Concentraciones gingivales de interleucina-23 y -17 en sitios sanos y en sitios De Pérdida de

Apego Clínico

Antecedentes: La presencia de interleucina (IL) -23 no se ha informado dentro de la encía

inflamada, por lo que evaluó su concentración dentro de la encía de sitios normales y sitios de
enfermedad periodontal crónica.

Métodos: Se obtuvo la encía previa a la extracción de los dientes. Se agruparon en base a la

pérdida de inserción clínica (CAL): 0 a 2 mm (normal-leve), 3 a 4 mm (moderada) y> 5 mm
(grave). Los tejidos se solubilizaron, e IL-12, -23, -6, -17, y -1b; Interferón - gamma (IFN - g); Y las
concentraciones de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) se evaluaron mediante ensayo
inmunoenzimático. Los datos fueron comparados por análisis factorial de varianza, prueba post
hoc de Tukey y prueba de correlación de Pearson. Los grupos fueron definidos como
significativamente diferentes cuando P <0,05.

Resultados: Las concentraciones gingivales de IL-23, -17, -1b, -6 e IFN-g fueron

significativamente mayores en los sitios CAL moderados que en los sitios normal-leve CAL. Las
concentraciones gingivales de IL-23, -1b, -17, y -6 y TNF-a fueron significativamente mayores en
los sitios CAL severos que en los sitios normal-leve CAL. Además, las concentraciones gingivales
de IL-23, -17, y -6 y TNF-a fueron significativamente mayores y las concentraciones gingivales de
IL-12 e IFN-g fueron significativamente más bajas en sitios CAL severos que en sitios CAL
moderados. Las concentraciones gingivales de IL-23, -17, -6, y -1b y TNF-a se correlacionaron
positivamente con la CAL. La concentración gingival de IL-23 se correlacionó significativamente
con las concentraciones de IL-17, -1b, y -6 y TNF-α y se correlacionó negativamente con las
concentraciones de IL-12 e IFN-g.

Conclusiones: Nuestros resultados sugirieron la posibilidad de que la respuesta inmune de IL-23

/ IL-17 estuviera presente en la encía inflamada crónicamente. Esta es una respuesta del
huésped que no se había informado previamente en la enfermedad periodontal y puede ser un
factor importante en la naturaleza crónica de la enfermedad.

Después de un desafío por bacterias periodontopatogénicas, las células CD4 + se incorporan al

tejido conectivo gingival donde inducen el desarrollo de subconjuntos de células T (TH)
auxiliares. El equilibrio entre estos subconjuntos determina el tipo de respuesta inmune
adaptativa. Un subconjunto de células TH1, que producen interleuquina (IL) -2, interferón-
gamma (IFN-g) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). El otro subconjunto es células TH2, que
producen IL-4, -5, -6, y -13.1.4 IL-12 e IFN-g son producidas por macrófagos, células dendríticas
y células asesinas naturales, que inducen TH0 para desarrollar células TH1 mientras que IL-4 y -
6 son necesarias para el desarrollo de TH2. Las células TH1 regulan una respuesta inmune de
tipo mediada por células y las células TH2 regulan una respuesta inmune de tipo humoral.
Además, cada subconjunto puede regular la función del otro. Por ejemplo, IFN-g (producido por
células TH1) inhibe el crecimiento de células TH2, mientras que IL-4 y -10 (producido por células
TH2) inhiben el desarrollo y la actividad de las células TH1. Por lo tanto, cuando un subconjunto
se convierte en dominante, puede suprimir el desarrollo del otro subconjunto, lo que hace difícil
modificar el tipo de respuesta inmune. Recientemente, se describió un tipo alternativo de
respuesta del huésped a bacterias patógenas: la vía IL-17 / IL-23. Esta respuesta se produce
cuando las bacterias inducen la síntesis de IL-23 en lugar de IL-12.
IL-12 y -23 tienen funciones contrastantes; Es decir, IL-23 promueve e IL-12 inhibe la síntesis de
IL-17. La IL-12 es necesaria para las respuestas antimicrobianas a patógenos, mientras que IL-23
es importante para el reclutamiento y la activación de una gama de células inflamatorias
necesarias para la inducción de la inflamación crónica, autoinmune. La respuesta inmunitaria de
IL-12 / IFN-g regula las condiciones inflamatorias sistémicas (por ejemplo, Lupus eritematoso
sistémico), mientras que la respuesta inmunitaria de IL-23 / IL-17 regula trastornos específicos
de tejidos (por ejemplo, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino y artritis reumatoide).

IL-17 es una citoquina que se informó a desempeñar un papel fundamental en la iniciación y el

mantenimiento de una respuesta inflamatoria. Esta citoquina es producida por células T CD4 +
activadas19,20 y neutrófilos. La función principal de IL-17 es amplificar la respuesta inmune
mediante estimulación de la secreción de quimiocinas, citoquinas y marcadores de superficie
celular. Se informó que IL-17 estimulaba células epiteliales, endoteliales y fibroblásticas para
producir IL-6 y -8. También se ha informado que IL-17 estimula la expresión del activador del
receptor del ligando B del factor nuclear-kappa, y del ligando 525 de quimioquina (motivo C-X-
C) por los osteoblastos in vitro. Se informó que los efectos de la IL-17 sobre la secreción de
quimioquinas por los osteoblastos tienen implicaciones significativas en la etiología de la
enfermedad inflamatoria ósea, incluyendo la periodontitis. Se informó que la expresión de IL-17
se regulaba positivamente en células derivadas de tejidos de gingivitis humana y periodontitis
in vitro e in vivo. También se informó que esta citocina estaba elevada dentro del líquido
crevicular gingival obtenido de sitios de periodontitis. En contraste, hay evidencia de que la IL-
17 está regulada negativamente en células derivadas de tejidos de periodontitis in vitro. Debido
a que la IL-17 puede estar en una forma soluble o unida por receptores a las membranas
celulares, estos informes contradictorios indican que se deben estudiar ensayos de tejidos
completos para evaluar con precisión la concentración gingival total de esta citocina.

IL-23 es un miembro de la familia de citoquinas IL-12. Es producido por las células dendríticas y
los macrófagos dentro de pocas horas después de la exposición a los lipopolisacáridos y otros
productos microbianos. Esta citoquina estimula la síntesis de IL-17, que promueve la síntesis de
otras citoquinas proinflamatorias (incluyendo IL-1b y -6 y TNF-a). La IL-17 se ha asociado con
muchas enfermedades inflamatorias, incluyendo la periodontitis. El descubrimiento de una
población de células T dependiente de IL-23 que mejora la síntesis de IL-17, pero no IFN-g o IL-
4, sugirió la necesidad de un subconjunto de células T separado de TH0, TH1 y TH2. Por lo tanto,
estas células han sido denominadas células THIL-17. La opinión actual sobre las funciones de las
respuestas inmunitarias IL-12 / IFN-g (TH1) e IL-23 / IL-17 se derivó del estudio de la inflamación
en sitios no orales. En estas localizaciones, la respuesta aguda a las bacterias patógenas es la
activación inmediata de la respuesta inmunitaria de IL-23 / IL-17, dando como resultado el
reclutamiento de neutrófilos en el tejido y la protección inmediata contra la invasión bacteriana.
Estos eventos son seguidos por la respuesta inmune específica de antígeno de IL-12 / IFN-g
(TH1), que elimina la bacteria patógena.14 Hay evidencia de una respuesta inmune desregulada
de IL-23 / IL-17 como factor de riesgo para varias enfermedades autoinmunes.

El estudio de la resolución de la inflamación gingival ha sido confundido por la presencia

simultánea de TH1 y TH2-tipo citoquinas dentro de la encía inflamada, lo que sugiere una
respuesta defectuosa TH1 a las bacterias que favorecen una respuesta inmune TH2 y la
hiperinflación. Sin embargo, si la inflamación gingival es similar a la de otros sitios, existe la
posibilidad de que una vía inflamatoria alternativa pueda ser funcional dentro de la encía
inflamada. No hay información disponible sobre la concentración de IL-23 en sitios de
inflamación periodontal. Tomados en conjunto con las concentraciones de IL-17 en estos sitios,
nuestros datos podrían sugerir la posibilidad de la vía IL-23 / IL-17 en la patogénesis de la
enfermedad periodontal crónica con pérdida de inserción.

MATERIALES Y MÉTODOS

Procedimiento de recolección de muestras gingivales

Este estudio fue revisado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Centro Médico de la
Universidad de Mississippi. El estudio cumplió con los requisitos para la exención de la revisión
IRB, que incluía el requisito de obtener el consentimiento informado de los participantes. Una
única papila gingival interdental se retiró de 118 pacientes hispanos antes de la extracción de
los dientes adyacentes debido a la caries extensa o enfermedad periodontal. Los sujetos
mayores de 17 años de edad fueron matriculados consecutivamente si requerían la extracción
de dientes adyacentes con coronas intactas. Ninguno de los pacientes había recibido cualquier
medicamento antes de la recolección de tejidos. Estas muestras fueron recogidas durante un
viaje de misión dental a varios sitios dentro de varias regiones rurales de la República
Dominicana en junio de 2006.

La papila gingival interdental se eliminó usando técnicas descritas por otros. Antes de la
eliminación de la papila, la pérdida de inserción clínica (CAL) en sus superficies mesial y distal se
midió con una sonda periodontal por un único investigador. La CAL para cada papila se definió
como la mayor de esas dos mediciones. Cada papila se clasificó como tener ligera pérdida de
inserción cuando CAL fue de 1 a 2 mm, pérdida moderada de inserción cuando la CAL fue de 3 a
4 mm y pérdida severa de inserción cuando la CAL fue ‡ 5 mm.

Después de la anestesia de bloque, la papila gingival interdental se retiró cuidadosamente con

un bisturí e incluyó el surco gingival completo, el epitelio de unión y el tejido conectivo
adyacente; Se mantuvo a -20ºC antes del almacenamiento a -80ºC. Nuestros datos anteriores
sugirieron que nuestros métodos de ensayo podrían detectar una diferencia del 15% en las
concentraciones de citoquinas gingivales entre estos grupos de muestra si cada grupo tuviera
un mínimo de 11 sujetos.42 †

Preparación de tejidos

Los tejidos se descongelaron y solubilizaron por molienda en solución salina tamponada con
fosfato (PBS), que contenıa un cóctel inhibidor de proteasa, ‡ con un homogeneizador mecánico.
El tejido congelado se pesó en una microbalanza y se colocó en un volumen suficiente de líquido
para asegurar la siguiente dilución: 10 mg de tejido / ml (PBS + inhibidor de proteasa). Las
muestras de tejido se trituraron con un homogeneizador de tejido y se centrifugaron a 2000 g.
Los sedimentos se resuspendieron en PBS y se pasaron a través de tres ciclos de congelación (-
20ºC) y descongelación (37ºC) y después se centrifugaron. Todos los sobrenadantes se
combinaron antes de los ensayos. Esta técnica dio como resultado una solubilización casi total
de las muestras.

Ensayo Total de Proteínas

El ensayo Astandard de ácido bicinquínico se utilizó para evaluar la concentración total de

proteínas dentro de cada muestra gingival. La absorbancia se leyó en un espectrofotómetro de
microplaca a 570 nm. La concentración de proteína total se calculó a partir de una curva
estándar y se registró como mg / ml.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Alícuotas de homogeneizados de tejidos o patrones de citoquinas se añadieron por triplicado a

los pocillos de placas de microvaloración para la determinación de IL-2, -6, -12, -17, -23 y -1b;
TNF - a; Y las concentraciones de IFN-g. La absorbancia de cada pocillo se leyó en un
espectrofotómetro de microplaca a 450 nm, y la concentración de tejido de cada citoquina se
calculó a partir de la curva estándar incluida con cada kit de ensayo. Se utilizaron los controles
de variación de la especificidad del método y del antisuero y de la variación de placa a placa. Las
concentraciones de citoquina se expresaron en nanogramos o picogramos por miligramo de
proteína.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando un paquete estadístico. Los datos se compararon

mediante análisis factorial de varianza, prueba post hoc de Tukey y prueba de correlación de
Pearson.

RESULTADOS

Nuestra población de estudio hispano contó con 54 hombres y 64 mujeres (N = 118) de la

población rural de la República Dominicana. La edad media (- SD) de los varones fue de 46,7 -
17,2 años, y la edad media de las mujeres fue de 43,6 - 15,1 años. La media de edad del grupo
CAL normal-leve fue de 36,2 - 15,3 años, la edad media del grupo CAL moderado fue de 43,8-
13,9 años y la edad media del grupo CAL grupo fue de 52,1 - 13,9 años.

La encía de los sitios normal-leve CAL tuvo concentraciones significativamente más altas de IL-
12 que la encía de los sitios moderados de calcio y calcio severo. Las concentraciones de IL-23 y
-17 y IFN-g fueron significativamente mayores en la encía obtenida de sitios CAL moderados que
en los sitios normal-leve CAL. Las concentraciones de IL-23, -1b, -6, y -17 y TNF-a fueron
significativamente mayores en la encía de los sitios de CAL severos que en los sitios de normal-
leve CAL. Además, las concentraciones de IL-23, -17, y -6 y TNF-a fueron significativamente
mayores en gingivales obtenidas de sitios CAL severos que en sitios CAL moderados, y las
concentraciones de IL-12 e IFN-g fueron significativamente más bajas Dentro de la encía
obtenida de sitios de CAL severos que de sitios de CAL moderados. Las concentraciones de IFN-
g e IL-2 no fueron significativamente diferentes entre la gingiva obtenida a partir de sitios de
CAL severa y normal-ligera CAL sitios (Tabla 1].

Las pruebas de correlación de Pearson indicaron numerosas correlaciones significativas entre

las concentraciones de citoquina gingival y CAL y entre las concentraciones de las citocinas
individuales. Las concentraciones gingivales de IL-23, -17, -6 y -1b y TNF-a se correlacionaron
significativamente con la CAL. La concentración gingival de IL-23 se correlacionó
significativamente con las concentraciones de IL-17, -1b, y -6 y TNF-a y se correlacionó
negativamente con la concentración de IL-12. Las concentraciones de IL-17 gingival se
correlacionaron significativamente con las concentraciones de IL-1b y TNF-α y se
correlacionaron negativamente con las concentraciones de IL-12. Las concentraciones gingivales
de TNF-a se correlacionaron significativamente con las concentraciones de IL-23 y -6 y se
correlacionaron negativamente con las concentraciones de IL-12 (Tabla 2).

DISCUSIÓN

Nuestros datos sugirieron que la vía inmunitaria IL-23 / IL-17 podría ser otra respuesta
inmunológica del huésped a patógenos periodontales, además de las respuestas TH1 y TH2.
Estos datos complementaron estudios previos de la presencia de IL-17 en el fluido crevicular
gingival y tejidos gingivales en sitios de inflamación periodontal27-29. Además, se informó de
una relación entre IL-23, varias citoquinas proinflamatorias y CAL por primera vez . Nuestros
métodos de ensayo no pudieron determinar si estas citoquinas estaban representadas en sus
formas solubles o ligadas a la membrana 28, ni podían determinar si IL-17 o -23 estaban
presentes en forma activa. Además, no pudimos determinar si la inflamación dentro de las
muestras gingivales estaba progresando o en remisión. Sin embargo, la correlación entre
concentraciones elevadas de tejido de IL-17 y -23 y la gravedad de CAL sugiere que esas citocinas
podrían haber sido un factor en la etiología de la inflamación.

Nuestros datos apoyaron otros estudios que informaron asociaciones entre elevación de IL-6,39
-1b, 40 y -1727,28 y TNF-a.44 En conjunto, las correlaciones significativas entre CAL y las
concentraciones gingivales de IL-23, -17, -6 y -1b y TNF-a dentro de nuestras muestras de tejido
sugiere que la respuesta inmune del hospedador IL23 / IL17 podría estar presente en las
muestras inflamadas. Esta respuesta podría ocurrir cuando la IL-12 no inicia una respuesta
inmunológica TH1 fuerte por el huésped después de la exposición por bacterias
periodontopatógenas. Concentraciones relativamente elevadas de IL-17 y -23 gingival y
concentraciones relativamente bajas de IL-2 y -12 e IFN-g (y falta de Correlaciones significativas
con CAL) dentro de nuestras muestras gingivales adyacentes a los sitios de CAL apoyó esta
hipótesis. Nuestros datos extendieron los resultados de estudios previos in vitro33-36
sugiriendo que IL-17 promovía la síntesis de IL-1b y -6 y TNF-a correlacionando la concentración
de cada citoquina con CAL in vivo. Las concentraciones elevadas de TNF-a e IL-23 y -17 podrían
promover la progresión de la inflamación gingival al hueso alveolar adyacente, resultando en
CAL, debido a que las concentraciones elevadas de IL-17 gingival produjeron concentraciones
elevadas de quimiocinas implicadas en la reabsorción ósea dentro del periodonto.

La respuesta inmune del huésped IL-23 / IL-17 se ha descrito en individuos con esclerosis
múltiple y artritis reumatoide. Nuestros datos indicaron que esta respuesta también podría
ocurrir en individuos con periodontitis. Dado que nuestros datos indicaban que vía podría
funcionar en la patogénesis de la inflamación periodontal, dirigiéndolo podría tener un beneficio
terapéutico. Se requieren estudios adicionales de la respuesta inmune IL-23 / IL-17 dentro de la
encía para identificar su contribución específica a la etiología de la periodontitis.