CONTROL Y MANDO DE PROCESOS BIOTECNOLÓGICOS

USANDO UNA APLICACIÓN FLEXIBLE DESARROLLADA EN LABVIEW

H. mediterranei es una archaeon haloplélica extrema que produce polisacáridos extracelulares con propiedades especiales. Para el
comando y control riguroso del bioproceso, se desarrolló un nuevo sistema de control y comando utilizando el entorno de programación
LabVIEW. El sistema se llamó, Biolab "y permite la regulación de la temperatura, el pH y el oxígeno disuelto con muy buenos
resultados, la aplicación reacciona rápidamente en los cambios del biosistema. La función de alimentación permite el mantenimiento de
varias concentraciones de sustrato durante mucho tiempo y puede usarse para ayudar a encontrar las condiciones de cultivo óptimas para
la producción de biomasa o polisacáridos.

Palabras clave: sistemas de comando y control, biotecnología, control de temperatura, control de pH, control PID.

INTRODUCCION La IV Federación Internacional de Control Automático

La biotecnología es un campo emergente en el límite entre la
biología y la ingeniería. En los últimos años, los metabolitos
valiosos como las enzimas (Aehle, 2004) o las vitaminas
(Shimizu, 2001) se producen de forma biotecnológica mediante
el uso de microorganismos. El desarrollo de un bioproceso
implica su control y comando. La estrategia de control es
fuertemente
depende del bioproceso. Por ejemplo, (Mailleret et al., 2004)
utilizan una estrategia de control adaptativo en los procesos de
tratamiento de aguas residuales, siendo la variable controlada el
oxígeno disuelto y la variable manipulada la tasa de aireación.
La estrategia de control de retroalimentación se utiliza para la
producción de biomasa de levadura (Heinzle y Saner,
1991) o para la producción de proteínas recombinantes
(Akesson 1999), siendo la variable controlada el coeficiente
respiratorio (en el primer caso) o el acetato como producto
secundario (en el segundo caso); la variable manipulada es la
tasa de alimentación de glucosa para ambos casos.
Los sistemas de cultivo utilizados en el cultivo de
microorganismos son por lotes, alimentados por lotes y
continuos. El sistema de lotes está cerrado, el cultivo significa
la presencia dentro del biorreactor de la cantidad total de
sustrato y células microbianas desde el principio, sin otras
entradas y / o salidas. El sistema por lotes es más barato,
pero el crecimiento y la producción de metabolitos se ven
inhibidos por la alta concentración de sustrato necesaria. Este
problema puede evitarse utilizando el sistema de cultivo
fedbatch que permite mantener un nivel de sustrato constante,
al introducir un nuevo sustrato en un biorreactor,
frecuentemente después de una función de alimentación
exponencial (Posten y
Rinas, 2000). Para el control y el control de lotes y bioprocesos
fedbatch, se diseñó un nuevo sistema llamado "BioLab" basado
en el paquete de software LabVIEW. Este sistema es el
resultado de un proyecto de colaboración entre el Departamento
de Biotecnología de la Universidad de Karlsruhe, Alemania, y
el Departamento de Ingeniería Eléctrica, Peninsula Technikon,
Sudáfrica (Kriger et al., 2005). Este documento muestra los
resultados prácticos obtenidos mediante el uso de "BioLab"
para el comando y control del cultivo en lotes alimentados de
un microorganismo. El IFAC MCPL 2007
Conferencia sobre Gestión y Control de Producción y Logística
del 27 al 30 de septiembre, Sibiu - Rumanía 801
cepa elegida para probar el sistema de comando y control es una
nueva archaeon descubierta llamada Haloferax mediterranei. El
microorganismo se presenta en la literatura como productor de
polisacáridos extracelulares (EPS) (Oren, 2002). Estos
polisacáridos muestran propiedades interesantes como la
capacidad de unión de iones (Mironescu y Mironescu, 2004a) o
la estabilidad de la viscosidad en un gran dominio de pH,
temperatura y salinidad
(Mironescu, 2006; Anton et al., 1988). Debido a estas
propiedades, EPS podría encontrar aplicaciones en la industria
alimentaria como agente de viscosidad en condiciones extremas
o
como aglutinante de iones Existe poca literatura disponible
sobre la optimización de la producción de biomasa y / o
polisacáridos por H. mediterranei (Mironescu, 2006; Mironescu
et al., 2004b, Rodriguez-Valera et al., 1991). Por esta razón, las
investigaciones sobre los factores que influyen en el bioproceso
como la temperatura, el pH, la estrategia de alimentación son
necesarios. El objetivo de esto
la investigación es establecer si "BioLab" podría usarse para el
control de factores físicos que influyen en el cultivo de H.
mediterranei (temperatura, pH, oxígeno disuelto) y para el
comando de la alimentación en la fase de lote alimentado del
bioproceso. Los resultados ayudarán a optimizar el cultivo e
identificar las condiciones para la síntesis máxima de EPS.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismo, medios de cultivo y determinaciones
Se utilizó el microorganismo Haloferax mediterranei ATCC
33500 de DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen, Alemania). Los medios de cultivo contenían:
200 g / l de NaCl; 50 g / l de MgCl2x6H2O; 5 g / l de K2SO4;
0.133 g / l de CaCl2x2H2O; 0.025 g / l KH2PO4; 5 g / l de
extracto de levadura; 5 g / l de peptona. La glucosa se usó como
fuente de carbohidratos, en una cantidad de 3.5-5 g / l durante
la etapa del lote y (0.1-0.2) -2 g / l en la etapa de lote alimentado
del bioproceso. La biomasa formada se determinó
gravimétricamente después del secado (Mironescu et al.,
2003a). La glucosa y el EPS se midieron
espectrofotométricamente (Mironescu et al., 2003b).
Cultivo
Al diseñar la planta de cultivo, algunos requisitos fueron
importantes:
- Los recipientes y las tuberías deben ser resistentes a la acción
de corrosión del sustrato de cultivo;
- Es necesario un sistema de comando y control para el pH, la
temperatura y la alimentación del sustrato durante la fase de
alimentación por lotes;
- Se exigió un sistema para monitorear el oxígeno disuelto y los
gases evacuados del biorreactor (O2 y CO2);
- El control del oxígeno disuelto en el caldo de cultivo (DO2)
mediante agitación como variable manipulada. Teniendo en
cuenta estos requisitos, la solución técnica se presenta
esquemáticamente en la figura 1.
La aplicación "BioLab"
"BioLab" es una aplicación LabVIEW flexible y fácil de usar,
que tiene las principales características:
- el bioproceso está ordenado mediante el uso de una función de
alimentación ajustable durante la fase de alimentación por lotes
de un bioproceso;
- la temperatura se controla mediante el control on / off en
tiempo real de las válvulas para agua fría o caliente;
- El pH se controla mediante el encendido / apagado del control
en tiempo real de las bombas para ácido o base;
- el oxígeno disuelto se controla utilizando un controlador PID
de autoajuste de LabVIEW, que controla la agitación (velocidad
del motor);
- muestra gráficamente las variables físicas en tiempo real y
registra los datos para facilitar
interpretación y extracción de resultados para análisis;
- permite cambiar los valores mínimo, máximo y de punto de
ajuste de las variables como se desee y muestra errores y
alarmas (Kriger et al., 2005). El algoritmo de software está
estructurado en tres niveles: interfaz de proceso, nivel de
control e interfaz de usuario como se detalla en (Kriger et al.,
2005; Mironescu, 2006). La función de alimentación es
exponencial, adaptada después (Posten y Rinas, 2000) teniendo
la forma:
dónde:
KLabView - coeficiente; μ set - velocidad de crecimiento
específica, establecida para la fase de lote alimentado, h-1;
cX - concentración de biomasa, g / l;
VR: volumen de líquido en biorreactor al comienzo de la fase
de lote alimentado, l;
yXS - rendimiento teórico de biomasa, g / g;
cS_in - concentración de sustrato (glucosa) en el medio de
alimentación, g / l;
cS - concentración de sustrato (glucosa) en biorreactor, g / l.
El coeficiente KLabView tiene valores variables, dependiendo
de cS_in y de la rotación inicial de la bomba de alimentación
(Mironescu et al., 2004b); cX se establece prácticamente para
cada cultivo; VR es siempre 5 l; yXS = 0,5 g de biomasa / g de
sustrato (glucosa) (Korz et al.,
1995); μset se fijó 0,05 h-1 en base a los resultados
experimentales (Mironescu et al., 2004b); cS_in fue 50 y 100 g
/ l; cS se varió entre 0.1-0.2 (en el límite del método de
cuantificación) y 2 g / l. Tal como se presenta en (Kriger et al.,
2005), los parámetros se introducen fácilmente por el usuario
(en este caso, el biotecnólogo).
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Control de temperatura
La evolución de la temperatura durante un cultivo alimentado
por lotes se presenta en la figura 2. Se probaron dos valores de
puntos de referencia en el rango de temperatura óptimo de este
microorganismo: 38 ° C y 45 ° C.
Fig. 2. Uso de "BioLab" para el control y control de la
temperatura durante el cultivo de H. mediterranei. Se probaron
dos puntos de ajuste para la temperatura (38 ° C y 45 ° C).
Para analizar los resultados, el programa de control debe estar
correlacionado con las fases de crecimiento de las células. En
las primeras 12 horas, las células de H. mediterranei se
encuentran en la fase de retraso, se adaptan a las condiciones en
el biorreactor; las células no crecen y no producen
metabolitos, el control no es representativo del bioproceso.
Aproximadamente 12 horas después del inicio del cultivo, las
células comienzan a multiplicarse y la población se desarrolla,
estando en la fase de crecimiento exponencial. Durante el
crecimiento, H. mediterranei produce calor. Los cálculos
preliminares mostraron que 3 g / l de biomasa producen 18.75
cal / h (que corresponde al calentamiento del medio de cultivo
con 0.0187 ° C / h). Entonces, "BioLab" actúa más para
disminuir la temperatura en el biorreactor. Como muestran los
resultados, "BioLab" funciona bastante bien en el control de la
temperatura, las fluctuaciones alrededor de 38 ° C se encuentran
en el rango de ± 0,4 ° C. Después del cambio de punto de ajuste
a 45 ° C, el biosistema (que consiste en sustrato y células)
atiende en muy poco tiempo a la nueva temperatura (figura 2).
Después de que comiencen las 45 horas de cultivo, se inicia la
etapa de lote alimentado del cultivo. Como figura 2
muestra, en la etapa de lote alimentado las variaciones de
temperatura no son tan altas. En esta etapa, el metabolismo
celular no está más orientado a la producción de biomasa y se
produce menos calor.
Control de pH
Prácticamente se observó que el microorganismo produce
ácidos durante el crecimiento normal y en ausencia de factores
de estrés. Cuando el sustrato se vuelve limitado (como en el
caso del cultivo en lotes alimentados con concentración
limitada de glucosa) u otros factores de estrés aparecen, las
células están produciendo bases. Con base en estas
observaciones prácticas, se impone el control del pH durante el
cultivo. La Figura 3 presenta un cultivo en lote alimentado
donde se probaron dos valores de pH: 7.1 y 7.2, ambos en el
rango de pH óptimo de H. mediterranei. Como se muestra en la
figura 3, "BioLab" es eficiente para controlar el pH durante la
fase de cultivo del lote, las variaciones alrededor de los puntos
de ajuste están en el rango ± 0.02. Cuando se cambia el punto
de ajuste, el sistema reacciona muy rápido, atacando en poco
tiempo el nuevo valor de pH. Para el cultivo presentado en la
figura 3, la fase de latencia fue de alrededor de 24 horas y no se
muestra.
Fig. 3. Uso de "BioLab" para el control y control del pH durante
el cultivo de H.
mediterranei. Se probaron dos puntos de referencia para los
valores de pH (7.1 y 7.2).
Control de oxígeno disuelto
Los valores de DO2 durante el cultivo en lote alimentado sin
control de DO2 y agitación constante se presentan en la figura
4.
Fig. 4. Evolución de DO2 (puntos) y agitación (línea) durante
el cultivo en tanda alimentada de H.
mediterranei con caudal de aire de 1 l / min y sin control de
oxígeno disuelto en el lote de fed
escenario...
La cantidad de oxígeno disuelto en el caldo de cultivo (DO2)
influye fuertemente en el cultivo de H. mediterranei, que es
aeróbico (Anton et al, 1988). La solubilidad del oxígeno
depende de la composición del sustrato y de los metabolitos.
El medio utilizado en el cultivo de este microorganismo en
particular tiene una fuerza iónica muy alta (I ≅ 421) debido a
su contenido de sales y reduce la solubilidad del oxígeno. La
peptona y el extracto de levadura disminuyen el DO2 con
alrededor del 30% (Zarnea et al., 1980). Esta podría ser la razón
principal por la cual el valor 100% (aire saturado con oxígeno)
de DO2 se mantiene durante un tiempo corto al comienzo del
cultivo y disminuye al 90% en 6 h. Como se muestra en la figura
4, el DO2 disminuye durante la etapa del lote del 90% a
alrededor del 30% en la fase de crecimiento exponencial. Esta
fase comienza después de alrededor de las 18 h
de cultivo y termina después de 40 h. Después del inicio de la
etapa de fed-batch, muchas fluctuaciones
de DO2 se observan. Estas variaciones son causadas por el
metabolismo de las células, pero la presencia de polisacáridos
puede influir en los valores de oxígeno disuelto. Los EPS
modifican la viscosidad del sustrato de cultivo y, por lo tanto,
el coeficiente de transferencia de oxígeno. Las mediciones de
viscosidad en biorreactor mostraron que la mezcla de células-
EPS tiene
alta viscosidad, especialmente después del aumento del
contenido de polisacáridos a valores superiores a 5 g / l. Esta
concentración se ataca en la fase del lote alimentado,
comportándose el caldo como un fluido pseudoplástico (datos
no mostrados). Teniendo en cuenta estas observaciones, se
requiere el control del oxígeno disuelto a un valor constante en
la etapa de cultivo de fedbatch. Los valores de DO2 durante el
cultivo en lote alimentado con control de DO2 usando agitación
se presentan en la figura 5.
Fig. 5. Evolución de DO2 (puntos) y agitación (línea) durante
el cultivo en tanda de alimentación de H. mediterranei con
control de oxígeno disuelto por agitación en la etapa de fed-
batch usando "BioLab". El punto de ajuste del DO2 fue del
30%; el flujo de aire fue de 1 l / min durante todo el cultivo.
El cambio de agitación determina la variación de la dimensión
de las burbujas de aire y facilita el acceso del oxígeno a las
células (Bailey y Ollis, 1986). En los resultados presentados en
la figura 5, al comienzo de la etapa de alimentación por lotes,
se usó "BioLab" para controlar el DO2 al valor del 30%. Para
la calibración, se utilizó el control automático PID provisto por
LabVIEW. Los valores para los parámetros de PID se
calcularon en muchos pasos (cuatro en el caso presentado en la
figura 5), cada paso tiene de 10 a 15 ciclos. Ejemplos de
parámetros calculados se presentan en (Kriger et al., 2005). La
calibración de los parámetros PID es necesaria en cada cultivo.
Como se muestra en la figura 5, a veces son necesarias nuevas
calibraciones durante el mismo cultivo. El proceso lleva horas,
algunas mejoras futuras son necesarias para reducir el tiempo
de calibración.
Otra desventaja es que durante la calibración, la agitación varía
muy fuertemente. Estas fluctuaciones no estresan al
microorganismo, las células y el bioproceso no son visibles
influenciados por cambios de agitación en el límite de 300-600
rpm impuesto por los biotecnólogos.
Comando de alimentación
El análisis de la influencia de la concentración de glucosa en la
fase de alimentación por lotes en la biomasa y la formación de
EPS permite encontrar las condiciones óptimas de cultivo de
fedbatch para la producción de EPS. Para este propósito, el
biorreactor se alimentó con sustrato que contenía sales y
glucosa usando el sistema "BioLab". Los resultados de dos
cultivos con diferentes concentraciones de glucosa se presentan
en las figuras 6 y 7. En ambos casos, se forma una pequeña
cantidad de biomasa en la etapa de lote de cultivo, necesaria
para producir EPS. Dependiendo del contenido de glucosa que
se desea mantener, la etapa de lote alimentado comienza
iniciando la función "FEED" en "BioLab".
Fig. 6. Consumo de glucosa y formación de biomasa y EPS
durante el cultivo en tanda de H. mediterranei con control de
DO2 (25% en la etapa de alimentación por lotes), pH (7.2
durante todo el cultivo) y temperatura (38 ° C) durante el
cultivo) y el control de la alimentación con glucosa usando
"BioLab". Los parámetros de la función de alimentación
exponencial fueron: VR = 5 l; mX = 11,65 g; cS_in = 100 g / l
de glucosa; cS = 0,1 g / l de glucosa; KLabView = 18; μ = 0.05
h-1. Aireación
1 l / min
En el lote alimentado, el cultivo presentado en la figura 6
pretende iniciar la alimentación al final de la etapa del lote,
cuando toda la glucosa es consumida por el microorganismo y
para mantener la concentración de glucosa a valores muy bajos,
alrededor de 0.1 g / l. Como se muestra en la figura 6, la función
de alimentación funciona bien.
El sustrato introducido en el biorreactor es consumido
rápidamente por H. mediterranei, manteniéndose la
concentración de glucosa a 0.1-0.2 g / l durante la etapa del lote
alimentado. Debido a la alimentación con limitación de glucosa,
la biomasa y el metabolito registran diferentes evoluciones. La
concentración de biomasa aumenta al comienzo de la etapa del
lote alimentado y luego se mantiene constante a valores
alrededor de 5 g / l, mientras que la concentración de EPS
aumenta mucho de 5.69 g / l al comienzo a 14.37 después de 23
h de
alimentando con sustrato. Se puede concluir que el
metabolismo microbiano está orientado a la formación de
polisacáridos cuando la glucosa es limitante en el sustrato
nutritivo.
Fig. 7. Consumo de glucosa y formación de biomasa y EPS
durante el cultivo en lote alimentado de H. mediterranei con
control de DO2 (25% en la etapa de alimentación por lotes), pH
(7.2 durante todo el cultivo) y temperatura (38 ° C) durante el
cultivo) y el control de la alimentación con glucosa usando
"BioLab". Los parámetros de la función de alimentación
exponencial fueron: VR = 5 l; mX = 7,65 g; cS_in = 100 g / l
de glucosa; cS = 2 g / l de glucosa; KLabView = 27; μ = 0.05
h-1. Aireación 1 l / min.
En el caso del cultivo presentado en la figura 7, la alimentación
se inicia cuando el microorganismo todavía está en la fase de
crecimiento exponencial y hay suficiente glucosa en el medio.
Al inicio de la alimentación, la concentración de glucosa es de
2 g / l y esta glucosa
el contenido se mantiene alrededor de este nivel mediante el uso
de "BioLab". La producción de polisacáridos no se estimula en
estas condiciones (la concentración máxima de EPS)
siendo 8.83 g / l), pero la producción de biomasa es favorecida,
aumentando después de una función lineal. El comando de
alimentación también funciona bien en este caso, lo que
demuestra la eficacia de "BioLab". La introducción del término
KLabView en la función de alimentación exponencial para la
regulación de la bomba de alimentación ofrece flexibilidad y
precisión a la fase de cultivo del lote alimentado (Mironescu et
al., 2004b).
Conclusion
Se analiza un nuevo bioproceso para la producción de EPS
mediante el cultivo de fedbatch de la arqueología halófila
extrema Haloferax mediterranei. Para el control y el control del
cultivo en lotes alimentados, los parámetros que influyen en el
proceso son el pH y la temperatura durante todo el cultivo y el
oxígeno disuelto durante la etapa del lote de alimentación. Para
ndación Nacional de Investigación NRF Sudáfrica.
el mantenimiento de los parámetros de control en ciertos límites
durante el cultivo y para el comando de la alimentación durante
la etapa de alimentación por lotes, el sistema "BioLab" se
construyó utilizando el paquete LabVIEWsoftware. Los
resultados muestran un buen control de la temperatura, pH y
oxígeno disuelto, la aplicación reacciona rápidamente a los
cambios en el biosistema que consiste en células de H.
mediterranei, polisacáridos y sustrato rico en sales en diferentes
fases de crecimiento. El análisis de la evolución del DO2 en
bioprocesos sin y con control ofreció información valiosa sobre
el biosistema, influenciada por la presencia de EPS que
modifica la transferencia de oxígeno. La función de
alimentación construida en este trabajo es exponencial y
permite identificar el efecto limitante de la glucosa durante el
cultivo y encontrar
las condiciones de cultivo óptimas para la producción de
biomasa y / o EPS. Por lo tanto, la producción de polisacáridos
se maximiza cuando la concentración de glucosa es muy baja
en la etapa de cultivo alimentado por lotes. Ambos bioprocesos
(producción de biomasa
y síntesis de EPS) son estimulados cuando la concentración de
glucosa es alta.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Este trabajo de investigación se realizó bajo el proyecto de
investigación colaborativa "Optimización del proceso de
fermentación discontinua en la industria alimentaria"
financiado por la Oficina Internacional de BMBF-IB Alemania
y la Fu