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Laboratorio de biociencias
Dra. Ana Ly Arroyo Herrera
Grupo 3
Elaboró:
Br. Cetina Pérez Irving Adrián
Br. Novelo Sarabia Patricia
Br. Sabido Che Amauri
Br. Serrano Gómez Nidia Rosa
Br. Torres Rivero Fernando Miguel
Mérida, Yucatán
21 de Marzo de 2018
Práctica 4: Transformación de plásmidos en células bacterianas.
Antecedentes
El corte de una molécula de ADN con una determinada enzima de restricción dirige
el ADN en una colección de fragmentos característica y reproducible, que refleja la
frecuencia y la localización de los lugares de corte específicos.
Las enzimas de tipo I cortan las dos cadenas del ADN en una posición
aleatoria a ciertas distancias del sitio de restricción
Las enzimas de tipo II, reconocen una secuencia específica y cortan las dos
secuencias de la molécula de ADN con absoluta precisión dentro de las
secuencias reconocidas. Las secuencias reconocidas por las enzimas de
Tipo II son simétricas (palindrónicas), es decir, la secuencia de una de las
cadenas leída en dirección 5´ 3´ es la misma que la secuencia de la cadena
complementaria leída también en dirección 3´5´.3
La transformación es el proceso por el cual ciertas bacterias (llamadas
competentes), son capaces de incorporar ADN exógeno proveniente de otras
bacterias, que está libre en el medio. El proceso de transformación bacteriana se
refiere a la alteración del genotipo y el fenotipo de una célula bacteriana por la
captura de ADN extraño y desnudo del ambiente circundante.
La transformación requiere tanto la captación del ADN del medio que rodea a la
bacteria como su incorporación al cromosoma bacteriano o a un plásmido. Las
bacterias que captan el ADN son competentes ya que captan el ADN con mayor
facilidad que otras; la competencia se ve influida por el estadio de crecimiento, la
concentración de ADN disponible y la composición del medio.
La PCR requiere de un molde a partir del cual se generan las copias, dos
oligonucleótidos (cebadores o primers) específicos complementarios a una porción
de la región que se desea amplificar, una enzima capas de sintetizar ADN utilizando
como molde ADN y los deoxinucleótidos (dNTPs) que serán incorporados a las
cadenas nacientes de ADN.7
Una vez que el ADN ha sido amplificado mediante la PCR los amplicones se
visualizan empleando la electroforesis en geles de agarosa para conocer si dicha
amplificación ocurrió eficientemente. La electroforesis se basa en la separación de
cierta molécula a través de una matriz sólida la cual funge como filtro al separar a
la molécula en un campo eléctrico de acuerdo con su tamaño y carga. En el caso
del ADN su grupo fosfato les otorga una carga negativa, teniendo que durante la
electroforesis migran hacia el polo positivo. El gel se prepara diluyendo agarosa en
un buffer y solidificándola de nuevo, mientras que el bromuro de etidio se añade ya
que permite la visualización de los amplicones al ser irradiado por luz UV. El
marcador molecular se carga en el gel junto con los amplicones (al contener un
segmento conocido de ADN facilita su identificación). 8
Objetivos
Adicionar 2L de ADN (solución stock del vector de clonación) a las células
competentes. Esto se hace en condiciones estériles.
Incubar las células a 42°C durante 50 segundos (No agitar, punto crítico:
temperatura exacta y tiempo exacto).
Incubar las cajas durante ~16 horas (toda una noche) a 37° C.
R1-2
B) PCR y Electroforesis
B)PCR y Electroforesis
Una vez solidificado el gel, retirar el peine en forma vertical, retirar los topes
de la cama y verter amortiguador TAE 1X hasta cubrir por completo el gel
de agarosa.
Componente Volumen
Agua 18 μL
Amortiguador 10X 2.5 μL
dNTPs 0.75 μL
Cloruro de Mg 1.5 μL
Oligonucleótido S 1 μL
Oligonucleótido AS 1 μL
Taq Polimerasa 0.25 μL
Una vez realizada la inserción del gen, la cepa de E. coli fue inoculada
observándose un crecimiento sin colonias aisladas (véase Figura 3).
Discusiones
En la práctica de la primera semana, se realizó como primer paso la inserción del
gen que confiere resistencia a la ampicilina, al plásmido de una cepa bacteriana; en
este caso a la cepa de E. coli (XL1-Blue, DH5α, TOP10, etc.), a este procedimiento
se le nombró transformación bacteriana. La captación de dicho inserto se logró
identificar a través del crecimiento bacteriano en cultivo de agar LB-Ampicilina y se
atribuyó al procedimiento utilizado para favorecer la captación de ADN exógeno;
choque térmico. Para esta metodología empleada fue importante el cambio brusco
de temperatura y la duración, ya que, para obtener óptimos resultados, los tubos
con la suspensión celular se deberían sacar directamente del hielo, situarlos en un
baño a 42 º C durante 50 segundos y ponerlos inmediatamente en hielo otra vez, es
muy rutinario dada la facilidad de realización del mismo y la no necesidad de utilizar
aparatos sofisticados, a diferencia de la electroporación. No obstante, la eficiencia
del mismo puede resultar baja, según el caso.9
Conclusión
Referencias
1. Campbell N.; Reece j. Biología. 7ª ed.; editorial medica panamericana,
España 2005. pp 348-349.
2. Pierce B. Genética: un enfoque conceptual. 3ª ed.; editorial medica
panamericana, México; 2009, pp 312-314.
3. Kenneth J.; Geoge C. Microbiología médica. 5ª ed.; Mc Graw Hill. México;
2010 pp 293.
4. Tecnología de ADN recombinante.
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNArecombinante/Tecnica%20D
NA%20recombinante.pdf (Consultado en marzo de 2018)