PRÁCTICA 4.

TIROSINASA: Extracción y evaluación de su actividad

enzimática

Tipo de práctica: Duración: Indicaciones de peligro:

Grupal (2 personas) 4 horas

OBJETIVOS

 Extraer la enzima tirosinasa de diferentes fuentes (banano, manzana y

papa).
 Determinar la actividad de la tirosinasa, usando como sustrato L-DOPA.
 Comparar la actividad de la enzima en diferentes fuentes y bajo diferentes
condiciones: calentamiento y en presencia de un inhibidor (NaCN).

Conceptos relacionados: Actividad enzimática, constante Michaelis-Menten

FUNDAMENTO TEÓRICO

Pardeamiento enzimático

La coloración café oscuro que se va formando en la superficie de algunas frutas

y vegetales cuándo se cortan, se denomina pardeamiento y se debe a la acción
de la enzima tirosinasa sobre el aminoácido tirosina, que en presencia de
oxígeno, lo va convirtiendo secuencialmente en dopa, dopaquinona y
dopacromo (café oscuro), hasta que termina en un pigmento muy oscuro
llamado melanina.
La secuencia de reacciones es la siguiente:

En esta práctica se pretende extraer la enzima tirosinasa de varias fuentes

vegetales (banano, manzana y papa), y ponerla a actuar sobre el sustrato L-
dopa, que se usa como droga antiparkinsoniana, hasta convertirlo en el
compuesto dopacromo, que es de color café oscuro; la concentración de éste
se puede seguir fotocolorimétricamente a una longitud de onda (λmax) de 420
nm.

La medida de la absorbancia a través del tiempo sirve para cuantificar la

velocidad de la reacción en términos de la cantidad de dopacromo que se va
formando, o de L-DOPA que va reaccionando:
Obtención de extractos enzimáticos

Se conoce como extracto enzimático a una fracción de material animal, vegetal

o microbiano, que contiene una mezcla de varias sustancias pero que se
caracteriza por presentar actividad de una o varias enzimas.

La preparación de un extracto enzimático se inicia con la adición al material

seleccionado de una solución amortiguadora, que garantice la conservación de
la actividad de la enzima o enzimas objeto de la extracción. Con el fin de
obtener un extracto lo más purificado posible, se acostumbra someter el
material a uno o varios de los siguientes procedimientos:

 Ruptura mecánica por molido o trituración.

 Separación de la enzima por autólisis: autodigestión del material por otras
enzimas de la misma célula.
 Adición de la enzima lisozima, que hidroliza el polisacárido mureína de la
pared celular.
 Congelación y descongelación rápida.
 Tratamiento con ultrasonido.
 Separación de residuos poco solubles por filtración y centrifugación.

El material así obtenido se denomina extracto bruto, y se puede emplear para

hacer ensayos de actividad enzimática. Si se desea un extracto con mayor
porcentaje de pureza, será necesario recurrir a una o varias de las siguientes
técnicas:

 Purificación por diálisis a través de membranas semipermeables.

 Ultrafiltración bajo presión usando membranas de poros muy pequeños.
 Precipitación fraccionada en frío con un solvente orgánico.
 Filtración por gel usando sefadex, poliacrilamida o agarosa.
 Cromatografía de intercambio iónico.
 Electroforesis.
 Ultracentrifugación.
 Cromatografía de afinidad.

Los últimos 5 métodos se emplean específicamente para obtener enzimas

puras y cristalizadas, destacándose la cromatografía de afinidad, que consiste
en unir selectivamente la enzima a una columna que contiene una sustancia,
que puede ser un inhibidor reversible, que se enlaza únicamente a ella. Cuando
se pasa el extracto sobre la columna, todas las sustancias la atraviesan,
excepto la enzima objeto de estudio, la cual forma un complejo con el ligando.
La enzima retenida se recupera de la columna mediante un solvente apropiado.

Medida de la actividad enzimática.

Las velocidades de varias reacciones enzimáticas se pueden usar para

comparar la eficiencia de las enzimas involucradas cuando se expresan en
términos de la cantidad usada de éstas. Ello significa que:

Si se conoce con precisión la concentración molar de la enzima usada, la

expresión anterior se llamará actividad molar (o molecular) de la enzima:

Este valor representa las moles de sustrato capaz de ser transformado en

producto por un mol de enzima en la unidad de tiempo. Ello recibe el nombre
de número de recambio, número de transformación, o simplemente actividad
molar de la enzima.
Si no se conocen las cantidades exactas de las enzimas empleadas, se puede
usar como factor de comparación el volumen de los extractos enzimáticos
preparados en condiciones similares; no se podrá hablar de actividad molar,
sino simplemente de actividad enzimática:

Con esta expresión se pretende comparar la eficiencia de varios extractos

enzimáticos, al cuantificar las moles de sustrato que es capaz de transformar
en producto, un mililitro de un extracto en la unidad de tiempo.

Cinética de Michaelis Menten

Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato

sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX.
Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como
intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y
Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron la ecuación de velocidad
que explica el comportamiento cinético de las enzimas.

Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial y la concentración

inicial de sustrato, Michaelis y Menten propusieron que las reacciones
catalizadas por enzimas ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma
el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato se
transforma en producto y enzima libre:
Dónde: S es el substrato; E es la enzima libre; ES es el complejo enzima
sustrato; k1, k-1 y k2 son las constantes de velocidad de la reacción.

La ecuación de Michaelis-Menten describe como la velocidad de la reacción

depende del equilibrio entre la [S] y la constante k2. Leonor Michaelis y Maud
Menten demostraron que si k2 es mucho menor que k1, entonces existe
aproximación del equilibrio dando como resultado la siguiente ecuación
matemática:

Esta famosa ecuación es la base de la mayoría de la cinética enzimática que

involucra solo un sustrato. La constante de Michaelis (Km) se define como la
concentración a la cual la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de la
Velocidad máxima (Vmax). La gráfica de velocidad frente a [S] no es lineal:

Aunque a bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va

curvando a medida que aumenta la concentración de sustrato. Esto dificulta
determinar la cinética de la enzima. Lineweaver Burk desarrollaron la
linealización de la ecuación de Michaelis-Menten, dando como resultado la
gráfica de Lineweaver-Burk:
La gráfica de Lineweaver Burk o representación de doble recíproco es la forma
más común de mostrar los datos cinéticos. Para ello, se toman los valores
inversos a ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten es decir: y = 1/v y
x=1/[S]. Como se puede apreciar en la figura de la derecha, el resultado de
este tipo de representación es una línea recta cuya ecuación es “y = mx + b”,
siendo b el punto de corte con el eje y. Además, este intercepto equivale a
1/Vmax y, el punto de corte en el eje x equivale a -1/Km.

La ecuación que se obtienen de la gráfica de Lineweaver Burk permite

determinar la Km y la Vmax mediante una regresión lineal donde la pendiente
(m) corresponde a Km/Vmax y, 1/Vmax corresponde al punto de corte en el eje y
como se mencionó anteriormente:
MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales: Reactivos:
 Mortero  Solución buffer de fosfato 0.1M a
 Gasa o lienzo pH = 7.2
 Vaso de precipitados 50 y 100  Solución buffer de fosfato 0.1M a
mL (2) pH = 6.0
 Tubos de ensayo (5)  Solución de L-DOPA (197.2
 Espectrofotómetro g/mol) 0.03M en buffer a pH =
 Termostato baño María 6.0 (Se disuelve una cápsula de
 Centrífuga L-DOPA en 50 ml de buffer para
 Hielo que quede con una
concentración de 4 mg/mL (30
mM))
 Fuente de tirosinasa (banano,
manzana y papa)

METODOLOGÍA

A. Preparación del extracto enzimático

 Se prepararán tres extractos: banano, manzana y papa, cada uno por

separado.
 Se pela el fruto, se corta en trozos pequeños y luego se pesan 20 gramos.
 Se adiciona 15 mL de buffer de fosfato pH=7.2 y se tritura en un mortero
pre-enfriado (baño de hielo); adicionar 15 mL más del buffer.
 Se filtra el extracto sobre una gasa y se recibe el filtrado en un vaso de
precipitados. Se trasvasa el filtrado a tubos de 15 mL y se centrifuga a
2000 rpm durante 10 minutos.
 La solución sobrenadante se transfiere a otro tubo teniendo cuidado de no
trasvasar el precipitado. Medir el volumen del sobrenadante.
 Se diluye el sobrenadante a una proporción 1:1 con solución buffer pH =
7.2
 La solución diluida se conserva en un baño de hielo o se almacena en la
nevera a 4°C y se rotula como “Extracto enzimático de banano, manzana o
papa según sea el caso”.
 Cuando sea el momento de realizar las lecturas en el espectrofotómetro, se
lleva a temperatura ambiente.

B. Medida de la actividad enzimática en condiciones normales

 En un tubo de ensayo “No.1”, preparara la mezcla de reacción así: 1 mL

del extracto enzimático, 3 mL de solución buffer de pH = 6.0 y 1 mL de
solución de L-DOPA 30 mM (éste último debe adicionarse al momento de
realizar las lecturas en el espectrofotómetro).
 Inmediatamente después de agregar el sustrato (DOPA) en el tubo No.1,
colocar la muestra en la celda e introducir en el espectrofotómetro.
 Calibrar el equipo a una longitud de onda (λ) de 420 nm y configurar en
absorbancia cero (0)
 Proceder a tomar las lecturas de absorbancia cada 30 segundos,
contabilizando el tiempo a partir de cero hasta completar 8 minutos.
 Anotar los datos en la tabla 1, bloque: Tratamiento 1.
 A partir de los datos, determinar la ecuación de la recta, la pendiente y el
coeficiente de determinación (r2).

C. Medida de la actividad enzimática con aumento de temperatura

 En un tubo de ensayo “No.2” agregar: 1 mL de extracto enzimático y 3 mL

de solución buffer a pH = 6.0
 Introducir el tubo No.2 en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos y
luego dejar enfriar hasta temperatura ambiente.
 Agregar 1 mL de L-DOPA 30 mM, colocar la muestra en la celda e introducir
al equipo (verifique que el equipo esté a λ= 420 nm)
 Ajustar en absorbancia 0 y continuar registrando las absorbancias cada 30
segundos iniciando desde tiempo cero hasta completar 8 minutos.
 Registrar los resultados en la tabla 1, bloque: Tratamiento 2.
 A partir de los datos, determinar la ecuación de la recta, la pendiente y el
coeficiente de determinación (r2).

D. Medida de la actividad enzimática en presencia de un inhibidor

 Prepare un tubo de ensayo “No.3” y agregar: 1 mL de extracto enzimático,

3 mL de solución buffer de pH = 6.0 y 100 mg de ácido ascórbico.
 Adicionar 1mL de solución de L-DOPA 30 mM y colocar la muestra en la
celda e introducir al equipo (verifique que el equipo esté a una λ= 420 nm)
 Ajustar en absorbancia 0 y continuar registrando las absorbancias cada 30
segundos, desde tiempo cero hasta completar 8 minutos.
 Registrar los resultados en la tabla 1, bloque: Tratamiento 3.
 A partir de los datos, determinar la ecuación de la recta, la pendiente y el
coeficiente de determinación (r2).

Tabla 1. Resultados actividad enzimática Tirosinasa en Papa (P), Banano (B) y

Manzana (M) en condiciones normales (tratamiento 1), con aumento de
temperatura (tratamiento 2) y con inhibidor (tratamiento 3).
Absorbancia (λ=420 nm)
Tiempo (seg) Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3
P B M P B M P B M
0
30
60
90
120
150
180
210
 240
270
300
330
360
390
420
450
480
Ecuación de la recta

Pendiente (m)

Coeficiente de
determinación (r2)

 Con los resultados obtenidos para cada uno de los extractos vegetales
(papa, banano y manzana) y, para cada tratamiento (condiciones
normales, efecto temperatura y, presencia de inhibidor), construya las
gráficas de “Absorbancia vs. tiempo” en las que incluya la ecuación de la
recta, las pendientes y el coeficiente de determinación para cada uno de los
extractos (banano, papa y manzana) (como se indica en la tabla 1).
 A partir de la pendiente (m) para cada regresión lineal, determine la
actividad enzimática de cada extracto en unidades de “Abs/(min*mL)” y la
velocidad en unidades de “Abs/min”.
 Compare la actividad enzimática del extracto de la enzima tirosinasa en los
diferentes vegetales (papa, manzana, banano) y bajo los diferentes
tratamientos. De una explicación de los resultados.
 Determine el porcentaje de inhibición para el extracto que le fue asignado
al cual se le adicionó inhibidor (ácido ascórbico), empleando la fórmula:
%Inhibición = [1-(mi/mn)] x 100
Dónde: mn es la pendiente en condiciones normales y mi es la pendiente
con inhibidor. De una explicación de este resultado.
 ¿Qué clase de inhibidor es el ácido ascórbico y como inhibe la reacción
bioquímica catalizada por la enzima tirosinasa?

E. Cinética de Michaelis-Menten

 Enumerar 5 tubos de ensayo y adicionar los reactivos que aparecen en la

siguiente tabla, excepto la L-DOPA. Utilizar el extracto enzimático (EE) de la
papa.
EE Buffer pH 6.0 L-DOPA 30 mM Concentración final
Tubo
(mL) (mL) (mL) L-DOPA (mM)
1 1.0 3.8 0.2 1.2
2 1.0 3.6 0.4 2.4
3 1.0 3.4 0.6 3.6
4 1.0 3.2 0.8 4.8
5 1.0 3.0 1.0 6.0

 Preparar el tubo No. 1 (concentración final L-DOPA 1.2 mM), adicionar el

sustrato (L-DOPA) según la cantidad descrita en la tabla. Colocar la
muestra en la celda e introducir al equipo (verifique que el equipo esté a λ=
420 nm)
 Ajustar a absorbancia 0 y continuar registrando las absorbancias cada 30
segundos, desde tiempo cero hasta completar 8 minutos.
 Repetir este procedimiento para los tubos 2, 3, 4 y 5, realizando las
lecturas inmediatamente después de adicionar el sustrato L-DOPA.
 Registre los resultados de absorbancia en la tabla 2.

Tabla 2. Actividad enzimática Tirosinasa del extracto de papa a diferentes

concentraciones de sustrato L-DOPA.

Concentración de L-DOPA (mM)

Tiempo (seg)
1.2 2.4 3.6 4.8 6.0
0
 30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
360
390
420
450
480
Ecuación de la recta
Pendiente (m)
Coeficiente de
determinación (r2)

 Con la información registrada en la tabla 2:

a. Determine las velocidades de reacción del extracto enzimático utilizado
para cada concentración de sustrato (L-DOPA)
b. Realice la gráfica de Michaelis – Menten con los datos de “Velocidad
(Abs/min) vs [L-DOPA]” que sean registrados en la siguiente tabla, y de
una explicación de la curva obtenida en la gráfica:

[L-DOPA] Velocidad
1/[DOPA] 1/Velocidad
(mM) (Abs/min)
1.2
 2.4
3.6
4.8
6.0

 Con los datos registrados en la tabla anterior, realice la gráfica del doble
recíproco “1/V vs 1/[S] que en este caso sería “1/Velocidad vs 1/[L-
DOPA]”. Explique la gráfica obtenida.
 Determine los valores Km y Vmax del extracto de tirosinasa empleando la
ecuación de Lineweaver Burk y de una explicación de los resultados. Señale
la Km y ½Vmax en la gráfica de Michaelis – Menten y en la gráfica de
Lineweaver Burk. Interprete los valores de Km y Vmax.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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