ADN Fetal en Sangre Materna

Clases de Residentes año 2014 ADN fetal libre en sangre materna
Servicio de Obstetricia y Ginecología

Hospital Universitario
Virgen de las Nieves
Granada
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Diagnostico prenatal no invasivo: ADN fetal libre en
sangre materna
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Dr. Raffaele Carputo
6 de Noviembre de 2014
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INTRODUCCIÓN
El diagnóstico prenatal reúne un conjunto de estrategias para la identificación
de defectos congénitos durante el embarazo, tales como alteraciones
morfológicas, estructurales, funcionales o moleculares del feto. Actualmente, el
diagnóstico de certeza de muchas de estas alteraciones requiere la obtención
de una muestra de material genético fetal mediante técnicas invasivas como
por ejemplo la amniocentesis y la biopsia de las vellosidades coriónicas (BVC),
que conllevando riesgos de perdida fetal (aproximadamente del 1%), no se
ofrecen a todas las gestantes.
Con el término "diagnóstico prenatal no invasivo" (NIPD, del inglés "Non

Invasive Prenatal Diagnosis") hacemos referencia a procedimientos que
permiten el estudio de las características genéticas del feto sin acceso directo
al útero, y por lo tanto, sin riesgo de pérdida del embarazo asociado. Hoy en
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Raffaele Carputo / Maria Paz Carrillo Badillo !1
día NIPD incluye el análisis de ADN fetal intracelular o presente en forma libre
en la sangre materna.

La obtención no invasiva de material genetico fetal podría permitir generalizar
el diagnóstico de determinadas alteraciones bastante frecuentes, a todas las
gestantes, así como minimizar el número de técnicas invasivas.
El aislamiento y procesado del ADN fetal libre (cell free fetal DNA, “cff DNA”) en
sangre materna ha sido uno de los descubrimientos recientes más
prometedores en el campo del diagnóstico prenatal y ha hecho que muchos
grupos de investigación vean en esta fuente de material genético una opción
interesante para el diagnóstico prenatal no invasivo de aneuploidías,
enfermedades monogénicas, así como la identificación del sexo y Rh del feto.
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FUENTES DE ADN FETAL EN SANGRE MATERNA:
Material genético fetal puede encontrarse en la circulación materna en dos

formas principales:
1. Células fetales intactas:
El análisis del ADN fetal se intentó inicialmente a través el aislamiento de

células fetales intactas en la sangre materna. Diferentes tipos de células fetales
se han encontrado en la sangre periférica materna, incluyendo trofoblastos,
leucocitos y eritroblastos primitivos o glóbulos rojos nucleados (nucleated red
blood cells ”NRBCs”). El enriquecimiento de las células trofoblasticas se vió
obstaculizada por la falta de anticuerpos placentarios específico y el
atrapamiento de la mayoría de estas células a nivel pulmonar. Los leucocitos
podían persistir desde embarazos previos (hasta 5 años), lo que complicaba su
evaluación en embarazos posteriores y además carecían de marcadores
específicos para diferenciarlos a los de origen materno. Los eritroblastos
primitivo en cambio por su vida media corta (25 a 35 días) por lo que poco
probablemente podrían persistir de embarazos previos, su morfología celular
única y un complemento cromosómico completo (información genetica global
del feto) representan el tipo celular sobre que se ha centrado la investigación
en este tema. [1,2].
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Raffaele Carputo/Maria Paz Carrillo Badillo !2
La hibridación in situ por fluorescencia (FISH) y la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) han demostrado que los eritroblastos primitivos: están
presente en numero muy limitado (promedio máximo de 6 células fetales/ml en
sangre periférica) [3,4] y que la mayoría son de procedencia materna. Además,
la mayoría de estas células sufriendo apoptosis poseen un ADN inestable y
fragmentado que no es adecuado en cuanto tal para el análisis citogenético
molecular.
Para superar estas dificultades analíticas era necesario aumentar el numero de

estas células con técnicas de enriquecimiento y posterior aislamiento.
El enriquecimiento de los eritroblastos fetales primitivos se basa en la

aplicación de un gradiente de densidad tipo “Ficoll o Percoll” separándolos de
los glóbulos rojos maduros (RBC) y granulocitos [5]. Tanto el metodo Ficoll e
Percoll conllevando pasos de centrifugación y lavado pueden implicar perdida
de elementos celulares. El aislamiento de células fetales se llevó a cabo
utilizando anticuerpos monoclonales marcados con compuestos fluorescentes
(“FACS” Fuorescence-activated cell sorting) o magnéticos (“MACS” Magnetic-
activated cell sorting) que se dirigen a antígenos específicos de superficie de la
células fetales de interés (selección positiva) o utilizando un proceso de
selección negativa, a células que se quieren posteriormente eliminar. No
obstante tanto la FACS que la MACS han demostrado bajas tasas de
recuperación.
El primer estudio prospectivo multicéntrico para el diagnostico prenatal no

invasivo de aneuploidias basado en el aislamiento de eritroblastos primitivos
fetales se realizó en el 1994. El estudio que incluía 2.744 gestantes, demostró
una tasas de sensibilidad del 41,1% en la identificación de fetos euploides
mientras que la sensibilidad en caso de aneuploidias era del 74,4%. Las
diferencias en las sensibilidades indica que las células fetales son más
abundantes en los embarazos aneuploides y por lo tanto más fácilmente
detectables [6].
En conclusión el NIPD basado en celulas fetales intactas en sangre materna:

aunque fue inicialmente prometedor, el escaso número en la circulación
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materna, la persistencia desde embarazo previos así como el hecho de que la

gran mayoría proceden de los padres, no ha permitido su implementación
exitosa [7]. Es evidente que una vez que se desarrollará un método altamente
sensible para el aislamiento de estas células se dará un paso en adelante
significativo en el diagnostico prenatal no invasivo de aneuploidias. Estas
células conteniendo el genoma fetal completo podrían permitir utilizando
técnicas de de alto rendimiento tales como los microarrays y la secuenciación
masiva en paralelo (MPS) el diagnóstico de cualquiera aneuploidías, así como
de otros trastornos genómico.
2. ADN fetal libre de células (cell free fetal ADN, cff ADN):
En comparación, el cff ADN no contenido dentro de las membranas celulares

tiene un gran potencial para su uso en el diagnostico prenatal siendo
abundante en la circulación materna y representativo del embarazo actual.
• ¿De donde procede el cff ADN?
Respecto al origen del ADN fetal en la circulación materna, uno de los posibles
mecanismos de liberación es la apoptosis de células fetales intactas por
interacción con el sistema inmunitario materno. La evidencia de secuencias de
ADN fetal pocos días después de la implantación y la elevación de las
concentraciones plasmaticas de ADN fetal en sangre periférica de gestantes
con preeclampsia, sugieren un origen placentario, probablemente debido a la
apoptosis de las células trofoblásticas. Los eritroblastos fetales representan la
fuente minoritaria de ADN fetal libre dado el bajo porcentaje de estas células en
sangre materna. Por otra parte, se han detectado secuencias de ADN fetal en
otros fluidos, como el líquido amniótico, la orina y el líquidos cefalorraquídeo
maternos, lo que ha llevado a considerar la posibilidad de una transferencia
directa de ADN. Es muy probable que los tres mecanismos coexistan,
aportando la placenta la mayor parte del ADN fetal libre en plasma materno.
• ¿Cuando se encuentra el cff ADN en la sangre materna?
El cff ADN puede ser aislado en la sangre materna a partir de la 5ª semana

postmenstrual, y siempre a partir de la 9ª semana desde la fecha de la ultima
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regla. La concentración relativa de cff ADN aumenta con la edad gestacional

siendo este aumento moderado hasta la semana 21 (0,1% por semana), para
luego ser rápido (1% por semana) hasta el término.
El cff ADN típicamente representa el 10-15% total de cf ADN en la circulación

materna durante el final de primer y el principio del segundo trimestre, hasta
llegar a un 50% del total de cf ADN circulante en sangre materna al final de la
gestación. La concentración de cff DNA fetal disminuye con el aumento de peso
de la madre pudiendo ser insuficiente para el diagnóstico prenatal en mujeres
obesas. Esta relación inversa se ha atribuido a la dilución de una cantidad
relativamente constante de cff DNA en el plasma materno y a un aumento en la
concentración de cf ADN de origen materno a medida que aumenta el peso de
la gestante [8].
El tiempo de depuración materno de cff ADN es extremadamente rápido; en

mujeres embarazadas sanas, la vida media es de aproximadamente una hora,
y esencialmente todo el cff DNA es eliminado dentro de los dos primeros días
tras el parto siendo el aclaramiento renal el mecanismo más probable [9];por lo
tanto el cff ADN ofrece una instantánea en tiempo real del estado genético fetal.
EXRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ADN LIBRE EN SANGRE MATERNA:
La muestra de sangre materna es extraída de forma periférica, en tubos

enriquecidos con anticoagulante, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), o
bien sin enriquecimiento del mismo. No existe consenso a la hora de
especificar qué volumen de sangre es necesario extraer. Las cantidades
oscilan desde 1,6-4,2 militros. Posteriormente, los métodos descritos para el
procesado de la muestra tienen en común dos procesos de centrifugación
llevados a cabo a 4ºC de temperatura durante 10 minutos. Con este paso se
consigue separar el plasma (sobrenadante que queda en la parte superior del
tubo) de los restos celulares (precipitado). Tras estos pasos el sobrenadante se
almacena a una temperatura de congelación que oscila entre los -80ºC y -30ºC.
Una vez obtenido el plasma, es necesario el aislamiento del ADN. Para llevar a
cabo esta tarea existen diversos kits en comercio producidos por distintos
laboratorios (Qiagen, Macherey-Nagel, Roche, Invitrogen).
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METODOS PARA DIFERENCIAR ENTRE ADN FETAL Y MATERNO:
Existen ácidos nucleicos expresados exclusivamente por el feto, cuya

detección en sangre materna permite la selección específica de una parte del
ADN y por tanto un análisis selectivo. Además, su presencia significa que
pueden ser usados para cuantificar la cantidad de cff ADN en sangre materna,
independientemente del sexo. Este último dato es relevante ya que, hasta
ahora, no ha sido posible discriminar directamente entre ADN materno y fetal
para la cuantificación de cromosomas, a parte del cromosoma sexual Y
presente exclusivamente en fetos varones.
Entre los métodos desarrollados para detectar marcadores fetales universales,

destacan los siguientes métodos de análisis:
1. Detección de secuencias específicas de ADN en el cromosoma Y: es el

método más fiable pero limita el diagnóstico a fetos de sexo varón.
2. Detección de secuencias específicas de ADN en cromosomas

autosómicos: solo pueden ser útiles para demostrar la herencia paterna de
determinadas características del genoma que no estarían presentes en la
circulación materna si la madre no las tiene. Se basan en en análisis de:
• Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP): Son puntos que difieren entre

el genoma paterno y materno sin implicar que se trate de una enfermedad.
Específicamente, este enfoque para aportar informaciones útiles requiere la
presencia de al menos un SNP homocigoto en la madre y heterocigotos en el
feto [10].
• Polimorfismo de repeticiones cortas en tándem (STR): Son segmentos

polimórficos que pueden variar entre el genoma paterno y materno. Al
amplificarlos, teniendo en cuenta que el feto tendrá dos diferentes, uno por
alelo de herencia paterna y otro por herencia materna diferentes entre si, se
obtendrán dos productos de mayor entidad (los propios maternos y el
heredado por el feto) y uno más pequeño correspondiente a la herencia
paterna.
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3. Aumento de las concentraciones relativas del cff ADN: una limitación

técnica para aislar cff DNA en sangre materna es que su proporción es de
tan solo del 10-15% en el momento de la realización de la pruebas de
cribado. Este porcentaje ha de ser aumentado, ya sea a expensas del
numerador (ADN fetal), o disminuyendo parte del denominador (ADN
materno).
• Aumento de [cff ADN]: basado en metodos de enriquecimiento que

aprovechan diferencias en longitud entre el ADN fetal y materno. Se ha
demostrado que las moléculas de ADN fetal circulantes en sangre materna,
con una longitud media inferior a 313 pares de bases (pb), son más cortas
que las maternas. Con el utilizo de la electroforesis en gel de agarosa
seguido por el análisis de los segmentos fraccionados con una longitud
inferior a 300 pb con PCR en tiempo real se puede enriquecer el cff DNA de
tal manera que pueda llegar a ser el 70% del ADN total de la muestra.
Marcadores microsatélites altamente polimórficos en el cromosoma 21 se han
utilizado para discriminar rasgos genéticos fetales de origen paterno y
materno. Sin embargo, este método no se puede utilizar para el desarrollo de
NIPD para aneuploidías ya que laborioso y susceptible a contaminación de
otras fuentes de ácidos nucleicos [11].
• Disminución o supresión de ADN materno: consiste en la adición de

formaldehído al plasma que estabilizando las células maternas reduce la
liberación de ADN. De esta manera, se reduce la presencia de ADN libre
materno y aumenta la cantidad relativa de cff DNA. En un estudio que incluya
60 embarazadas de las cuales 3 con fetos con trisomia 21, se clasificaron
correctamente 56 de los 57 casos normales y dos de los tres casos de
trisomía 21. Aunque los resultados iniciales de este enfoque fueron
prometedores, no fueron reproducibles en los distintos grupos de
investigación [12].
4. Modificaciones epigenéticas: son diferencias somáticas del ADN que no

alteran la secuencia genética (secuencia de nucleotidos) pero que afectan a
la expresión génica (mARN, productos proteicos). El análisis de las
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modificaciones epigeneticas permitiría evidenciar diferencias entre los alelos

maternos propios y los fetales heredados por vía materna.
A)Métodos basados en la metilación:
Implica la individuación de patrones de metilación diferencial entre feto y madre

(differentially methylated regions “DMR”) en los nucleótidos citosina, localizados
en los denominados islotes CpG. Si una secuencia genética está hipermetilada,
tenderá a no ser expresada (p.e. el segundo cromosoma X femenino, cuya
expresión génica está muy frenada).
El fenomeno de la metilación ha sido estudiado a traves del tratamiento con

bisulfito de sodio (NaHSO3). Cuando se trata el ADN con bisulfito las citosinas
de los islotes CpG no metilados se convierten en uracilo mientras que las

metiladas se quedan iguales. En el 2002 Poon y cols. [13] descubrieron un
pattern de metilación diferencial entre feto y madre para el locus “maspin"
localizado en el cromosoma 18 que contiene el gen SERPINB5 “inhibidor de la
serin protesa 5”. El promotor de este gen no está metilado en la placenta (feto)
pero está hipermetilado en el ADN materno. Aprovechándose de la reacción
con bisulfito, diferencias en la secuencia de nucleotidos entre el ADN fetal y
materno pueden discriminarse mediante espectrometría de masas (MS) o PCR.
Como el locus maspin está en el cromosoma 18, se ha empleado para la
detección de la trisomía 18. Se cuantifican 2 alelos, y se calcula la relación, de
modo que una ratio 1:1 será propia de fetos euploides y una ratio 1:2 ó 2:1
significará aneuploidía fetal. A pesar de este enfoque es muy interesante la
conversión de la citosina no metilada a uracilo no siempre es completa y el
bisulfito provoca una degradación parcial del genoma hechos que juntos
complican la valoración de cantidades extremadamente bajas de cff ADN.
El metodo más moderno para el estudio de las “DMR” es la

inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP) que permite el enriquecimiento
de regiones fetal específicamente hipermetiladas utilizando un anticuerpo que
se dirige a los residuos de 5-metilcitosina de los dinucleótidos CG. En un
estudio realizado en 2009 para el diagnostico de trisomia 21 que combinaba
MeDIP a PCR en tiempo real se llegó a un diagnóstico correcto para todos los
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casos normales y anormales, demostrando una sensibilidad y especificidad del

100% [14].
B) Análisis de la ratio alélico/Medición de la dosis cromosomica relativa (DCR):
Se basa en la diferencia existente entre el ratio alélico de un sujeto sano que

es 1:1, y el de un feto afectado por alguna aneuploidía que será 2:1, 1:2. Este
método solo es posible utilizarlo si el feto es heterocigoto para el locus diana.
Se basa en este enfoque el estudio de mARN específicos que se transcriben

activamente sólo en el feto. Lo y cols. [13] identificaron con éxito una moléculas
de ARNm llamada PLAC4 (Proteina a codificación especifica placentaria 4)
localizada en el cromosoma 21 que se transcribe activamente sólo en el feto
pero no en la madre. Para el estudio de PLAC4 se utilizó un estrategia llamada
ARN-SNP utilizando MS. En este enfoque, los SNP informativos (heterocigotos
en el feto y homocigotos en la madre) situados en el mARN PLACA4 son
valorados midiendo la dosis cromosomica relativa (DCR) o sea la relación entre
la cantidad de los distintos alelos del ARNm en la circulación sanguínea
materna. El feto lleva un cromosoma 21 de cada progenitor y, por lo tanto, un
feto normal (disomía 21) debe generar cantidades iguales de los dos alelos.
Una proporción de 2:1 o 1:2 sugiere trisomía. Con este enfoque en un estudio
realizado en 2007 se identificaron 9 de cada 10 casos de síndrome de Down y
se excluyeron 55 de 57 controles sanos. [15]
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APLICACIONES DE DIAGNÓSTICO PRENATAL
1. Determinación del sexo fetal:
Determinar el sexo del feto es quizás el uso más directo de esta prueba de
diagnostico prenatal no invasiva. La determinación de la presencia o ausencia
de loci (lugares de los genes o secuencias de ADN en los cromosomas)
específicos del cromosoma Y como el gen SRY “sex-determining region” o la
región que codifica la proteína testicular específica ligada al Y “DYS14”,
permiten la determinación del sexo del feto a partir de la 7ª semana
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postmenstrual con una sensibilidad cercana al 100% a partir de la 10ª semana.

La identificación de estas secuencias en la sangre materna se realiza con PCR
convencional o con PCR cuantitativa en tiempo real (RTQ) obteniendo con la
última resultados más fiables [16]: si las secuencias del cromosoma Y están
presentes, el feto es masculino; en su defecto se presume que el feto es de
sexo femenino.
La sensibilidad en general aumenta con la edad gestacional:
• < 7ª semana post-menstrual (sensibilidad 74,5%, especificidad 99,1%).
• 7ª-12ª semana post-menstrual (sensibilidad 94.8%, especificidad 98,9%).
• 13ª- 20ª semana post-menstrual(sensibilidad 95,5%, especificidad 99,1%).
• > 20ª semana post-menstrual (sensibilidad 99%, especificidad 99,6%).
La determinación del sexo es particularmente útil como primer paso en el

diagnóstico prenatal de enfermedades recesivas ligadas al cromosoma X (p.e.
hemofilia, distrofia muscular de Duchenne, hiperplasia, Sindrome del X frágil,
etc). En estos casos, las madres portadoras de la enfermedad saben que si su
feto es de sexo femenino no necesitan someterse a técnicas de diagnostico
prenatal invasivas ya que será portador asintomático de la mutación o
completamente libre de esta. Por otro lado, si se diagnostica la presencia del
cromosoma Y, existe una probabilidad del 50% que el feto padezca la
enfermedad siendo en este caso indicada la realización de una tecnica de
diagnostico prenatal invasiva. El conocimiento del sexo fetal además es útil
para fetos de familias con riesgo de desarrollar un hiperplasia suprarrenal
congenita (trastorno autosomico recesivo) debido a un deficit de la 21-0H
idroxilasa. La presencia de este deficit enzimatico conlleva un acumulo de
androgenos y un deficit de cortisol y aldosterona. En fetos de sexo femenino el
exceso androgenico produce ambigüedad sexual y posible virilización que
puede ser evitada con la administración en el embarazo de dexametasona. En
fetos masculino no es necesaria la administración de corticoides.
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Raffaele Carputo/Maria Paz Carrillo Badillo !1 0
Una de las principales limitaciones técnicas del test es la dificultad en

establecer un control positivo para demostrar el éxito en el aislamiento del cff
ADN en fetos femeninos. Como el diagnóstico de sexo fetal femenino no es por
detección directa, sino que se infiere ante la ausencia de secuencias
específicas del cromosoma Y, un resultado negativo no se puede diferenciar de
una falla en la amplificación del cff ADN. Para solucionar este problema, se
están utilizando simultáneamente secuencias paternas que no están presentes
en el genoma materno, o secuencias de origen placentario que tengan distinto
patrón de metilación en la placenta y en la madre.
2. Tipificación del antígéno RH:
La determinación del Rh fetal constituye la primera aplicación rutinaria de este

tipo de diagnóstico prenatal no invasivo. El servicio nacional de sangre
británico (British National Blood Service) realiza esta determinación desde
2001.
La enfermedad hemolítica feto-neonatal es un patología que puede provocar

secuelas en el feto, como anemia, hidropsia, muerte fetal intrautero y
necesidad de parto prematuro. Está provocada por anticuerpos anti-D de
madres Rh negativas (RhD-) que atraviesan la placenta y se unen a los
eritrocitos de fetos Rh positivos (RhD+) destruyéndolos y provocando anemia.
Desde la introducción de la profilaxis preventiva el riesgo de isoinmunización
anti-RhD se ha reducido considerablemente, disminuyendo de un 5% al 0,16%,
no obstante se ha estimado que el 40% de las mujeres caucásicas RhD
negativo con pareja RhD positivas heterocigotas recibe una administración
antenatal innecesaria de inmunoglobulina anti-D, ya que son portadoras de
fetos RhD negativos. La determinación del genotipo RhD fetal en embarazadas
RhD negativo sensibilizadas en embarazo anteriores incluye procedimientos
invasivos tales como amniocentesis y análisis de vellosidades coriónicas
siendo incorporadas a este grupo, pacientes cuyos fetos son RhD negativo.
Este abordaje implica riesgos para el embarazo (0,5-1%) y puede aumentar la
sensibilización, como resultado de hemorragias materno-fetales (1-2%).
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Por lo tanto la posibilidad de un diagnóstico prenatal no invasivo para el gen

RHD haría posible restringir la profilaxis antenatal sólo a aquellas mujeres con
riesgo de inmunización.
Las ventajas de este tipo de enfoque incluyen:
• Evitar un tratamiento innecesario en gestantes no sensibilizadas. En

gestantes ya sensibilizadas en caso de nuevo embarazo evitaría la
realización de técnicas invasivas para descartar la incompatibilidad materno-
fetal [17].
• El coste del análisis del ADN fetal empleando tecnología automatizada es

inferior a un tercio del coste de la terapia con inmunoglobulinas
(aproximadamente 30 euro para cada dosis).
Este procedimiento tiene actualmente amplia utilización clínica tanto en

Estados Unidos como en Europa (Reino Unido, Francia y Holanda), con cifras
de sensibilidad y especificidad entre el 95 y el 100%, habiéndose extendido
también la técnica al primer trimestre. Sin embargo, aún no se ha dado el paso
para sustituir la administración sistemática de gammaglobulina en el embarazo
por esta determinación a todas las gestantes, aunque la prueba ha demostrado
gran fiabilidad clínica.
3. Diagnostico de aneuploidías autosómicas
El diagnostico prenatal no invasivo de aneuploidías usando cff ADN en sangre

materna se puso a disposición para su uso clínico en 2011. Los niveles
globales de cff ADN en la circulación materna se incrementan en la trisomía 13
y 21 pero no en la trisomía 18. El reto en la detección de aneuploidías fetales
es identificar una copia adicional (o la falta) del cromosoma fetal en estudio en
la sangre materna donde pero el cff ADN constituye sólo una pequeña fracción
del total cf ADN.
Importantes pasos en adelante en la identificación de las aneuploidias se ha

alcanzado con la implantación de técnicas de secuenciación de ultima
generación como la secuenciación masiva en paralelo (MPS). Esta tecnica
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permite secuenciar cortos segmentos de cf ADN materno y fetal asignandolos a

cada cromosoma. La “dosis especifica” de ADN perteneciente a un
determinado cromosoma son entonces comparados con los valores de
controles normales. A pesar de los avances tecnológicos la tecnica requiere el
analisis de aproximadamente 25 millones de fragmentos de ADN limitando este
factor su uso en la practica clinica por su coste.
Algunos investigadores [18] proponen, que si se realiza el análisis selectivo del

ADN libre de los cromosomas 21 y 18, con el análisis digital de regiones
seleccionadas (DANSR), se puede mejorar la eficiencia, el costo de
secuenciación, y el rendimiento de MPS. En el método DANSR,
oligonucleótidos complementarios se unen a secuencias de ADN libre
específicas de los cromosomas que se quieren evaluar. Los oligonucleótidos
hibridizados son amplificados usando primers de PCR universales, y los
productos de la reacción de PCR son secuenciados. El nivel de secuenciación
que se requiere en este método selectivo es menor al 5 % del que se requiere
en la secuenciación del genoma completo. La desventaja de esta
secuenciación selectiva es que no detecta otras anomalías que no sean la
trisomía 13, 18 y 21 [19].
Una serie de estudios se han publicado para analizar la capacidad diagnostica

de cff ADN en sangre materna que utilizaban técnicas de secuenciamento de
ultima generación (MPSS, DANSR) para el diagnostico de aneuploidia para en
poblaciones de alto riesgo (Tabla 1) [20]. En todos ellos se establece que ya
desde las 10ª semanas de gestación se puede detectar con fiabilidad la
trisomía 21 en embarazos únicos en poblaciones de alto riesgo (sensibilidad
del 99%-100%, con tasas de falsos positivos por debajo del 1%). Las trisomía
18 y 13 también se pueden detectar pero con menor exactitud (sensibilidad
92%-100% y 80%-100%, respectivamente). Recientemente se ha demostrado
que estos test pueden realizarse en gestaciones únicas de bajo riesgo, también
con altos niveles de sensibilidad y especificidad [20].
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Tabla 1:Resultados estudios de diagnostico prenatal usando ADN fetal en

sangre materna para gestaciones simples en poblaciones de alto riesgo.
Autor, año N Total N con Resultados T21 Resultados Resultados Tecnica

cariotipo T18 T13 utilizada
anormal
Palomaki, 1971 212 (T21) Sen:98.6% Sen:100% Sen:91.7% MPS

2011 59 (T18)
12 (T13) Esp:99.8% Esp:99.7% Esp:99.1%
Palomaki,
2012
Sehnert,  119 53 Sen:100% Sen:100% N/E MPS

2011
Ehrich,
2011
480 39
!
Sen:100%
Esp:99,7%
N/E N/E MPS
Bianchi, 532 221 Sen:100% Sen:97,2% Sen:78,6 MPS

2012 89 (T21)
36 (T18)
14 (T13)
Chiu,
2011
753 86
!
Sen:100%
Esp:97,9%
N/E N/E MPS
Ashoor,
2012
400 100
50 (T21)
50 (T18)
!
Sen:100%
Esp:99%
!
Sen:100%
Esp:99%
N/E DANSR
Norton,
2012
3228 119
81 (T21)
38 (T18)
!
Sen:100%
FP:0,03%
!
Esp:97%
FP:0,07%
N/E DANSR
Sparks,
2012
338 36 (T21)
8 (T18) !
Sen:100%
Esp:99,2%
!
Sen:100%
Esp:99.2%
N/E DANSR
Chen,
2011
392 37 (T18)
25 (T13)
N/E
!
Sen:91,9%
Esp:98%
!
Sen:100%
Esp:98.9%
MPS
N/E:No evaluada, MPS: Massively Parallel Sequencing, DANSR: Digital

Analysis of Selected Regions
Aunque existe alguna evidencia de que esta técnica se puede utilizar para
identificar otras aneuploidías y mosaicismos menos comunes con alta
sensibilidad [21], otros estudios son necesario para demostrar esta capacidad.
!
En un estudio multicentrico [22] que incluya 1914 mujeres con gestaciones de

feto único a las cuales se descartó aneuploidia con cariotipo, se comparó la
tasa de falsos positivos para el diagnostico de las principales trisomia
utilizando el cff ADN en sangre materna y el diagnostico prenatal estándar
(translucencia nucal y/o bioquímica materna). Los resultados evidenciaron
tasas de falsos positivo significativamente más bajas utilizando el cff ADN en
vez que el cribado estándar (0.3% vs 3.6% por la T21 y 0.2% vs 0.6% por la
T18). Según este estudio si la prueba del cff ADN fuese implantada como
tecnica estándar de cribado y si todas las clasificadas como positiva se
sometiesen a un procedimiento invasivo, la disminución relativas de estas
ultimas sería del 89%.
Resultados no concluyentes: Son un 2-4% y podrían ocurrir cuando la

concentración de cff ADN fetal es demasiado baja en el plasma materno
(gestación precoces < 10 SG, mujeres obesas).
Falsos positivos: podrían deberse a factores tales como aneuploidía materna,

cáncer materno, gestación gemelar con un gemelo fallecido en via de
degradación, mosaicismo confinado a la placenta (la mayoría del cff ADN
procede de la placenta).
Gestaciones múltiples:
La detección de aneuploidias en gestaciones múltiples utilizando técnicas

diagnóstico prenatal no invasiva representa un desafío dado que la cff ADN en
la circulación materna procede de cada singulo feto. Las pruebas están
disponibles comercialmente para las trisomías 13, 18 y 21 con resultados
prometedores, aunque hay menos datos disponibles de validación respecto a
las gestaciones de feto unico [23]. Debido a que es imposible determinar cuál
de los gemelos es anormal basandose solo en el análisis genético, los
resultados se informan para el embarazo en conjunto necesitandose una
prueba invasiva para distinguir cuál de los gemelos se ve afectado por la
aneuploidia. Para embarazos múltiples obtenidos con ovodonación y en los de
más de dos fetos la pruebas de diagnostico prenatal no invasivas todavía no
han sido validadas.
!
En conclusión:
En la actualidad, los test genetico de diagnostico prenatal no invasivo para la

detección de aneuploidias se ha posicionado, desde el punto de vista clínico,
como un “test de screening avanzado”, más que como un test diagnóstico. Si
bien la detección de aneuploidias utilizando cff ADN parece tener tasas de
falsos positivos y falsos negativos más bajos que las pruebas de detección de
aneuploidía no invasivas existentes (<1%) se considera que está indicado en
embarazadas que han sido previamente identificadas como grupo de alto
riesgo con el cribado estándar de 1º y/o 2º trimestre y que prefieren evitar o
retrasar los estudios invasivos diagnósticos. En ningún caso debe sustituirse a
la realización de la ecografía de primer trimestre para la evaluación de la
anatomía fetal y búsqueda de marcadores de otras alteraciones como
preeclampsia, CIR, parto pretérmino, etc [20]. La Sociedad Internacional de
Diagnóstico Prenatal (ISPD) publicó un comunicado donde recomienda que
todavía es necesario confirmar un resultado anormal de los test basados en cff
ADN en sangre materna mediante estudios invasivos, y advierte que el NIPD
no sea utilizado de rutina en población de bajo riesgo.
4. Diagnostivo de aneuploidias relacionadas a los cromosomas sexuales:
Estos trastornos se encuentran en 1 de cada 400 nacidos vivos, por lo cual son
más comúnes que las aneuploidía autosómica. Son disponibles en comercio
pruebas para: monosomía X “Sindrome de Turner”, síndrome de Klinefelter
(XXY), síndrome XYY, y para otras aneuploidías de los cromosomas sexuales.
Con la excepción del sindrome de Turner, diagnosticado a veces tras encontrar
higroma quístico o defectos cardíaco en la ecografía prenatal, la mayoría de las
otras aneuploidías de los cromosomas sexuales no tienen un fenotipo
diagnosticable ecograficamente o con la bioquímica del suero materno.
5. Diagnostico de enfermedades monogenicas:
El diagnóstico prenatal no invasivo de enfermedades monogenicas está

limitado a la detección de mutaciones heredadas del padre, que no estarían
presentes en el genoma materno (suponiendo que la madre no se ve afectada).
!
• Condiciones autosómicas dominantes: el diagnóstico depende de la

identificación del alelo paterno. Cuando el padre se ve afectado por la
enfermedad, una prueba "positiva" en la sangre materna significa la presencia
del alelo paterno defectuoso y un feto afectado (suponiendo que la madre
estando sana no presente el gen defectuoso). Enfermedades de transmisión
autosómica dominante como la corea de Huntington, la distrofia miotónica, y
la acondroplasia [24] han sido diagnosticadas utilizando esta tecnica. Cuando
la madre se ve afectada por una enfermedad autosómica dominante, el
diagnóstico fetal no invasivo no es posible en este momento porque los
ácidos nucleicos fetales de origen materno no pueden distinguirse de el ADN
materno.
• Condiciones autosómicas recesivas: en el caso donde sólo uno de los

progenitores es portador de la mutación, no es necesario realizar pruebas al
feto dado que no padecerá la enfermedad. En parejas en que ambos son
portadores (heterocigotos) del gen mutado sí existe riesgo de tener un hijo
con la enfermedad (25%) y en estos casos el alelo paterno mutado puede ser
investigado en el plasma de la embarazada. La ausencia de la mutación
paterna en ADN fetal descarta que el feto esté afectado por la enfermedad en
estudio. Si la mutación paterna está presente, no puede diferenciarse si se
trata de un feto afectado o portador. Más recientemente se han desarrollado
técnicas de secuenciación para detectar un feto homocigoto en una madre
heterocigota para un determinado gen, sobre la base de que la proporción
entre gen anormal/normal se eleva. Las enfermedades diagnosticadas
mediante este enfoque hasta ahora han sido: fibrosis quística,
hemoglobinopatías e hiperplasia adrenal congénita.
6. Diagnostico de las síndromes de microdeleción:
Algunas compañías ofrecen pruebas para las síndromes de microdeleción más

comunes como las del 22q11 (Sindrome de Di George), del 5p (Sindorme de
cri-du-chat, del 15q (Sindromes de Prader-Willi/Angelman), para el síndrome
de deleción 1p36. Debido a que estos trastornos son tan raros, se espera que
el valor predictivo positivo de estos test sea bajo. Al estado actual para
!
recomendar el utilizo de forma difusa de este test para el diagnostico de

síndromes de microdeleciones se necesitan estudios más amplios [25].
7. Detección de trastornos del embarazo:
Los niveles circulantes de ácidos nucleicos fetales libres de células son

significativamente más elevados en el desprendimiento de placenta,
preeclampsia, retraso de crecimiento intrauterino [26], amenaza de parto
prematuro, hiperemesis gravídica, y polihidramnios.
DIFUSIÓN ACTUAL EN LA PRACTICA CLINICA:
1. Determinación del sexo del feto:amplia difusión en EEUU y países de

Europa. Debido a que es la aplicación más directa de la detección de cff DNA
en sangre materna, se venden kits directamente a las personas que lo soliciten
por internet.
2. Determinación del Rh:ampliamente desarrollado en Europa y Estados

Unidos.
3. Trastornos de un solo gen:se desconoce.
4. Aneuploidías:en el mes de octubre del 2011 salió al mercado el primer kit con
licencia en EEUU por los laboratorios Sequenom (MaterniT21®).
Sucesivamente otras compañía han desarrollado kit aptos para este tipo de
diagnostico (Tabla 2).
Tabla 2: Principales Kits para NIPD actualmente comercializados.
Compañía Nombre del Test Anomalias Metodo Coste

valoradas aproximado
Ariosa Harmony Prenatal Embarazo único (incluso DANSR 700 euro

Diagnostics Test® ovodonación)
- Trisomias 21,18,13
San Jose, CA, - Aneuploidias Cr. sexuales
USA - Sexo fetal
Embarazo gemelar (no por
ovodonación , > 2 fetos)
- No sexo ni aneuplodias
cromosomas sexuales)
!
Compañía Nombre del Test Anomalias Metodo Coste

valoradas aproximado
Sequenom MaterniT21 PLUS® Embarazo único (incluso MPS 1300 euro

ovodonación)
San Diego, CA, - Trisomias 21,18,13
USA - Aneuploidias Cr. sexuales
- Sexo fetal
! - Sdm. Microdeleciones
Verinata Health Verifi® prenatal test Embarazo único (incluso MPS 850 euro
ovodonación)
Redwood City, - Trisomias 21,18,13
CA, USA - Aneuploidias Cr. sexuales
- Sexo fetal
! Embarazo gemelar (no por
!
Natera
San Carlos, CA,

Panorama-estandard
®
Embarazo único (incluso
ovodonación)
MPS 800 euro
USA - Aneuploidias Cr. sexuales

- Triploidias
- Sexo fetal
Panorama- Embarazo único (incluso
extended® ovodonación)
- Aneuploidias Cr. sexuales
- Triploidias
- Microdeleciones
- Sexo fetal
!
BIBLIOGRAFIA:
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common sex chromosome aneuploidies from maternal blood using
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subsequently develop preeclampsia and intrauterine growth restriction.
Prenat Diagn. 2009, 29:1118-22
!

ADN Fetal en Sangre Materna

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Clases de Residentes año 2014 ADN fetal libre en sangre materna

Servicio de Obstetricia y Ginecología

Con el término "diagnóstico prenatal no invasivo" (NIPD, del inglés "Non

Material genético fetal puede encontrarse en la circulación materna en dos

1. Células fetales intactas:

El análisis del ADN fetal se intentó inicialmente a través el aislamiento de

La hibridación in situ por fluorescencia (FISH) y la reacción en cadena de la

Para superar estas dificultades analíticas era necesario aumentar el numero de

El enriquecimiento de los eritroblastos fetales primitivos se basa en la

El primer estudio prospectivo multicéntrico para el diagnostico prenatal no

En conclusión el NIPD basado en celulas fetales intactas en sangre materna:

materna, la persistencia desde embarazo previos así como el hecho de que la

En comparación, el cff ADN no contenido dentro de las membranas celulares

• ¿De donde procede el cff ADN?

• ¿Cuando se encuentra el cff ADN en la sangre materna?

El cff ADN puede ser aislado en la sangre materna a partir de la 5ª semana

regla. La concentración relativa de cff ADN aumenta con la edad gestacional

El cff ADN típicamente representa el 10-15% total de cf ADN en la circulación

El tiempo de depuración materno de cff ADN es extremadamente rápido; en

EXRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ADN LIBRE EN SANGRE MATERNA:

La muestra de sangre materna es extraída de forma periférica, en tubos

METODOS PARA DIFERENCIAR ENTRE ADN FETAL Y MATERNO:

Existen ácidos nucleicos expresados exclusivamente por el feto, cuya

Entre los métodos desarrollados para detectar marcadores fetales universales,

1. Detección de secuencias específicas de ADN en el cromosoma Y: es el

2. Detección de secuencias específicas de ADN en cromosomas

• Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP): Son puntos que difieren entre

• Polimorfismo de repeticiones cortas en tándem (STR): Son segmentos

3. Aumento de las concentraciones relativas del cff ADN: una limitación

• Aumento de [cff ADN]: basado en metodos de enriquecimiento que

• Disminución o supresión de ADN materno: consiste en la adición de

4. Modificaciones epigenéticas: son diferencias somáticas del ADN que no

modificaciones epigeneticas permitiría evidenciar diferencias entre los alelos

A)Métodos basados en la metilación:

Implica la individuación de patrones de metilación diferencial entre feto y madre

El fenomeno de la metilación ha sido estudiado a traves del tratamiento con

de los islotes CpG no metilados se convierten en uracilo mientras que las

El metodo más moderno para el estudio de las “DMR” es la

casos normales y anormales, demostrando una sensibilidad y especificidad del

B) Análisis de la ratio alélico/Medición de la dosis cromosomica relativa (DCR):

Se basa en la diferencia existente entre el ratio alélico de un sujeto sano que

Se basa en este enfoque el estudio de mARN específicos que se transcriben

1. Determinación del sexo fetal:

postmenstrual con una sensibilidad cercana al 100% a partir de la 10ª semana.

La sensibilidad en general aumenta con la edad gestacional:

• < 7ª semana post-menstrual (sensibilidad 74,5%, especificidad 99,1%).

• 7ª-12ª semana post-menstrual (sensibilidad 94.8%, especificidad 98,9%).

• 13ª- 20ª semana post-menstrual(sensibilidad 95,5%, especificidad 99,1%).

• > 20ª semana post-menstrual (sensibilidad 99%, especificidad 99,6%).

La determinación del sexo es particularmente útil como primer paso en el

Una de las principales limitaciones técnicas del test es la dificultad en

2. Tipificación del antígéno RH:

La determinación del Rh fetal constituye la primera aplicación rutinaria de este

La enfermedad hemolítica feto-neonatal es un patología que puede provocar

Por lo tanto la posibilidad de un diagnóstico prenatal no invasivo para el gen

Las ventajas de este tipo de enfoque incluyen:

• Evitar un tratamiento innecesario en gestantes no sensibilizadas. En

• El coste del análisis del ADN fetal empleando tecnología automatizada es

Este procedimiento tiene actualmente amplia utilización clínica tanto en

3. Diagnostico de aneuploidías autosómicas

El diagnostico prenatal no invasivo de aneuploidías usando cff ADN en sangre

Importantes pasos en adelante en la identificación de las aneuploidias se ha

permite secuenciar cortos segmentos de cf ADN materno y fetal asignandolos a

Algunos investigadores [18] proponen, que si se realiza el análisis selectivo del

Sehnert,  119 53 Sen:100% Sen:100% N/E MPS