Borrador: Abril 2009

Lab 309
Chemical and Biomolecular Nanotechnology
IQAC-CSIC

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Indice

Introducción

Nociones Básicas del HPLC

· El sistema des de el Inicio ……………………………………………… 4

· Software del HPLC…………………………………………………………………………… 5

· Puesta a Punto del Sistema HPLC……………………………………… 6

· Análisis de muestras ………………………………………………………………… 8

Solución de Problemas
· Detección de Problemas ………………………………………………………… 11

· Recomendaciones para evitar disfunciones…………… 14

· Verificación……………………………………………………………………………………… 15

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 Este casi-PNT es un recopilatorio de ideas básicas de los HPLC del 309.

Pretende dar unas instrucciones básicas para sacar el máximo provecho, haciendo un
buen uso de ellos y minimizando las averías.

El HPLC es un sistema de análisis muy útil, multidisciplinar y una herramienta básica

para el seguimiento y la evaluación de compuestos.

En el 309 además, debido a la naturaleza de nuestros compuestos, es necesario y muy

valioso. Debemos tratarlos con cuidado, pulcritud, cariño porque son muy sensibles.

Sensibles a nivel de análisis, ya que si no somos limpios van a aparecer picos

fantasmas…

Y sensibles a nivel operativo, ya que pequeñas alteraciones en el modus operandi

pueden llevar a fallos y averías.

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El sistema des del Inicio
El HPLC consta de dos sistemas conectados: Los módulos de HPLC y el ordenador
control. Los módulos son:

· Hay un LED que indica el estado el módulo.

ORDEN ENCENDIDO
1) Encender todos los módulos del HPLC (5 botones, se pondrán en verde)
- DEGASSER
- QUAT PUMP
- ALS y ALST THERM
- COLCOMP
- DAD

2) Encender ordenador y pantalla. Si sale mensaje de error de conexión, no pasa nada, quitar.
3) Iniciar programa Instrument 1-On line. Esperar que se ejecute por completo y deje de
pensar.
4) Inicar programa Instrument 1-Off line.

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Software del HPLC
Hay que tener en cuenta que son ordenadores que ya tienen sus años, no
supercomputers de la NASA.

Es muy importante que déis tiempo al ordenador para que piense en todo momento.
A la hora de abrir programas, espectros, calcular cosas, hacer Snapshots…

El sistema Operativo es Windows NT. No está conectado a internet, pero está en línea con el
ordenador central, que os permite pasaros los espectros via ethernet.

HP ChemStations
4 aplicaciones básicas. Se accede por el menú pestañita debajo de File.
· Method and Run Control
· Data Analysis
· Report Layout
· Verification
· Diagnosis

En realidad se dividen las tareas en dos programas:

· Ins 1 On-line: SOLO para Method Control y Diagnosis. No usar para ver espectros (colapso).
· Ins 1 Off-line: Analysis y Report.

Method and Run Control

· En On-line: Para el control del sistema.
· En Off-line: Para crear programas y secuencias.

- Diagrama módulos: Inyector, Bombeo disolventes, termostato, DAD UV, calibración,

integración. Cada uno tiene menú.
- Operator control (disco): Control espacio en disco, operador, y apagado automático.
- Bandeja viales: Programar pinchadas.
- Cromatogramas on-line: Seguimiento parámetros. Se pueden elegir (longitudes UV, presión,
% disolventes…)

Data Analysis
· Abrir espectros o secuencias:

· 4 sub-aplicaciones. Se accede con los botones indicados:

Son: Integracion, Calibración, Manipulación señal, tareas análisis UV.

Diagnosis
Herramienta básica en el caso de avería. Permite detectar el origen, indicando el
problema observado.
Tiene un diagrama del sistema que permite hacer tests para cada módulo.

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Puesta a Punto del Sistema HPLC
Preparación Disolventes
Preparar 1 L para uso continuo, menos si es antes de día festivo. Medir en probeta 1 L.
Eliminar el aire ocluido en los disolventes via ultrasonidos o flujo de Helio.
Los solventes con el tiempo pueden coger aire, o evaporarse parte del TFA. Por lo tanto, no
usar si han pasado 4 días. El 1r día de la semana se preparan, no valen los del viernes.
Reutilización solventes orgánicos: Tratamiento extra previo de sonicar al vacío 5 min.
En solventes próticos (agua y demás) con TFA no se pueden reutilizar. Parte del TFA puede
estar en forma aniónica y por lo tanto no tendremos un % conocido del ácido.

· H2O milliQ: Sonicar 10-15’ con vacío.

· ACN: Sonicar mínimo 6’, sin vacío, pero con tapón no roscado o papel aluminio.
Es para evitar que se contamine, pero permitiendo que salga el aire.

· (H2O/ ACN) + TFA: Se añade el ácido después de sonicar.

- Standard [H2O+ 0.1% TFA] y [ACN+ 0.07% TFA]. Esta proporción está optimizada para una
buena separación. Además da una línea de base con la mínima deriva. (Menos TFA en el ACN
compensa la absorción al UV del ACN.)
Este casi-PNT usa estos disolventes como referencia.

· (MeOH)/ (H2O + TFA): Si se añade TFA al MeOH, se puede formar CF3COOMe y perjudicar
en los análisis y a la larga al aparato.

· iPrOH/Hexano: Se usa con la columna de fase directa.

· Otros ácidos/bases, buffers: Informarse de la compatibilidad con la columna. Ciertos pH

pueden ser nocivos para la fase reversa y hacer que sangre. (Ver folletos columnas).

· Otros disolventes. No hagáis el loco. Comprobar qué se puede usar con los folletos de
columnas y aparato HPLC. Recordad que los tubos, conexiones, válvulas, son de plástico y
algunos disolventes pueden ser perjudiciales.

Colocación de los Disolventes

Colocar disolventes en los canales pertinientes.
- HPLC VENTANA: Canal A: H2O Canal B: ACN
- HPLC MEDIO: Canal C: H2O Canal B: ACN

Enroscar bien la botella. Sino puede salirse el tubo durante el análisis y coger aire en vez
de disolvente, cosa mortal para el HPLC.
Controlar que el filtro de entrada toque el fondo. Si está en un nivel medio, cuando el
nivel de disolvente sea más bajo que el del filtro, entraría aire (mortal).

Indicar cantidad de solvente a programa:

Ins 1 On-line: En el Diagrama Solvent, botón derecho mouse a botellas: Solvent Bottle Filling…

En el mismo menú tiene que estar marcada la opción que el sistema se pare si el nivel de
solvente es inferior a…: ⌧ Prevent solvent filling … L. Lo recomendable: Inferior a 0.25 L.

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Purga del Sistema
· Esencial para purgar los canales y “ambientar” los pistones y válvulas.

Purga canales
Girar válvula de purga ABRIR: Antihorario. CERRAR: Sentido agujas reloj
OJO!!! No abrir/cerrar llegando al límite, haciendo fuerza. Se desgasta la valvula y no serviría.
Con suavidad, con dos dedos, hasta notar el tope!!!

Programa On-line. En el Diagrama Solvent, dar a pump Menú

- Auxiliary Cambiar a máximo flujo 5 mL/min.
- Set up pump Ventana control flujo y % solventes. Sabiendo que hay en cada canal, pasar:
· 100% H2O. 5 mL/min. Durante 7 min aprox.

Pasado este tiempo, sin bajar el flujo a 0 mL/min, ponemos a purgar el canal de ACN.
· 100% ACN. 5 mL/min. 7 min aprox.

Se hace en este orden porque así el último solvente en pasar es el solvente que vamos
a usar en el siguiente paso.

Una vez purgados los canales, se baja el flujo a cero. Cambiamos en Auxiliary a 1 mL/min.
Cerramos la válvula de purga (sentido horario).

OJO! El % de solvente de B se pone automáticamente según el que hayamos puesto en A.

En el HPLC del medio se usa el canal C, por lo tanto hay que indicar en los dos canales el %.
Vigilar SIEMPRE que pone 0% en los canales no usados, sino entraria aire!

En condiciones de purga la presión del sistema tiene que ser 0-5 bar. Si da más, ver
Solución de Problemas.
Si se cambia el disolvente de un canal, necesita más tiempo de purga.
Si se usan disolventes con buffers, hay que purgar el sistema al final del análisis con
disolventes sin buffers.
OJO! Muy importante con los buffers salinos! Las sales pueden colapsar en las válvulas y
obstruirlas.También obturar la celda y todo lo que se menea.
Hay un programa de purga programado (PURGA.M). En caso de usarlo, no olvidar de
abrir/cerrar la válvula de purga y cambiar el flujo en auxiliary igualmente.

Limpieza y Acondicionamento Columna

LIMPIEZA: 100% ACN. 1 mL/min. 10 min aprox.

ACONDICIONAMIENTO: % ACN deseado. 1 mL/min. 6 min mínimo.

Si dejamos más tiempo acondicionando, el sistema se estabiliza mejor, la línea base mejora,
entre otras cosas.

La línea base debe ser cero en el punto del análisis donde la señal de los solventes es
mínima.

Ejemplo: Analizar a 220 nm con el Linker, que empieza a 20% ACN y va hasta 100%, la señal
es más baja al 20% ACN.
Nos interesa que en caso que haya deriva, sea positiva (la línea base suba).
Por lo tanto daremos como cero de absorbancia al 20% ACN.

COMO PONER A CERO de señal en el % solvente que nos interesa:

- Acondicionar a ese % hasta que la línea base observada en el On-line sea
estable.
- Darle al botón Balance.

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Análisis de muestras

Programación de secuencia
· Definir parámetros Operador
Click al disco duro (debajo Bandeja viales).
- Operator Name: Saldrá en los reports.
- Subdirectory: Define la carpeta donde va a grabar los espectros.

Ahora hemos decidido tener un operador único, el 309Met, de dónde saca todos los métodos.
El subdirectorio es 309. Cada uno tiene que encargarse de sacar sus espectros de la carpeta y
ponerlos en su carpeta personal, o enviarlos al ordenador 309-1.

HPLC VENTANA
· Carpeta 309 y 309Met está en C:\ HPCHEM\1\DATA. Hay acceso directo en escritorio.
· Carpetas usuarios están en el disco duro F:\. “ ”
HPLC MEDIO.
· Carpeta 309, 309Met, y de Usuarios están en C:\ USUARIS. “ “

· Click a Bandeja viales Ventana programación muestras. Hay que escribir:

Vial Sample Name Method Name Injections Datafile Inj Volume

Posición vial Nº injecciones* = q name Max 100

* Nº injecciones siempre será 1. Sólo en casos excepcionales, p. ej. limpiar aguja, haríamos 3
inyecciones de lo mismo (DMSO).

Los programas que vienen en la lista de Method Name no son los del Operator Name ni del
Subdirectory Name. Son los del usuario que sale al darle en el desplegable de Methods.

Ej: Desplegable donde pone DEF_LC.M

Al abrir el desplegable, saldrá la ruta de acceso a ese método, y veremos de qué

usuario viene.
Como esto siempre era un problema a la hora de hacer programas nuevos y encontrar donde
guardarlos, finalmente se ha optado por lo de un usuario único como operador (309).

Los programas de Acon, limpieza, parar… etc que no se pincha ninguna muestra hay que
dejar en blanco ciertos campos, y el nombre es opcional.
Ejemplo:

Vial Name Program Inj Data file Volume

____ ____ ACON20 1 ____ ____

Si no ponemos nombre, se gravará como NV—xxxx (nº).

De vez en cuando hay que hacer limpieza en el directorio donde se guardan las pinchadas,
eliminar estos archivos NV-xxx para liberar espacio.

Para empezar la secuencia, darle al botón START. Se pueden ir añadiendo muestras después
de la que está corriendo.

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 APAGADO AUTOMATICO: Podemos dejar una secuencia con la opción que se pare al
acabarla (p. ej. Por la noche):
- Poner programa PARAR al final de la secuencia. Es una limpieza que acaba en 100%
ACN a 0mL/min.
- Menú Operador: …: ⌧ Post-Sequence Cmd/Macro: STANDBY
Hay varias opciones de Post Sequence, pero la que funciona de verdad es esta.

OJO! No se puede dejar secuencia antes de un día festivo!

En caso de dejar secuencia por la noche, el responsable debe venir al día siguiente a comprobar
que se ha apagado bien.
Este aparato falla y a veces por magia se le borra la crucecita, no se para, y va pasando
solvente hasta agotarse. Si el nivel de solventes estaba mal indicado, puede entrar aire en la
columna (mortal).

OJO! Una vez dado al Start, no se puede poner la crucecita!

· Podemos parar la secuencia en el minuto final de alguna pinchada (cuando se acondiciona).
· Ponemos la crucecita (⌧ Post-Sequence..).
· Dejamos que se acondicione antes de lanzar de nuevo la pinchada en el % adecuado.
· Hay que actualizar la secuencia, borrar las pinchadas que ya se han hecho.

Para empezar la secuencia, darle al botón START. Se pueden ir añadiendo muestras después
de la que está corriendo.

Si cambiamos flujo, % solvente, antes de pinchar, él interpreta que estamos modificando el

método que había el principio. Por esa razón, cuando damos al Start, nos saldrá un mensaje
preguntando si queremos guardar los cambios en el método. La respuesta es NO.
Recordad que si queremos modificar métodos, lo mejor para evitar colapsos
softwariales es hacerlo desde el Off-line.

Es recomendable hacer siempre un blanco, ya sea sin pinchar o pinchando ACN, para
detectar picos fantasmas, problemas de deriva de la línea base, contaminaciones en la aguja,
vial o solvente… (Ver solución de problemas)

Podemos hacer lo anterior todo por separado, o programar una secuencia con:
CLEAN.M ACON BLANCO MUESTRAS

Preparación de las Muestras

Concentración. Cada compuesto tiene su de absorción, por lo que es difícil marcar unas
reglas.
En general, es suficiente una concentración con la que veamos 100 UA. No hace falta
saturar la columna con unos picachos que llegan a la sexta planta y que se quedan forever
eluyendo en las siguientes pinchadas.
En caso de pasarse un huevo, limpiar la columna con un programa de limpieza (100%
ACN, 5-6 min, con unos minutos de acon final), antes que pinche la siguiente muestra.

Cantidad solvente necesaria. No quiere decir que si vamos a pinchar 20 uL, pongamos 20
uL. Podría coger aire!
COMO CALCULARLO?
· Hay que poner de sobras para que pinche y volumen extra.
· Si vas a poner la muestra en el momento, con 20 uL extras es suficiente.
· Si es una secuencia y la muestra va a tardar en pincharse, calcula que el solvente se evapora!
· Si la muestra preparada contiene agua, te va a aguantar más tiempo sin evaporarse.

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Teniendo en cuenta que a veces se tiene muy poco material y hacer diluciones representaría no
ver nada, os doy unos parámetros mínimos de volumen.

· Si va a tardar de 1 a 2 horas en pincharse, poner 50 uL extra.

· Si va a tardar más (secuencias de noche), poner 50 uL y septum.

No podemos pinchar todos los crudos en el HPLC!

Pretratamiento muestras:
· Filtración: Filtros PVDF 0.4 mm o inferior. Coger muestra con jeringa y aguja y filtrar.
· Evaporación disolventes de crudos nocivos: Los halogenados.
· DMSO y DMF no se pueden evaporar. No son dañinos para la columna, pero dan picos anchos
a 1-5’ (Linker).
IDEA: Si DMF emascara picos, se puede hacer una mini-extracción en un vial de HPLC con HCl.

Lavado de Viales e Insertos

· Una vez usados, separar viales y insertos en dos vasos de plástico diferentes.
· OJO!!! Vaso de insertos: Al tirar los insertos dentro, se pueden romper del choque unos con
otros.
Solución: Echarlos con cariño, o ponerlos con agua para que amortigue el golpe.

· El procedimiento de lavado es:

- Agua+ Jabon: Sonicar 7’. Enjuagar bien para quitar espuma (puede ser agua del grifo).
Enjuagar finalmente con agua destilada.
- 2 x Agua destilada. Sonicar 7’.
- 3-4 x Acetona. Sonicar 10’.
- Es habitual que queden burbujas de aire al cambiar de agua a acetona que hagan que
floten los insertos y no se limpien bien. Llenaremos de cetona (con el flascón)
los que se resisten.
- Secar con trapicel al aire. Repasar que estén bien lavados.

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Detección de Problemas

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DETECCIÓN MEDIANTE EL SOFTWARE

· Ciertos problemas se pueden detectar mediante els software. Si el aparato detecta alguna
anomalía o disfunción, automáticamente se para.
· El diagrama de módulos nos ayudará a aislar el problema.

· Cuando el software da errores (rojo), se puede concretar el problema y encontrar posibles

causas mediante el Current Logbook.

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DIAGNOSIS APPLICATION
· Aplicación del Software. Usar en el Ins 1 On-line.
· Desplegables para seleccionar el problema observado. Propone posibles causas y ofrece test
de diágnostico.
· Informa sobre el numero de inyecciones realizadas, volumen pasado, estado de la lámpara…

PREVENCIÓN AUTOMÁTICA DE DAÑOS

· El aparato tiene sistemas de detección de anomalías para evitar daños mayores.

PÉRDIDAS DE SOLVENTE
· En cada módulo de HPLC hay un sistema de desguace para las posibles pérdidas que van a
parar a una resistencia.
Si esa resistencia se moja, el aparato se para, el diagrama de módulos se pone en rojo.

SOBREPRESIÓN
· Si la presión del sistema supera la máxima establecia -400 bar-, se para.

NIVEL DE SOLVENTES CRÍTICO

· El nivel de solvente crítico se determina en el menú de volumen de solventes.
· Cuando llega a ese nivel, el aparato se para.
Si no se para la secuencia (no se ha puesto crucecita en STANDBY o el software falla), se
podría parar el flujo con este sistema.

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Recomendaciones para evitar
disfunciones
LA DELICADEZA DEL SOFTWARE.
· Snapshot: Mejor des del On-line: Menú Instrument Snapshot
· Es recomendable hacer siempre un blanco, ya sea sin pinchar o pinchando ACN, para detectar
picos fantasmas, problemas de deriva de la línea base, contaminaciones en la aguja, vial o
solvente… (Ver solución de problemas).

· Trabajar siempre con un usuario en Operator Name y Subdirectory (Sequence Parameters).

Si no se pone nada, se grava en carpeta .

LA ESTABILIZACIÓN DEL SISTEMA ES MUY IMPORTANTE

· Para tener buenos resultados y evitar problemas, cuando uno va a usar el HPLC y está
parado, hay que:
· Purgar canales. Opcional si el día anterior se usó.
· Limpiar la columna (5-10’ 100% ACN).
· Acondicionar (5-10’ mínimo). Cuanto más tiempo, más se estabiliza la presión y la linea base
UV.

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Verificación
Es recomendable que delante de cualquier problema, después de probar una solución,
verificar que funciona con:
1. Limpieza columna con ACN: Mirar que la presión es estable y sale toda la suciedad (picos,
productos retenidos de la pinchada anterior, sangrado columna…).
2. Acondicionamiento: Comprobar que la presión se mantiene estable.
3. Blanco: Depende del caso, sin pinchar o pinchando ACN.
4. Muestras. Si es necesario, pasar un patrón primero para comprobar que el tiempo de
retención se mantiene.

Nota: por favorrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr cumplid este paso. Las prisas, colar muestras
cuando aun no se ha verificado ni estabilizado el sistema, no sirve para nada.
Los minutos que crees que vas a ganar se pueden convertir en una semana más de demora
reparando de nuevo el HPLC.

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