estos fragmentos fueron digeridos con las enzimas
de restricción mencionadas en materiales y métodos y no se
observaron diferencias en los patrones de restricción (fig. 8).
Se aislaron los fragmentos correspondientes a los siguientes
productos de restricción:
16S rRNA con Sau 3AI/Mbo I: 154 bp, 170 bp, 377 bp y 554 bp
16S rRNA con Hae III: 187 bp, 195 bp, 219 bp, 262 bp y 303 bp
3’ rps 12 con Taq I: 190 bp y 209 bp
Estos fueron analizados por la técnica de SSCP. El fragmento de
209 bp del extremo 3’ del gen rps 12 de la plántula resistente
mostró una pequeña diferencia en su movilidad con respecto al
control normal (fig. 9).
Este resultado fue reproducido tres veces. Esta variación en
movilidad podría indicar una diferencia en la secuencia que deberá
ser confirmada con electroforesis más prolongadas y con la
secuenciación del fragmento.
CONCLUSIONES
1) Se confirmó la resistencia a estreptomicina en plántulas
obtenidas luego de tres generaciones de selección sobre una
familia que segrega plántulas de diverso vigor derivada del
genotipo mutador de cloroplastos cpm/cpm. Los análisis
moleculares de ADN sugieren que correspondería a una mutación
del gen de la proteína ribosomal rpS12.
2) Las mutantes potenciales obtenidas para cuatro de los
antibióticos probados, de confirmarse, apoyarían la hipótesis de
una alta variabilidad inducida en el genoma cloroplástico por el
genotipo mutador de cloroplastos.
3) El genotipo mutador en estudio permitiría obtener una gran
cantidad de variantes en el plastoma, las cuales bien
caracterizadas pueden contribuir a un mejor entendimiento de la
genética citoplásmica y sus interacciones con el núcleo. Asimismo
algunas de las nuevas variantes disponibles podrían constituir
herramientas útiles para la transformación genética del
cloroplasto como vectores, señales regulatorias y genes
seleccionables.
Fig. 3.- Plántulas en hidroponia con estreptomicina 100 mg/l. Centro:
6 plántulas de familias pdv resistentes (3ª generación). Izquierda:
control. Derecha: familia susceptible
Fig. 4.- Plántulas en hidroponia con kanamicina 50 mg/l. Derecha:
plántula de familia pdv resistente (3ª generación). Izquierda:
control.
Fig. 5.- Plántulas en hidroponia con eritromicina 350 mg/l. Derecha:
plántula de genotipo mutador resistente (1ª generación). Izquierda:
control.
espectinomicina 2 g/l. Plántula de MD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 MSD
genotipo mutador resistente (1ª
generación).
Fig. 9.- Gel de SSCP. MD: 100 bp marker desnaturalizado, 1 y 2: fragmento de 154 bp del
16S rRNA digerido con MboI, 3 y 4: fragmento de 170 bp del 16S rRNA digerido con
MboI, 5 y 6: fragmento de 377 bp del 16S rRNA digerido con MboI, 7 y 8: fragmento de
554 bp del 16S rRNA digerido con MboI, 9 y 10: fragmentos de 187 bp y 195 bp del 16S
rRNA digerido con Hae III, 11 y 12: fragmento de 219 bp del 16S rRNA digerido con Hae
III, 13 y 14: fragmento de 262 bp del 16S rRNA digerido con Hae III, 15 y 16: fragmento
de 303 bp del 16S rRNA digerido con Hae III, 17 y 18: fragmento de 190 bp del 3’rps 12
Fig. 7.- Plántulas en hidroponia con digerido con Taq I, 19 y 20: fragmento de 209 bp del 3’rps 12 digerido con Taq I, MSD:
estreptomicina 100 mg/l. Plántulas de 100 bp marker sin desnaturalizar. Los números impares corresponden al ADN del
familia pdv resistente con estrías control y los pares al de la resistente.
verdes sobre fondo albino. Una
plántula de esta familia fue analizada
molecularmente.
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