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Desarrollo de metodologías Analíticas para la

caracterización de compuestos de bajo peso
molecular en bio-oil y su ....
Thesis · October 2011

DOI: 10.13140/RG.2.2.14236.49287
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Catherine Tessini
Universidad Técnica Federico Santa María
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PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS Y TECNOLOGÍA ANALÍTICA
FACULTAD DE FARMACIA
UNIVERSIDAD DE CONCEPCION
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

ANALÍTICA
TÍTULO
DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALITICAS PARA LA CARACTERIZACIÓN

DE COMPUESTOS DE BAJO PESO MOLECULAR EN BIO-OIL Y SU APLICACIÓN EN
LA OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE PRODUCCIÓN Y FRACCIONAMIENTO
CATHERINE VALESKA TESSINI ORTIZ
Profesor Tutor Dr. Dietrich von Baer von Lochow

Profesor Co-Tutor Dra. Claudia Mardones Peña
Departamento de Análisis Instrumental

Facultad de Farmacia
Universidad de Concepción
Concepción-Chile
2011
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica ii
Desarrollo de metodologías analíticas para la caracterización de compuestos de bajo peso
molecular en bio-oil y su aplicación en la optimización del proceso de producción y
fraccionamiento
Comisión Evaluadora
Dr. Dietrich von Baer von Lochow

Profesor Tutor
Dra. Claudia Mardones Peña

Profesor Co-Tutor
Dr. Alex Berg Gebert

Dr. Edward Fuentes Pérez

Universidad de Chile
Director de Postgrado
Dr. Carlos Peña Farfal

Decano Facultad de Farmacia
Dr. Carlos Calvo Monfil

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica iii

AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo de investigación ha sido realizado en el Departamento de Análisis Instrumental

de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Concepción, bajo la dirección de los profesores
Dr. Dietrich von Baer y la Dra. Claudia Mardones a quienes deseo expresar mi agradecimiento
por su aportación científico y principalmente por el apoyo personal. Con ellos también, agradecer
al Dr. Carlos Bruhn, quien me recibió en el programa de doctorado.
La investigación desarrollada se ha financiado a través de los proyectos PFB-27/PCS 003,

FONDEF D07-I-1137. Además de la beca doctoral proporcionada por CONICYT en el año 2010, y
las becas y beneficios otorgados por el Departamento de análisis Instrumental y la Dirección de
Postgrado de la Universidad de Concepción.
Quiero también expresar mi gratitud al Dr. Dietrich Meier, por su recibimiento y apoyo en la
estadía realizada en el vTI, Institute of Wood Technology and Wood Biology-Alemania.
Mis más sincero agradecimientos a mis compañeros y docentes del departamento de Análisis
Instrumental quienes colaboraron al desarrollo de mi trabajo de tesis.
Y finalmente, pero no menos importante, deseo agradecer a mi familia y en especial a mis amigos
que me recibieron en esta ciudad, me animaron a seguir adelante y me arrancaron una sonrisa en
los momentos difíciles.
Gracias
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica iv

A mis padres
A mi abuelito José.
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica v

ÍNDICE GENERAL
Índice………………………………………………………………………………………………..iii
Abreviaturas………………………………………………………………………………..………..vi
Índice de Tablas……………………………………………………………………………………viii
Índice de Figuras……….……………………………………………………………………………ix
Resumen…………………………………………………………………………………………….xii
Abstract..……………………………………………………………………………………………xiv
ÍNDICE
CAPITULO 1 Introducción................................................................................................................1
1.1 Introducción General ............................................................................................................... 1
1.2 Tipos y utilización de biomasa como fuente de energía ........................................................... 1
1.3 Conversiones térmicas de biomasa .......................................................................................... 2
1.3.1 Gasificación de biomasa.................................................................................................... 2
1.3.2 Pirólisis de biomasa ........................................................................................................... 3
1.4 Propiedades físico-químicas del bio-oil................................................................................ 5
1.5 Reactividad del bio-oil ............................................................................................................. 7
1.5.1 Compuestos inorgánicos en el bio-oil................................................................................ 7
1.5.2 Compuestos orgánicos en el bio-oil................................................................................... 8
1.6 Productos de interés nacional del bio-oil ................................................................................. 9
1.7 Analítica del bio-oil ............................................................................................................... 12
1.7.1 Parámetros físicas del bio-oil .......................................................................................... 12
1.7.2 Análisis del bio-oil por método químicos ........................................................................ 13
1.7.3 Análisis del bio-oil por métodos instrumentales .............................................................. 14
1.8 Bibliografía ............................................................................................................................ 23
CAPÍTULO 2 Hipótesis y objetivos.................................................................................................26

2.1 Hipótesis General................................................................................................................... 26
2.1.2 Hipótesis derivadas ......................................................................................................... 27
2.2 Objetivos Generales ............................................................................................................... 27
2.2.1 Objetivos específicos....................................................................................................... 27
CAPÍTULO 3 Estrategia analítica y material de estudio ..................................................................28

3.1 Obtención del bio-oil ............................................................................................................. 28
3.2 Procesos de fraccionamiento del bio-oil para la obtención de grupos de compuesto de interés
a nivel industrial .......................................................................................................................... 29
3.2.1 Extracción de compuestos volátiles del bio-oil................................................................ 30
3.2.2 Extracción de ácidos y aldehídos por extracción con solvente ........................................ 30
3.2.3 Extracción con solventes ................................................................................................. 31
3.2.4 Separación de la lignina pirolítica del bio-oil .................................................................. 32
3.3 Métodos analíticos de tratamientos de muestras .................................................................... 32
3.3.1 Extracción líquido‐líquido............................................................................................... 33
3.3.2 Extracción en fase sólida ................................................................................................. 33
3.3.3 Microextracción en fase sólida ........................................................................................ 34
3.4 Métodos de derivatización ..................................................................................................... 38
3.5 Métodos quimiométricos ....................................................................................................... 38
3.6 Propuesta de la estrategia analítica......................................................................................... 39
3.7 Bibliografía ............................................................................................................................ 40
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica ii

CAPÍTULO 4 Caracterización de bio-oil por inyección directa en GC/MS .....................................41
4.1 Resumen ................................................................................................................................ 41
4.2 Introducción........................................................................................................................... 41
4.3 Materiales y métodos ............................................................................................................. 42
4.3.1 Reactivos ......................................................................................................................... 42
4.3.2 Instrumentación ............................................................................................................... 42
4.3.3 Condiciones cromatográficas .......................................................................................... 42
4.3.4 Preparación de muestras de bio-oil crudo y fracciones .................................................... 43
4.3.5 Identificación y cuantificación ........................................................................................ 43
4.3.6 Muestras y fracciones ...................................................................................................... 43
4.4 Resultados y discusión ........................................................................................................... 45
4.4.1 Análisis de bio-oil crudo y diferentes fracciones por GC/MS/FID .................................. 45
4.4.2 Análisis de bio-oil crudo y diferentes fracciones por GC/MS ......................................... 51
4.5 Conclusiones......................................................................................................................... 58
4.6 Bibliografía ............................................................................................................................ 59
CAPÍTULO 5 Desarrollo de metodología analítica para la determinación de azúcares en bio-oil por

HPTLC .............................................................................................................................................60
5.1 Abstract.................................................................................................................................. 61
5.2 Introduction ........................................................................................................................... 61
5.3 Materials and methods ........................................................................................................... 63
5.4 Standard solutions and bio-oil samples .................................................................................. 63
5.5 HPTLC quantification of main sugars ................................................................................... 64
5.7 Conclusions ........................................................................................................................... 70
5.8 References ............................................................................................................................. 71
CAPÍTULO 6 Determinación de ácidos orgánicos en bio-oil por HPLC-UV y su determinación

simultámea con azúcares por GC/MS ..............................................................................................73
6.1 Resumen ................................................................................................................................ 73
6.2 Introducción........................................................................................................................... 73
6.3 Materiales y métodos ............................................................................................................. 75
6.3.1 Reactivos ......................................................................................................................... 75
6.3.2 Materiales........................................................................................................................ 75
6.3.3 Instrumentación ............................................................................................................... 75
6.3.4 Condiciones cromatográficas .......................................................................................... 75
6.3.5 Preparación de estándares y muestras.............................................................................. 76
6.4 Resultados y Discusiones....................................................................................................... 77
6.4.1 Determinación de ácidos orgánicos en bio-oil y sus fracciones mediante HPLC-UV ..... 77
6.4.2 Determinación simultánea de ácidos orgánicos y azúcares por GC/MS previa
derivatización con BSTFA .......................................................................................................87
6.6 Conclusiones.......................................................................................................................... 96
6.7 Bibliografía ............................................................................................................................ 98
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica iii

CAPÍTULO 7 Determinación de aldehídos de bajo peso molecular en bio-oil por HPLC-UV y por
GC/MS, previa derivatización/extracción simultánea por HS-SPME............................................. 100
7.1 Resumen .............................................................................................................................. 100
7.2 Introducción......................................................................................................................... 100
7.3 Materiales y métodos ........................................................................................................... 106
7.3.1 Reactivos ....................................................................................................................... 106
7.3.2 Materiales...................................................................................................................... 106
7.3.3 Instrumentación y condiciones cromatográficas ............................................................ 106
7.3.4 Preparación de estándares y tratamiento de muestras de bio-oil .................................... 107
7.3.5 Optimización de metodologías D-HS-GC/MS y OFD-HS-SPME-GC/MS ................... 108
7.4 Resultados y discusión ......................................................................................................... 108
7.4.1 Determinación de aldehídos por HPLC previa derivatización con 2,4-DNPH .............. 108
7.4.2 Determinación de aldehídos de bajo peso molecular por GC/MS previa derivatización
con PFBHA. Comparación de procedimientos de derivatización en solución y derivatización
en fibra (D-HS-GC/MS y OFD-HS-SPME-GC/MS respectivamente) .................................... 111
7.5 Conclusiones........................................................................................................................ 126
7.6 Bibliografía .......................................................................................................................... 128
Conclusión General………………………………………………………………………………..129
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica iv

ABREVIATURAS
Å Ångstrom
amu Unidad de masa atómica
ANOVA Análisis de la varianza
ASTM American Society for Testing Materials
ATD Análisis térmico diferencial
ATG Análisis termogravimétrico
BSTFA N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamida
CAR Carboxen
cp CentiPoises, medida de viscosidad
cSt CentiStokes, medida de viscosidad
CW Carbowax
DNPH 2,4-Dinitrofenilhidrazina
DSC Calorimetría diferencial de barrido
DTG Termogravimetría diferencial
DVB Divinilbenceno
FID Detector de ionización de llama
FT-IR Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier
GC Cromatografía de gases
GC x GC Cromatografía de gases bi-dimensional
GPC Cromatografía de permeación por gel
HAA Hidroxiacetaldehído
HPLC Cromatografía líquida de alta resolución
HPTLC Cromatografía de capa fina de alta resolución
HS Espacio de cabeza o “Headspace”
ICP Plasma de acoplamiento inductivo
IR Infrarrojo
LC Limite de cuantificación
LD Limite de detección
LDI Desorción/ionización laser
LLE Extracción líquido-líquido
MALDI Desorción/ionización láser asistida por matriz
MS Detector selectivo de masas
MTBE Metil terbutileter
OFD Derivatización “on-fiber”
PA Poliacrilato
PDMS Polidimetilsiloxano
PFBHA O-(2,3,4,5,6-Pentafluorobencil) hidroxilamina clorhidrato
Py Pirolizador
R Resolución cromatográfica
RMN Resonancia magnética nuclear
RSD Desviación típica relativa
SAX Intercambio aniónico fuerte
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica v

SCAN Barrido completo de masas
SIM Monitoreo de ion selectivo
SPE Extracción en fase sólida
SPME Microextracción en fase sólida
TAN Acidez total
THF Tetrahidrofurano
TLC Cromatografía de capa fina
TMS Trimetilsilil derivados
TMSI Trimetilsililimidazol
TOF Tiempo de vuelo
XRF Espectrometría de fluorescencia de rayos X
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica vi

ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1.1 Productos y rendimientos típicos, obtenidos en distintas condiciones de pirólisis……….3

Tabla 1.2 Propiedades típicas y características del bio-oil obtenido de biomasa forestal…………..5
Tabla 1.3 Algunas Propiedades físicas del bio-oil…………………………………………………..6
Tabla 1.4 Principales compuestos presentes en el bio-oil…………………………………………...7
Tabla 3.1 Principales propiedades de las fibras de SPME…………………………………………37
Tabla 4.1 Concentraciones de compuestos de interés identificados en bio-oil y sus fracciones…..49
Tabla 4.2 Resultados obtenidos para el bio-oil L y las diferentes fracciones. Los resultados están
expresados en % p/p húmedo…………………………………………………………………….....55
Table 5.1 Physico-chemical properties of analyzed bio-oil samples obtained by pyrolysis at
500°C………………………………………………………………………………………………..63
Table 5.2 Analytical parameters for HPTLC sugar determination in bio-oil………………………65
Table 5.3 Sugar concentrations in fresh bio-oil samples and extracts……………………………..68
Tabla 6.1 Parámetros analíticos obtenidos de la curva de calibración instrumental, para los
principales ácidos orgánicos presentes en el bio-oil………………………………………………..78
Tabla 6.2 Repetibilidad y error en la determinación de ácidos orgánicos en fracciones de destilado
al vacío de bio-oil mediante HPLC-UV……………………………………………………………79
Tabla 6.3 Concentración de ácidos orgánicos en destilados de bio-oil. Comparación de los métodos
TAN y HPLC-UV………………………………………………………………………………….79
Tabla 6.4 Repetibilidad y recuperación de ácidos orgánicos desde fracciones orgánicas (MTBE) del
bio-oil, (n=9)………………………………………………………………………………………..82
Tabla 6.5 Porcentajes de recuperación del método de SPE en bio-oil crudo y en agua…………...85
Tabla 6.6 Variables optimas para cada grupo de compuestos, y la propuesta realizada para la
determinación simultanea…………………………………………………………………………..90
Tabla 6.7 Principales parámetros analíticos obtenidos en la determinación de ácidos orgánicos en
muestras de bio-oil…………………………………………………………………………………90
Tabla 6.8 Principales parámetros analíticos obtenidos en la determinación de azúcares en muestras
de bio-oil…………………………………………………………………………………………...91
Tabla 6.9 Comparación de resultados obtenidos en el análisis de bio-oil, para ácidos orgánicos y
azucares, ambos por GC/MS………………………………………………………………………94
Tabla 6.10 Comparación de resultados obtenidos en el análisis de bio-oil por HPTLC y GC/MS
previa derivatización. En la determinación de levoglucosano y celobiosano……………………..95
Tabla 7.1 Parámetros analíticos de la curva de calibración instrumental de aldehídos por HPLC-
UV, previa derivatización con 2,4-DNPH………………………………………………………..108
Tabla 7.2 Métodos propuestos para la realización de forma automática del método OFD-HS-
SPME-GC/MS……………………………………………………………………………………118
Tabla 7.3 Variables empleadas en el diseño experimental para la optimización de la metodología
OFD-HS-SPME-GC/MS…………………………………………………………………………119
Tabla 7.4 Parámetros operativos óptimos para la determinación de aldehídos por OFD-HS-SPME-
GC/MS…………………………………………………………………………………………....122
Tabla 7.5 Principales parámetros analíticos obtenidos en ambas metodologías………………...124
Tabla 7.6 Comparación del análisis de muestras de bio-oil crudo por ambas metodologías. Los
aldehídos no detectados se abreviaron como ND………………………………………………...125
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica vii

ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.1 Diagrama general propuesto en la pirólisis rápida de biomasa…………………………..4

Figura 1.2 Procesos de conversión térmica, productos principales y sus aplicaciones……………...4
Figura 1.3 Efecto de la temperatura del reactor en el rendimiento de los productos obtenidos en el
bio-oil………………………………………………………………………………………………...6
Figura 1.4 Fracciones de compuestos de importancia en el bio-oil y su detección mediante técnicas
cromatográficas……………………………………………………………………………………..14
Figura 1.5 Ejemplo de un esquema de fraccionamiento por solvente del bio-oil………………….15
Figura 1.6 Ejemplo N°2 de un esquema propuesto para la caracterización del bio-oil……………15
Figura 1.7 Termograma de una fracción de acuosa de una muestra de bio-oil, Señales a, b, c y d
corresponden a compuestos polares volátiles, compuestos polares de mediana volatilidad,
compuestos polares de alto peso molecular y azúcares…………………………………………….18
Figura 1.8 Típico cromatograma de bio-oil obtenido por GC/MS/FID, y la caracterización de los
principales compuestos……………………………………………………………………………..21
Figura 3.1 Esquema de la planta piloto para la producción de bio-oil…………………………….28
Figura 3.2 Dispositivo empleado en la SPME……………………………………………………..34
Figura 3.3 Esquema propuesto en este trabajo de tesis para la determinación de grupos químicos en
las diferentes muestras de bio-oil…………………………………………………………………...39
Figura 4.1 Esquema de fraccionamiento de bio-oil J. (Fraccionamiento realizado en UDT)…….44
Figura 4.2 Esquema de fraccionamiento de bio-oil L. (Fraccionamiento realizado en UDT)……45
Figura 4.3 Cromatograma de bio-oil J obtenido por la detección por FID. Desde 0 a 25 minutos..46
Figura 4.4 Cromatograma de un amuestra de bio-oil crudo por GC/MS, en modo SCAN, utilizando
una columna RTx-5 de 105 metros de largo. Señales: (1) ácido fórmico e hidroxiacetaldehído; (2)
ácido acético y acetol y (3) levoglucosano. Compuestos de derivados de la lignina pirolítica entre 30
y 88 minutos………………………………………………………………………………………...51
Figura 4.5 Cromatograma de bio-oil por GC/MS, separación entre hidroxiacetaldehído (1) y ácido
fórmico (2)………………………………………………………………………………………….52
Figura 4.6 Cromatograma de bio-oil crudo obtenido por GC/MS, en modo SCAN desde los 6
minutos y m/z 31 entre 5.5 y 6 minutos. Cromatograma desde 0 a 40 minutos…………………...53
Figura 4.7 Cromatogramas por GC/MS en modo SCAN de las muestras de bio-oil crudo L1 A);
fracción acuosa L2 (B) y fracción orgánica L2.1. Señales: (1) hidroxiacetaldehído, (2) ácido acético,
(3) acetol, (4) ácido propiónico, (5) levoglucosano y (6) fluoranteno (patrón interno)……………56
Figure 5.1 Levoglucosan (A) and cellobiosan (B) chemical structures…………………………...61
Figure 5.2 HPTLC plate of bio-oil 1 and sugar standards using acetonitrile/water 80/20 v/v as
mobile phase……………………………………………………………………………………….64
Figure 5.3 HPTLC plates of bio-oil 4 and their fractions using acetonitrile/water as mobile phase.
I: bio-oil 4; II: pyrolytic lignin III: n-butanol and aqueous phase. Standards: cellobiosan (C),
arabinose (A), levoglucosan (L) and xylose (X)…………………………………………………..65
Figure 5.4 HPTLC plate of bio-oil samples, cellobiosan and glucose standards using butanol/formic
acid as mobile phase. Cellobiosan (C) and glucose (G). Track 1 and 4 cellobisan and glucose
standards. Track 2 bio-oil 2 whithout glucose. Track 3 bio-oil 2 with glucose added…………...66
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica viii

Figure 5.5 Screening of different bio-oil samples for glucose detection. Cellobiosan (C), glucose
(G) and levoglucosan (L). Sample 1, 2 and 3 correspond to bio-oil 4, pyrolytic lignin and bio-oil
aqueous phase respectively………………………………………………………………………….66
Figure 5.6 HPTLC plate of sugar standards using butanol/formic acid as mobile phase. cellobiosan
(C), glucose (G), arabinose (A), levoglucosan (L) and xylose (X)…………………………………67
Figure 5.7 Proposed scheme for the determination of principal sugars in bio-oil samples………..67
Figura 6.1 HPLC-UV de la mezcla de estándares de ácido fórmico (1), ácido acético (2) y ácido
propiónico (3) en concentración de 30 mg L-1 cada uno…………………………………………….77
Figura 6.2 HPLC-UV de una muestra de destilado de bio-oil. Señales: (1) ácido fórmico; (2) ácido
acético; (3) ácido propiónico………………………………………………………………………..78
Figura 6.3 HPLC-UV del extracto orgánico (MTBE) de bio-oil pre-tratado por evaporación y
reconstitución con fase móvil (H2SO4 0.005 mol L-1). Señales: (1) ácido fórmico; (2) ácido acético;
(3) ácido propiónico………………………………………………………………………………...81
Figura 6.4 HPLC/UV del extracto acuoso de una muestra de extracto orgánico (MTBE) de bio-oil.
Señales: (1) ácido fórmico; (2) ácido acético; (3) ácido propiónico………………………………..82
Figura 6.5 HPLC-UV del extracto acuoso de bio-oil. Señales: (1) ácido fórmico; (2) ácido acético;
(3) ácido propiónico………………………………………………………………………………...83
Figura 6.6 HPLC-UV del extracto en fase sólida de una muestra de bio-oil crudo. Señales 1, 2 y 3
corresponden respectivamente a los ácidos fórmico, acético y propiónico respectivamente……...85
Figura 6.7 Cromatograma de la determinación de ácidos orgánicos y azúcares en bio-oil. Señales:
(1) ácido fórmico-TMS: (2) ácido acético-TMS; (3) ácido propiónico-TMS; (4) ácido isobutírico-
TMS (estándar interno 100 mg L-1); (5) ácido glicólico-TMS y (6) ácido láctico-TMS; (7) 2,5-
anhidro-D-manitol-TMS (estándar interno 100 mg L-1); (8) levoglucosano-TMS; (9) celobiosano-
TMS………………………………………………………………………………………………..93
Figura 7.1 Reacción del 2,4-DNPH con grupos carbonilos. R1 y R2 pueden corresponder a H,
grupos alquil o aril………………………………………………………………………………..101
Figura 7.2 Reacción de derivatización para formación de oximas, mediante la reacción de PFBHA
con grupo carbonilos……………………………………………………………………………...102
Figura 7.3 Esquema de las estrategias de derivatización posibles utilizando SPME. (Modificación
esquema propuesto por J. Pawliszyn)…………………………………………………………….103
Figura 7.4 Etapas de las constantes de distribución propuestas en las cuatro etapas de la
derivatización on-fiber……………………………………………………………………………104
Figura 7.5 Cromatograma por HPLC-UV de 2,4-dinitrofenilhidrazonas de estándares de aldehídos
en condiciones óptimas. Señales: 1 = HAA-DNPH, 2 = formaldehído-DNPH, 3 = acetaldehído-
DNPH y 4 = 2-furaldehído-DNPH……………………………………………………………….108
Figura 7.6 Cromatograma HPLC/UV de 2,4-dinitrofenilhidrazonas de aldehídos presentes en una
muestra de bio-oil crudo. Señales: 1 = HAA-DNPH, 2 = formaldehído-DNPH, 3 = acetaldehído-
DNPH y 4 = 2-furaldehído-DNPH……………………………………………………………….109
Figura 7.7 Gráfico de coeficientes de la superficie de respuesta para la derivatización/extracción de
formaldehido en muestras de bio-oil por D-HS-GC/MS………………………………………....111
Figura 7.8 Gráfico de coeficientes de la superficie de respuesta para la derivatización/extracción
del acetaldehído en muestras de bio-oil por D-HS-GC/MS………………………………………112
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica ix

Figura 7.9 Cromatograma de una muestra de bio-oil por D-HS-GC/MS, en modo SCAN. Señales: 1
= formaldehído-PFBHA oxima; 2 = acetaldehído-PFBHA oxima; 3 = propionaldehído-PFBHA
oxima and 4 = valeraldehído-PFBHA oxima (estándar interno)…………………………………..113
Figura 7.10 Esquema propuesto de las etapas y fases involucradas en la extracción/derivatización
de aldehídos “on-fiber”……………………………………………………………………………114
Figura 7.11 Evaluación de los diferentes recubrimientos poliméricos a distintas temperaturas de
extracción. (A) 30 °C; (B) 40 °C y (C) 60°C……………………………………………………...115
Figura 7.12 Gráfico de coeficientes de la superficie de respuesta para la determinación de
formaldehído en muestras de bio-oil por OFD-HS-SPME-GC/MS………………………………120
acetaldehído en muestras de bio-oil por OFD-HS-SPME-GC/MS………………………………..121
propionaldehído en muestras de bio-oil por OFD-HS-SPME-GC/MS…………………………....122
Figura 7.15 Cromatograma de aldehídos de bajo peso molecular por OFD-HS-SPME-GC/MS.
Señal: 1 = oxima formaldehído-PFBHA; 2 = oxima acetaldehído-PFBHA; 3 = oxima
propionaldehído-PFBHA y 4 = oxima valeraldehído-PFBHA (estándar interno)………………..123
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica x

RESUMEN
En la presente tesis se desarrollaron y evaluaron diferentes metodologías para la determinación de

diversos componentes en el bio-oil. Para ello se emplearon distintas técnicas cromatográficas, con
el objetivo de determinar ácidos orgánicos de cadena corta, compuestos volátiles, azúcares y
aldehídos en bio-oil y sus fracciones. La caracterización y determinación de estos analitos además
sirve de base para evaluar las condiciones óptimas de pirólisis de biomasa, para orientar el proceso
hacia la obtención de productos químicos de interés industrial.
Para la determinación de los aldehídos de bajo peso molecular, como formaldehído, acetaldehído y
propionaldehído, se evaluó su determinación por HPLC-UV, previa derivatización con 2,4-DNPH.
Las condiciones de esta derivatización pueden provocar reacciones no deseadas que afecten la
estabilidad del bio-oil y de sus principales componentes.
Por ello fue necesario desarrollar una metodología de mayor selectividad y en que la reacción de
derivatización no se realice en condiciones que afecten la cuantificación. Este procedimiento está
basado en la utilización de la microextracción en fase sólida en modo espacio de cabeza (head
space), empleando la derivatización directamente en la fibra con PFBHA como agente
derivatizante. Posteriormente la separación/detección es realizada en un sistema GC/MS. Esta
metodología demostró ser sencilla y rápida. Además es posible su optimización, empleando
herramientas quimiométricas. Alternativamente se desarrolló un método basado en la derivatización
en la solución de la muestra, empleando el sistema de inyección en modo espacio de cabeza. Los
aldehídos determinados por ambas metodologías fueron: formaldehído (~ 2 %), acetaldehído (~ 0.1
%) y propionaldehído (~ 0.05 %).
Mediante cromatografía liquida de alta resolución, en la modalidad de fase inversa en serie con
exclusión iónica y detección directa al UV a 210 nm, es posible la determinación por inyección
directa de ácidos orgánicos (fórmico, acético y propiónico) en fracciones de bio-oil obtenidas por
destilación. Ello no requiere un tratamiento previo de la muestra, sin embargo esta metodología no
es aplicable a muestras de bio-oil crudo, por los interferentes que éste contiene.
Los azúcares en bio-oil fueron determinados por HPTLC. Con esta técnica fue posible la
cuantificación de los principales azúcares en el bio-oil. Para ello fue necesaria la implementación de
un sistema de screening para descartar la presencia de glucosa en las muestras, ya que de estar
presente en altas concentraciones, podría interferir en la cuantificación del celobiosano. Esta
metodología puede aplicarse directamente a muestras de bio-oil crudo, fracciones de solventes
orgánicos y fracciones acuosas e incluso a muestras de lignina pirolítica. Los principales azúcares
que se determinaron fueron: levoglucosano (~ 1.5-3 %), celobiosano (~ 0.5-2.0 %), xilosa y
arabinosa. Estos últimos en la mayoría de las muestras, si es que se detectaban, se encontraban bajo
los límites de cuantificación del método.
Además se desarrolló una metodología sencilla basada en la derivatización de analitos con BSTFA.
Ello permite determinar ácidos orgánicos y azúcares, los cuales pueden ser derivatizados de forma
simultánea y cuantificados en un solo cromatograma, empleando un estándar interno para cada
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica xi

grupo de compuestos. Los principales ácidos determinados mediante este método fueron ácido
fórmico (~ 0.5-2 %), acético (~ 1.5-3.0 %), propiónico (~ 0.1-0.8 %), láctico (~ 0.1-0.6 %) y
glicólico. A su vez, los principales azúcares determinados fueron levoglucosano (~ 1.5-2.8 %),
celobiosano (~0.2-1.5 %), xilosa (~ 0.05 %) y arabinosa (~ 0.05 %).
Dependiendo de la utilidad que tenga el bio-oil a nivel industrial, las metodologías desarrolladas
pueden ser aplicadas de forma individual o complementada con el método general de
caracterización de bio-oil mediante su inyección directa a GC/MS. De esta forma es posible contar
con diferentes alternativas para la cuantificación de los compuestos en el bio-oil.
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica xii

ABSTRACT
In this thesis different methodologies to determine composition of bio-oil were evaluated. For these
purpose different chromatographic techniques, to determine short chain organic acids, volatile
components, sugars and aldehydes were used. The importance of the characterization and
determination of these analyte serve as basis to evaluate the optimal pyrolysis conditions of
biomass, to orient the process towards to obtain chemical products of industrial interest.
Low molecular weight aldehydes; formaldehydes, acetaldehyde and propionaldehyde was evaluated
by HPLC-UV, previous derivatization with 2,4-DNPH. Considering that the derivatization
conditions can produce undesired reactions which can affect the stability of bio-oil and its main
components, it was necessary to develop a more selective methodology under condition which do
not affect the quantification. This procedure is based on the use of solid phase microextraction in
the headspace mode, using direct derivatization on fiber with PFBHA as derivatization agent. The
separation/detection is done by GC/MS. This methodology has demonstrated to be simple and fast.
Additionally is possible its optimization by chemometric tools. Alternatively was developed a
method based on the derivatization in the sample solution, using injection in the head space mode.
The aldehydes determined by both methodologies were formaldehyde (~ 2 %), acetaldehyde (~ 0.1
%) and y propionaldehyde (~ 0.05 %).
It is possible to determine organic acids by direct injection (formic, acetic and propionic) in bio-oil
fractions obtained by distillation through high performance liquid chromatography in the reversed
phase mode in series with ion exclusion and direct detection at 210 nm. In this procedure it is not
necessary sample pre-treatment, however this methodology cannot be applied to crude bio-oil
samples, due to the interferences that it contains.
Sugars in bio-oil were determined by HPTLC. With this technique was possible the quantitative
analysis of the main sugars in bio-oil. For this purpose it was necessary to implement a screening
system to discard the presence of glucose in the samples, because its presence at high
concentrations, it can interfere in the determination of cellobiosan. This methodology can be
applied directly to crude bio-oil, organic and aqueous fractions, inclusively pyrolytic lignin. The
main sugars determined in bio-oil were levoglucosan (~ 1.5-3 %), ~ 0.5-2.0 %), xylose and
arabinose. The latter, if detected, were below the quantification limit of the method.
Additionally a simple methodology based on the derivatization of analyte with BSTFA, was
developed. This make possible the determination of organic acids and sugars, which can be
derivatized simultaneously and quantified together in one chromatogram using one internal standard
for each group of compounds. The main acids determined by this method were formic (~ 0.5-2 %),
acetic (~ 1.5-3.0 %), propionic (~ 0.1-0.8 %), lactic (~ 0.1-0.6 %) and glycolic acid. On the other
hand, the main sugars were levoglucosan (~ 1.5-2.8 %), cellobiosan (~0.2-1.5 %), xylose (~ 0.05 %)
and arabinose (~ 0.05 %).
Depending on the use that will be given to the bio-oil at industrial scale, the methodologies
proposed in this thesis can be applied separately or complimented with the general characterization
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica xiii

method of bio-oil by direct injection into GC/MS. By this way are amenable different ways to
quantify bio-oil components.
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica xiv

Capítulo 1
CAPITULO 1
INTRODUCCIÓN
1.1 Introducción General
Se espera que en los próximos años el mundo se vea enfrentado con una seria realidad asociada al
futuro energético. El carbón, el petróleo, y el gas natural seguirán siendo indispensables para
satisfacer el crecimiento de demanda energética total esperada. Si bien el mundo no se está
quedando sin recursos energéticos, si se acumulan riesgos relacionados con la expansión continua
de la producción de petróleo y gas natural. Estos riesgos plantean desafíos significativos para poder
satisfacer la demanda energética esperada1.
Para reducir estos riesgos, se requerirá la expansión de todas las fuentes de energía económicas,
incluyendo el carbón, la energía nuclear, la biomasa, entre otras energías renovables, el petróleo y el
gas natural. Cada una de estas fuentes se enfrenta con desafíos importantes, que incluyen la
seguridad y la existencia de barreras ambientales, políticas o económicas, y requiere de
infraestructura para su desarrollo y distribución1. Bajo éste escenario se impulsa fuertemente el
desarrollo de fuentes alternativas renovables de energía.
Entre las fuentes alternativas renovables de energía, la biomasa es una alternativa atractiva ya que
permite obtener un combustible a partir de recursos biológicos y su utilización no produce impactos
significativos en el medio ambiente. La biomasa, a diferencia de la energía eólica y solar, es
relativamente fácil de almacenar pero en contrapartida, opera con enormes volúmenes de
combustibles que hacen su transporte oneroso y constituyen un argumento a favor de una utilización
local. En la actualidad las formas de utilización más difundidas de la biomasa como fuente de
energía son la combustión de residuos agrícolas y los procedentes de la industria maderera2.
1.2 Tipos y utilización de biomasa como fuente de energía
La biomasa, abreviatura de masa biológica, es un término genérico que hace referencia a la cantidad
de materia viva producida por plantas, animales, hongos o bacterias, en un área determinada. Se
suele utilizar para hacer referencia al combustible energético que se obtiene directa o
indirectamente de estos recursos biológicos. Hay otra característica que diferencia a la biomasa de
otros recursos energéticos, y es el hecho de que es un recurso potencialmente renovable. El carbón,
el gas, el petróleo y otros combustibles fósiles, no se consideran biomasa, aunque deriven de
material vivo. El tiempo necesario para la formación de estos combustibles hacen que no puedan ser
considerados como renovables3.
La biomasa como fuente para la producción de energía renovable puede clasificarse en:
a) Biomasa natural: Se produce de forma espontánea en la naturaleza, sin intervención
humana. Por ejemplo, las podas naturales de los bosques.
b) Biomasa residual seca: Procede de recursos generados en las actividades agrícolas,
forestales. También se produce este tipo de biomasa en procesos de la industria
agroalimentaria y de la industria de transformación de la madera. Dentro de este tipo de
biomasa, se puede diferenciar la de origen forestal y la de origen agrícola.
Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica 1

Capítulo 1
c) Biomasa residual húmeda: Procede de vertidos biodegradables formados por aguas

residuales urbanas e industriales y también de los residuos ganaderos.
d) Cultivos energéticos tanto forestales como agrícolas: Son aquellos cultivos realizados
tanto en terrenos agrícolas como forestales y que están dedicados a la producción de
biomasa con fines no alimentarios4.
Para el uso de la biomasa en general, es necesario un tratamiento de ésta, principalmente se utiliza
la conversión térmica.
1.3 Conversiones térmicas de biomasa
Hay tres procesos térmicos principales para la conversión de biomasa en energía útil. Estas son
pirólisis, gasificación y combustión. La combustión está ampliamente descrita y actualmente se
realizan estudios para disminuir el impacto ambiental que produce. De la combustión, el producto
primario que se genera es calor, para su uso en calderas, generando a través de ellas dos productos
para el mercado: calor y electricidad. La gasificación y pirólisis se detallan a continuación.
1.3.1 Gasificación de biomasa
En la gasificación el producto primario generado es gas combustible. El proceso de gasificación se
compone de dos etapas encadenadas. La primera consta de un secado de la biomasa (relativamente
rápido). La segunda etapa corresponde a una pirólisis (300-500°C). Estos procesos se pueden llevar
de distintas formas5:
1) La oxidación parcial con aire, de la cual los mayores productos generados son CO, CO2, H2,
CH4, N2 y alquitrán. Este proceso genera un poder calorífico aproximado de 5 MJm-3.
2) La oxidación parcial con oxígeno donde los mayores productos generados son CO, CO2,
H2, CH4 y alquitrán. El poder calorífico de los gases generados es entre 10-12 MJm-3;
3) Vapor (pirolítico): este proceso tiene dos etapas. El reactor principal produce gas y carbón.
La arena y el carbón pasan a un segundo reactor donde el carbón se quema con aire para
calentar la arena, que luego se vuelve a distribuir al primer reactor para proporcionar el
calor para la reacción. El gas calorífico se maximiza debido a un alto contenido de metano
y de hidrocarburos del gas, pero a expensas de una menor eficiencia global debido a la
pérdida de carbono en el segundo reactor. Los principales productos generados son CO,
CO2, H2, CH4 y alquitrán. El poder calorífico es entre 15-20 MJm-3.
4) Gasificación por presión. Este proceso tiene un costo de capital y operación más alto que
los anteriores. Esto se debe a que trabaja a bajas presiones entre 15-50 bar.
5) Método con oxigenación. Este proceso es usado en conjunto con el de presión De esta
forma se obtienen mayores temperaturas de reacción y por tanto menores niveles de
alquitrán. Esta tecnología tiene un mayor costo asociado al uso de oxigeno5.

Capítulo 1
En general, el proceso de gasificación debe incluir una etapa de limpieza de los gases formados. La
contaminación puede provenir del alquitrán, material particulado, algunos metales, entre otros
formados en el proceso o impurezas de la biomasa.
1.3.2 Pirólisis de biomasa
La pirólisis es la descomposición térmica de la biomasa, proceso que ocurre en ausencia de oxígeno
y con temperaturas entre 300 a 500 °C. Los principales productos obtenidos son gases, carbón y
líquido. Estos productos varían dependiendo en gran medida de la temperatura de pirólisis y el
tiempo de residencia de la biomasa en el reactor6.
La pirólisis también es la etapa principal de los otros procesos térmicos descritos. Sin embargo, la
diferencia radica en que tanto la gasificación como la combustión son seguidas por una oxidación
parcial o total de los productos primarios. En la pirólisis, bajas temperaturas y alto tiempo de
residencia de la biomasa en el reactor beneficiaran la producción de carbón. A diferencia, altas
temperaturas y alto tiempo de residencia favorecerán la obtención de gas, y altas temperaturas y
corto tiempo de residencia en el reactor favorecerá la obtención de líquidos. En la Tabla 1.1 se
muestran los diferentes productos y rendimientos, de acuerdo al modo de pirólisis utilizado.
Tabla 1.1 Productos y rendimientos típicos, obtenidos en distintas condiciones de pirólisis 6.
Liquido Carbón Gas

Modo Condición
% % %
Temperatura alrededor 500°C, vapor caliente en
Rápida 75 12 13
residencia por 1 segundo.
Temperatura alrededor de 500°C, vapor caliente en
Intermedia 50 20 30
residencia por 10-20 segundos
Temperatura alrededor de 400°C, alto tiempo de
Lenta 30 35 35
residencia
Gasificación Temperatura de 800°C, alto tiempo de residencia 5 10 85
El principal uso de esta pirólisis de biomasa es la obtención de un líquido, lo que tiene una gran
ventaja, ya que puede ser almacenado y transportado con mayor facilidad y a un costo menor que la
biomasa sólida debido a su menor volumen. Para favorecer el mayor rendimiento en el producto
líquido, la pirólisis se debe realizar con temperaturas moderadas y corto tiempo de residencia de la
biomasa, proceso llamado “Fast Pirolisis” o pirólisis rápida (Tabla 1.1)
En la pirólisis rápida, los procesos de transferencia de calor, cinética de reacción de los productos
químicos y la transferencia de masas, juegan un papel importante, pues en la pirólisis, la biomasa se
descompone en varios gases, aerosoles y carbón. Después del enfriamiento y condensación, se
forma un líquido oscuro de color café que tiene un poder calorífico menor que el combustible
convencional. Este líquido proveniente de biomasa forestal recibe el nombre de “bio-oil” o también
llamado líquido de pirólisis. En la Figura 1.1 se muestra un diagrama general del proceso de
pirolisis rápida y la obtención de bio-oil7.

Capítulo 1
Figura 1.1 Diagrama general propuesto en la pirólisis rápida de biomasa7.
Considerando que el producto principal de la pirólisis rápida de biomasa forestal es el bio-oil, es

necesario incluir un secado, de tal forma que la biomasa tenga menos de un 10 % de humedad con
el fin de minimizar el contenido de agua en el bio-oil. También es necesario que el material
utilizado tenga un tamaño de partícula pequeño (< 3 mm). De esta forma se puede asegurar una
reacción rápida. En la Figura 1.2 se muestran los principales procesos de conversión térmica y sus
productos con las aplicaciones respectivas. Este trabajo se acotará a la matriz de estudio bio-oil.
Figura 1.2 Procesos de conversión térmica, productos principales y sus aplicaciones 7.
El bio-oil se obtiene por despolimerización y fragmentación rápida y simultánea de celulosa,

hemicelulosa y lignina, principales componentes de la madera. Al proseguir con un enfriamiento
rápido, se evita la degradación de los compuestos formados. Sin embargo, se produce degradación
de celulosa a las temperaturas entre (240-350 °C), generando anhidrocelulosa y levoglucosano. La
pirólisis de la celulosa además produce grupos carbonilos (aldehídos), ácidos orgánicos y furanos.

Capítulo 1
También se produce la degradación de hemicelulosa, entre 200-260 °C, generando principalmente

algunos ácidos, furanos, lactonas y algunos aldehídos. Por último, la descomposición de lignina
puede ocurrir en un amplio rango de temperatura (entre 280-500°C), produciendo un alto contenido
de grupos fenólicos y lignina pirolítica.
1.4 Propiedades físico-químicas del bio-oil
El bio-oil es un líquido oscuro de color café, el cual contiene una composición elemental
aproximada a la biomasa. Este líquido presenta una compleja composición de especies oxigenadas e
hidrocarburos, con una proporción no despreciable de agua. Los subproductos obtenidos del bio-oil,
como agua, gas, carbón y productos orgánicos dependerán en gran medida de la temperatura del
reactor. En la Tabla 1.2, se muestran algunas características del bio-oil. Las temperaturas de
pirólisis afectan el rendimiento de los productos. Es así que optimizando el proceso de pirólisis se
puede obtener un mayor rendimiento en bio-oil. En la Figura 1.3 se muestra un gráfico con los
rendimientos de estos productos, a diferentes temperaturas.
Tabla 1.2 Propiedades típicas y características del bio-oil obtenido de biomasa forestal.
Líquido oscuro, de color café. Dependiendo de la materia prima inicial y el

modo de pirólisis rápida, el color puede ser casi negro. Un alto contenido de
Apariencia
nitrógeno en el líquido puede dar un tinte de color verde oscuro.
El líquido tiene un olor particular a humo acre que puede irritar los
ojos si se expone durante un período prolongado. La causa de este olor es
Olor
debido a los aldehídos de bajo peso molecular y ácidos.
El líquido contiene cantidades variables de agua, que van desde un 15 % en

peso a un máximo de alrededor de 30 a 50 %. Este líquido puede tolerar la
Miscibilidad adición de un poco de agua, antes que comience a separarse en dos fases. Es
miscible con solventes polares, tales como metanol y acetona.
La complejidad y la naturaleza del bio-oil, provoca un comportamiento

inusual en algunas propiedades. Estas tienden a cambiar con el tiempo,
Envejecimiento aumentando la viscosidad, disminuyendo la volatilidad y produciéndose una
separación de fases.
Modificado de: A. Bridgwater, Bio-Energy Research Group, Aston University, 2004

Capítulo 1
Figura 1.3 Efecto de la temperatura del reactor en el rendimiento de los productos obtenidos en el
bio-oil7.
El bio-oil posee capacidad calorífica (alrededor de 16 – 17 MJ Kg-1), y una gran variedad de

compuestos que pueden potencialmente poseer una gran utilidad. En la Tabla 1.3 se muestran las
principales características físicas del bio-oil.
Tabla 1.3 Algunas Propiedades físicas del bio-oil8.
Parámetros Valor típico Rango

Valor calórico 17 MJ/Kg 15-19 MJ/Kg
Punto de inflamación 55 ºC 51-58 ºC
Densidad 1.18 Kg/L 1.16-1.22 Kg/L
Acidez pH 2.5 pH 2.1-3.4
Humedad 22 % en peso 14-31 % en peso
Viscosidad (40ºC) 45 cp 35-55 cp
Solubilidad
Hexano 0.1 % --
Tolueno 16 % --
Acetona/ácido acético 99.86 % --
El bio-oil puede ser obtenido de diferentes materias primas. Entre ellas está la madera de pino. En
la Tabla 1.4 se presentan algunos de los principales compuestos químicos presentes en bio-oil
obtenido de madera de pino, realizado por la empresa “Dynamotive”.

Capítulo 1
Tabla 1.4 Principales compuestos presentes en el bio-oil9.
Compuestos Porcentaje en peso

Lignina 24.7
Hidroxiacetaldehído 9.4
Levoglucosano 7.3
Acetol 6.6
Ácido fórmico 4.6
Ácido acético 4.5
Formaldehído 3.4
Celobiosano 2.3
Glioxal 2.3
Considerando la variabilidad de compuestos, el bio-oil puede presentar diferentes reacciones

químicas, las cuales son catalizadas por el medio ácido en que se encuentra el bio-oil. A
continuación, se explican las principales reacciones químicas que pueden tener lugar.
1.5 Reactividad del bio-oil
La composición del bio-oil varía dependiendo de los siguientes parámetros10.
- Nitrógeno orgánico y proteínas presentes en la biomasa.

- Parámetros del proceso de pirólisis como: temperatura de pirólisis, tasa de
transferencia de calor, tiempo y temperatura de los vapores en el reactor, eficiencia
de los equipos de condensación, entre otros.
- Contenido de agua del bio-oil
- La exposición al aire del bio-oil durante el almacenamiento
- El tiempo de almacenamiento
- Temperatura de almacenamiento
- El grado de contaminación que podría suceder durante el almacenamiento.
Estas condiciones determinarán los compuestos del bio-oil, en especial los de carácter orgánico. A
continuación se detalla brevemente la composición orgánica e inorgánica del bio-oil, junto con las
posibles reacciones implicadas.
1.5.1 Compuestos inorgánicos en el bio-oil
El contenido inorgánico o mineral del bio-oil, puede estar asociado en diferentes formas,
encontrándose principalmente en solución acuosa en formas de iones (fosfatos, oxalatos, carbonatos
etc.). Estas especies son de importancia en el bio-oil, ya que están involucradas principalmente en el
proceso de envejecimiento. Estas especies pueden catalizar las reacciones de polimerización durante
el almacenamiento, aumentando la viscosidad y el crecimiento del tamaño de partícula del carbón
presente en el bio-oil. En general, la presencia de compuestos inorgánicos puede afectar las
propiedades de combustión de cualquier bio-oil. Aunque hay una gran variabilidad de estas
especies, generalmente es posible encontrar en el orden de los ppm las siguientes especies: calcio,
silicio, potasio, hierro, aluminio, níquel, cromo, zinc, entre otros 10.

Capítulo 1
Afortunadamente las especies inorgánicas pueden ser disminuidas, modificando el proceso de

pirólisis.
1.5.2 Compuestos orgánicos en el bio-oil
La pirólisis involucra sólo una descomposición parcial de la biomasa, lo que implica, que gran parte
del contenido dependerá del tipo de biomasa utilizada. Por ejemplo, es posible esperar que el bio-oil
producido con alfalfa, la cual contiene niveles mayores de proteínas, se presente mayor contenido
de nitrógeno orgánico, en comparación con la madera. El nitrógeno orgánico puede causar
condiciones adversas por la presencia de NOx en la combustión y en las propiedades de
envejecimiento del bio-oil10.
Otro componente importante es la lignina, de la cual sus principales derivados son los componentes
fenólicos. Además de la celulosa y la hemicelulosa, el bio-oil contiene más de 400 compuestos
orgánicos entre ácidos, alcoholes, aldehídos, ésteres, cetonas, azúcares, fenoles, guaiacoles,
siringoles, furanos y compuestos multifuncionales, como el ácido hidroxiacético,
hidroxiacetaldehído, hidroxicetona, y 3-hidroxi- 3-metoxi-benzaldehído10.
Estos compuestos pueden generar diferentes tipos de reacciones químicas. Según literatura, las
posibles reacciones que pueden ocurrir en el bio-oil son las siguientes10:
a) Esterificación: Reacción producida entres ácidos orgánicos y alcoholes, para la formación

de ésteres y agua. Esta reacción es catalizada en medio ácido, el pH del bio-oil está
comunmente entre 2 y 3. También es posible que los ácidos orgánicos reaccionen con
olefinas para formar iso-esteres, sin el agua como subproducto.
Reacción de esterificación.
b) Homopolimerización: Reacción entre aldehídos para generar polímeros oligómeros y

poliacetal.
c) Hidratación: La reacción ocurre entre aldehídos y agua es rápida. En el caso del bio-oil, el
cual contiene cerca de 25 % de agua y alrededor de un 3% de formaldehido, el 99 % de la
masa de formaldehído se encuentran en forma de hidratos. Si el porcentaje de acetaldehído
es de 3 % el 24 % en peso de este aldehído se encontrará como hidrato. La acetona, en
similares porcentaje se encontraría sólo un 0.04% (en peso) en su forma de hidrato.
Ejemplo de hidratación donde R’ corresponde a un hidrogeno o un grupo alquil.

Capítulo 1
d) Formación de hemiacetal: La reacción entre un aldehído y un alcohol para la formación de

hemiacetales, puede suceder en forma rápida y sin la presencia de un catalizador. El
formaldehido, puede reaccionar con grupos fenólicos para formar fenil-hemiformal, aunque
mayoritariamente forme metil-hemiformal.
e) Acetilación: En presencia de una catálisis ácida, aldehídos y alcoholes pueden formar

acetales estables. Debido a que la formación de acetales es reversible, pueden ocurrir
reacciones de transacetlilación.
f) Otras posibles reacciones son: fenol/formaldehido para la formulación de resinas;

polimerización de furanos; dimerización de compuestos orgánicos nitrogenados; oxidación,
hidrogenación, entre otras.
Reacción fenol/formaldehído.
Dimerización de compuestos orgánicos nitrogenados.
Es importante el conocimiento de las posibles reacciones que pueden ocurrir en la matriz de estudio.
Esto afectará a las metodologías que se implementarán y/o desarrollarán para la determinación de
componentes de interés en el bio-oil
1.6 Productos de interés nacional del bio-oil
Como ya se ha mencionado, además de su uso como combustible para la producción de energía y
calor, el bio-oil puede servir de base para la fabricación de una amplia gama de productos químicos
orgánicos.
a) Bio-oil como combustible: El uso comercial en el cual se puede utilizar bio-oil es en la

generación de energía y calor, sea en hornos, calderas, turbinas a gas entre otros9.
b) Bio-oil como fuente de productos químicos: Se puede obtener una amplia gama de
productos químicos a partir del bio-oil, ofreciendo un valor agregado más alto en
comparación con su uso como combustible. Los productos químicos pueden ser separados,
extraídos y procesados. Es necesario que los productos químicos presentes se encuentren en

Capítulo 1
una alta proporción para que el proceso sea económicamente viable. En el bio-oil obtenido
de madera los productos que se encuentran en mayor proporción son: hidroxiacetaldehído,
ácido acético, ácido fórmico, levoglucosano y levoglucosenona. Los principales usos están
destinados a lubricantes, fertilizantes, industria farmacéutica, aditivos en alimentos y como
antioxidantes9.
Lignina pirolítica y fenoles polisubtituidos
En presencia de agua el bio-oil se separa en una fase acuosa y una fase orgánica más densa. La fase
orgánica contiene lignina pirolítica y la mayor parte de los fenoles polisubtituidos. La aplicación
más promisoria de la fracción fenólica es en la formulación de resinas fenol-formaldehído11.
Propuesta de la estructura de lignina
Si bien no es posible definir una estructura de la lignina, si se han propuesto diferentes modelos que
la pueden definir.

Capítulo 1
Hidroxiacetaldehído
Uno de los compuestos más abundantes en el bio-oil de madera de pino es el hidroxiacetaldehído

(9-12%), producto de las reacciones de fragmentación de celulosa y hemicelulosa. Su química es
similar a la del glioxal y formaldehído.
O OH
O
HO
HO O
Glicolaldehído (dímero) Hidroxiacetaldehído
El hidroxiacetaldehído es el componente más reactivo del humo líquido y su acción bronceadora es

aproximadamente 2000 veces superior a la de la glucosa. Otras aplicaciones son la reducción de la
reversión de la blancura inducida térmicamente o por la luz en pulpas que contienen ligninas12 y la
eliminación de H2S utilizando emulsiones agua aceite13. La oxidación selectiva del
hidroxiacetladehído permite obtener ácido glicólico14, materia prima para polímeros PGA (ácido
poliglicólico) con propiedades de barrera de gases, de alto interés en la industria de envases para
alimentos y bebidas.
Levoglucosano y Celobiosano
El levoglucosano (1,5 anhidro β-D-glucopiranosa) y el celobiosano (1,6-anhidro-β-celobiosa) son

productos de la depolimerización de la celulosa. El levoglucosano en el bio-oil alcanza
concentraciones de 3 a 6%. Se produce debido a la fragmentación de la celulosa y a la formación de
hidroxiacetaldehído. Este compuesto tiene aplicaciones en la industria farmacéutica, en la
producción de polímeros y resinas especiales, surfactantes glucósidicos y poliglucosas no
hidrolizables. Otra aplicación que requiere anhidroazúcares puros y para la cual existe actualmente
un mercado, es la metabolización por microorganismos para la producción de ácidos carboxílicos o
etanol15.
Levoglucosano Celobiosano
También estos anhidroazúcares pueden ser convertidos en azúcares por hidrólisis ácida. Algunos
trabajos han demostrado que al agregar ácido sulfúrico al líquido de pirólisis, se forma una alta
cantidad de glucosa, dependiendo del nivel de levoglucosano presente16.

Capítulo 1
Ácidos carboxílicos de cadena corta (C1-C3)
La fracción de ácidos carboxílicos de cadena corta en el bio-oil es de 6 a 10%, principalmente

ácido acético, fórmico y propiónico. El ácido acético es un importante commodity con una
producción mundial sobre las 8 millones t/año, de origen fundamentalmente no renovable (etano).
La producción de ácido acético se ha incrementado por la creciente demanda de sus derivados
como el acetato de vinilo. Como los ácidos hacen ser corrosivo al bio-oil, su separación mejora las
características de los combustibles, elevando su atractivo comercial.
OH H3C OH O
CH3
H O O OH
Ácido fórmico Ácido acético Ácido propiónico
1.7 Analítica del bio-oil

Por la importancia que presenta el bio-oil, se han reportado diferentes metodologías aplicadas a su
caracterización y la posible cuantificación de los compuestos presentes en éste. Cabe destacar que
es de gran importancia el desarrollo de metodologías analíticas, validadas y eficaces, para la
producción de los compuestos de interés en el bio-oil.
Dependiendo del uso que se le de al bio-oil, es necesario determinar las propiedades de este líquido
ya que tanto sus propiedades físicas como químicas juegan un rol importante. En esta sección se
describen brevemente los métodos para la caracterización física del bio-oil y las metodologías tanto
químicas como instrumentales en la determinación de sus componentes.
1.7.1 Parámetros físicos del bio-oil

La utilización de bio-oil como combustible requiere de características especiales. Las principales
propiedades físicas que deben ser evaluadas son contenido de agua, sólidos, silicio, homogeneidad,
estabilidad y punto de inflamación. Estos test se encuentran descritos por la American Society for
Testing and Materials (ASTM) 17.
a) Contenido de agua: Se recomienda realizar la determinación de agua por el método Karl

Fischer (ASTM E-203). En este método, se pesa alrededor de 0.2 gramos de muestra, se
agrega cloroformo/metanol 1/3 v/v, y el agua es titulada con 2-metoxi etanol18, 19.
b) Sólidos y otros compuestos: Es recomendado determinar los sólidos, como material

insoluble de la solución metanol/diclorometano 1/1 v/v. Posteriormente se filtra (1 µm de
tamaño de poro). Silicio y otros metales pueden ser analizados a partir de cenizas, ya sea
por XRF (espectrometría de fluorescencia de rayos X) o por ICP 17,19.

Capítulo 1
c) Homogeneidad: El alto contenido de agua causa un efecto negativo en la homogeneidad del

bio-oil. Es posible realizar determinaciones microscópicas para la información sobre la
separación de fases, sólidos, compuestos inorgánicos etc. Además es recomendable dejar el
bio-oil por 7 días en reposo y determinar en distintos niveles el contenido de agua por el
método de Karl Fischer17, 19.
d) Estabilidad: Es posible determinar la estabilidad por el cambio de viscosidad del bio-oil.

Esto debido a los cambios químicos que ocurren durante el almacenamiento, aumentando
los compuestos insolubles en agua por el aumento del peso molecular de las especies
presentes, lo que se traduce en un aumento de la viscosidad. La prueba de envejecimiento
acelerado es de utilidad en esta determinación. Para ello la muestra debe estar por 24 horas
a 80 °C. Posteriormente se determina la viscosidad a 40 °C. La viscosidad es determinada
según el método ASTM D-44517,19.
e) Punto de inflamación: El método de prueba se realiza bajo el procedimiento ASTM D-93.

El principal inconveniente es que la temperatura de inflamación es entre 70-100 °C. Siendo
poco aplicable al bio-oil, por la evaporación del agua17, 19.
f) Densidad: En el bio-oil ésta se correlaciona con la concentración de agua presente. La

determinación es sencilla, utilizando un densímetro según la norma ASTM D-405217,19.
1.7.2 Análisis del bio-oil por método químicos

Los aldehídos y las cetonas participan de las reacciones de envejecimiento durante el
almacenamiento del bio-oil. Por lo tanto, se ha sugerido utilizar el contenido del grupo carbonilo
como un indicador de estabilidad.
La determinación del grupo carbonilo se basa en la reacción cuantitativa de clorhidrato de

hidroxilamina con aldehídos y cetonas en presencia de piridina. La función de la piridina en el
sistema de reacción es la permanencia de la formación de la oxima. El ácido liberado en forma de
clorhidrato de piridina se determina por titulación y es una medida directa de la concentración de
grupos carbonilo originalmente presentes en la muestra. Por lo general, el contenido de carbonilos
de un bio-oil fresco está en el rango de 4-6 carbonilo mol/kg de líquido17.
En el caso de los ácidos orgánicos, se utiliza como determinación rápida la acidez total mediante
titulación volumétrica ácido/base con indicador, considerando que el bio-oil tiene un pH entre 2 y 3
debido fundamentalmente a los ácidos carboxílicos (fórmico, acético y propiónico) presentes en
bio-oil. Los resultados se expresan como mg de KOH equivalentes por gramos de muestra. Esta
metodología está estandarizada en la norma ASTM D-924. Sin embargo, el bio-oil al ser un líquido
oscuro, las valoraciones volumétricas presentan la desventaja en la visualización del punto final de
la reacción18. En algunos casos para mejorar esta determinación se ha empleado la titulación
potenciométrica.

Capítulo 1
1.7.3 Análisis del bio-oil por métodos instrumentales

La caracterización completa del bio-oil es poco factible. El bio-oil contiene especies de alto peso
molecular, incluyendo productos de degradación como pentosas, hexosas, y lignina. Sólo una
fracción de los componentes del bio-oil puede ser analizado a través de GC, utilizando programas
de alta temperatura. Además, el bio-oil contiene componentes polares, que sólo pueden ser
analizados sin pre-tratamientos por HPLC o por GPC20. En la Figura 1.4 se muestra un gráfico con
las fracciones del bio-oil, junto con su posible detección y cuantificación por cromatografía líquida
y de gases.
Figura 1.4 Fracciones de compuestos de importancia en el bio-oil y su detección mediante técnicas

cromatográficas14.
Los componentes volátiles y no volátiles del bio-oil pueden ser analizados por GC/MS y HPLC
respectivamente. FT-IR sirve para detectar grupos funcionales de interés, GPC para la distribución
de peso molecular y RMN para la determinación de tipos de hidrógeno o carbonos en grupos
estructurales específicos.
La alta complejidad del análisis del bio-oil por estas técnicas se debe especialmente a los grupos
fenólicos complejos (pesos moleculares hasta 500 amu), que provienen de la descomposición de la
lignina. En estos fragmentos oligoméricos existen diferentes concentraciones variables de ácidos
fenólicos, ácidos carboxílicos y grupos hidroxilo, así como presencia de aldehídos, alcoholes, y
funciones éter. También hay una diversidad de enlaces puentes de hidrógeno que pueden formar
miscelas, geles, etc. Una consecuencia de esto es por ejemplo que el análisis por GPC puede
sobreestimar el peso molecular debido a estas interacciones.
El análisis por HPLC puede ser afectado por la combinación de compuestos con diferentes
polaridades y diferencias en el peso molecular. Estas diferencias pueden producir el solapamiento
de las señales, afectando la caracterización y la cuantificación de las especies.
En la caracterización del bio-oil se han propuesto diferentes técnicas, en las cuales es necesaria la
extracción de los distintos componentes, basándose en criterios de solubilidad. De acuerdo a esto, se
separan las muestras en fracciones, las cuales son analizadas por las diferentes técnicas. En las
Figuras 1.5 y 1.6 se muestran diferentes esquemas de fraccionamiento propuestos en literatura para
la caracterización de compuestos en muestras de bio-oil21, 22. No obstante, hay autores que previo al
fraccionamiento realizan un análisis completo del bio-oil. Las principales técnicas que se utilizan

Capítulo 1
son FT-IR, RMN, GPC, DTG, GC-MS y HPLC. Además se ha utilizado un tratamiento de
pirolización (Py) de la muestra, acoplado a un GC/MS.
Figura 1.5 Ejemplo de un esquema de fraccionamiento por solvente del bio-oil21.
Figura 1.6 Ejemplo N°2 de un esquema propuesto para la caracterización del bio-oil22.
1.7.3.1 Caracterización por FT-IR y 1H NMR

El análisis por FT-IR se ha aplicado en gran medida a la caracterización de la lignina pirolítica
obtenida por el tratamiento del bio-oil. En este análisis es posible la caracterización de los grupos
carbonilos, éster y aromáticos, entre otros. No obstante, no muestra una mayor aplicación a la
caracterización del bio-oil por presentar una gran mezcla de compuestos con diferentes propiedades
físico-químicas23, lo que dificulta su utilización, limitándola al uso de fracciones del bio-oil22, 24-28.
Bayerbach et. al28 determinan grupos carbonilos y grupos OH en la fracción acuosa de bio-oil. Los

Capítulo 1
grupos OH se determinan como contenido total de fenoles y alifáticos, además de utilizar una
relación entre OHfen/OHalif.
Uno de los usos del FT-IR es en la caracterización de la lignina pirolítica. Esta es secada y
mezclada con KBr. De esta forma se obtienen las principales señales en la región 1750 cm-1 a 1000
cm-1.
Las bandas características encontradas son31:
 1701-1734: C=O, correspondiente a cetonas, carbonilos y grupos éster

 1652-1666: C=O (strech), correspondiente a sistema conjugado aril-cetonas.
 1593-1609: C=O (vibracional) correspondiente a grupos aromáticos.
 1510-1515: anillo aromático (vibracional)
 1443-1463: C-H, correspondiente a grupos –CH3, -CH2-
 1422-1431: C-H, correspondiente a grupos aromáticos
 1214-1233: C-C, C-O
Al igual que FT-IR, la aplicabilidad de la técnica RMN sólo es posible al utilizar un

fraccionamiento del bio-oil. La utilización que ha presentado es a la caracterización de los grupos
aromáticos y alifáticos26, 27. Si bien las principales aplicaciones de la resonancia magnética nuclear
son la identificación y confirmación de estructuras, también es posible realizar determinaciones
cuantitativas, ya que muestra señales que son directamente proporcionales al número de núcleos en
que originan24. Sin embargo, mientras más compleja sea la muestra, hay una mayor probabilidad de
solapar algunas señales.
Los principales grupos que se caracterizan y cuantifican por NMR, en este caso de protones son
compuestos aromáticos, fenólicos y alifáticos. Bayerbaceth28 determinó OH totales en diferentes
tipos de bio-oil, obtenidos de madera de haya, Pícea y bambú. Esta técnica junto con FT-IR puede
ser utilizada como apoyo para el conocimiento de algunos grupos funcionales en el bio-oil.
1.7.3.2 Análisis por cromatografía de permeación por gel

La cromatografía de permeación en gel (GPC) separa moléculas en virtud de sus diferencias de
tamaño molecular. La capacidad separadora reside en el gel cuya matriz consta de un gran número
de esferas porosas microscópicas. Estas esferas están constituidas por largas cadenas de polímeros
unidas entre si, por enlaces químicos para formar una red tridimensional.
Bajo ciertas condiciones es posible la separación de oligómeros y especies poliméricas. Esto

dependerá del tamaño de poro de la fase estacionaria utilizada y el límite de exclusión que ésta
presente. La principal ventaja que presenta es la determinación rápida de distribución de pesos
moleculares en polímeros, lo cual puede favorecer la determinación de pesos en la fracción que
contiene lignina. También permite determinar azúcares. Las mayores desventajas es que no es
aplicable a muestras de componentes de tamaño molecular similar, ya que se necesita por lo menos

Capítulo 1
una diferencia del 10 % entre los pesos moleculares y que las especies poliméricas del bio-oil no
tienen un peso molecular único, sino que determinados intervalos.
La aplicación habitual de esta técnica en muestras de bio-oil es la determinación de la masa

molecular media. Para ello se utiliza THF como disolvente (muestras en un 10 % en peso),
columnas de HP PL gel 10.000, 500 y 50 Å en serie17.
1.7.3.3 Análisis por termogravimetría derivada

El análisis termogravimétrico es una técnica en la que la masa de la muestra es registrada en
función del tiempo o de la temperatura cuando la temperatura de la muestra sigue cierto programa,
en una atmósfera específica. Estos análisis se basan en la medida de la relación entre la temperatura
y alguna propiedad de un sistema, como la masa o el calor de reacción. Los métodos térmicos más
utilizados son tres Análisis termogravimétrico (ATG), análisis térmico diferencial (ATD) y
calorimetría diferencial de barrido (DSC).
En el ATG se registran cambios de peso de las sustancias y en los otros dos (ATD y DSC) se
registran cambios de energía. En termogravimetría puede obtenerse también la derivada del peso
respecto al tiempo, dando lugar a la técnica denominada DTG. Se han descrito diversas técnicas
múltiples que combinan varios métodos térmicos o bien un método térmico y un método de
detección de gases.
En el análisis termogravimétrico se registra de forma continua la masa de una muestra a medida que
aumenta su temperatura en forma lineal, desde la temperatura ambiente hasta temperaturas del
orden de 1200 °C. La gráfica de la masa en función de la temperatura se denomina termograma y
proporciona información cualitativa y cuantitativa de las muestras30.
Esta técnica encuentra su mayor aplicabilidad en la determinación de especies poliméricas, ya que

pueden mostrar la información de la descomposición de las diversas preparaciones poliméricas. Al
utilizar la derivada, esta proporciona una mayor información que no es detectable en un termograma
común. La mayor desventaja de este método es la limitación de compuestos detectables, ya que el
cambio de temperatura debe causar un cambio en la masa del analito, evitando la descomposición,
vaporización, oxidación u otro cambio físico-químico que afecte al analito. En la Figura 1.7 se
presenta un ejemplo de termograma correspondiente a una fracción acuosa de una muestra de bio-
oil.

Capítulo 1
Figura 1.7 Termograma de una fracción de acuosa de una muestra de bio-oil, Señales a, b, c y d
corresponden a compuestos polares volátiles, compuestos polares de mediana volatilidad,
compuestos polares de alto peso molecular y azúcares32.
Las principales familias de compuestos que pueden ser caracterizadas en diferentes fracciones de
bio-oil son las siguientes32:
- Especies volátiles no-polares: Los principales compuestos corresponden a la familia

del etilbenceno y p-xileno. Presentan señal entre 116 °C y 153°C.
- Monoligninas: Estas especies presentan señal entre 100 °C y 300 °C, y se pueden
encontrar derivados del fenol, o productos de degradación de la lignina.
- Compuestos de extracción: Se pueden encontrar entre los 225 °C y 296 °C. Las
principales especies determinadas son: resinas, parafinas y fenantrenos.
- Compuestos no polares de alto peso molecular: Presentan una pequeña señal

alrededor de los 350 °C.
- Compuestos polares volátiles: Esta macrofamilia posee especies solubles en agua y

que son determinadas por DTG en temperaturas entre 50 °C y 220 °C. Los
principales componentes identificados corresponden a la familia de las cetonas.
- Compuestos polares de mediana volatilidad: Estos compuestos no pueden ser

seleccionados en una sola familia, ya que las especies presentan una alta polaridad
y similar volatilidad. Las señales máximas se encuentran entre 178 °C y 198 °C.
Las identificaciones corresponden a algunos fenoles, aldehídos, y derivados de la
celulosa y hemicelulosa.
- Compuestos polares de alto peso molecular: Estas señales son apreciadas a

temperaturas entre 340 °C y 365 °C por DTG. Se identifican pequeñas señales
correspondientes a la familia de la lignina.
- Azúcares: Las señales son observadas entre 235 °C y 300 °C.

Capítulo 1
1.7.3.4 Caracterización por cromatografía líquida

HPLC es una de las mejores formas para determinar los compuestos moleculares polares y de
mayor masa. En la Figura 1.4 se muestra el porcentaje de compuestos del bio-oil que pueden ser
determinados por esta técnica. Las columnas de resina tienen una capacidad única para retener y
separar las moléculas neutras tales como azúcares y alcoholes. Actualmente las condiciones
cromatográficas para el análisis de bio-oil por HPLC corresponden al uso de una columna Aminex
HPX-87H, empleando fase móvil de ácido fosfórico 0.007 N, temperatura de 30 °C, de n-propanol
como estándar interno y detección refractométrica19,30,32. Los principales compuestos que se han
determinados son manosa, xilosa, glucosa, arabinosa, galactosa, levoglucosano, celobiosano, ácido
fórmico y acético, formaldehido, hidroxiacetaldehído, glioxal, metanol y etanol.Cabe destacar que
en los trabajos publicados en los cuales se utiliza la técnica de HPLC, no se muestran los
cromatogramas respectivos.
La detección refractométrica diferencial, si bien es presentada por algunos autores como un detector
universal, presenta la desventaja de ser poco sensible y ser dependiente de la temperatura. Además
es posible que por la gran complejidad de la muestra de bio-oil, este detector no presente una
selectividad adecuada. Estos detectores no se pueden utilizar con protocolos de HPLC en que se
utilice un método de elución con gradiente de temperatura, lo cual es una limitante, para la
optimización de un método.
Autores como A. Oasmaa19 y C. Mullen 31, reportan la utilización de HPLC para la determinación
de compuestos como ácidos, azúcares, cetonas y aldehídos en bio-oil (previa derivatización con 2,4-
dinitrofenilhidrazina). En estos trabajos no se presenta información de los parámetros
cromatográficos obtenidos ni de las características analíticas de la metodología empleada. A su vez,
tampoco se presentan cromatogramas y tampoco el tratamiento que se le ha dado a la muestra de
bio-oil.
Actualmente se ha reportado el uso de HPLC con detección UV/vis para la determinación de ácidos
orgánicos, derivados de del furfural y aldehídos. Para ello se utilizó una columna Aminex TMHPX-
87H para los ácidos orgánicos (fórmico y acético), y una columna RP-18 para derivados del
furfural. Sin embargo en el trabajo no se muestran los cromatogramas obtenidos ni las condiciones
de separación a excepción de las columnas ya mencionadas33.
1.7.3.5 Análisis por cromatografía de gases

Esta técnica presenta una gran aplicabilidad, siendo posible la determinación de compuestos en bio-
oil de forma directa y también en fraccionamiento22, 36-41. El bio-oil, al presentar numerosos
compuestos, presenta una alta variabilidad en sus propiedades. Sin embargo, es necesario tener en
consideración que entre la lignina y el agua presentes en el bio-oil representan entre un 45 % a un
60% de la masa y que los carbohidratos, ácidos carboxílicos de bajo peso molecular, representan en
conjunto entre un 15 % a un 25 %. Por tanto, resta alrededor de un 15 % de la masa del bio-oil, que
es fácilmente volatilizable y térmicamente estable y por tanto analizable por GC (Ver Figura 1.4).
Para los analitos que no cumplen dichos requisitos, es posible la formación de derivados volátiles
que si permiten su análisis por GC, aumentando de esta forma el porcentaje de compuestos que

Capítulo 1
pueden ser determinados por GC-MS, aunque la limitante sigue siendo válida para compuestos muy
polares o de peso molecular algo mayor. A continuación se detalla el uso de los diferentes
detectores empleados.
Detector de conductividad térmica
Si bien el uso de esta detección no se ha utilizado en muestras de bio-oil, si se utiliza en el proceso

de pirólisis, para la determinación de los gases producidos, como CO, CO2, CH4 y H2. La principal
importancia de la determinación de estos gases, es su recirculación como gases combustibles en el
reactor de pirólisis39.
Detector de ionización de llama
De los detectores empleados para la caracterización de compuestos en bio-oil, éste es el que

presenta un mayor uso, principalmente por la cantidad de compuestos que pueden ser determinados.
Sin embargo, gran parte de las cuantificaciones con este detector se realizan empleando un sistema
GC/MS y un GC/FID40 o actualmente, realizando la determinación paralela en ambos detectores
GC/MS/FID17, 41. De esta forma realizan la identificación por MS y la cuantificación en el sistema
FID.
Detector selectivo de masas
El amplio uso del detector selectivo de masas se debe a alto número de compuestos que pueden ser
identificados. Gran parte de los trabajo en que se realizan caracterizaciones al bio-oil han empleado
el sistema GC/MS, por ejemplo autores como Sipilä et.al22, realizan fraccionamiento del bio-oil
con diferentes solventes, e inyección en GC/MS con una columna capilar HP Ultra 1, 50 m x 0,32
mm x 0,52 µm. Sin embargo los cromatogramas presentados muestran baja resolución (alrededor
de 45 compuestos en un tiempo de 25 minutos). Rutkowski et al36 emplea una columna capilar HP-
1 de 25 m x 0,2 mm x 0,33 µm, utilizando m/z entre 15-450. En este estudio, el bio-oil se fracciona
con benceno y con hexano, identificando 15 compuestos en la primera extracción y 28 en la
segunda extracción. Tsai et al35, utiliza una columna HP-1 MS de 60 m x 0,25 mm x 0,25 µm, en
modo scan con m/z desde 45-500. El trabajo no presenta cromatogramas y solo se realiza una
caracterización del bio-oil sin fracciones, logrando identificar alrededor de 48 compuestos.
Se ha desarrollado un método para la cuantificación de compuestos en bio-oil, empleando un

sistema GC/MS/FID en el cual la caracterización se realiza con el detector de masas, y la
cuantificación con el detector FID, obteniendo resultados reproducibles. La metodología empleada
es utiliza una columna VF-1701 (14%-cianopropil-fenil-86%-dimetilpolisiloxano, 60m x 0.25mm,
0.25 μm) 17, 41 utilizando acetona como solvente para la dilución de la muestra. Con esta
metodología es posible eluir entre un 25-40 % en peso de los compuestos presentes en el bio-oil, e
identificar cerca del 70-90% de los compuestos eluidos17. En la Figura 1.8 se muestra un
cromatograma típico obtenido por la metodología descrita.
Figura 1.8 Cromatograma típico de bio-oil obtenido por GC/MS/FID, y la caracterización de los
principales compuestos17.

Capítulo 1
Considerando la complejidad de la muestra de bio-oil se han empleado diversos tratamientos de

muestra, para determinar tanto compuestos de una forma selectiva o para la determinación de
compuestos que no poseen características químicas para ser determinadas directamente por GC/MS.
Una técnica rápida y poco costosa para la extracción de los compuestos volátiles es la
microextracción en fase sólida (SPME). Tiene dos funciones importantes: la extracción de analitos
y la desorción en instrumentos analíticos (en este caso GC). A.Oasmaa et.al17 evaluó esta técnica
para la extracción de los compuestos volátiles del bio-oil y su posterior desorción en un sistema
GC/MS. La principal ventaja es la mayor selectividad en la extracción. Los principales compuestos
identificados por esta técnica son: acido acético, acetol, furfural, fenoles, guaiacoles, siringoles,
eugenol17.
Para compuestos de alto peso molecular, que no son posibles de determinar directamente por GC, se
puede utilizar esta misma técnica, previa pirólisis de la muestra. La pirólisis es un método
degradativo de gran interés para el estudio de especies macromoleculares, el cual da lugar al
rompimiento térmico del polímero, donde los compuestos monoméricos obtenidos se pueden
determinar por ejemplo por GC/MS. A las temperaturas de trabajo no tan solo se produce el
rompimiento de los enlaces éster o éter, sino también los enlaces C-C. Esto solo es posible si la
pirólisis se realiza en atmósfera inerte, altas temperaturas y por un corto tiempo.
Actualmente la nueva técnica GC x GC-TOF-MS para el análisis de bio-oil ha sido reportada por
Sfetsas et.al42 en la cual lograron identificar alrededor del 70 % de las señales obtenidas en un
cromatograma de bio-oil, a diferencia de la técnica GC/MS, en que sólo el 47 % de las señales son
posibles de caracterizar. El fundamento de la cromatografía de gases multidimensional es el que
todos los analitos de interés sean sometidos a dos etapas de separación independientes y que los
analitos permanezcan separados hasta que se complete todo el análisis. Para ello, el análisis de la

Capítulo 1
primera columna cromatográfica es reanalizado por una segunda columna con una fase estacionaria
de distinta selectividad. Este sistema responde a la necesidad de aumentar el poder de separación en
la cromatografía. Con respecto a los parámetros analíticos evaluados, estos presentan menores
límites de detección en comparación con un sistema GC/FID, pero sólo para algunas especies.
Las técnicas pirolíticas presentan la ventaja de ser rápidas, utilizar pequeña cantidad de muestra y
permitir el análisis in-situ. El compuesto que se encuentra en un alto porcentaje en el bio-oil, y no
puede ser caracterizado por GC, es la lignina pirolítica. Las ligninas son fracciones no
carbohidratadas de la madera libre de extraíbles, extremadamente complejas y difíciles de
caracterizar, por lo que la pirólisis acoplada a un GC/MS se presenta como una buena opción en la
determinación de la lignina pirolítica29, 37,44.
Para la pirólisis se debe utilizar 60 µg de lignina pirolítica, la cual es pirolizada en un tubo de

cuarzo comenzando a 450 °C hasta 1000 °C. Este pirolizador está acoplado al sistema GC-MS. Las
condiciones son: columna capilar Chrompack DB 1701 60 m x 0,25 mm, 0,25 µm film; gas de
arrastre helio; Inyector 250 °C; detector 280 °C29. Los principales compuestos identificados son
guaiacoles, vainilina y derivados, siringoles y coniferaldehídos entre otros derivados fenólicos 26.
Últimamente se ha utilizado para la caracterización de lignina las técnicas MALDI-TOF-MS que

presenta la ventaja de ser altamente sensible y determinar el extenso de una molécula sin realizar el
fraccionamiento de ésta43. Como desventaja, es la señal que puede presentar la matriz,
especialmente en los rangos de menor masa. La técnica LDI-TOF-MS, presenta la ventaja de evitar
las interferencias de la matriz, sin embargo, la aplicación de esta técnica es sólo para moléculas más
pequeñas43. Por último la Py-FIMS es una técnica por la cual es posible extraer e ionizar especies
monoméricas o subunidades de dímeros a partir de polímeros u oligómeros. Las cuales por su alto
costo no han demostrado una gran aplicabilidad43.
Se han evaluado variadas técnicas analíticas tanto para el análisis cualitativo y cuantitativo del bio-
oil, enfocando cada vez más a técnicas con mayor sensibilidad y selectividad, siendo este último
parámetro el de mayor interés considerando la alta complejidad de la matriz de bio-oil. Sin
embargo, las técnicas actuales tienen la gran desventaja de presentar un alto costo en la adquisición
y la mantención de estas, siendo por esta razón que en este trabajo de tesis se buscó el desarrollo de
metodologías analíticas con una alta selectividad, orientando el estudio a los posibles tratamientos
de la muestra de bio-oil.
Cabe destacar que en bibliografía se ha reportado el uso de más de una técnica analítica, con el fin
de complementarse y lograr determinar un mayor número de compuestos. Esto debido
principalmente al elevado número de compuestos presentes en el bio-oil, y que no todos presentan
una compatibilidad con la técnica empleada.

Capítulo 1
1.8 Bibliografía
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Bioresource Technology 102 (2011) 6178–6185.

Capítulo 1
40. P. K. Rout, M. K. Naik, S. N. Naik, V. Goud, L. M. Das, A. Dalai, Supercritical CO2

Fractionation of Bio-oil Produced from Mixed Biomass of Wheat and Wood Sawdust,
Energy Fuels 23 (2009) 6181–6188.
41. A. Azeez, D. Meier, J. Odermatt, J. Willner, Fast Pyrolysis of African and European
Lignocellulosic Biomasses Using Py-GC/MS and Fluidized Bed Reactor, Energy Fuels
24 (2010) 2078–2085.
42. T. Sfetsas, C. Michailof, A. Lappas, Q. Li, B. Kneale, Qualitative and quantitative
analysis of pyrolysis oil by gas chromatography with flame ionization detection and
comprehensive two-dimensional gas chromatography with time-of-flight mass
spectrometry, Journal of Chromatography A, 1218 (2011) 3317–3325.
43. B. Scholze, C. Hanser, D. Meier, Characterization of the water-insoluble fraction from
pyrolysis oil. Part II, Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 58-59 (2001) 387-
400.
44. R. Bayerbach, D. Meier, Characterization of the water-insoluble fraction fron pyrolysis
oil. Part III, Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 77 (2006) 95-101.

Capítulo 2
CAPÍTULO 2
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
El uso de biomasa forestal como materia prima para la obtención de productos químicos de alta
demanda industrial requiere desarrollar e implementar metodologías analíticas para la
caracterización y cuantificación de los compuestos de interés.
Desde un punto de vista industrial es un desafío el que se pueda contar con procesos de pirólisis
eficaces que se enfoquen en la producción de los principales compuestos del bio-oil (ácidos
orgánicos, aldehídos, azúcares etc.) en la extracción de estos compuestos desde la matriz
(purificación) y además en la utilización del bio-oil como un posible combustible.
En virtud de los antecedentes reportados se propone el desarrollo y optimización de metodologías

analíticas para la caracterización y cuantificación de los compuestos de interés del bio-oil como
ácidos orgánicos, aldehídos, azúcares y la posible automatización de las metodologías a emplear.
La estrategia analítica a desarrollar debe ser lo suficientemente selectiva y sensible para cuantificar
al menos todos los componentes más relevantes del bio-oil, pero no ser demasiado compleja,
evitando una preparación de muestra muy tediosa, asegurando así un razonable balance entre el
esfuerzo analítico a realizar y el grado de detalle de la información requerida para la optimización
de los procesos de pirólisis y del fraccionamiento del bio-oil.
Se propone además una priorización en el desarrollo de metodologías analíticas que presenten una
innovación en el ámbito analítico para la determinación de los compuestos de mayor interés en la
matriz de bio-oil.
De acuerdo con esta propuesta, las hipótesis y objetivos de la presente tesis son:
2.1 Hipótesis General
En base a los antecedentes bibliográficos, considerando la complejidad de la matriz de bio-oil y
debido a la presencia de gran cantidad de interferentes, es posible la caracterización cualitativa y
cuantitativa de compuestos de interés de bajo peso molecular, mediante el desarrollo y aplicación de
métodos analíticos avanzados que incluyan técnicas de extracción u otro tratamiento de muestra
acopladas con técnicas cromatográficas (HPLC, GC y HPTLC), permitiendo la resolución de
posibles interferencias y análisis de distintos grupos de compuestos por separado.
Desde un punto de vista industrial, es posible dirigir la producción de bio-oil como materia prima
para la obtención de productos químicos de alta demanda.

Capítulo 2
2.1.2 Hipótesis derivadas

La aplicación de metodologías analíticas basadas en la cromatografía gaseosa acoplada a un
detector de masas (GC/MS), cromatografía liquida acoplada a un detector UV (HPLC-UV), y
cromatografía en capa fina de alta eficiencia (HPTLC), permitirán la determinación de familias de
compuestos.
La posible automatización de algunas de las metodologías desarrolladas, considerando que la

determinación de los compuestos en bio-oil debe ser viable como análisis de rutina.
2.2 Objetivos Generales
En virtud de los antecedentes anteriormente presentados se plantea como objetivo general de esta
tesis desarrollar metodologías analíticas para la determinación de ácidos orgánicos de cadena corta,
compuestos volátiles, azúcares y aldehídos en matriz de bio-oil.
2.2.1 Objetivos específicos

El análisis de bio-oil requiere de varias etapas de tratamiento de muestra, cuya selección dependerá
de la naturaleza de las muestras y de la técnica instrumental seleccionada. En este estudio los
métodos cromatográficos han sido seleccionados para la separación de los analitos. De esta manera,
los objetivos específicos planteados para este proyecto son:
a) Determinación de compuestos volátiles en bio-oil por GC/MS.

Se evaluarán dos técnicas analíticas de tal forma de utilizar la matriz de bio-oil sin
tratamiento previo. Las técnicas a evaluar son: Extracción en espacio de cabeza o
“headspace” (HS) y microextracción en fase sólida en modo espacio de cabeza (HS-
SPME), para este último considerando diferentes tipos de recubrimientos de la fibra.
b) Determinación de ácidos orgánicos por HPLC con detección UV. La aplicación de ésta
técnica de análisis requiere una etapa previa de tratamiento de muestra. Para tal efecto se
estudiará la extracción de los analitos mediante una extracción liquido-liquido, seguido de
una extracción en fase sólida, basados en el intercambio aniónico, utilizando rellenos
compuestos por amina cuaternaria. La separación por HPLC se basará en la metodología
para la determinación de ácidos orgánicos en matriz de vino.
c) Determinación de azúcares, la cual contempla la implementación y validación de la técnica

HPTLC para la determinación de los principales azúcares presentes en el bio-oil, y
desarrollar un método de confirmación por GC-MS para los azúcares, principalmente
levoglucosano y celobiosano, previa derivatización.
d) Determinación de aldehídos y cetonas. Evaluación de la determinación de aldehídos y

cetonas, como hidroxiacetaldehído, glioxal, hidroxiacetona, entre otros, por HPLC con
detección en el visible, previa derivatización con 2,4-dinitrofenilhidrazina.

Capítulo 3
CAPÍTULO 3
ESTRATEGIA ANALÍTICA Y MATERIAL DE ESTUDIO
Uno de los objetivos generales de esta tesis es el desarrollo de metodologías analíticas para la
caracterización de compuestos de interés en bio-oil, con el objeto de utilizarlo como una fuente de
obtención de grupos de compuestos químicos de interés, como ácidos orgánicos, azúcares y
aldehídos. Como estrategia analítica se plantea el uso de diversas técnicas de separación
cromatográficas, como GC/MS, HPLC-UV y HPTLC.
Uno de los principales énfasis está en el desarrollo de sistemas de tratamientos de muestras de bio-
oil y sus diferentes fracciones, estas pueden incluir extracción líquido-líquido, extracción en fase
sólida, microextracción en fase sólida, derivatización en medio acuoso y derivatización por medio
de modificación de fibras de SPME. La aplicación de estos sistemas de tratamientos, fue
desarrollada en consideración del tipo de muestra (bio-oil crudo, fracciones acuosas y orgánicas de
bio-oil, lignina pirolítica) la técnica analítica y el grupo de compuestos de interés.
La optimización de estos métodos analíticos se realizó mediante optimización multivariada para

tener en cuenta las diferentes interacciones entre las variables.
3.1 Obtención del bio-oil
Las muestras de bio-oil analizadas en este trabajo son obtenidas de dos fuentes, la primera
corresponde a un reactor a escala de laboratorio del Departamento de Ingeniería Metalúrgica,
Universidad de Concepción, y las otras muestras son obtenidas de la planta piloto productora de
bio-oil de la Unidad de Desarrollo Tecnológico. En la Figura 3.1 se muestra un esquema de este
último reactor de pirólisis a escala piloto.
Figura 3.1 Esquema de la planta piloto para la producción de bio-oil. (Gentileza UDT)

Capítulo 3
3.2 Procesos de fraccionamiento del bio-oil para la obtención de grupos de compuesto de

interés a nivel industrial
Como ya se ha indicado, el interés de esta investigación no sólo está enfocado en la caracterización

de bio-oil crudo, sino que también en poder caracterizar diferentes fracciones de éste, lo que se
llevara a cabo para la obtención de productos de interés a nivel industrial. Esto plantea el desafío de
desarrollar métodos analíticos versátiles que puedan ser empleados en la caracterización del bio-oil
crudo, junto con las fracciones acuosas, orgánicas, lignina pirolítica entre otras. Para esto el
conocimiento de la posible composición de estas fracciones es de gran importancia para lograr
elegir el tratamiento de muestra adecuado y la técnica instrumental a utilizar. En este apartado se
describen las diferentes muestras que se caracterizaran, cuyo fraccionamiento se llevó a cabo en la
UDT.
La finalidad del proceso de separación o fraccionamiento del bio-oil, es de acuerdo a la aplicación

que se le quiera dar. En el caso de la refinación de bio-oil, el producto combustible es claramente
un “commodity”, mientras que los productos químicos (componentes de resina y aditivo de
ensilaje) se ubican más cerca del espectro de productos de química fina o especialidades
(“specialities”). El “commodity” combustible siempre va a tener un mercado, mientras que las
especialidades pueden o no ser vendibles, dependiendo de las alternativas que hay en el mercado
y la relación precio/beneficio del producto. Por lo tanto, las estrategias del fraccionamiento están
enfocadas en 3 principales objetivos.
Obtención de productos químicos: para este objetivo el bio-oil debe ser sometido a un
fraccionamiento completo, en el cual se prioriza la mayor recuperación de los productos y la
pureza que se requiere. Los residuos obtenidos pueden ser quemados para su uso como
combustible. La desventaja de utilizar este proceso es que los compuestos químicos no se
encuentran en un alto porcentaje y la alta complejidad del bio-oil demanda fraccionamientos
altamente selectivos, haciendo de este punto una solución poco viable. Además, un
fraccionamiento completo del bio-oil producirá un gran número de sub-fracciones que no pueden
ser utilizadas como combustibles.
Obtención de combustible: el objetivo es centrar las separaciones hacia la obtención de un

combustible con mejores propiedades que el bio-oil crudo. Los residuos obtenidos pueden ser
utilizados para la obtención de subproductos. De igual forma que en el ítem 2, para la obtención
exclusiva de combustible desde el bio-oil se deben realizar extracciones selectivas para la
eliminación de los interferentes o compuestos indeseados.
Obtención de combustible y productos químicos: En este caso la prioridad de la separación es

obtener tanto productos químicos como combustibles. Este procedimiento muestra mayores
ventajas, al incluir el combustible como un producto del fraccionamiento, considerando que la
producción exclusiva de productos químicos es poco factible por su baja concentración.
En esta investigación el fraccionamiento del bio-oil es llevado a cabo con el objetivo de obtener,
tanto productos químicos como combustible.

Capítulo 3
Es importante considerar que la formación de bio-oil se realiza lejos del equilibrio

termodinámico, y por consiguiente, el bio-oil fresco es una mezcla de componentes reactivos que
experimentan reacciones químicas que tienden a aumentar su peso molecular medio, disminuir la
polaridad de algunos constituyentes, y aumentar el contenido de agua1. En consecuencia, la
solubilidad mutua de los componentes cambia, y el bio-oil es propenso a separarse en dos o más
fases, una fase acuosa y otra orgánica resinosa.
La separación fue evaluada para grupos de compuestos, de esta forma a continuación se detalla el
procedimiento seguido en cada caso.
3.2.1 Extracción de compuestos volátiles del bio-oil
La extracción de compuestos volátiles permite una mejor estabilidad del bio-oil, junto con mejorar
su olor2. Los principales compuestos volátiles son cetonas, aldehídos y ácidos orgánicos de bajo
peso molecular. El fraccionamiento completo de bio-oil por destilación no es posible, ya que el 50
% en peso del bio-oil está constituido por compuesto de alto punto de ebullición, muchos de ellos se
descomponen con la temperatura, o aumentan su reactividad. No obstante, utilizando sistemas de
vacío o la utilización de solventes, es posible crear una mezcla azeotrópica. Teniendo presente lo
expuesto, para la separación se proponen tres procesos de destilación:
1) Destilación a vacío de bio-oil
Diferentes fracciones fueron obtenidas, variando la temperatura del baño y la presión. 1 ra

fracción: 60 minutos, 55 mbar; 2da fracción: 50 minutos, 70-50 mbar; 3ra fracción: 38 minutos,
50 mbar; 4ta fracción 60 minutos, 50 mbar.
2) Destilación atmosférica de bio-oil con glicerol
El glicerol es un solvente de alto punto de ebullición, que permite la destilación de bio-oil

(temperaturas de 95-105 °C) a presión atmosférica, evitando la coquificación del residuo. Para
separar el glicerol, es necesario añadir agua para precipitar la lignina pirolítica. El agua es
removida por evaporación, para recuperar el glicerol.
3) Destilación atmosférica de bio-oil con n-pentanol y n-butanol
Es posible realizar una destilación azeotrópica de bio-oil con n-butanol y n-pentanol. Éstos
forman destilados que se separan en dos fases, una fase solvente y otra fase acuosa, por lo que es
fácil devolver todo o una parte de una u otra fase como reflujo a la columna de destilación.
3.2.2 Extracción de ácidos y aldehídos por extracción con solvente

Una alternativa de refinación que extrae los ácidos y aldehídos desde el bio-oil crudo es la
utilización de un solvente poco polar que no disuelve apreciablemente la lignina pirolítica. Entre
los solventes comunes utilizados, el metil ter-butil éter (MTBE). Este es uno de los pocos que
además del agua, no disuelve apreciablemente la lignina pirolítica y que al mismo tiempo es
suficientemente polar para extraer aldehídos y ácidos. Es posible recuperar entre un 70-80 % de los
ácidos, usando una extracción en caliente de bio-oil con MTBE a 45 °C. La principal desventaja es

Capítulo 3
que utilizando temperatura hay una mayor solubilidad de la lignina pirolítica. Esto es posible debido
a que el MTBE en medio ácido y en presencia de temperatura, se puede descomponer en isobutileno
y metanol. Este último logra disolver la lignina. Por lo tanto, es de esperar que este tipo de muestras
presenten un nivel importante de lignina pirolítica.
3.2.3 Extracción con solventes
En esta extracción se prioriza la utilización de solventes que sean inmiscibles con agua, presenten
característica polar y que puedan solubilizar gran parte del bio-oil, junto con la lignina pirolítica.
a) Extracción con metil-isobutil cetona.
Usando una relación 1:5 de bio-oil:solventes hacen posible la extracción de aproximadamente

el 85 % de los ácidos. El extracto contiene también gran parte de la lignina pirolítica. La
presencia de un solvente con grupo carbonilo, interferirá en el método químico para la
determinación de grupos carbonilos.
b) Extracción con n-butanol.
El n-butanol es un solvente que se puede obtener de fuentes renovables y se encuentra en la lista

de solventes ambientalmente favorables3. Presenta una miscibilidad parcial con el agua. La fase
acuosa contiene hasta un 10% en peso de n-butanol y la fase orgánica cerca de un 50% de agua.
Desde el punto de vista de un solvente de extracción, la miscibilidad parcial usualmente es
indeseable, pues dificulta la recuperación del solvente. No obstante, la miscibilidad es muy
sensible a la presencia de sales en la fase acuosa, las que disminuyen significativamente la
solubilidad mutua agua/n-butanol. Para el trabajo con este solvente es necesario agregar agua
para producir la separación de fases. Estas corresponden a fase orgánica y fase acuosa (o
refinado acuoso). La fase orgánica contiene principalmente ácidos carboxílicos, lignina
pirolítica y carbonilos. En el refinado acuoso se puede encontrar algunos ácidos y carbonilos
que no fueron completamente extraídos con n-butanol en una primera extracción y azúcares.
c) Extracción con n-pentanol
El n-pentanol presenta una menor solubilidad en agua que el n-butanol. En la fracción acuosa es
posible encontrar lignina pirolítica, aldehídos volátiles, ácidos orgánicos y azúcares. En la fase
orgánica es posible encontrar gran parte de los aldehídos, también una fracción de ácidos
orgánicos.
d) Extracción con n-butanol y NaHCO3
El uso de NaHCO3 influye en la miscibilidad que presenta el n-butanol con agua. Similar al
punto (b), de esta extracción obtendremos 2 fases. En la fase orgánica se encontrará
principalmente ácidos y algunos aldehídos, en la fase acuosa se espera encontrar azúcares.

Capítulo 3
e) Separación de solventes de la fase orgánica
La separación del solvente por destilación azeotrópica a presión atmosférica, retornando la fase
acuosa del destilado a la columna, es una manera para recuperar el solvente por destilación. La
destilación subsecuente del agua permite recuperar también parte de los ácidos presentes
f) Extracción con acetato de etilo y acetato de butilo
La finalidad de esta extracción es la obtención de la lignina pirolítica, junto con los compuestos
fenólicos en la fase orgánica y los azúcares, ácidos y grupos carbonilos en la fase acuosa.
3.2.4 Separación de la lignina pirolítica del bio-oil

La separación de lignina desde el bio-oil se realiza adicionando agua. Uno de los procedimientos es
agregar agua y dejar decantar la lignina pirolítica. La fase acuosa es comúnmente llamada humo
líquido y contiene principalmente ácidos orgánicos, aldehídos y azúcares. También es posible
encontrar en la fase orgánica, en baja concentración ácidos orgánicos, azúcares y aldehídos.
3.3 Métodos analíticos de tratamientos de muestras

Considerando la diversidad de muestras de bio-oil, es necesario evaluar distintos procesos de
tratamiento de diferentes tipos de muestras. La finalidad de la metodología de preparación de
muestra es disponer del analito en un estado en el cual pueda ser determinado lo más selectivamente
posible, evitando las posibles interferencias que afectan la cuantificación. Además las muestras se
deben encontrar en un disolvente compatible con la técnica de determinación utilizada. Para ello, en
la mayoría de los casos es necesario realizar una primera etapa en la cual se aísla los analitos de la
matriz que los contiene, consiguiendo su purificación y concentración. En muchos casos, es
inevitable una etapa de transformación de los analitos, variando una serie de propiedades de los
mismos para facilitar su determinación. Se ha descrito en los capítulos precedentes la alta
complejidad de las muestras de bio-oil, por lo que es inevitable la evaluación de los posibles
tratamientos de la muestra, junto con la modificación química de los analitos a determinar.
En las siguientes secciones se describen brevemente los posibles procedimientos de tratamiento de

muestras, considerando al bio-oil como una muestra liquida. Además, reseñan las modificaciones
químicas que se pueden emplear.
Tratamiento de muestras
Generalmente las matrices complejas presentan una incompatibilidad con la técnica a utilizar, por lo
cual suele ser necesaria una etapa de preparación de muestra, que nos permite separarlos de otros
compuestos que puedan interferir en su determinación y si es necesario, concentrar los analitos.

Capítulo 3
Entre los métodos de preparación de muestra empleados en esta tesis figuran la extracción
líquido‐líquido (LLE), la extracción en fase sólida (SPE) y la microextracción en fase sólida
(SPME).
Es de importancia considerar que los compuestos de mayor relevancia de analizar en el bio-oil no se

encuentran en bajos niveles de concentración, por lo que en el momento de elegir una técnica se
deberá priorizar su selectividad, sobre su sensibilidad, sin dejar de considerar esta última.
3.3.1 Extracción líquido‐líquido

El principal inconveniente que presentan las fracciones de bio-oil son los solventes en los que se
obtuvieron. Las fracciones necesarias de analizar son tanto las orgánicas como las acuosas. Las
fracciones en MTBE tienen la ventaja de no presentar un alto contenido de lignina pirolítica y que
además contienen en gran medida a los ácidos orgánicos. Si esta fracción se analiza por HPLC,
tiene la limitante de dañar la columna cromatográfica.
Este inconveniente hace necesario evaluar la LLE como posible pre-tratamiento de las fracciones
orgánicas, de tal forma que la muestra no presente una incompatibilidad con el instrumento a
utilizar. Como se expuso en el Capítulo 1, es posible determinar azúcares, ácidos orgánicos y
aldehídos por HPLC, utilizando una columna Aminex HPX-87, con ácido fosfórico diluido como
fase móvil. Esto requiere que las muestras necesariamente sean solubles en la fase móvil, condición
inversa a las fracciones orgánicas obtenidas del bio-oil, en las cuales el objetivo es la inmiscibilidad
en solución acuosa.
Una de las principales desventajas de emplear esta técnica es que las muestras ya provienen de una
extracción. Si se agrega otra LLE puede que los porcentajes de recuperación no sean los adecuados,
afectando la cuantificación. Otra desventaja es que la opción de solventes que pueden ser
compatibles con la técnica instrumental, y que además sea la adecuada para la extracción del analito
por LLE, es limitada, reduciendo en gran medida la aplicabilidad de esta técnica.
La LLE fue evaluada en fracciones orgánicas de bio-oil para la obtención de solución acuosa, en la
determinación de ácidos orgánicos por HPLC-UV.
3.3.2 Extracción en fase sólida

La SPE se desarrolló a mediados de los años 70 como alternativa a la LLE. Hoy en día es una de las
técnicas de preparación de muestra más ampliamente utilizadas en el caso de matrices líquidas e
incluso gaseosas. Mediante SPE se consigue concentrar y/o purificar los analitos mediante su
retención en una fase sólida o una fase líquida inmovilizada sobre un soporte sólido, para a
continuación proceder a su elución con un disolvente adecuado.
Entre las múltiples ventajas que presenta destacan las siguientes:

- baja manipulación de la muestra
- alto poder de concentración
- obtención de extractos purificados con altas recuperaciones

Capítulo 3
- menor consumo de disolventes en comparación con LLE

- ausencia de emulsiones
- posibilidad de automatización
- versatilidad en el tipo de adsorbentes utilizados
La SPE fue evaluada en la determinación de ácidos orgánicos desde bio-oil crudo y fracciones
acuosas de éste.
3.3.3 Microextracción en fase sólida

La técnica de SPME se basa en la extracción de los analitos de la matriz de la muestra mediante una
fibra de sílice fundida de 10 mm, de muy pequeñas dimensiones, recubierta por un sorbente de 80-
100 μm (del orden de 0.5 μL casi siempre polimérico). El tamaño pequeño de la fibra y su
geometría cilíndrica permiten incorporarla a una jeringa. De esta forma, se facilita la manipulación
y se protege la fibra cuando ésta no se utiliza (Figura 3.2). Esta técnica fue desarrollada por
Pawliszyn en 1992 y durante la última década se ha aplicado a múltiples analitos.
Figura 3.2 Dispositivo empleado en la SPME4.
Las principales ventajas de la técnica de SPME son:

- Gran simplicidad
- Utiliza pequeños volúmenes de muestra
- No necesita disolventes orgánicos
- Fácilmente transportable
- Útil para todo tipo de muestras gaseosas, liquidas y sólidas
- Posibilidad de automatización
- Permite la concentración de compuestos volátiles y semi-volátiles
- El límite de detección puede ser muy bajo (del orden de ppt), lo que demuestra la
sensibilidad de esta técnica

Capítulo 3
Sus principales inconvenientes son:

- Limitada capacidad de las fibras debido a que contienen una cantidad muy pequeña
de recubrimiento.
- La presencia de materia suspendida en la muestra puede dañar el recubrimiento de
la fibra durante la agitación. Compuestos de elevado peso molecular pueden
adsorberse irreversiblemente en la fibra cambiando sus propiedades.
- La formación de burbujas de gas en la superficie de la fibra puede afectar a tasa de
transferencia de masa.
- Pueden aparecer problemas de sensibilidad. La sensibilidad de la técnica de SPME
depende de la cantidad de analitos extraídos de la muestra; si el volumen de la
muestra (Vs) es muy elevado, será mucho mayor al producto entre la constante de
distribución (Kfs) y el volumen de recubrimiento (Vf) de la fibra (Kfs×Vf<<Vs) y,
por tanto, aunque se aumente el volumen de muestra no se consigue aumentar la
sensibilidad.
3.3.3.1 Variables que afectan el proceso de SPME

El proceso de SPME se puede ver afectado por una serie de variables experimentales que influyen
sobre el equilibrio de analito extraído o bien sobre su desorción. Estas variables pueden ser
modificadas para incrementar la eficacia del proceso de extracción, pero cualquier modificación de
las variables o condiciones experimentales repercute en la cantidad de analito que se determina y en
la repetitividad del análisis.
Los parámetros que pueden afectar el proceso de extracción por SPME son los siguientes:
a) Tiempo de extracción5: Es necesario determinar el tiempo necesario para llegar al estado de

equilibrio, e intentar trabajar en estas condiciones. Es decir, tiempo a partir del cual la
cantidad de analito que se extrae se mantiene constante y es característico de cada pareja
analito-fibra. Para algunos compuestos el tiempo necesario para llegar al punto de
equilibrio es muy elevado, mientras que para otros es corto. Generalmente, en estos casos
se fija un tiempo de extracción de compromiso. Se suele optar por seleccionar tiempos de
extracción inferiores para no alargar el tiempo de análisis, con lo cual para algunos analitos
se trabajará en condiciones de no equilibrio. En estos casos, es muy importante controlar
estrictamente el tiempo de extracción en aras a la repetitividad de los análisis, ya que
pequeñas variaciones pueden variar considerablemente la cantidad de analito extraída.
b) Temperatura de extracción5: Este parámetro contribuye de dos formas opuestas en el

proceso de SPME. En el modo de espacio de cabeza, al aumentar la temperatura aumenta la
concentración de los analitos en el espacio de cabeza, por lo que la extracción es más
rápida, ya que se necesita menos tiempo para alcanzar el equilibrio. Pero, por otra parte,
reduce la eficacia de la extracción, ya que un aumento de la temperatura disminuye los
coeficientes de partición del analito entre el espacio de cabeza y la fibra y, por tanto,
disminuye la cantidad de analito extraída por la fibra en el equilibrio.

Capítulo 3
c) Presencia de sales en la muestra5: Generalmente la presencia de electrólitos en un sistema

de adsorción disminuye la solubilidad de los compuestos hidrofóbicos en la fase acuosa.
Este efecto se llama “salting out” y se utiliza para incrementar la sensibilidad de un método
analítico. Pero si los analitos se encuentran en forma no ionizada, se observa una
disminución de la eficacia de la extracción debido probablemente, a un aumento del
coeficiente de actividad de las especies iónicas al aumentar la fuerza iónica de la solución.
La adición de sal no es siempre conveniente para moléculas de elevado peso molecular, ya
que provoca que los analitos se adhieran al vidrio del contenedor de la muestra o vial. Para
la extracción de analitos volátiles y semivolátiles por HS-SPME se usa habitualmente NaCl
y, a veces, Na2SO4.
d) pH de la muestra5: Este factor está relacionado con el apartado anterior, ya que los analitos
deberán estar mayoritariamente presentes en su forma neutra para favorecer su extracción.
e) Volumen de la muestra5: El volumen debe seleccionarse en función de los coeficientes de

distribución de los analitos, Kfs. n = K fs Vf Co en esta ecuación se puede observar que la
cantidad de analito extraída (n) es directamente proporcional a la concentración de analito
en la muestra e independiente del volumen de la muestra, lo cual significa que, previo al
análisis, no es necesario estudiar el volumen de muestra más adecuado a elegir, ya que la
fibra puede ser directamente expuesta al aire.
f) Agitación de la muestra5: En SPME hay que tener en cuenta la cinética del proceso. Los
analitos deben ser transportados desde la matriz de la muestra a la fibra en inmersión o, si la
extracción se realiza mediante HS/SPME, desde la matriz de la muestra al espacio de
cabeza y, de allí, a la fibra. La efectividad de la agitación determinará el tiempo de
equilibrio en muestras acuosas.
g) Tipo de fase5: La eficacia de la extracción depende de la constante de distribución (Kfs) que

es característica de cada pareja analito-fibra y determina principalmente las propiedades del
recubrimiento de la fibra y la afinidad del analito respecto a otros componentes de la matriz.
En la tabla 3.1, se muestra un resumen de las propiedades de diferentes fibras.
h) Desorción5: La constante de distribución (Kfs) disminuye al aumentar la temperatura. Por lo

tanto la desorción térmica de los analitos usando un cromatógrafo de gases, dependerá de la
volatilidad, temperatura del inyector, tiempo de desorción, ubicación de la fibra en el
inyector y el espesor de la fibra.

Capítulo 3
Tabla 3.1 Principales propiedades de las fibras de SPME5.
T° máxima Proceso de Uso

Fase Estacionaria Polaridad
de uso extracción recomendado
PDMS
280 °C Absorción Apolar GC/HPLC
(polidimetilsiloxano)
PDMS/DVB Polaridad
270 °C Adsorción GC/HPLC
(PDMS/divinilbenceno) media
PA
320 °C Absorción Polar GC/HPLC
(poliacrilato)
CAR/PDMS Polaridad
320 °C Adsorción GC
(carboxen/PDMS) media
CW/DVB
265 °C Adsorción Polar GC
(carbowax/DVB)
CW/TPR
- Adsorción Polar HPLC
(CW/resina templada)
DVB/CAR/PDMS Polaridad
270 °C Adsorción GC
media
A diferencia de la LLE y la SPE, esta técnica no requiere del uso de solventes para la extracción,
limpieza o elución de los compuestos. Además es posible emplear sumergiendo la fibra en la
solución de la muestra o realizarla en modo espacio cabeza.
La modalidad de inmersión de la fibra en muestras de bio-oil, puede causar la sobresaturación tanto

por parte de los compuestos de interés como de la matriz, causando el deterioro inmediato de la
fibra utilizada.
La modalidad espacio de cabeza, proporciona una mayor versatilidad en el momento de la

extracción. Como se muestra en la Tabla 3.1, la diversidad de fibras es útil cuando se requiere
analizar muestras de alta complejidad como el bio-oil. La desventaja es que esta modalidad es útil
sólo para compuestos volátiles o semivolátiles, reduciendo el espectro de compuesto a determinar.
No obstante esta desventaja es útil al buscar una selectividad en el análisis.
En el caso de compuestos que presenten una incompatibilidad con la técnica instrumental o

presenten baja volatilidad, es posible recurrir a la modificación del analito (derivatización). Este
método puede tener principalmente el inconveniente de que la reacción de derivatización no se
produzca de manera óptima, evitando la determinación fiable de los compuestos, por la complejidad
de la matriz (posibles interferentes en la reacción) y el solvente en que se encuentra cuando
corresponden a diferentes fracciones.
Esta técnica se utilizará en la determinación de aldehídos por GC/MS, mediante la modificación

química del recubrimiento de la fibra.

Capítulo 3
3.4 Métodos de derivatización

Las dificultades más habituales en el desarrollo de una metodología analítica son la complejidad de
la matriz, analitos diluidos que dificultan su detección y la incompatibilidad de la muestra y/o los
analitos de interés con el sistema instrumental.
La derivatización es una reacción química del analito (alta constante de equilibrio, e irreversible),
que permite la modificación de éste en una especie que presenta compatibilidad con el sistema
instrumental. Además, la derivatización puede eliminar las interferencias de la muestra, ya que el
reactivo derivatizante reaccionará selectivamente con ciertos grupos químicos. Dependiendo del
sistema a utilizar, hay una variedad de reactivos derivatizantes. Las principales reacciones de
derivatización son las siguientes:
a) Alquilación: Tiene como finalidad la reducción de la polaridad de los compuestos mediante

sustitución de hidrógenos lábiles por un alifático o alifático aromático. Entre las ventajas
que presentan las reacciones de alquilación está el alto número de reactivos disponibles, las
condiciones de reacción son muy amplias, variando entre medios muy ácidos a medios muy
básicos. Algunas de las reacciones de alquilación pueden realizarse en medios acuosos.
Además los derivados obtenidos son generalmente muy estables6.
b) Sililación: Es la reacción de derivatización más usada por su sencillez y la rapidez de la

reacción. Esta reacción tiene como finalidad la sustitución de un hidrógeno activo por un
grupo de silicio trisustituido. Estos compuestos generan mayor volatilidad, menor polaridad
de la molécula y estabilidad térmica6.
c) Acilación: Tiene similares ventajas a la sililación. Las reacciones de acilación reducen la

polaridad de los grupos amino, hidroxilo, tioles y adiciona funcionalidades halogenadas. La
acilación transforma los compuestos con hidrógenos ácidos en ésteres, tioésteres y amidas 6.
El empleo de algunos de estos reactivos en compuestos del bio-oil, puede ser de utilidad, en
especial en cromatografía de gases, para favorecer su volatilidad y estabilidad térmica.
La derivatización en esta tesis se evaluó en la determinación de aldehídos por HPLC-UV, ácidos

orgánicos y azúcares por GC/MS y aldehídos de bajo peso molecular por GC/MS, en muestras de
bio-oil.
3.5 Métodos quimiométricos

Para el desarrollo de las metodologías propuestas, se utilizaron herramientas quimiométricas, en
especial el diseño experimental. El objetivo de utilizar esta herramienta fue, determinar cuáles son
las variables que tienen un efecto significativo sobre la respuesta, determinar el mejor valor de las
variables controlables que influyen en la respuesta, de manera que ésta, sea casi siempre cercano al
valor nominal deseado, determinar la mejor combinación de las variables controlables que ayuden a
reducir la variabilidad de la respuesta y establecer la combinación óptima de las variables
controlables, con el objetivo de minimizar los efectos de las variables incontrolables 7.

Capítulo 3
Para ello se emplearon diversos diseños, dependiendo de la cantidad de variables utilizadas, y las
condiciones técnicas que permitieron realizar los experimentos.
El screening, diseño experimental y la optimización del diseño, se realizaron con el programa

estadístico MODDE 7.0, facilitado por el Dr. David Contreras de la Facultad de Química de la
Universidad de Concepción.
3.6 Propuesta de la estrategia analítica

Para la determinación de los diferentes compuestos en el bio-oil, se consideró como metodología
general de base, la determinación de compuestos por GC/MS en la modalidad de inyección directa.
Considerando que por esta metodología no es posible la determinación de algunos compuestos que
presenta alto interés industrial, se desarrolló un esquema (ver Figura 3.3), en el cual se considera el
tipo de muestra, sea fracción acuosa u orgánica, destilados de bio-oil o bio-oil crudo, el tipo de
grupo químico a determinar, y las posibles técnica instrumentales propuestas, junto con los
tratamientos previos de la muestra.
Figura 3.3 Esquema propuesto en este trabajo de tesis para la determinación de grupos químicos en
las diferentes muestras de bio-oil.
TIPO DE MUESTRAS DE BIO-OIL
Bio-oil crudo
Destilación de Fase orgánica Fase acuosa
bio-oil
CARACTERIZACIÓN GC/MS iny.dir. GC/MS iny.dir. GC/MS iny.dir. GC/MS iny.dir.

GENERAL
ÁCIDOS HPLC-UV iny.dir. HPLC-UV trat. LLE HPLC-UV trat. SPE HPLC-UV trat.SPE
ORGÁNICOS GC/MS der. BSTFA GC/MS der. BSTFA GC/MS der. BSTFA GC/MS der. BSTFA
HPLC-UV der. DNPH HPLC-UV der. DNPH

ALDEHÍDOS OFD-HS-SPME-GC/MS OFD-HS-SPME-GC/MS OFD-HS-SPME-GC/MS OFD-HS-SPME-GC/MS
D-HS-GC/MS D-HS-GC/MS D-HS-GC/MS D-HS-GC/MS
AZÚCARES HPTLC HPTLC HPTLC HPTLC

GC/MS der. BSTFA GC/MS der. BSTFA GC/MS der. BSTFA GC/MS der. BSTFA
Iny. Dir Inyección directa, Der: derivatización, Trat: tratamiento de muestra, LLE: extracción
líquido líquido, SPE: extracción en fase sólida, HS: modalidad espacio de cabeza, SPME:
microextracción en fase sólida, OFD: derivatización on-fiber.
De acuerdo a este esquema se evaluaron las diferentes metodologías analíticas propuestas. En los
capítulos posteriores se desarrollan con más detalle, y se evalúan las ventajas y desventajas de cada
metodología, al ser empleada en esta matriz.

Capítulo 3
3.7 Bibliografía
1. J. Diebold, A review of the chemical and physical mechanisms of the storage stability of
fast pyrolysis bio-oils, ttp://home.rmi.net/~dieboljc, Thermalchemie Inc. (1999).
2. A. Oasmaa, K. Sipila, Y. Solantausta, E. Kuoppala, Quality improvement of pyrolysis
liquid: Effect of light volatiles on the stability of pyrolysis liquids, Energy Fuels 19 (2005)
2556-2561.
3. D. Li, Z. Yan, Y. Fu, Q.X. Guo, Green Solvent for Flash Pyrolysis Oil Separation, Energy
& Fuels 23 (2009) 3337-3338.
4. J. Pawliszyn, Applications of solid phase microextraction, The Royal Society of Chemistry,
Cambridge, UK, (1999).
5. J. Pawliszyn, Handbook of Solid Phase Microextraction, Chemical Industry Press, China,
(2009).
6. K. Blau, J.M. Halket, Handbook of derivatives of chromatography, Second Edition, John
Wiley & Sons, London UK, (1993) 51-74.
7. R. Brereton, Applied Chemometrics for Scientists, John Wiley & Sons, Chichester, UK,
(2007).

Capítulo 4
CAPÍTULO 4
CARACTERIZACIÓN DE BIO-OIL POR INYECCIÓN DIRECTA EN GC/MS
En este capítulo se aborda lo que hoy en día es la metodología estándar para el análisis y
caracterización de bio-oil, con ciertas modificaciones orientadas a los objetivos específicos de esta
tesis.
4.1 Resumen
La metodología que actualmente es usada para la caracterización y cuantificación de compuestos
volátiles en el bio-oil es GC/MS/FID. En el presente trabajo se evalúan diferentes fracciones de bio-
oil usando dicha método, desarrollada en el Institute for Wood Technology and Wood Biology
(Hamburgo-Alemania). Junto con ello se implementa, tanto para análisis cualitativo como
cuantitativo, un método usando un sistema GC/MS desarrollado en el Departamento de Análisis
Instrumental (Facultad de Farmacia - Universidad de Concepción). Con este último, se logró
cuantificar los principales compuestos de interés, tanto en bio-oil crudo como en las respectivas
fracciones acuosas y orgánicas, poniendo énfasis en la determinación de hidroxiacetaldehído
(glicolaldehído), ácido acético, acetol y levoglucosano.
4.2 Introducción
La determinación de compuestos por GC/MS/FID es actualmente la mejor opción en la
caracterización general del bio-oil, permitiendo la determinación de grupos químicos como ácidos
orgánicos, alcoholes, aldehídos y cetonas no aromáticas, furanos, piranos, azúcares, benceno,
catecoles, aldehídos y cetonas aromáticas, derivados de lignina pirolítica y guaiacoles entre otros 1-4.
Esta metodología se basa en la disolución del bio-oil en acetona y su posterior inyección directa en
un sistema GC/MS/FID utilizando fluoranteno como patrón interno. Es posible identificar los
compuestos con el detector selectivo de masas para luego cuantificarlos usando el detector de
ionización de llama. Con esta metodología es posible cuantificar alrededor de 100 compuestos
presentes en el bio-oil, utilizando normalización interna con factores de respuesta relativo como
método de cuantificación. La principal desventaja es que esta cuantificación es posible de utilizar
principalmente en detectores como el FID, por presentar una mayor estabilidad. Sin embargo en un
detector selectivo de masas la variabilidad de los factores de respuestas es alta, por lo que se
necesita el uso de curvas de calibración con patrón interno.
Uno de los objetivos de este trabajo es la implementación de un método basado en el descrito, pero
utilizando un sistema GC/MS, sin acoplar un segundo detector como el FID. Esto implica que tanto
la identificación como la cuantificación deben ser realizadas usando el detector de masas, mientras
que en el sistema convencional, usando el detector FID se realiza la cuantificación. Para ello fue
necesario construir curvas de calibrado para cada compuesto en estudio, usando fluoranteno como
patrón interno. Considerando la gran diversidda de compuestos que se pueden identificar y
cuantificar por esta metodología, en este trabajo se priorizaron aquellos que representaban un mayor
interés para los objetivos de esta tesis, siendo acetol, hidroxiacetaldehído (HAA), ácido acético,
ácido propiónico, 2-furaldehído, 2(5H)-furanona, guaiacol, vainillina y levoglucosano los
compuestos considerados, ya que representan principal interés hacia la obtención de productos
químicos desde el bio-oil.

Capítulo 4
El objetivo de esta parte del trabajo fue la transferencia tecnológica de una metodología de análisis
general de bio-oil y sus fracciones, con ciertas modificaciones, para lograr su caracterización
rápida.
4.3 Materiales y métodos
4.3.1 Reactivos
Ácido propiónico > 99,5 %, 2-furaldehído 99 %, 2(5H)-furanona 98 %, guaiacol, acetol 90 %,
fluoranteno 99 % y glicolaldehído dímero cristalino fueron adquiridos en Sigma-Aldrich (St. Louis
MO, USA). Ácido acético glacial 100% anhidro p.a, Acetona (SupraSolv), vainillina cristalino p.a,
y levoglucosano fueron adquiridos en Merck (Darmstadt, Germany).
4.3.2 Instrumentación
Sistema GC/MS/FID
El sistema GC/MS/FID estaba compuesto por un cromatógrafo de gases HP 6890 Series Hewlett-
Packard con inyector split/spltless. Acoplado en forma paralela se contaba con un FID y un detector
MS HP 5972. Las muestras se inyectaban con un autosampler multifuncional CTC Analytics,
Combi PAL y el sistema estaba controlado por el programa ChemStation G1701DA y el programa
Cycle composer 1.4.0 para el autosampler. La identificación de los componentes se realizó con el
programa Mass Finder 4 comparando el índice Kovat’s y los espectros de masas con los de la
librería NIST y la librería desarrollada en el Institute for Wood Technology and Wood Biology.
Sistema GC/MS
El sistema GC/MS estaba compuesto por un cromatógrafo de gases HP 6890 Series Hewlett-
Packard (Palo Alto, CA, USA) equipado con un inyector split/splitless, detector de selectivo de
masas HP 5973 y autosampler Combi PAL CTC-G6500 (CTC Analytics AG, Zwingen, Suiza). El
sistema es controlado por MSD ChemStation G1701AA, versión D.03.00.611 y el programa Cycle
Composer versión 1.6.0 para el autosampler.
4.3.3 Condiciones cromatográficas

Sistema GC/MS/FID
Según lo descrito previamente por A. Azeez et al4. Se utilizó una columna Varian DB-1701 de 60
m x 0.25mm x 0.25 μm. El programa de temperatura fue de 45 °C por 4 minutos, hasta 280 °C
(razón de 3 °C min-1) manteniéndose constante a 280 °C por 20 minutos. Se utilizó como gas de
arrastre helio con un flujo constante de 2.0 mL min-1. La temperatura del FID fue de 280 °C. Los
parámetros de la detección por MS fueron: modo SCAN, solvente delay de 5 minutos; energía de
ionización de 70 eV y el volumen de inyección fue 1.0 uL

Capítulo 4
Sistema GC/MS
Se utilizó una columna Varian VF-1701 de 60 m x 0.25mm x 0.25 μm. El programa de temperatura
fue de 45 °C por 4 minutos, hasta 60 °C (razón de 1 °C min-1) seguido por una rampa de 3 °C min-1
hasta 280 °C, manteniéndose por 20 minutos. Se utilizó como gas de arrastre helio a un flujo
constante de 2.0 mL min-1. Los parámetros de detección por MS fueron: modo SCAN, solvente
delay de 3 minutos, con m/z entre 15-220 y desde 5.5-6.0 minutos m/z entre 30-31. La energía de
ionización fue de 70 eV y el volumen de inyección de 1.0 uL.
4.3.4 Preparación de muestras de bio-oil crudo y fracciones
Para ambos sistemas cromatográficos las muestras de bio-oil crudo, fracciones orgánicas y acuosas
fueron masadas (20-60 mg) y llevadas a 1 mL con una solución de estándar interno fluoranteno
(200 mg L-1) en acetona.
4.3.5 Identificación y cuantificación
En el sistema GC/MS/FID la identificación fue realizada con el detector de masas, comparando los
espectros de masas y el índice Kovat’s de cada compuesto. La cuantificación se realizó utilizando la
información del detector FID, empleando factor de respuesta relativo con estándar interno de
fluoranteno.
En el sistema GC/MS, tanto la identificación y la cuantificación se realizó con los datos

proporcionados con el detector de masas. Sin embargo la cuantificación se realizó por curva de
calibrado con estándar interno de fluoranteno entre concentraciones de 0.01 y 1.6 mg mL-1 para
cada uno de los compuestos estudiados.
4.3.6 Muestras y fracciones
El objetivo general de los fraccionamientos fue la evaluación de diferentes solvente, hacia la
extracción de ácidos orgánicos, azúcares, aldehídos. Como también la separación de la lignina
pirolítica del bio-oil en los procesos de extracción. El objetivo final de los fraccionamientos es la
búsqueda de condiciones que permitan la separación de compuestos de interés para luego a escala
piloto y convertir al bio-oil en una fuente de este tipo de compuestos. En ambos sistemas, se
analizaron diferentes fraccionamientos que se detallan a continuación
4.3.6.1 Sistema GC/MS/FID
Se realizaron análisis a muestras de bio-oil crudo “J” y diferentes fracciones empleando como
solventes: agua, n-butanol y n-pentanol. En la Figura 4.1 se muestra un esquema del
fraccionamiento del bio-oil J.

Capítulo 4
Figura 4.1 Esquema de fraccionamiento de bio-oil J. (Fraccionamiento realizado en UDT)
F. acuosa F. orgánica
M1 Bio-oil J M5
n-butanol + agua n-butanol + NaHCO3
F. orgánica F. acuosa
agua n-pentanol + agua
M4
Lignina
F. acuosa F. orgánica F. acuosa
pirolítica
M2 M3
Las fracciones analizadas fueron M1, M2, M3, M4 y M5, el detalle de cada muestra se explica a
continuación:
M1: 117.4 g de bio-oil J con 0.86 g de n-butanol se dispersaron en 99.528 g de agua. Separación
por decantación, muestra de fase acuosa.
M2: Se dispersan 117.11 g de bio-oil en 49.73 g de agua. La fase acuosa resultante se utiliza para
dispersar otros 116.27 g de bio-oil. Muestra de fase acuosa resultante. Se esperan altas
concentraciones de los compuestos del bio-oil soluble en agua, pero también puede tener más
lignina pirolítica solubilizada.
M3: Extracción de 119.13 g de bio-oil J con 40.5415 g de n-pentanol y 49.8848 g de agua. La fase
orgánica resultante se lava con 49,9 g de agua. Muestra de la fase orgánica lavada. Se espera que
contenga pocos compuestos volátiles, pocos azúcares, ácidos y toda la “lignina”.
M4: 116.7 g de bio-oil se mezclan con 40.1406 g de n-butanol y se extraen con 50.773 g de
solución de NaHCO3 al 5%. La fase acuosa salina se extrae (lava) sólo una vez con 40.5319g de n-
butanol. Muestra de la fase acuosa salina. Se espera que tenga glicolaldehído, acetol, butanol y
levoglucosano y muy pocos otros compuestos.
M5: Muestra de fase butanol correspondiente al lavado de la fase acuosa salina (ver muestra M4).
Se espera que tenga poco glicolaldehído, acetol, butanol y levoglucosano.
4.3.6.2 Sistema GC/MS

Se analizaron muestras de bio-oil crudo “L” y las fracciones con solventes como agua, acetato de
butilo y metil isobutil cetona. La cuantificación fue realizada por calibración interna y con
fluoranteno4 como estándar interno. En la figura 4.2 se muestra el esquema de fraccionamiento
utilizado.

Capítulo 4
Figura 4.2 Esquema de fraccionamiento de bio-oil L. (Fraccionamiento realizado en UDT)
Bio-oil L
Agua L1
Agua
L2 L3
Lignina Lignina
F. acuosa F. acuosa
pirolítica pirolítica
Acetato de butilo Metil isobutil cetona

3 extracciones 3 extracciones
L2.0 L3.1 L3.0

F. Orgánica F. Orgánica F. acuosa
L2.1 F. acuosa
(1) extracción (1) extracción
F. Orgánica L3.2 F. Orgánica

L2.2 (2) extracción (2) extracción
F. Orgánica F. Orgánica
L2.3 L3.3 (3) extracción
(3) extracción
4.4 Resultados y discusión
4.4.1 Análisis de bio-oil crudo y diferentes fracciones por GC/MS/FID

El uso de esta metodología permite una caracterización rápida del bio-oil, presentando una gran
utilidad en los métodos de fraccionamiento para la obtención de productos químicos. Con este
objetivo se evaluaron muestras de bio-oil crudo y diferentes fracciones de éste en los sistemas de
GC/MS/FID y GC/MS. A continuación se discuten los resultados obtenidos en cada caso.
En la Figura 4.3 se presenta el cromatograma por detección en FID de un bio-oil (bio-oil J). Como
se evidencia en ella, se identifican 53 compuestos, sin embargo en muchos casos la resolución es
pobre. Se observa bastante tailing por las diferentes velocidades en la transferencia de masas
producidas por la alta heterogeneidad en la polaridad de los compuestos presentes y el hecho que la
fase estacionaria empleada no es apolar, si no que de polaridad intermedia. Además para algunos
compuestos no se observa una adecuada sensibilidad del método, lo cual no permite su correcta
cuantificación. A pesar de estas limitaciones, mediante el método de normalización interna con
factores de respuesta relativa, es posible estimar el % p/p de compuestos o grupos de compuestos de
interés. A este respecto, es necesario precisar que fue posible identificar un 95.3 % de las señales
obtenidas en el cromatograma. Además fue posible la cuantificación del 21.3 % en peso húmedo de
diferentes compuestos en la muestra de bio-oil J y la determinación de los principales compuestos
de interés como el ácido acético, acetol, hidroxiacetaldehído y levoglucosano. Sin embargo, no
todos los compuestos de mayor concentración en el bio-oil se pueden determinar bien por esta
metodología, en especial compuestos polares de bajo peso molecular de los principales grupos
químicos como formaldehído, acetaldehído, ácido fórmico y azúcares como celobiosano, xilosa y
arabinosa.

Capítulo 4
Figura 4.3 Cromatograma de bio-oil J obtenido por la detección por FID. Desde 0 a 25 minutos

47 Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica
cts.
2.0e6
0.5e6
1.0e6
1.5e6
6.61 Acetaldehyde, hydroxy-

6.91 Formic acid
7.67 Acetic acid
7.50
9.11 Acetol (Hydroxypropanone)

10.00
11.86 Propanoic acid
12.50
13.16 Cyclopentanone
13.41 Butanone, 1-hydroxy-2-
13.65 Propionaldehyde, 3-hydroxy
15.22 Furaldehyde, 3-
15.00
15.87 Butandial or Propanal
16.22 Butyric acid
16.44 Cyclopenten-1-one, 2-
16.60 Furaldehyde, 2-
17.14 Diacetone alcohol
17.50
18.49 impurity in Acetone
19.17 Acetyloxypropane-2-one, 1-
19.61 unknown compound (similar to 2-Butanone spectrum)
20.18 Ethanone, 1-(2-furanyl)-
20.00
21.54 unknown compound (unspecific spectrum)
22.32 Cyclopentene-1-one, 2-hydroxy-2-
22.50
22.82 Acetonylacetone (Hexandione, 2,5-)
23.65 Furaldehyde, 5-methyl-2-
24.36 Cyclopenten-1-one, 3-methyl-2-
24.62 Butyrolactone, gamma-
[CTOIL-FID1A-integ] TIC #1
min
Capítulo 4
48 Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica
cts.
0.5e6
1.0e6
2.0e6
1.5e6
25.13 Furanone, 2(5H)-

27.02 Cyclopenten-1-one, 2,3-dimethyl-2-
27.31 Furanone, 3-methyl-2(5H)-
27.50
27.89 sugar derived compound

29.00 Phenol
29.62 Guaiacol
30.10 Cyclopenten-1-one, 3-ethyl-2-
30.00
31.32 Cresol, o-
32.00 sugar derived compound with Phenol, dimethyl-
32.55 Benzaldeyde, hydroxy-methyl-
32.50
33.07 Cresol, m-
33.61 Lactone derivative
34.47 Guaiacol, 4-methyl
34.87 Phenol, 2-ethyl-
35.22 Phenol, 2,4-dimethyl-
35.00 36.10 Phenol, 2,4,6-trimethyl-
36.84 Phenol, dimethyl- overlapping with Phenol, C4-
37.11 Phenol, 4-ethyl-
37.50
38.27 Phenol, 3,5-dimethyl-
38.97 Phenol, ethyl-methyl-
39.75 Inden-1-one, 2,3-dihydro-1H-
40.08 Dianhydro-alpha-D-glucopyranose, 1,4:3,6-
40.00
40.92 Phenol, propyl-
42.56 Phenol compound (perhaps ethyl-methyl- or ethyl-dimethyl-)
42.50
45.00
47.36 Vanillin
47.50
47.93 Hydroquinone
48.35 Benzaldehyde, hydroxy- with overlapping compounds
49.52 Benzenediol, methyl-
min
Continuación Figura 4.3 Cromatograma de bio-oil J desde 25 a 50 minutos.
Capítulo 4
Capítulo 4
Continuación Figura 4.3 Cromatograma de bio-oil J desde 50 a 75 minutos.
min
72.50
70.00
68.74 Fluoranthene
67.50
65.00
62.50
60.00
57.50
56.61 Anhydro-beta-D-glucopyranose (Levoglucosan)

55.00
52.50
1.5e6
2.0e6
1.0e6
0.5e6
cts.

Capítulo 4
El ácido fórmico presenta una baja sensibilidad en un detector FID junto con la co-elución con el
HAA, siendo recomendable cuantificar este compuesto en un detector de masas. Sin embargo, el
ácido fórmico también puede presentar problemas de retención, al ser un compuesto altamente
polar, evitando su retención en columnas apolares y produciendo el efecto tailing en columnas de
mediana polaridad.
En cuanto al análisis cuantitativo de los compuestos de interés, en la Tabla 4.1 se muestran los
resultados generales obtenidos en las diferentes muestras analizadas en el sistema GC/MS/FID
usando las condiciones descritas en materiales y métodos.
Tabla 4.1 Concentraciones de compuestos de interés identificados en bio-oil y sus fracciones.
Compuestos Bio-oil J M1 M2 M3 M4 M5
% p/p en base húmeda
Acido acético 3.7 2.9 3.5 1.4 NDa 0.05
Hidroxiacetaldehído (HAA) 3.4 2.8 3.7 0.6 2.9 0.8
Acetol 2.9 1.8 2.9 0.4 1.9 1.2
Levoglucosano 3.6 1.6 2.3 0.1 1.6 0.6
Totales
Cetonas no aromáticas 5.1 2.6 4.3 1.5 2.4 1.7
Furanos 1.1 0.5 0.8 0.9 ND 0.3
Catecoles 0.2 0.03 ND ND 0.06 ND
Guaiacoles 0.2 0.01 0.02 0.07 ND 0.01
Fenoles derivado de lignina 1.2 0.2 0.31 1.5 ND 0.08
a
No detectado
Los resultados obtenidos del análisis de bio-oil J muestran un bajo porcentaje de

hidroxiacetaldehído (3.4 %) en comparación con niveles reportados en literatura, donde se
describen porcentajes cercanos al 10.0 %. Además, llama la atención que el ácido acético se
encuentra en una mayor proporción que el HAA, lo que no es frecuente en este tipo de muestras.
Por otro lado, análisis realizados por el método químico de oximación mostraron que había un 50 %
más de grupos carbonilos en bio-oil, y considerando que el HAA es el aldehído que se encuentra en
mayor porcentaje, se estaría observando que el método de inyección directa de bio-oil estaría
presentando una subestimación de la concentración de este compuestos. Si bien el método químico
por oximación presenta inconvenientes al utilizarlo en muestras de bio-oil, por la adición de
diferentes reactivos que pueden causar interferencias o reacciones cruzadas en el análisis, si puede
presentar una estimación general de la cantidad de grupos carbonilos presentes. Esto demuestra la
necesidad de evaluar la cuantificación del HAA por una metodología analítica alternativa, dado que
este método de cuantificación presenta ciertas limitaciones.
Por otro lado, se observa que, a excepción del HAA, los otros compuestos de interés detectados en
bio-oil presentan concentraciones cercanas a las reportadas en bibliografía3.

Capítulo 4
En cuanto a las fracciones, las observaciones más interesantes son:

- La fracción acuosa de la extracción con n-butanol/agua (M1) contiene altos niveles de ácido
acético y levoglucosano (aproximadamente el 70 % del presente en bio-oil). La principal
ventaja se muestra en que es posible la separación de la lignina pirolítica, lo que se
evidencia por el bajo porcentaje de fenoles derivados de lignina, ya que la lignina pirolítica
tiene mayor afinidad por la fase orgánica.
- La fracción acuosa M2, que proviene de la directa separación de fases ocurrida al agregar
agua al bio-oil, muestra las concentraciones más altas de compuestos de interés, sin
embargo también presenta una mayor solubilización de la lignina pirolítica, impidiendo el
uso directo de esta fracción para la obtención de estos compuestos.
- La fracción orgánica M3, proveniente de la extracción con n-pentanol/agua, presenta
concentraciones bajas, por lo que se postula que hay un reparto equitativo en ambas fases,
lo que permite concluir que no es un solvente adecuado para la extracción de estos
compuestos, no obstante presenta un ventaja al solubilizar un alto porcentaje de lignina
pirolítica, en comparación con el n-butanol.
- Con respecto a la extracción con n-butanol/ NaHCO3 al 5 %, donde M4 es la fase acuosa y
M5 la orgánica, se observa que el uso de una sal redujo la solubilidad del agua en butanol,
favoreciendo la neutralización y la extracción de los ácidos orgánicos en M4. No obstante
en M5 permanecen concentraciones importantes de los compuestos de interés como acetol,
HAA y levoglucosano, por lo que esta extracción no representa una vía de separación de
estos compuestos, y sólo serviría para la extracción de ácidos orgánicos, los cuales como se
observa, quedan neutralizados en la fase acuosa.
Considerando los resultados obtenidos, queda de manifiesto la necesidad de desarrollar

metodologías en las cuales sea posible la determinación de los compuestos de interés industrial en
la matriz de bio-oil. Sin embargo es necesaria la implementación de esta metodología en el
laboratorio de Análisis Instrumental en un sistema GC/MS, para obtener una caracterización general
del bio-oil, y lograr comparar los resultados obtenidos con las futuras metodologías desarrolladas. A
continuación se detalla la metodología implementada en un sistema GC/MS
4.4.2 Análisis de bio-oil crudo y diferentes fracciones por GC/MS
Hasta la fecha, el uso de la cromatografía gaseosa con detección de masas ha sido de gran utilidad
al momento de realizar una caracterización del bio-oil en conjunto con técnicas espectroscópicas.
De esta forma han logrado identificar los diferentes compuestos (más de 100 compuestos), dando
un especial énfasis en el estudio de la composición en la fracción de la lignina pirolítica, diferentes
fracciones realizadas para la separación de compuestos y en la evaluación en el proceso de
producción del bio-oil 5-10. En todos los casos se ha empleado columnas capilares apolares y en
mayor orden columnas capilares de mediana polaridad. Considerando la complejidad de la muestra,
y la presencia de compuestos de diferentes polaridades, el uso de una columna de mediana
polaridad permite la separación de la mayor cantidad de compuestos en el bio-oil, en especial los
de mayor interés.
En este apartado se describen algunos análisis realizados a muestras de bio-oil, como a diferentes
fracciones por un sistema GC/MS, para ello fue necesaria la implementación y optimización del
método propuesto, considerando que la identificación de compuestos y la cuantificación, se

Capítulo 4
realizarían con la detección selectiva de masas. Por ello se optimizaron tanto el programa de
temperatura como los parámetros de detección.
Previo a la implementación del método propuesto, se evaluó una columna RTx-5 de 105 metros de
largo, con una pre-columna Hidroguard deactivation de 5 metros de largo, junto con la evaluación
de diferentes programas de temperaturas. El uso de esta columna fue con el objetivo de evaluar una
columna apolar, con mayor número de platos teóricos, esperando la obtención de una mayor
resolución cromatográfica considerando el gran número de compuestos presentes. En la Figura 4.4
se muestra el cromatograma de un amuestra de bio-oil obtenido con la columna mencionada.
Figura 4.4 Cromatograma de una muestra de bio-oil crudo por GC/MS, en modo SCAN, utilizando
una columna RTx-5 de 105 metros de largo. Señales: (1) ácido fórmico e hidroxiacetaldehído; (2)
ácido acético y acetol y (3) levoglucosano. Compuestos de derivados de la lignina pirolítica entre 30
y 88 minutos.
Abundance
T IC : B IO M E O H .D
70000
65000
60000
55000
3
50000
45000
2
40000
35000
1
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
8 . 0 0 1 0 . 0 01 2 . 0 01 4 . 0 01 6 . 0 01 8 . 0 02 0 . 0 02 2 . 0 02 4 . 0 02 6 . 0 02 8 . 0 03 0 . 0 03 2 . 0 03 4 . 0 0
T im e - - >
De esta forma queda de manifiesto que en el caso del bio-oil, el cual presenta una gran variabilidad
de compuestos con diferentes características químicas, el empleo de columnas cromatografías con
una mayor polaridad pueden mejorar la separación cromatográfica logrando una mejor resolución
de los compuestos. Otra posible opción empleando esta columna, es la derivatización de los
compuestos o grupos químicos, para la obtención de derivados con las características químicas
apropiadas para ser separados en una columna apolar.
Según lo expuesto con anterioridad y empleando una columna de mediana polaridad como VF-1701
se evaluó el programa de temperatura propuesto por A. Azeez et.al4, el cual mostró problemas de
separación entre HAA y ácido fórmico (ver Figura 4.5). Si bien el ácido fórmico no puede ser
cuantificado por este método, ya que no presenta un buen comportamiento cromatográfico por sus
características químicas, se hace necesaria la evaluación de un programa de temperatura que
permita la separación de éste con el HAA, con el fin de evitar un error en la cuantificación del
HAA. Los diferentes programas evaluados no mostraron una separación adecuada para estos
compuestos. Como medida alternativa se realizó una razón selectiva de masas en el tiempo de

Capítulo 4
retención correspondiente al hidroxiacetaldehído (m/z 31, mayoritaria en la fragmentación del

HAA) disminuyendo así, la señal producida por el ácido fórmico.
Figura 4.5 Cromatograma de bio-oil por GC/MS, separación entre hidroxiacetaldehído (1) y ácido
fórmico (2).
Abundancia
2
1
Tiempo (min)
Con el método implementado y optimizado, se realizaron análisis a diferentes muestras de bio-oil

y sus respectivas fracciones. No obstante la cuantificación de los compuestos en el bio-oil se enfocó
sólo en los compuestos de mayor interés como HAA, ácido acético, acetol, ácido propiónico, 2-
furaldehído, 2(5H)-furanona y levoglucosano. Este hecho no impide el uso de esta metodología para
otros compuestos ya que también sería posible su cuantificación. En la Figura 4.6 se muestra un
cromatograma de una muestra de bio-oil crudo, con los principales compuestos identificados.
Para la cuantificación se evaluaron los siguientes procedimientos: curva de calibrado, curva de

calibrado con estándar interno, adición estándar y factores de respuesta relativos. Los factores de
respuesta relativos para cada compuesto presentaron una alta variabilidad entre las inyecciones
realizadas. La adición estándar presentó una baja linealidad. Se postula que se debe a la adición de
reactivos en un sistema inestable como lo es la matriz de bio-oil. La cuantificación empleando
curvas de calibrado también presentó una alta variabilidad en cada inyección, la cual fue mejorada
empleando el estándar interno. No obstante, considerando la alta sensibilidad del detector de masas,
es necesaria la evaluación continua de estas curvas, de tal forma de obtener resultados confiables.

Capítulo 4
Figura 4.6 Cromatograma de bio-oil crudo obtenido por GC/MS, en modo SCAN desde los 6
minutos y m/z 31 entre 5.5 y 6 minutos. Cromatograma desde 0 a 40 minutos.
Fenol
2(5H)-Furanona
2-Furaldehído
Ácido propiónico
Acetol
Ácido acético

Capítulo 4
Continuación Figura 4.6 Cromatograma de bio-oil crudo obtenido por GC/MS, en modo SCAN
desde los 6 minutos y m/z 31 entre 5.5 y 6 minutos. Cromatograma desde 40 a 80 minutos.
(estándar interno)
Fluoranteno
Levoglucosano
Vainillina
4-metil fenol
2-metil fenol

Capítulo 4
Posteriormente, se procedió al estudio de las fracciones del bio-oil. El fraccionamiento realizado

estuvo enfocado principalmente a la separación de compuestos como ácidos orgánicos y azúcares
desde la fracción acuosa, empleando solventes como acetato de butilo y metil isobutilcetona. En la
Tabla 4.2 se muestra el detalle de los resultados obtenidos para las diferentes fracciones y la
muestra de bio-oil crudo.
Tabla 4.2 Resultados obtenidos para el bio-oil L y las diferentes fracciones. Los resultados están
expresados en % p/p húmedo.
Ácido Ácido
Muestras HAAa Acetol Levoglucosano
acético propiónico
L1 (Bio-oil L) 10.8 3.4 6.6 0.2 3.4
L2 6.6 2.8 4.4 0.2 1.7
L3 6.2 2.0 3.3 0.1 2.0
Extracción con acetato de butilo
L2.0 fase acuosa 6.0 1.7 3.1 NDb 1.8
L2.1 fase orgánica 0.6 1.2 0.9 ND ND
Extracción con metil isobutilcetona
L3.0 fase acuosa 6.0 1.9 3.2 0.1 1.9
a
b
No detectado: ND
Respecto a las fracciones analizadas, se puede concluir que el uso de metil isobutil cetona como
solvente de extracción presenta una mayor eficiencia en la recuperación del ácido acético respecto a
lo que se logra con acetato de butilo. Con tres extracciones de metil isobutil cetona es posible lograr
una recuperación cercana al 85 % de los ácidos presentes en la fase acuosa.
Ambos solventes permiten separar los azúcares de ambas fases. El solvente metil isobutil cetona
permite una mejor recuperación de ácidos orgánicos desde la fase orgánica. De esta forma, se puede
eliminar el solvente y extraer los ácidos con un menor porcentaje de agua que si se realizara
exclusivamente la extracción de ácidos con agua. Por otra, parte es posible la separación de los
azúcares en la fase acuosa, ya que estos no presentan un reparto en la fase orgánica.
En la Figura 4.7 se muestran tres cromatogramas por GC/MS correspondientes a bio-oil crudo,
fracción acuosa y una fracción orgánica.

Capítulo 4
Figura 4.7 Cromatogramas por GC/MS en modo SCAN de las muestras de bio-oil crudo L1 A);
fracción acuosa L2 (B) y fracción orgánica L2.1. Señales: (1) hidroxiacetaldehído, (2) ácido acético,
(3) acetol, (4) ácido propiónico, (5) levoglucosano y (6) fluoranteno (patrón interno).
6
6
6
5
Derivados de la lignina pirolítica

Solvente
4
4
3
3
3
2
1 2
2
1
1
A

Capítulo 4
Un aspecto importante a considerar es que con el uso de una columna de mediana polaridad, los
compuestos derivados de la lignina pirolítica, presentan menor interferencia, y a la vez una mejor
resolución que los observados en la Figura 4.4 con el uso de una columna apolar, permitiendo de
esta forma la cuantificación de los componentes restantes y que presentan un porcentaje importante
en el bio-oil.
Al hacer una comparación de las concentraciones de los principales compuestos de interés en bio-
oil, determinada por ambos sistemas GC/MS y GC/MS/FID, se observa que tanto para ácido acético
y levoglucosano, las concentraciones son comparables. De acuerdo a ello, se puede postular que a
pesar de ser dos muestras diferentes de bio-oil, pero dado que ambas tienen el mismo origen
(aserrín de Pinus radiata), tanto desde el punto de vista de materia prima como proceso de
producción, se pueden comparar. Sin embargo, tanto para HAA como para el acetol, el método por
GC/MS reporta mayores porcentajes de ambos compuestos que el método por GC/FID. Esto es
atribuible a la mayor selectividad del detector MS y principalmente a que efectivamente se logra
obtener una calibración externa adecuada, considerando solo señal de hidroxiacetaldehído y no de
otros interferente.
4.5 Conclusiones
La transferencia tecnológica del método mediante GC/MS/FID para caracterización de bio-oil y/o
sus fracciones es posible caracterizar en un sistema que sólo cuenta con un detector selectivo de
masas (GC/MS). Incluso es más eficiente desde el punto de vista de la exactitud, ya que el sistema
MS permite una mayor selectividad para la detección, lo que incide en una mayor exactitud en la
cuantificación por eliminación selectiva de señales interferentes que coeluyen con los compuestos
de interés. Esto se puede confirmar al comparar los resultados con un método independiente, como
lo es el método de oximación, que detecta en forma selectiva grupos carbonilos.
Los sistemas de fraccionamiento del bio-oil mediante el uso de solventes, en mayor o menor forma
permiten la separación de los compuestos de interés para posteriores aplicaciones industriales.
Dentro de ellos, el agua, n-butanol y metil isobutil cetona serían los solventes que mejor permiten
estos procesos de separación. Sin embargo, el uso de agua como solvente de extracción implica una
mayor dilución de los compuestos presentes en el bio-oil y una mayor dificultad al extraer los
compuestos desde la fase acuosa, a diferencia de los solventes orgánicos, los cuales presentan una
mayor facilidad al extraer los compuestos desde dichas fases.
Los bio-oil analizados con la metodología transferida, muestran interesantes porcentajes de HAA,
levoglucosano y ácidos orgánicos, observándose concentraciones similares a las descritas, y
representando una fuente interesante de estos compuestos presentes en el bio-oil crudo.
Si bien esta metodología permite la cuantificación de un gran número de compuestos en el bio-oil,

no permite la cuantificación de otros compuestos de interés como el ácido fórmico, aldehídos de
bajo peso molecular y algunos azúcares, dejando de manifiesto la necesidad de desarrollar
metodologías con una alta selectividad que permitan la cuantificación de los compuestos
mencionados.

Capítulo 4
4.6 Bibliografía
1. A. Oasmaa, E. Kuoppala, Y. Solantausta, Fast Pyrolysis of Forestry Residue. 2.

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2. A. Oasmaa, D. Meier, Characterisation, Analysis, Norms & Standards, Thermonet –PyNe
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3. A. Oasmaa, D. Meier, Norms and standards for fast pyrolysis liquids 1. Round robin test, J.
Anal. Appl. Pyrolysis 73 (2005) 323–334.
Lignocellulosic Biomasses Using Py-GC/MS and Fluidized Bed Reactor, Energy Fuels 24
(2010) 2078–2085.
5. T. Chen, C. Wu, R. Liu, W. Fei, S. Liu, Effect of hot vapor filtration on the characterization
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7. R. Lu , G.P. Sheng, Y.Y. H, P. Zheng, H. Jiang, Y. Tang, H.Q. Yu, Fractional
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8. T. Chen, C. Deng, R. Liu, Effect of Selective Condensation on the Characterization of Bio-
oil from Pine Sawdust Fast Pyrolysis Using a Fluidized-Bed Reactor, Energy Fuels (2010),
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9. P. Das, T. Sreelatha, A. Ganesh, Bio oil from pyrolysis of cashew nut shell-characterisation
and related properties, Biomass and Bioenergy 27 (2004) 265-275.
10. S. Uҫar, S. Karagöz, The slow pyrolysis of pomegranate seeds: The effect of temperature on
the product yields and bio-oil properties, J. Anal. Appl. Pyrolysis 84 (2009) 151-156.

Capítulo 5
CAPÍTULO 5
DESARROLLO DE METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE AZÚCARES EN

BIO-OIL POR HPTLC
Los azúcares en bio-oil se encuentran en 5-10 % en peso, la importancia de estos compuestos a

nivel nacional corresponde a las aplicaciones en la industria farmacéutica, en la producción de
polímeros y resinas especiales, surfactantes glucósidicos y poliglucosas no hidrolizables. Otra
aplicación que no requiere anhidro-azucares puros y para la cual existe actualmente un mercado es
la metabolización por microorganismos para la producción de ácidos carboxílicos o etanol (Olson &
Free 2007)1.
La determinación de azúcares en bio-oil, en particular el levoglucosano se realiza por inyección

directa en GC/MS, de bio-oil diluido con acetona y empleando fluoranteno como patrón interno
(columna VF-1701). La ventaja de esta metodología es que no necesita previa derivatización o
tratamiento de la muestra de bio-oil, los valores encontrados para el levoglucosano por este método,
fluctúan entre los 3-5 %. Al realizar una inyección directa de la solución de bio-oil, sin tratamiento
previo, no tan solo ingresarán al sistema cromatográfico compuesto de mediana o baja volatilidad,
si no que un gran porcentaje corresponde a lignina pirolítica (24 %), la cual con el tiempo puede
quedar adherida en las paredes de la columna capilar, disminuyendo, la vida útil de la columna.
También se ha reportado el uso de HPLC con detección IR para otros azúcares en el bio-oil. Los
azúcares reportados por esta metodología son: levoglucosano, glucosa, xilosa y celobiosano con
porcentajes alrededor de un 3-7 % para el levoglucosano, seguido por la xilosa y celobiosano con
porcentajes cercanos al 1-2 %. Estos valores son proporcionados por test “Round Robin” realizado
el año 2005, en el cual sólo 3 laboratorios realizaron la experiencia, uno de ellos por GC (no se
especifica metodología) y los dos restantes por HPLC (no se especifica metodología), los análisis
por GC sólo se determinó levoglucosano, en los análisis por HPLC, fue posible determinar
levoglucosano, xilosa y celobiosano, siendo este último, el segundo azúcar con mayor porcentaje en
bio-oil.
La determinación de azúcares por HPLC, con detección IR puede ser una opción para determinar no
tan sólo el levoglucosano, si no que otros azúcares presentes en el bio-oil. La principal desventaja es
las interferencias producidas por la lignina pirolítica y los compuestos restantes del bio-oil.
Al desarrollar una metodología por HPTLC, se tomaron en cuenta principalmente los siguientes
factores: rapidez de análisis, costos (reactivos e instrumentales) y tratamiento de la muestra. La
técnica de HPTLC está ampliamente descrita en la determinación de diferentes tipos de azúcares, en
diferentes tipos de matriz, en el caso del levoglucosano y el celobiosano no hay información al
respecto de la determinación por esta técnica, ni tampoco en matriz de bio-oil (esta última sólo se
menciona una evaluación por TLC).

Capítulo 5
De acuerdo a estos antecedentes, se desarrolló una metodología capaz de determinar los principales
azúcares del bio-oil, sin tratamiento previo de la muestra, y aplicable a bio-oil crudo, como a
fracciones orgánicas y acuosas, incluso a la fracción de lignina pirolítica.
HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY DETERMINATION OF

CELLOBIOSAN AND LEVOGLUCOSAN IN BIO-OIL OBTAINED BY FAST PYROLYSIS
OF SAWDUST
Catherine Tessini, Mario Vega, Niels Müller, Luis Bustamante, Dietrich von Baer, Alex Berg, Claudia Mardones.
Journal of Chromatography A, 1218 (2011) 3811–3815
5.1 Abstract
In this work, high performance thin layer chromatography (HPTLC) is applied to the determination
of sugars in fast pyrolysis liquids (bio-oil) and fractions thereof. The proposed procedure allows the
separation of anhydrosugars levoglucosan and cellobiosan, as well as glucose, arabinose, xylose and
cellobiose. Pre-treatment and derivatization of samples are not necessary and volatile compounds
present in bio-oil do not interfere with sugar analysis. The detrimental effect of the complex bio-oil
matrix on columns and detector lifetime is avoided by using disposable HPTLC plates. Prior
screening of glucose, present especially in aged and aqueous bio-oil fractions, is required to
quantify cellobiosan without interference. Concentrations of levolucosan and cellobiosan in bio-oil
samples obtained from Pinus radiata sawdust was ranged between 1.27 % - 2.26 % and 0.98 %-
1.96 % respectively, while a bio-oil sample obtained from native wood contained a higher
levoglucosan concentration.
5.2 Introduction
Bio-oil, the liquid product of fast biomass pyrolysis, is attracting considerable interest as a
renewable source of liquid fuels and chemicals. There are several methods for thermal biomass
conversion. One of them is fast pyrolysis, which maximizes the yield of this liquid fuel2. It is a
high-density fuel that can be transported and used by conventional systems like power generation
turbines3. The biomass is decomposed to generate mostly vapors, aerosols and some charcoal. After
cooling and condensation, a dark brown liquid is formed (crude bio-oil), with yields of up to 75%
wt (on a dry-feed basis) 2-6.
Characterization of bio-oil is a challenge and several analytical techniques must be applied to obtain
a detailed product distribution which is still incomplete. Only about 40% of bio-oil compounds can
be quantified by gas chromatography (GC), especially volatile and thermostable compounds7, 8. On
the other hand, 10-15% polar and nonvolatile compounds have been determined by high
performance liquid chromatographic (HPLC) 7, 8. Such complexity requires laborious sample pre-
treatment, including sequential extractions, and derivatization8. However, for the development of
bio-oil applications, simple and direct analytical methods for bio-oils and their fractions are
preferred.
The ‘sugar’ fraction of bio oil has particular interest as a fuel and as a source of chemicals. As
chemical, levoglucosan (1,5-anhydro-β-D-glucopyranose) and cellobiosan (1,6-anhydro-β-

Capítulo 5
cellobiose) may have pharmaceutical applications, for example, in the synthesis of macrolide
antibiotics9. The use of anhydrosugars in polymer production, non-ionic surfactants and non-
hydrolysable polyglucose has also been described10-11. Due to the reactivity and sticking tendency12,
components of the ‘sugar fraction’ should be separated from the whole bio-oil to improve its fuel
properties. Anhydrosugars present in bio-oil can be hydrolysed to cellobiose and glucose1, 12 and be
used for ethanol production.
The main compounds in the ‘sugar’ fraction are levoglucosan (Figure 5.1A) and cellobiosan (Figure
5.1B) with concentrations between 3-6% and 1-3%, respectively. Low concentrations of glucose,
xylose, arabinose and cellobiose have also been reported7. The concentrations of levoglucosan and
cellobiosan, product of cellulose depolymerization, depend on pyrolysis conditions and the raw
material employed, with maximum yields obtained at around 500 ºC. Pretreatments of biomass by
hydrolysis or demineralization can substantially improve the yields of sugars13.
Figure 5.1 Levoglucosan (A) and cellobiosan (B) chemical structures.
For rough determination of ‘sugars’ in bio-oil, a method based on solvent fractionation of the water
soluble fraction and analysis by refractive index has been proposed12. Levoglucosan determination
has been described using HPLC and especially GC/MS methods14, 15. Identification of cellobiosan
has been described using GC/MS and HPLC in products of pyrolysate cellulose matrix, using
spectra libraries16, 17. Silylation using TMS of bio-oil samples has also been tested for cellobiosan
detection by GC/MS18. However, no quantification of sugars in bio-oil has been previously
described.
Other sugars, like monosaccharides, disaccharides and polysaccharides have of course been
determined in different matrices (e.g., food, drugs and human fluids) using high performance thin
layer chromatography (HPTLC) 19-23. However, this technique has not been used extensively for
bio-oil analysis, or for anhydrosugar separation. The content of arabinose, galactose, glucose,
mannose and xylose has been determined and compared in acid hydrolysis products of woods by
three different chromatographic methods24. These are borate complex anion-exchange
chromatography, anion-exchange chromatography in NaOH medium and HPTLC. Determination of
cellobiosan and levoglucosan by the latter has not been described before.
The main aim of this work is to determine sugars, especially anhydrosugars in bio-oil and fractions
thereof, by using a HPTLC technique. This offers great advantages in biomass pyrolysis research,
especially considering that bio-oils are complex matrices with different kinds of compound, some of

Capítulo 5
which can be retained in the HPLC column and damage it. For GC analysis, sugars need complex
derivatization procedures. On the other hand, bio-oil has many volatile compounds that will not
remain on the plate after sample application and will not interfere with sugar separation. HPTLC
has the additional advantage over HPLC that the separation layer (the plate) is used just once, so
compounds that are irreversibly bonded to the plate are not important. Because the separated
analyte remains on the plate after chromatography, multiple development procedures that definitely
improve separation can be used, giving reproducible and confident quantitative results, especially if,
as in this work, the Automatic Development Chamber (ADC2) is used.
5.3 Materials and methods
Reagents and standard

Levoglucosan (1,6-anhydro-β-D-glucopyranose) was obtained from Merck (Hohenbrunn,
Germany). Cellobiosan (1,6-anhydro-β-cellobiose) from Sussex Research Laboratories Inc.
(Ottawa, Canada). D-(+)-cellobiose was obtained from Sigma-Aldrich. L(+)-arabinose, D(+)-
xylose, D(+)-glucose, methanol (liquid chromatography grade), acetonitrile (liquid chromatography
grade), 1-butanol (Lichrosolv), aniline p.a, diphenylamine p.a, di-potassium phosphate anhydro p.a,
formic acid (98-100%) and orto-phosphoric acid (85%) p.a, were all obtained from Merck
(Darmstadt, Germany),. Deionized water (18 mΩ) was produced with a water purification system
Millipore Milli-Q (Bedford, MA, USA).
Instrumentation
The HPTLC system was constituted by a Scanner 3 spectrodensitometer, running winCATS 1.4.3
software, an automatic application band device ATS 4 and an automatic developing chamber ADC
2, all from CAMAG (Muttenz, Switzerland). Chromatographic plates were 20 cm × 10 cm silica gel
60 F254 HPTLC plates (extra thin) from Merck (Darmstadt, Germany), impregnated with
phosphate. Glucose screening method used the same HPTLC not impregnated plates. CAMAG TLC
Immersion Device III and a CAMAG TLC Plate Heather III were used for plate treatment and
visualization. Evaluation of different mobile phases used in separation of cellobiosan from glucose
was carried out using a HPTLC Vario Chamber.
5.4 Standard solutions and bio-oil samples
Stock solutions of sugars were prepared in methanol/water 70/30 v/v at 1.0 mg mL-1. Bio-oil
samples and extracts were diluted 1:25 (v/v) in methanol. No other sample treatment was required
before HPTLC analysis.
The samples were weighted on analytical balance and dissolved in methanol. This last step was
carried out at the moment of analysis, because methanol can react over time with compounds
present in bio-oil. Generally, sugars can react with acids, esters or alcohols by acid catalysis25; with
bio-oil at pH around 2-3, can react during storage of diluted samples.
Bio-oils samples (1, 2, 3 and 4) were produced in a bench–scale pyrolysis plant at the Metallurgical
Engineering Department of the University of Concepción. In each run, oven-dry sawdust was fed
into a fluidized bed reactor using nitrogen and pyrolyzed in contact with hot sand. After removing

Capítulo 5
char, bio-oil was condensed and collected in two catch pots. The first one collected was the main
liquid product after the condenser and cyclone; the second one collected was bio-oil drops trapped
in a demister. Bio-oil sample 1 and 4 were obtained by mixing the two liquid products, while bio-oil
2 and 3 were samples of the two liquids. Table 5.1 shows a summary of some of the physico-
chemical characteristics of the obtained bio-oils.
In addition, three bio-oil fractions were prepared from bio-oil 4 for ‘sugar’ analysis in different
matrices: a water insoluble lignin derived precipitate, an aqueous phase and an organic extract
obtained as described below.
Table 5.1 Physico-chemical properties of analyzed bio-oil samples obtained by pyrolysis at 500 °C
Viscosity (at Density Total acids

Bio-oil Sawdust
40ºC) (at 20ºC) mg KOH / g
samplesa source
cSt g/cm3
Bio-oil 1 Pinus radiata 13.6 1.18 54
Bio-oil 4 Native wood 7.7 1.18 66
a
Bio-oil 2 corresponds to the main liquid product collected in catch pot A (after condenser and
cyclones); Bio-oil 3 is the liquid product received in catch pot B (demister). Bio-oil 1 and 4 are the
mixtures of products collected in catch pot A and B.
Bio-oil extraction with n-butanol
100 mL sample of bio-oil (bio-oil 4) was extracted with 50 mL of n-butanol and 50 mL of water.
The heavier, water-rich fraction was extracted again with the same mixture, and another time with
50 mL of n-butanol. The water-rich fraction (water phase) and the mixture of 3 n-butanol extracts
(butanol-phase) were analyzed.
Pyrolytic lignin
20 mL sample of bio-oil 4 was very slowly dispersed in 200 mL cold water (5 ºC) with the help of
an IKA T-25 Ultra-Turrax at 6000 rpm. The precipitate or “pyrolytic lignin”, was filtered off and
the filtrate was analyzed.
5.5 HPTLC quantification of main sugars
HPTLC silica-gel plates were impregnated with anhydrous di-potassium phosphate (0.2
M)/methanol 1:1 (v/v), using the TLC Immersion Device with a dipping speed of 2 cm s -1 and
dipping time of 8 s. The drying was carried out at 120 ºC for 20 minutes. Sample application was
done as 8 mm bands, using 0.1-1 uL of the standard solution (100-800 ng per band) in the
calibration. The chromatographic procedure was a multiple development (three times) with
water/acetonitrile 20/80 v/v as mobile phase26. The development distance was 70 mm from the
lower edge of the plate. A solution containing 1.2 g of aniline, 1.2 g of diphenylamine, 10 mL of
phosphoric acid and 100 mL of methanol was used as chromogenic reagent27. Post-chromatographic
derivatization on silica-gel was performed with the TLC Immersion Device using the same

Capítulo 5
condition as described before. Sugars were visible after 15 minutes in the plate heater at 120 °C.
Detection was performed by scanning the plate at 520 nm in the reflectance/absorbance mode.
Different mobile phases were evaluated in order to detect glucose, especially in aged bio-oil
samples. Finally the separation was carried out on plates without impregnation and using butanol /
formic acid 45:5 (v/v) 28 as the mobile phase. Development distance, chromogenic reagent and
detection wavelength were as described in the preceding paragraph for the other sugars.
5.6 Results and discussion
Separation of main sugars and calibration curves

Figure 5.2 shows the HPTLC plate of bio-oil 1 and sugar standards using the methodology
described in Section 5.5. The calibration curves for levoglucosan and cellobiosan were prepared
between 100 and 800 ng by band, 50-400 ng by band for xylose and cellobiose, and 50-300 ng by
band for arabinose. The chromatographic development was carried out using the procedure
described in Section 5.5. As can be seen, the five analytes are adequately separated with R f 0.29,
0.35, 0.42, 0.49 and 0.69 for cellobiose, cellobiosan, arabinose, xylose and levoglucosan,
respectively. No other interfering compounds from the bio-oil matrix are observed, allowing the
quantification of these sugars without major sample pretreatment steps, as required in GC or HPLC.
Figure 5.2 HPTLC plate of bio-oil 1 and sugar standards using acetonitrile/water 80/20 v/v as
mobile phase
In Figure 5.3 are included the HPTLC plates of the fraction obtained from bio-oil 4. It is possible to
detect the studied sugars in these fractions with the optimized method using the procedure described
in Section 5.5. Therefore, the developed method can also be used for different fractions of bio-oil.

Capítulo 5
Figure 5.3 HPTLC plates of bio-oil 4 and their fractions using acetonitrile/water as mobile phase.
I: bio-oil 4; II: pyrolytic lignin III: n-butanol and aqueous phase. Standards: cellobiosan (C),
arabinose (A), levoglucosan (L) and xylose (X).
Linearity, detection and quantification limits and intermediate precision (the latter measured with a
bio-oil sample) are summarized in Table 5.2. The detection limits obtained for levoglucosan and
cellobiosan were acceptable, considering that the reported concentrations of these sugars in bio-oils
from sawdust are around 1-6 wt %3.
Table 5.2 Analytical parameters for HPTLC sugar determination in bio-oil.

Linear range Detection limit Quantification limit Intermediate precisiona
Sugars
ng ng ng RSD (n=3)
Levoglucosan 100-800 60 180 11 %
Cellobiosan 100-700 80 240 20 %
Xylose 50-400 16 48 -
Arabinose 50-300 14 42 -
Cellobiose 50-300 18 59 -
a
The intermediate precision was determined using three different bio-oil samples in triplicate, at
different days and with different HPTLC plates.

Capítulo 5
The determination of anhydrosugars in crude bio-oil and fractions can be affected by the presence
of glucose, produced by first-order hydrolysis reactions of levoglucosan and cellobiosan. The decay
in anhydrosugar concentrations was notorious in aqueous fractions of bio-oil and aged bio-oil
samples. Hence, for quantification of the main sugars in bio-oil and aqueous fractions, the presence
of glucose must be established. This separation has not been studied before using any
chromatographic method. The first results of HPTLC analysis showed good separation between
levoglucosan and cellobiosan, but not between cellobiosan and glucose. Different mobile phases
were studied for HPTLC separation of cellobiosan from glucose (butanol / boric acid (100 mg / 20
mL water / iso-propanol 30:50:10 (v/v)25; ethyl acetate / hexane 1:9 (v/v)29; benzene /acetone 10:1
(v/v)30; chloroform / methanol / water / acetic acid 30:12:4:5 (v/v)31 and butanol / formic acid 45:5
(v/v)28. Finally, separation of both analytes was achieved by using a mobile phase of butanol /
formic acid 45:5 (v/v). In Figure 5.4 the separation of cellobiosan and glucose in a sample of crude
bio-oil 2 using these conditions is shown. The screening of glucose in bio-oil and different fractions
is shown in Figure 5.5. In figure 5.6 is shown the glucose screening in presence of all sugar
standards. Under these conditions, xylose and levoglucosan are not separated.
Figure 5.4 HPTLC plate of bio-oil samples, cellobiosan and glucose standards using butanol/formic
acid as mobile phase. Cellobiosan (C) and glucose (G). Track 1 and 4 cellobisan and glucose
standards. Track 2 bio-oil 2 whithout glucose. Track 3 bio-oil 2 with glucose added.
Figure 5.5 Screening of different bio-oil samples for glucose detection. Cellobiosan (C), glucose
(G) and levoglucosan (L). Sample 1, 2 and 3 correspond to bio-oil 4, pyrolytic lignin and bio-oil
aqueous phase respectively.

Capítulo 5
Figure 5.6 HPTLC plate of sugar standards using butanol/formic acid as mobile phase. cellobiosan
(C), glucose (G), arabinose (A), levoglucosan (L) and xylose (X).
Considering that this procedure is effective only to separate glucose from cellobiosan, it was used
just for screening purposes, avoiding the overestimation of cellobiosan due to the presence of
glucose. Based on this fact, Figure 5.7 shows the scheme adopted for the determination of principal
sugars in bio-oil samples.
Figure 5.7 Proposed scheme for the determination of principal sugars in bio-oil samples.
Bio-oil sample
Glucose detection in bio-oil samples using HPTLC-

plate (without treatment), and butanol/formic acid as
mobile phase.
YES NO
Determination and quantification only of Determination and quantification of cellobiosan,

cellobiosan using mobile phase butanol/formic levoglucosan and the other sugars in bio-oil
acid, followed by determination of other sugars samples according to procedure 5.5.
using HPTLC-plates (with treatment) and
water/acetonitrile as mobile phase (procedure
5.5).
Quantification of sugars in bio-oil samples and fractions
Table 5.3 shows the results obtained by the proposed HPTLC method for seven samples of fresh
bio-oil and bio-oil fractions. Different samples were selected for analysis, including bio-oils
produced from soft- and hardwood sawdust, bio-oils collected at different points in the pyrolysis
condensation train, and samples from exploratory bio-oil fractionations.

Capítulo 5
Analysis revealed no presence of glucose, cellobiose, or arabinose in the freshly produced bio-oils.
Analytical signals for xylose were observed, but their values were below the detection limit of the
methodology (see Figure 5.2). However, in aged bio-oil samples, detectable amounts of
monosaccharides were found (results not shown).
The raw material for the production of bio-oils 1-3 was sawdust of Pinus radiata, and for bio-oil 4 a
mixture of native woods was used (see table 5.1). The concentration of levoglucosan was higher for
bio-oil 4, which is in accordance with those reported by Ingram et al, where shows higher
concentrations of this sugar in hardwood (oak wood) than in softwood32.
The bio-oil 2 and 3 were collected at different steps of the pyrolysis condensation train: bio oil 2 at
the exit of the cyclone after the condenser, and bio oil 3 at the bottom of the demister. The presence
of anhydrosugars in bio-oil 3 shows that high-molecular-weight compounds are not condensed and
are not trapped effectively in the condenser and these are carried over to the demister. Pyrolysis
products tend to form aerosols difficult to trap successfully. In this case, no final electrostatic
precipitator has been used.
Common bio-oil fractionation schemes start by removing high-molecular-weight compounds

derived from lignin by addition of water and precipitation. A heavy, viscous organic fraction settles
down and sticks to the walls of the recipient. However, if an excess of cold water and a
homogenizer are used, a fine precipitate can be collected. In Table 5.3, the fine precipitate (bio-oil 4
pyrolytic lignin) displays a similar concentration of anhydrosugars, compared to the source bio-oil.
As this fraction accounts 19-23% wt of the whole bio-oil, a similar percentage of anhydrosugars
remains trapped in the pyrolytic lignin. Re-suspension in water and repeated filtration and washing
may be necessary to improve the separation of anhydrosugars from pyrolytic lignin.
Table 5.3 Sugar concentrations in fresh bio-oil samples and extracts.
Glucose Levoglucosan Cellobiosan Xylose Arabinose

Samples
wt % wt % wt % wt %
a
Bio-oil 1 ND 1.27 1.46 ND ND
Bio-oil 4 aqueous phase ND 1.81 0.93 ND ND
Bio-oil 4 n-butanol/ phase ND 0.78 0.82 ND ND
Bio-oil 4 pyrolytic lignin ND 0.75 0.88 ND ND
a
ND: Not detected; wt%: weight/weight percent
An alternative bio-oil fractionation scheme involves an organic polar solvent that dissolves the
hydrophobic lignin compounds, giving a lighter organic phase and a heavier water fraction. In the
case of bio-oil extracted with n-butanol/water, the yield of pyrolytic lignin in the butanol phase,
determined by the same method of dispersion and precipitation in an excess of cold water (1:10 v),
is almost the same as the yield from bio-oil. Therefore, the high-molecular-weight lignin-derived

Capítulo 5
compounds ends up effectively in the butanol phase, as intended; but anhydrosugars as can be seen
from Table 5.3, are also significantly extracted into the butanol phase.
Our results show that a high percentage of sugars still remain in the pyrolytic lignin fraction,
obtained either by dispersion using water or organic polar solvent, producing both treatments
similar sugar levels. Another dispersion step, using water, followed by filtration and washing could
allow the separation between anhydrosugar and pyrolytic lignin.
5.7 Conclusions
The HPTLC technique displays a major advantage in the analysis of bio-oil samples than other
expensive or laborious procedures using HPLC or GC: no sample pre-treatment and disposable
HPTLC plates providing a new separation layer for each sample. The proposed HPTLC method
shows adequate analytical parameters for the quantification of main sugars in bio-oil samples and
their fractions. In addition, the same methodology can be used to quantify the main sugars in
different bio-oil extracts (butanolic, pyrolytic lignin and aqueous extract) with adequate
intermediate precision. In all studied bio-oils, cellobiosan and levoglucosan were detected but not
xylose, arabinose and cellobiose. On the other hand, glucose screening of bio-oil samples is needed,
because of its interference with cellobiosan, especially for aged bio-oil samples. A separation using
butanol/formic acid as mobile phase allows for this purpose. Considering this fact, a scheme for the
determination of principal sugars in bio-oil samples is proposed. Separation of anhydrosugars from
pyrolytic lignin is complex. To achieve their separation, an additional resuspension in water may be
necessary.
Acknowledgements
The authors thank the financial support received from FONDEF Chile, Grant N° DO7-I-1137 and
from CONICYT Chile, Grant PFB-27/PCS 003 and the postgraduate fellowship of Dirección de
Postgrado, Universidad de Concepción for Catherine Tessini in the Programa de Doctorado en
Ciencia y Tecnología Analítica.

Capítulo 5
5.8 References
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Capítulo 6
CAPÍTULO 6
DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS ORGÁNICOS EN BIO-OIL POR HPLC-UV Y SU

DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA CON AZÚCARES POR GC/MS
En este capítulo se presentan el desarrollo de metodologías analíticas orientadas a la determinación

de ácidos orgánicos en bio-oil. La determinación de diversos grupos de componentes en bio-oil se
realiza con el objeto de cuantificar la mayor cantidad de compuestos químicos de forma selectiva y
orientada a la extracción de productos químicos a escala industrial desde el bio-oil.
6.1 Resumen
La determinación de ácidos orgánicos en bio-oil se puede realizar en parte, mediante la inyección
directa en un sistema GC/MS, con el inconveniente de que no todos los ácidos de interés pueden ser
cuantificados. En este capítulo se evalúa la determinación de ácidos orgánicos por HPLC-UV,
adaptando y optimizando una metodología previamente desarrollada para el análisis de vinos. Sin
embargo, la selectividad obtenida no fue adecuada, inclusive después de realizar diferentes
tratamientos previos a las muestras de bio-oil. Por ello, se desarrolló y evaluó una metodología
mediante GC/MS previa derivatización con BSTFA, la cual no sólo permitió la determinación de
ácidos orgánicos sino que junto con ellos fue posible la cuantificación de azúcares, con un
tratamiento de muestra simple. Finalmente, se comparan los resultados obtenidos para ácidos y
azúcares por el método propuesto con aquellos obtenidos por GC/MS (inyección directa) y HPTLC.
6.2 Introducción
La alta concentración de ácidos orgánicos en el bio-oil, específicamente ácido fórmico y acético,
producen un pH entre 2 y 3. Las concentraciones de estos dos ácidos oscilan entre un 70 % y 80 %
del total de ácidos presentes en el bio-oil. Estos a la vez representan entre un 60 % y 70 % de la
acidez del bio-oil, ya que los valores de sus pKa son los más bajos de los componentes presentes en
el bio-oil. No obstante, otros compuestos como las especies fenólicas y los ácidos grasos aportan
entre un 10 % y un 5 % respectivamente a su acidez 1-5.
La condición de acidez del bio-oil impide su uso directo como combustible, al ser altamente
corrosivo e incompatible con las estructuras actuales. Sin embargo estos ácidos pueden ser
removidos del bio-oil y pueden ser usados como aditivos de ensilaje (en el caso del ácido fórmico),
el cual actúa como inhibidor de la fermentación, asegurando la preservación del ensilaje6. En el caso
del ácido acético es posible su aplicación en el proceso de pulpaje Acetosolv7. Considerando estos
antecedentes, es importante la determinación y cuantificación de los ácidos orgánicos presentes en
el bio-oil.
Tal como se describe en el capítulo 4, la determinación de diferentes grupos químicos en el bio-oil

puede ser realizada mediante inyección directa en un sistema GC/MS empleando una columna de
mediana polaridad. Usando el método descrito fue posible la identificación de ácido acético y ácido
propiónico, pero para este último no fue posible su cuantificación dado que las concentraciones
presentes en bio-oil no son detectables por este método10. El ácido fórmico, segundo en porcentaje
en bio-oil, presenta inconvenientes al ser determinado por GC/MS, principalmente por ser un
compuesto altamente polar. Otros ácidos como el ácido glicólico y el ácido láctico, aunque no se

Capítulo 6
encuentran en concentraciones importantes, pueden aportar información sobre la oxidación de un

compuesto de interés como el glicolaldehído (hidroxiacetaldehído), por lo tanto su determinación
también se hace necesaria.
Otra alternativa que ha sido descrita para análisis de ácidos orgánicos es su derivatización y su
posterior separación por cromatografía de gases8, en particular para la determinación de ácido
fórmico, ya que este presenta incompatibilidad con las columnas cromatográficas empleadas como
columnas apolares y de mediana polaridad en la inyección directa. La derivatización más usada es
la formación de ésteres de bencilo8, 9.
Por otro lado, hay dos referencias bibliográficas sobre determinación conjunta de ácidos orgánicos y
azúcares en bio-oil, mediante HPLC con detector refractométrico8, 9 Se describe la determinación de
ácidos orgánicos (principalmente ácidos fórmico y acético), azúcares (celobiosano, levoglucosano
entre otros) y aldehídos (incluyendo el hidroxiacetaldehído), utilizando una columna Aminex HPX-
87H. A pesar de ser un método interesante desde el punto de vista de su capacidad de determinar un
gran número de compuestos polares en bio-oil en un solo análisis, dichas publicaciones no
presentan ni cromatogramas, ni características analíticas del método descrito, por lo que su
transferencia y utilización son poco factibles, sobre todo considerando la pobre selectividad que
representa un detector refractométrico. Los azúcares presentes en el bio-oil (como se explicó en el
Capítulo 5) son importantes en la obtención de productos químicos, como por el inconveniente que
causarían al utilizar el bio-oil como combustible. Estos antecedentes hacen necesario desarrollar
metodologías que permitan determinar dichos compuestos tanto en bio-oil crudo como en diferentes
fracciones de éste, con metodologías suficientemente selectivas.
Considerando estas referencias, en el presente trabajo se plantea evaluar la determinación de ácidos

orgánicos mediante HPLC-UV, considerando que la detección espectrofotométrica es más selectiva
que la refractométrica. Para ello se adaptó una metodología implementada para el análisis de ácidos
orgánicos en vino, la cual consiste en la inyección directa de la muestra, sin tratamiento previo (sólo
filtración) 11. Sin embargo, considerando lo complejo de la matriz del bio-oil y de sus fracciones, se
hace necesario evaluar diversos sistemas de pre-tratamiento de muestra.
Además se desarrolló un método para la determinación simultánea de ácidos orgánicos y azúcares

en bio-oil por GC/MS, previa derivatización con BSTFA. Se fundamenta el desarrollo de esta
metodología como medida de comparación de los resultados obtenidos en la inyección directa de
bio-oil en GC/MS, la determinación de azúcares por HPTLC y la determinación de ácidos orgánicos
que no pueden ser determinados por los métodos descritos.

Capítulo 6
6.3.1 Reactivos
Acido fórmico 98-100%, ácido acético glacial, ácido láctico 90 %, ácido glicólico, ácido
isobutírico, ácido sulfúrico, L(+)-arabinosa, D(+)-xylosa, 1,6-anhidro-β-D-glucopiranosa
(levoglucosano) y metanol (grado HPLC) fueron obtenidos en Merck (Darmstadt, Alemania). Ácido
propiónico > 99.5 % y N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) fueron adquiridos en
Sigma (St. Louis MO, USA). Celobiosano (1,6-anhydro-β-cellobiosa) fue adquirido en Sussex
Research Laboratories Inc. (Ottawa, Canadá). 2,5-anhidro-D-manitol fue adquirido en ACROS
organics (Geel-Belgium). Agua desionizada (18 mΩ) es obtenida en un sistema Millipore Milli-Q
(Bedford, MA, USA).
6.3.2 Materiales
Columnas de extracción en fase sólida, de intercambio aniónico SAX column, 3 mL, 500 mg (amina
cuaternaria –NR3+) adquiridas en Agilent Technologies (CA, USA), sistema de extracción en fase
sólida Supelco Visiprep SPE Vacuum Manifold Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), bomba de vacío y
filtros Millex-GV, con membrana Durapore (PVDF), tamaño poro 0.22 µm, diámetro 13 mm,
fueron obtenidos por Millipore (Bedford, MA, USA).
6.3.3 Instrumentación
Sistema HPLC-UV
Sistema HPLC Merck Hitachi equipado con un autosampler L-2200, bomba L-2130 y detector L-
2400 UV–vis (Merck, Darmstadt, Alemania). La temperatura de la columna fue de 65 °C, en un
horno CTO-10AVP Shimadzu (Kyoto, Japón). El programa de integración corresponde Interactive
Graphics, versión 6.20 de Varian Inc. (Palo Alto, CA, USA).
Sistema GC/MS
Sistema GC/MS compuesto por cromatógrafo de gases HP 6890 Series Hewlett-Packard (Palo Alto,
CA, USA) equipado con un inyector split/splitless. Detector selectivo de masas HP 5973 y
autosampler Combi Pal CTC-G6500 (CTC Analytics AG, Zwingen, Suiza). El sistema es
controlado por MSD ChemStation G1701AA, versión D.03.00.611 y el programa Cycle Composer
version1.6.0 para el autosampler.
6.3.4 Condiciones cromatográficas
Sistema HPLC-UV
La separación se realizó con dos columnas en serie. Como pre-columna se utilizó la columna
LiChrospher® RP-18, (5 µm), 100 mm (Darmstadt, Alemania), seguida por una columna Aminex
HPX-87H de exclusión iónica de 300 mm de largo y 97.8 mm de diámetro interno (Bio-Rad
Laboratories, California, USA). La composición de la fase móvil fue de H2SO4 0.005 mol L-1 a un
flujo de 0.5 mL min-1 en modo isocrático. La detección se realizó a 210 nm, con un volumen de
inyección de 5 µL.
Sistema GC/MS
En la separación cromatográfica se utilizo una columna VF-1701 de 60 m × 0.25 mm I.D, 0.25 µm
film y helio electrónico grado 6.0 (99.9999%) con un flujo de 1.0 mL min−1 como fase móvil. El

Capítulo 6
programa de temperatura fue el siguiente: temperatura inicial de 45 °C constante por 4 minutos, con
un incremento de 3 °C min−1 hasta 120 °C constante por 10 minutos, un incremento de 7 °C min−1
hasta 280 °C constante por 10 minutos. La temperatura del inyector fue de 250 °C con un volumen
de inyección de 1.0 µL utilizando el sistema Split 100:1.
Los parámetros del detector fueron los siguientes: Modo SIM.

- Grupo 1 desde 0 a 11.7 minutos las siguientes masas: 103, 117, 131 y 145.
- Grupo 2 desde 11.7 a 11.8 la masa 131.
- Grupo 3 desde 11.8 minutos en adelante, las siguientes masas: 103, 117, 131, 145,
204, 217, 328 y 361.
6.3.5 Preparación de estándares y muestras
6.3.5.1 Sistema HPLC-UV

Preparación de la curvas de calibrado para HPLC-UV
Las soluciones estándar de ácidos orgánicos se prepararon en concentraciones entre 1.0–150 mg L-1
y fueron guardadas a una temperatura de 4 °C. Cada punto de la curva de calibración fue preparado
por triplicado e inyectado 3 veces.
Tratamiento de muestra de bio-oil y sus fracciones para análisis por HPLC-UV

En el Capítulo 2 describen las fracciones en las cuales es posible extraer los ácidos orgánicos desde
la matriz del bio-oil. No todas las fracciones son compatibles con la metodología descrita, para lo
cual fue necesario un tratamiento previo de la muestra. Las principales fracciones que se evaluaron
son las siguientes: acuosas, destilados de bio-oil y orgánicas. A continuación se detallan los
procedimientos a seguir, dependiendo del tipo de muestras.
a) Destilados de bio-oil: Estas muestras corresponden a bio-oil previamente evaporado con

rotavapor. El bio-oil se sometió a una destilación fraccionada a presión atmosférica y a
destilación en vacío. Es necesario tener presente que los destilados de bio-oil no contienen
lignina pirolítica ni tampoco compuestos de alto peso molecular, por lo cual se postula que
la metodología implementada no requiere de tratamiento previo de la muestra.
b) Fracciones orgánicas de bio-oil: Tienen la desventaja de estar en solventes que son

inmiscibles con la fase móvil empleada, además de dañar la columna cromatográfica. Para
estas fracciones se propusieron 2 posibles procedimientos: (1) extracción líquido-líquido
con agua a pH 7, de esta forma los ácidos de mayor interés pueden ser extraídos en su
forma aniónica (2) evaporación con N2 a temperatura ambiente, para la eliminación del
solvente. En ambos casos, la muestra puede ser reconstituida en fase móvil. El principal
inconveniente de realizar la extracción es la recuperación de los ácidos desde la fracción
orgánica.
c) Bio-oil crudo: Como se ha mencionado en el Capitulo 1, el bio-oil contiene un alto número

de compuestos orgánicos que pueden interferir en la determinación de los ácidos orgánicos
lo que obstaculiza su análisis por inyección directa. Como tratamiento se evaluaron 2

Capítulo 6
procedimientos: (1) Eliminación de lignina pirolítica del bio-oil mediante la adición de agua
y posterior centrifugación y (2) SPE usando columnas de intercambio aniónico (SAX). Este
último procedimiento se aplica en el caso en que la separación de lignina pirolítica no sea
suficiente en la eliminación de las interferencias.
6.3.4.2 Sistema GC/MS

Preparación de estándares y muestras de bio-oil para análisis por GC-MS
Todas las soluciones estándar de ácidos y azucares fueron preparados con metanol y fueron
almacenadas a -4 °C. El tratamiento de las muestras de bio-oil consistió en la dilución del bio-oil en
metanol, y la realización de diluciones con el mismo solvente en los casos necesarios.
Derivatización de muestras con BSTFA

Para la reacción de derivatización se agrega una alícuota adecuada de bio-oil, conteniendo 100 mg
L-1 de cada patrón interno (ácido isobutírico y 2,5-anhidro-D-manitol). Esta solución se evapora a
sequedad con N2, a temperatura ambiente. Inmediatamente se reconstituye con 140 µL de piridina y
60 µL de BSTFA. La reacción tiene lugar a 60 °C por 50 minutos.
Optimización de la reacción de derivatización

Para realizar la optimización de los parámetros de la reacción, se realizó una evaluación para
determinar los factores con mayor significancia en la derivatización. Los factores estudiados fueron
el tiempo de reacción, la temperatura de reacción y la concentración de BSTFA, esto último debido
a que, si bien en las reacciones de derivatización el reactivo debe estar en exceso, de tal forma de no
ser el reactivo limitante en la reacción, el exceso de reactivo puede provocar problemas de
resolución cromatográfica de los ácidos orgánicos presentes en el bio-oil, en especial a los de bajo
peso molecular.
Posteriormente y luego de evaluar la significancia mediante un test ANOVA, se realizó un diseño

experimental con las variables con efecto significativo sobre la derivatización, optimizando la
respuesta y validando los resultados mediante un test de ANOVA.
6.4 Resultados y Discusiones

En este apartado se describe en primer lugar la determinación de ácidos orgánicos en bio-oil y
diferentes fracciones por HPLC-UV, empleando diferentes tratamientos de muestras.
Posteriormente se describe la determinación simultánea de ácidos orgánicos y azúcares en bio-oil
por GC/MS previa derivatización con BSTFA.
6.4.1 Determinación de ácidos orgánicos en bio-oil y sus fracciones mediante HPLC-UV

Como se mencionó con anterioridad, la determinación de ácidos orgánicos en bio-oil se realizó
adaptando una metodología para análisis de ácidos orgánicos en vino 11. Considerando la alta
complejidad del bio-oil, es inminente el uso de tratamientos de muestras previos al análisis.

Capítulo 6
En la separación cromatográfica de los ácidos orgánicos se emplearon 2 columnas cromatográficas:

una columna de fase inversa, que efectúa la función de pre-columna y que retiene a los compuestos
de menor polaridad, dejando eluir a los ácidos orgánicos, los cuales se encuentran al pH del análisis
a la forma ácida (pH ~ 3.0). La segunda columna, de exclusión iónica, permite la separación de
ácidos basados en el mecanismo de exclusión de Donnan, donde compuestos de la misma carga son
repelidos y eluídos en el volumen intersticial. Los compuestos no iónicos o débilmente iónicos
pueden penetrar la estructura de la resina, por lo que la separación de los compuestos se realiza por
la exclusión estérica y los efectos de partición. La separación de los ácidos orgánicos depende de la
disociación del ácido y de la interacción con la fase estacionaria.
Primeramente, se realizó la evaluación de la separación cromatográfica y los parámetros analíticos

de una solución estándar de los 3 principales ácidos orgánicos: ácido fórmico, ácido acético y ácido
propiónico. En la Figura 6.1, se muestra una cromatograma de la mezcla de patrones de los ácidos
de interés en una concentración de 30 mg L-1 cada uno.
Figura 6.1 Cromatograma HPLC-UV de la mezcla de estándares de ácido fórmico (1), ácido
acético (2) y ácido propiónico (3) en concentración de 30 mg L-1 cada uno.
La separación de la solución estándar de la mezcla de ácidos presenta una resolución adecuada

(R>2) y un tiempo de análisis de 30 min. Se evaluaron los principales parámetros analíticos de esta
metodología, con las soluciones estándar de cada ácido, realizando las curvas de calibración
correspondientes y la determinación de los límites de detección de cada ácido. En la Tabla 6.1 se
exponen los parámetros analíticos instrumentales obtenidos para las respectivas curvas de
calibración.

Capítulo 6
Tabla 6.1 Parámetros analíticos instrumentales obtenidos de la curva de calibración, para los
principales ácidos orgánicos presentes en el bio-oil.
Parámetros analíticos Ácido fórmico Ácido acético Ácido propiónico

Rango lineal mg L-1 LCb-150 LC-150 LC-150
Ecuación de la recta y=0.547x -2.309 y=0.302x-1.345 y=0.294x-2.011
R 0.9998 0.9999 0.9997
Observaciones 19 19 19
a -1
Límite de detección (mg L ) 4.1 6.2 6.5
-1
Límite de cuantificación (mg L ) 13.6 20.6 21.6
a
Límite de detección obtenido por el Sy/x de los 4 primeros puntos de la curva de calibrado.
b
LC: límite de cuantificación.
Considerando que los ácidos orgánicos a determinar se encuentran en un alto porcentaje en el bio-
oil, el rango lineal y los límites de detección obtenidos, principalmente para el ácido fórmico y
acético, son satisfactorios, desde el punto de vista instrumental, para evaluar la aplicación de esta
metodología a muestras crudas y fracciones de bio-oil, aspecto que se discute a continuación..
6.4.1.1 Determinación de ácidos orgánicos en destilados de bio-oil
En el análisis de destilados de bio-oil se utilizó la inyección directa de las muestras, previa dilución
con fase móvil (H2SO4 0.005 mol L-1), no siendo necesario ningún otro tipo de tratamiento. En la
Figura 6.2, se presenta un cromatograma de una muestra de destilado de bio-oil.
En el cromatograma no tan solo se observan las señales correspondientes a los ácidos orgánicos,
sino que además es posible visualizar otras señales cromatográficas que no afectan la resolución del
ácido fórmico y ácido acético (R>2). Sin embargo la señal correspondiente al ácido propiónico,
muestra una señal pequeña que puede ser debido a una coelución de este con otra especie.
Figura 6.2 Cromatograma HPLC-UV de una muestra de destilado de bio-oil. Señales: (1) ácido
fórmico; (2) ácido acético; (3) ácido propiónico.
Para resolver el problema con el ácido propiónico se evaluaron diferentes concentraciones de H2SO4
en la fase móvil, y diferentes temperaturas de la columna de exclusión iónica. Sin embargo los

Capítulo 6
mejores resultados, que no involucraron una pérdida de resolución de los ácidos fórmico y acético,
fueron obtenidos con la metodología propuesta inicialmente. Esto implicó que no fue posible
obtener una mejor separación entre ácido propiónico y su interferente sin afectar a los otros ácidos
presentes.
Dado que no se dispone de un material de referencia de bio-oil, tanto la repetibilidad como la

recuperación del método fueron evaluados con un destilado de bio-oil. Para evaluar repetibilidad,
tres muestras de destilados al vacío de bio-oil fueron inyectadas por triplicado. Para evaluar el error
sistemático, se adicionaron 10 y 20 mg L-1 de una mezcla estándar que contenía los tres ácidos a una
muestra de destilado al vació de bio-oil. En la Tabla 6.2 se resumen los resultados obtenidos.
Tabla 6.2 Repetibilidad y error en la determinación de ácidos orgánicos en fracciones de destilado

al vacío de bio-oil mediante HPLC-UV.
Ac. fórmico Ac. acético Ac. propiónico

Repetibilidad (RSD) 9.5 7.1 9.1
Error (%) -9.7 -6.3 -8.9
Si bien los resultados obtenidos son satisfactorios, es necesario confirmar la identidad de estos
ácidos por un sistema más selectivo como GC/MS, ya que dependiendo de las condiciones bajo las
cuales se obtienen las fracciones de destilados de bio-oil, se podrían observar otros compuestos
interferentes en el cromatograma. Esto debido principalmente a la alta concentración de compuestos
volátiles que presenta el bio-oil.
Con el objeto de confirmar estos resultados, se determinó la concentración de ácidos orgánicos por
el método químico TAN el cual, tal como se describe en la sección 1.7.2, permite estimar la
concentración de ácidos orgánicos mediante su titulación ácido/base. En la Tabla 6.3 se muestra una
comparación de los resultados obtenidos por HPLC-UV y la determinación de ácidos TAN. Para la
comparación fue necesario realizar la suma de los ácidos orgánicos determinados por HPLC-UV, y
expresarlos como mg de KOH por gramos de muestra.
Tabla 6.3 Concentración de ácidos orgánicos en destilados de bio-oil. Comparación de los métodos
TAN y HPLC-UV.
Total de ácidos orgánicos
Muestras TAN (método químico)
determinados por HPLC
M2 47.0 40.9
M3 59.3 48.6
M4 86.0 74.3
M5 141.1 112.0
M6 48.4 41.1
Valores expresados como mg de KOH por gramos de muestra de bio-oil.
Se observa que los resultados no son estadísticamente iguales (95 % de confianza). Se encuentra
mayor concentración de ácidos con el método propuesto (HPLC-UV) que con el método químico

Capítulo 6
(TAN). Considerando que por este último método la concentración de ácidos es determinada
mediante la acidez total del bio-oil, lo cual no solo incluye los ácidos estudiados, sino que también
otros grupos de ácidos, como grupos fenólicos, los cuales también pueden ser neutralizados con
KOH. Se esperaría que los valores fueran mayores por el método químico que por HPLC-UV, ya
que este último sólo considera los tres principales ácidos.
Con los resultados obtenidos mediante HPLC-UV, se realizó un balance de masa después de
realizado en proceso de destilación a vacío del bio-oil, obteniéndose 140 % quedando de manifiesto
que la señal del ácido propiónico debe estar coeluyendo con algún otro compuesto del bio-oil,
produciendo la sobreestimación de su concentración.
Considerando que para obtener mejor resolución de este ácido se evaluaron otras condiciones de
separación las que no fueron satisfactorias, se plantea como alternativa para confirmar su coleución
con otra especie, la utilización de un detector de fila de diodos, donde sea posible evaluar la pureza
de la señal a diferentes longitudes de onda y verificar de esta forma la presencia de algún
interferente, considerando que también en las fracciones de destilados de bio-oil, se esperan
encontrar no tan solo ácidos orgánicos, sino que también otros compuestos de bajo peso molecular.
6.4.1.2 Determinación de ácidos orgánicos en fracciones orgánicas
La determinación de estas fracciones, se realizó bajo las mismas condiciones cromatográficas
expuestas en el ítem 6.3.4. Las fracciones orgánicas analizadas corresponden a la extracción de
ácidos orgánicos con metil ter-butiléter (MTBE).
Para la primera evaluación del tratamiento de la muestra a seguir, se realizó la evaporación de una
alícuota de la muestra con N2 a temperatura ambiente. La reconstitución se realizó con fase móvil
(H2SO4 0.005 mol L-1). En la solución final se observó la presencia de un precipitado junto con una
película adherida a las paredes del material. El precipitado formado fue eliminado en el proceso de
filtración de la solución previo a la inyección en el sistema HPLC-UV. Este precipitado podría
corresponder a lignina pirolítica, la cual debería solubilizarse en MTBE. En la Figura 6.3 se muestra
el cromatograma obtenido mediante este proceso.

Capítulo 6
Figura 6.3 Cromatograma HPLC-UV del extracto orgánico (MTBE) de bio-oil pre-tratado por
evaporación y reconstitución con fase móvil (H2SO4 0.005 mol L-1). Señales: (1) ácido fórmico; (2)
ácido acético; (3) ácido propiónico.
8 16 32
W I: W I: W I:
mVolts
15
3
10
5
1
X:
Y:
-2
5 10 15 20 25 30
Minutes
Las señales cromatográficas observadas son poco eficientes y están poco resueltas. Para los ácidos
fórmico y acético no superan el valor de 1.4. Además, la señal correspondiente al ácido fórmico
presenta una deformación que puede ser explicada por una posible coelución con otra especie. La
resolución para ácido propiónico es inferior a 0.8 respecto a la señal cromatográfica que le
antecede. Con estos antecedentes se concluye que el tratamiento de muestra propuesto, el cual
consiste en la volatilización del solvente orgánico y posterior reconstitución en fase móvil no es
adecuado para cuantificar los ácidos orgánicos en esta fracción orgánica, ya que en la etapa de
solubilización, un alto porcentaje de compuestos indeseados pueden ser solubilizados e ingresar al
sistema cromatográfico.
Otra opción para la extracción de los ácidos orgánicos desde esta fracción es realizar una extracción
líquido-líquido con agua desionizada, de tal forma de dejar la mayor cantidad de interferentes en la
fase orgánica, y los ácidos orgánicos en la fase acuosa.
La extracción de ácidos desde la fracción orgánica se realizó directamente con agua desionizada
usando diferentes razones entre agua y MTBE: 0.5/1; 1/1; 2/1; 3/1; 4/1; 5/1 v/v. Los mejores
resultados se obtuvieron usando una relación de 3/1 de agua/fase orgánica, observándose un pH
entre 2.8-3.2 de la fracción acuosa. También se evaluó la recuperación de tres extracciones
sucesivas usando la proporción óptima. Los resultados mostraron que tanto en la segunda como en
la tercera extracción no se encontraron niveles detectables de los ácidos de interés. Por ello se optó
por realizar sólo una extracción líquido-líquido.
Si bien la adición de una mayor cantidad de agua aumentará la dilución de la muestra, esto no es un
inconveniente debido a que las muestras de bio-oil presentan altos niveles de ácidos orgánicos. En
la Figura 6.4 se presenta un cromatograma del extracto acuoso obtenido con una extracción liquido-
liquido 3/1 de agua/fracción MTBE. Es posible visualizar que hay una mayor presencia de
compuestos que presentan absorción a esa longitud de onda, más que en las fracciones de destilado
de bio-oil. Esto se atribuye a la mayor solubilización de compuestos de mayor peso molecular, junto
con la solubilización de una fracción menor de lignina pirolítica.

Capítulo 6
Figura 6.4 Cromatograma HPLC/UV del extracto acuoso de una muestra de extracto orgánico
(MTBE) de bio-oil. Señales: (1) ácido fórmico; (2) ácido acético; (3) ácido propiónico.
2
1 3
Si bien el cromatograma presenta un mayor número de señales cromatográficas, la resolución

obtenida para los ácidos de interés es mayor a 1.7, y no se observa una deformación de la señal de
ácido fórmico en comparación con el cromatograma obtenido por la evaporación y posterior
reconstitución de la muestra (ver Figura 6.3). Esto estaría demostrando que la mayor cantidad de
interferentes quedaron disueltos en la fase orgánica (MTBE). De acuerdo a ello, se determinaron
algunas características analíticas, las cuales son presentadas en la Tabla 6.4. La repetibilidad se
determinó por medio de tres extracciones, inyectando cada una por triplicado (n=9). Para la
recuperación se adicionaron 2 niveles de concentración de una mezcla de ácidos orgánicos de 10,
20 y 30 mg L-1 en tres diferentes muestras (fracciones de MTBE), obteniendo su valor promedio.
Tabla 6.4 Repetibilidad y recuperación de ácidos orgánicos desde fracciones orgánicas (MTBE) del
bio-oil. (n=9)
Ac. fórmico Ac. acético Ac. propiónico

Repetibilidad (RSD) 12.1 13.6 17.2
Recuperación (%) 82.5 88.7 81.1
Si bien la repetibilidad presenta valores superiores al 12 %, se debe considerar que se realizó con
diferentes muestras, y además la extracción liquido-liquido es un método que puede presentar
problemas de reproducibilidad por los diferentes equilibrios químicos que se presentan en cada
extracción. La recuperación presenta un nivel promedio de un 84 %. Este valor puede ser
incrementado agregando una sal a la solución acuosa con la cual se realiza la extracción, para
extraer los ácidos orgánicos en forma iónica y así aumentar su solubilidad en el agua. Sin embargo
el principal inconveniente de esta opción es la incompatibilidad que presenta el uso de una sal con
la columna de exclusión iónica, impidiendo la aplicación por este método.
No obstante, en las fracciones analizadas por el método químico TAN, la concentración de ácido
propiónico sigue manteniendo porcentajes de recuperación sobre el 100 %. Esto puede corresponder
a la coelución de esta especie con un posible interferente. La baja selectividad que presenta esta
metodología puede provocar un error en la determinación de los compuestos del bio-oil, lo cual

Capítulo 6
afectará directamente en las decisiones adoptadas para el proceso de fraccionamiento del bio-oil a
nivel industrial, impidiendo así su uso como una fuente productos químicos.
6.4.1.3. Determinación de ácidos orgánicos en bio-oil crudo
Tanto las muestras de fracciones orgánicas de bio-oil como los destilados de bio-oil presentaron
inconvenientes para la determinación de sus ácidos orgánicos usando HPLC-UV. En todos los casos
se observan errores por exceso en la cuantificación. Es esperable que las muestras de bio-oil crudo
presenten una mayor cantidad de interferentes, los cuales se podrían visualizar en los
cromatogramas por HPLC-UV. Por ello se optó por realizar un tratamiento de muestra más
selectivo, empleando una extracción en fase sólida con columnas de intercambio aniónico.
El primer procedimiento realizado fue la evaluación en la remoción de la lignina pirolítica mediante

la adición de agua al bio-oil y una posterior centrifugación. Se evaluaron diferentes razones de bio-
oil/agua 1/10; 1/50; 1/100 v/v. La fase acuosa obtenida después de la centrifugación fue filtrada e
inyectada directamente en el sistema HPLC-UV (pH ~ 2.8). La fase orgánica que se formó,
consistió en un líquido muy viscoso que en gran parte de los ensayos quedó adherido a las paredes
del material. La homogenización del bio-oil fue laboriosa porque se encontraba separado en dos
fases. Los primeros ensayos se realizaron con un bio-oil de más de 2 años. Este tiempo de
antigüedad permitió que el bio-oil fuera más viscoso presentando una separación de fases.
En la Figura 6.5 se muestra un cromatograma de la fase acuosa (bio-oil/agua 1/50 v/v). El

cromatograma presenta una muy baja selectividad para determinar ácidos orgánicos. Las fracciones
realizadas con la razón 1/100, presenta de igual forma las interferencias, y las posibles señales de
los ácidos orgánicos son bajas, al presentar una mayor dilución de la muestra.
Figura 6.5 Cromatograma HPLC-UV del extracto acuoso de bio-oil. Señales: (1) ácido fórmico; (2)
ácido acético; (3) ácido propiónico.
mVolts
20
2
1
15
10
3 ¿?
1
5 10 15 20 25
Se debe considerar que en la fracción acuosa de bio-oil es posible encontrar un alto número de
compuestos. Esto se ve reflejado en el cromatograma por GC/MS de la Figura 4.7 del capítulo 4. Si
bien se logra la precipitación de la lignina pirolítica, una cantidad importante se solubiliza en la fase
acuosa, encontrándose no tan sólo azúcares, aldehídos y ácidos orgánicos, sino que también
compuestos fenólicos que pueden afectar la separación cromatográfica.

Capítulo 6
Es necesario realizar un tratamiento del bio-oil más selectivo, removiendo los compuestos que
presentan una interferencia en la separación cromatográfica. Para ello se evaluó la extracción en
fase sólida usando cartuchos de intercambio aniónico SAX.
El fundamento principal de esta extracción es la retención de los ácidos orgánicos, en su forma

aniónica en el sorbente compuesto por aminas cuaternarias. Para lograr este objetivo, se debe ajustar
a pH básico la matriz de bio-oil. Posteriormente se debe realizar la elución de estos compuestos ya
retenidos en los cartuchos SAX con una solución a pH neutro o ácido, para su posterior inyección
en el sistema HPLC-UV.
Tanto el acondicionamiento (3 mL de metanol y 3 mL de agua desionizada) de los cartuchos para la

activación de la resina, como el lavado (3 mL de agua desionizada) fueron realizados por
recomendación del fabricante de los cartuchos SAX. Sin embargo hay una diferencia entre las
constante de distribución de los ácido de interés (3.7 para el ácido fórmico, 4.8 para el ácido acético
y 4.9 para el ácido propiónico), lo que hace difícil adecuar el pH para lavar la muestra sin producir
una pérdida en la recuperación. Esto fue demostrado analizando los lavados realizados, donde
señales importantes correspondientes a ácido fórmico, ácido acético y ácido propiónico fueron
detectadas.
Por lo tanto las condiciones que deben ser evaluadas corresponden a la extracción de ácidos
orgánicos desde la matriz de bio-oil, la solución de lavado de la muestra en la extracción en fase
sólida y la solución empleada en la elución de los ácidos orgánicos desde los cartuchos SAX. Todas
las condiciones se evaluaron por separados, esto a raíz de que se analizaron conjuntamente los
residuos obtenidos en cada etapa de la SPE.
Método de extracción de ácidos orgánicos desde bio-oil crudo

En primer lugar se extrajeron los ácidos orgánicos desde bio-oil con una solución de NaOH 0.3 N,
durante 30 minutos con agitación constante y a temperatura ambiente. Posteriormente se filtró la
solución acuosa para eliminar la lignina pirolítica precipitada. A continuación se procedió con la
SPE. Los mayores rendimientos de ácidos orgánicos después de la SPE se obtuvieron con el
siguiente procedimiento:
- Acondicionamiento de la columna SAX con 3 mL de metanol y 3 mL de agua desionizada
- Carga de 5 mL de extracto acuoso del bio-oil a pH 10.
- Solución de lavado básica (3 mL de solución de NaOH 0.05 N y 1.5 mL de agua
desionizada) para eliminar el exceso de la solución básica
- Elución con 2 mL de fase móvil H2SO4 0.005 M.
Posteriormente a la optimización de la SPE, se realizó la optimización de la extracción de los ácidos

orgánicos desde la matriz de bio-oil. Para ello se evaluaron diferentes concentraciones de NaOH y
tiempos de extracción. Los valores óptimos encontrados fueron:
- Extracción con solución acuosa de NaOH 0.9 N
- Tiempo de extracción de 45 minutos a temperatura ambiente, en agitación constante.
5 mL del extracto acuoso de bio-oil (previamente filtrado) realizado de acuerdo a lo descrito, se
extrajeron en cartuchos SAX de acuerdo al método de SPE optimizado para finalmente inyectar el

Capítulo 6
extracto en el HPLC-UV. En la Figura 6.6 se muestra el cromatograma de la extracción de ácidos

desde una muestra de bio-oil crudo.
Figura 6.6 Cromatograma HPLC-UV del extracto en fase sólida de una muestra de bio-oil crudo.
Señales 1, 2 y 3 corresponden respectivamente a los ácidos fórmico, acético y propiónico
respectivamente.
El cromatograma presenta una adecuada separación cromatográfica, con una resolución mayor a 2.
Además esta metodología presenta una mayor selectividad, al realizar primeramente una extracción
de los ácidos orgánicos desde el bio-oil y luego una SPE de intercambio aniónico. Sin embargo, el
principal inconveniente del uso de este método de extracción es la utilización de una alta
concentración de NaOH que puede causar reacciones indeseadas que pueden afectar la
cuantificación de los ácidos orgánicos. Por ello también fue evaluado el uso de NaHCO3 el cual no
presentó rendimientos satisfactorios. Considerando estos antecedentes, se evaluó la eficiencia de la
recuperación el método de extracción, tanto para patrones como para una muestra de bio-oil, para lo
cual se realizaron adiciones de ácidos orgánicos en ambas matrices (agua y bio-oil crudo),
sobrecargando ambos con iguales concentraciones. Los ácidos añadidos fueron ácido fórmico y
acético, los cuales se encuentran en un mayor porcentaje en el bio-oil. En la Tabla 6.5 se muestran
los resultados obtenidos.
Tabla 6.5 Porcentajes de recuperación del método de SPE en bio-oil crudo y en agua.
% Recuperación
Agua Bio-oil crudo
-1
mg L añadidos Ác. fórmico Ác. acético Ác. fórmico Ác. acético
3.0 98 94 73 71
7.0 99 100 70 66
12.0 103 95 65 64
Los porcentajes promedio de recuperación en la matriz de agua resultan satisfactorios con un valor
promedio de un 98 %, sin embargo en las muestra de bio-oil el porcentaje de recuperación
disminuye considerablemente a un 68 % como valor promedio. Esto se puede deber a problemas en
la extracción de ácidos desde el bio-oil crudo o a la capacidad de la resina en la sorción de los

Capítulo 6
ácidos en medio aniónico. Sin embargo, las concentraciones adicionadas están consideradas en la
capacidad de intercambio de la resina. Los porcentajes de recuperación son bajos para el bio-oil
crudo, lo cual podría explicarse por la adición de NaOH, la cual puede causar una reacción de
saponificación de los ésteres presentes en el bio-oil, produciendo los carboxilatos correspondientes
y metanol. Este último, en parte podría explicar la solubilidad que presenta parte del bio-oil con la
solución alcalina.
Los métodos propuestos en este trabajo no lograron la eliminación de las interferencias en la

determinación de ácidos orgánicos por HPLC-UV en la matriz de bio-oil, obteniendo baja
resolución y selectividad además de posibles reacciones químicas, impidiendo una cuantificación
confiable de los ácidos presentes en el bio-oil. Sin embargo, tanto para el ácido fórmico como para
el ácido acético es útil su aplicación a muestras de destilados de bio-oil y a las fracciones con
solventes orgánicos, a diferencia del ácido propiónico, el cual presentó inconvenientes en la
separación cromatográfica.
Queda de manifiesto la necesidad de emplear un sistema con una detección más selectiva y la
realización de tratamientos de la muestra de bio-oil con reactivos menos agresivos. Es importante
considerar que los resultados obtenidos por estas metodologías influyen directamente en el posible
uso del bio-oil como fuente de obtención de productos químicos. Para lograr este objetivo se
desarrolló una metodología por GC/MS, previa derivatización de sililación, la cual presenta la
ventaja de ser más selectiva y tener una mayor versatilidad ya que es posible aplicar tanto a la
determinación de ácidos orgánicos y azúcares de forma simultánea. A continuación se detalla el
método desarrollado.
6.4.2 Determinación simultánea de ácidos orgánicos y azúcares por GC/MS previa
derivatización con BSTFA
Las reacciones de derivatización tienen como objetivo la modificación química de la molécula de
los analitos, principalmente con tres propósitos. Mejorar la volatilidad, aumentar la detectabilidad y
mejorar a su vez la selectividad del método.
La derivatización formando Trimetilsilil derivados (TMS), es ampliamente utilizada, ya que los

reactivos de sililación reaccionan con una gran variedad de grupos funcionales que poseen un
protón-activo, como los grupos hidroxilos12, 13. De los reactivos empleados para la derivatización el
que presenta una mayor reactividad es el N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA),
utilizando como catalizador/solvente piridina, dimetilformamida, tetrahidrofurano, entre otros 12,13.
Además se encuentra ampliamente descrito el uso de mezclas de reactivos silalizantes, los cuales
para ciertos análisis puede mejorar la reacción12, 13.
La derivatización de ácidos orgánicos con BSTFA se encuentra ampliamente descrita en diferentes

tipos de muestra. Asimismo la derivatización de azúcares en especial para levoglucosano con N–
trimethylsilylimidazol (TMSI) 14,18. Ambos reactivos proponen una reacción de sililación, en el caso
de los ácidos orgánicos ayuda a disminuir polaridad y en los azúcares a aumentar su volatilidad.

Capítulo 6
En el presente trabajo se evalúa la derivatización simultánea de ácidos orgánicos y azúcares en

muestras de bio-oil. Sin embargo, considerando la inestabilidad de esta matriz en presencia de
diferentes reactivos, se debe emplear una reacción sencilla, en el cual el solvente empleado pueda
cumplir su función de disolver completamente la matriz de bio-oil. La evaluación de diferentes
reacciones de derivatización para la determinación de estos grupos de compuestos en bio-oil se
hace necesaria dado que como ya se ha discutido, es una matriz de alta complejidad y que podría
presentar importantes interferencias analíticas.
En el caso de matrices ambientales, se ha descrito la derivatización de ácidos orgánicos y azúcares,

empleando BSTFA como reactivo derivatizante 16. Además para estas matrices la misma reacción
ha sido usada para la determinación de azúcares empleando otros reactivos como el TMSI15.
De acuerdo a lo expuesto se evaluó el uso de los reactivos derivatizantes TMSI y BSTFA con el
objeto de determinar simultáneamente ácidos orgánicos y diferentes azúcares.
Elección reactivo derivatizante
El principal objetivo al elegir el reactivo derivatizante para esta metodología es que permita
derivatizar tanto ácidos orgánicos como azúcares, priorizando aquellos analitos que se encuentran
en mayor porcentaje en el bio-oil, es decir, principalmente ácido fórmico, ácido acético, ácido
propiónico, levoglucosano y celobiosano. Es importante señalar este último sólo ha sido
cuantificado por la metodología desarrollada por HPTLC, descrita en el capítulo 5.
Por otra parte, los reactivos silanizantes no presentan selectividad de grupos químicos, por lo que
tanto alcoholes, ácidos orgánicos, fenoles, azúcares y otros compuestos pueden ser silanizados.
Considerando que el bio-oil contiene todos estos grupos de compuestos, es necesario realizar la
detección en modo SIM, de tal forma de que la detección sea más selectiva. Para ello cada
compuesto por separado fue analizado en modo SCAN, posteriormente se eligió la razón m/z de
mayor abundancia para cada uno de ellos.
Se realizaron ensayos preliminares para la evaluación de ambos reactivos derivatizantes (TMSI y

BSTFA) bajo las condiciones experimentales especificadas por los fabricantes de cada reactivo. Los
ácidos orgánicos (fórmico y acético) lograron ser derivatizados con ambos reactivos. El
levoglucosano fue derivatizado tanto por TMSI y BSTFA, sin embargo el celobiosano sólo
reaccionó con BSTFA. El celobiosano es un disacárido, por lo tanto su derivatización se debe
realizar en condiciones de reacción más extremas que las evaluadas o emplear un reactivo
silanizante de mayor reactividad. Esto explicaría que sólo reaccionó con BSTFA. Si bien es posible
evaluar las condiciones de reacción con TMSI y hacerlas favorables para que reaccione con este
azúcar, condiciones de reacción extremas pueden afectar la estabilidad del bio-oil causando
equilibrios químicos que pueden afectar la cuantificación de las especies de interés. Por ello en
definitiva se eligió el BSTFA como reactivo derivatizante.

Capítulo 6
Selección de variables experimentales y optimización mediante diseño experimental en la

silanización simultanea de ácidos orgánicos y azúcares en muestras de bio-oil con BSTFA
La optimización de la derivatización se llevó a cabo por medio de un diseño experimental. El

procedimiento evaluado consistió en la solubilización de la muestra de bio-oil con metanol, y
evaporación del solvente con N2 a temperatura ambiente, para su reconstitución con piridina como
solvente y catalizador, añadiendo además el reactivo BSTFA. Se seleccionó como patrones internos
el ácido isobutírico y el 2,5-anhidro-D-manitol para la determinación de ácidos orgánicos y
azúcares, respectivamente.
En una primera etapa se evaluó la significancia estadística de las siguientes variables: temperatura,
tiempo de reacción y concentración de BSTFA. Para la evaluación se realizó un diseño factorial
ortogonal, de 12 análisis y 4 puntos centrales. Este diseño fue elegido para el screening
principalmente por presentar una evaluación rápida y sencilla a diferentes niveles de cada variable.
La respuesta para este diseño estuvo dada por la abundancia de las masas. Para encontrar las
variables significativas se realizó un test de ANOVA, validando a un nivel de confianza del 95 %,
con un valor-p < 0.05.
Para los ácidos orgánicos las tres variables estudiadas resultaron significativas, mientras que para
los azúcares sólo el tiempo y la temperatura de reacción fueron variables significativas. La
explicación a este resultado puede ser que los ácidos orgánicos, en especial los de bajo peso
molecular, reaccionan en forma instantánea con el BSTFA, por lo que mayores excesos de reactivo
silanizante permiten mayor probabilidad de reacción. Considerando estos antecedentes y además el
número de compuestos a determinar se optimizó el método para los ácidos fórmico y acético y los
azúcares levoglucosano y celobiosano.
Entre los diferentes diseños de superficie de respuesta posibles se eligió el diseño de Doehlert, dado
que ofrece una distribución uniforme de puntos en el espacio de respuesta experimental. Dicha
uniformidad en la distribución describe una figura romboidal (en el caso de dos variables se
produce un hexágono). Los rangos para las variables evaluadas en el caso de la determinación de
ácidos orgánicos fueron los siguientes: Temperatura (X1) de 40 a 80 °C, Tiempo (X2) de 30 a 160
minutos, concentración de BSTFA (X3) fue de 10 a 80 %v/v. Se realizaron un total de 15 análisis
con 3 puntos centrales.
Modelo matemático para el ácido fórmico:
y = 28594 (± 2670) + 12391 X1 (± 3404) + 3650 X2 (± 3404) + 17891 X3 (± 3404) + 9641 X3*X2 (±
3404)
El tiempo (X2) presentó alta variabilidad para este ácido. Esto puede corresponder a que el ácido
fórmico es la molécula más pequeña de los compuestos analizados, por lo tanto el posible
impedimento estérico que puede presentar al momento de la silanización es menor que los otros
ácidos, disminuyendo el tiempo de reacción, produciéndose de forma instantánea la derivatización

Capítulo 6
de este compuesto, más aún en presencia de temperatura y en exceso del reactivo derivatizante. Sin
embargo, y considerando este efecto, el diseño experimental fue optimizado y validado empleando
el test de ANOVA
En el caso del ácido acético, para el cual no se logró validar el modelo, se obtuvo un valor-p = 0.08
(95 % de confianza), y se visualizó que el tiempo de reacción fue la variable con mayor
significancia, seguida por la temperatura de reacción, lo cual es lógico considerando que la
molécula es mayor que la del ácido fórmico.
La evaluación de la concentración del BSTFA se realizó sólo porque un alto exceso de ésta genera
interferencia con la señal del ácido propiónico. Por lo tanto, es necesario buscar una concentración
que sea suficientemente alta para la derivatización, pero que no afecte la resolución del ácido
propiónico. Esta interferencia se observó al emplear una concentración superior a 70 % v/v. Este
parámetro fue de guía hacia la optimización de la reacción de los azúcares.
Para la optimización del diseño experimental de los azúcares, los rangos de temperaturas y tiempo
de reacción fueron mediante los mismos que se realizaron para los ácidos orgánicos. La
concentración de BSTFA se mantuvo constante a 40 % v/v (concentración en exceso que no
representa un interferencia en la determinación del ácido propiónico). Los modelos matemáticos
para ambos azúcares, se presentan a continuación.
Levoglucosano
y = 230677 (± 11074) + 27441 X1 (± 1356) + 61188 X2 (± 1356)
Celobiosano
y = 26935 (± 2847) + 6410 X1 (± 348) + 16951 X2 (± 348)
El modelo obtenido para ambos azúcares fue validado por el test ANOVA al 95 % de confianza
(Valor-p < 0.05). En ambos casos el efecto del tiempo (X2) fue significativo, sin embargo la
temperatura favoreció una reacción más corta, en especial para los azúcares. Por ello junto con
considerar las diferencias químicas entre ambos grupos de compuestos (ácidos orgánicos y
azúcares) y que las diferentes condiciones óptimas, se buscó un compromiso para la optimización
de la reacción, que fuera eficiente en conjunto tanto para ácidos como para azucares.
En la Tabla 6.6 se muestra un resumen de las variables óptimas para cada grupo de compuestos, y la
propuesta realizada para la determinación simultánea de ambos grupos.

Capítulo 6
Tabla 6.6 Variables optimas para cada grupo de compuestos, y la propuesta realizada para la
determinación simultanea.
Ácidos orgánicos Ácidos orgánicos +

Variables experimentales Azúcares
(ácido fórmico) azúcares
Tiempo de reacción (min) 30 50 50
Temperatura de reacción (°C) 40 80 60
Concentración de BSTFA (% v/v) 35 - 40
Un aumento de la temperatura afecta considerablemente la determinación de los ácidos orgánicos, a

diferencia de los azúcares, en que la disminución de los productos es mínima, observándose para
este caso mayor estabilidad a los cambios de temperatura. El tiempo es la variable cuyo efecto sobre
la reacción es mayor (ver modelos matemáticos, variable X2). Por ese motivo, se mantuvo constante
el tiempo de reacción de los azúcares y sólo se modificó la temperatura de reacción, disminuyendo
posibles inestabilidades de los ácidos orgánicos silanizados ya formados.
Determinación de parámetros analíticos y análisis de muestras de bio-oil
Usando las condiciones de derivatización óptimas, se evaluaron los parámetros analíticos para la
determinación de ácidos orgánicos y azúcares en muestras de bio-oil. En la Tabla 6.7, se muestra el
resumen de los parámetros analíticos para los ácidos orgánicos. En la Tabla 6.8 se muestran los
parámetros analíticos correspondientes a la determinación de azúcares y en la Figura 6.7 se muestra
un cromatograma de los ácidos orgánicos y azúcares determinados en una muestra de bio-oil.
Tabla 6.7 Principales parámetros analíticos obtenidos en la determinación de ácidos orgánicos en

muestras de bio-oil.
Ácido Ácido Ácido Ácido Ácido

Parámetros analíticos
fórmico acético propiónico láctico glicólico
Ecuación de la recta y=0.026x + y=0.0415x + y=0.0153x - y = 0.4029x- y = 0.070x +
instrumental 0.0926 0.0656 0.0383 0.9073 0.0442
R 0.9963 0.9879 0.9934 0.9889 0.9795
LDa (mg L-1) 10.5 3.4 25.1 13.3 6.5
-1 b
Rango lineal (mg L ) LC -200 LC-200 LC-150 LC-200 LC-200
% Recuperación
86±5 74±6 98±4 79±4 74±4
(muestras de bio-oil )
Precisión intermedia 11.1 6.9 5.4 11.8 6.2
a
Límite de detección (LD), calculado como 3*S y/x /m, donde Sy/x corresponde al error típico de la curva de
calibración, considerando los primeros 4 puntos y m corresponde a la pendiente.
b
LC: limite de cuantificación.
Los parámetros analíticos como límite de detección y rango lineal cumplen satisfactoriamente,
aunque los valores de los limites de detección pueden ser elevados considerando la detección

Capítulo 6
empleada, sin embargo, para este caso particular se priorizó la selectividad por sobre la sensibilidad
del método desarrollado, considerando que estos compuestos se encuentran en concentraciones
suficientemente altas para ser identificados y cuantificados.
Con respecto a los valores de R, estos muestran una disminución de la linealidad en el intervalo
estudiado en comparación con los resultados obtenidos por HPLC-UV. Sin embargo, la
cuantificación en general en un detector selectivo de masas presenta mayor dificultad por tener una
alta sensibilidad a pequeñas variaciones, por lo que se confirma el uso de un estándar interno. El
ácido isobutírico se emplea como estándar interno principalmente para las variaciones que afecten
la reacción de derivatización, para obtener una mejor linealidad de las curvas de calibrado. Es
posible emplear un segundo estándar interno que permita la corrección de las fluctuaciones propias
del sistema empleado, no obstante los valores proporcionados fueron considerados satisfactorios, al
ser una metodología en la cual se realiza previamente una derivatización de dos diferentes grupos
químicos.
La precisión se obtuvo realizando 3 niveles de adiciones de la mezcla de los ácidos orgánicos

estudiados (total de muestras n = 9), las concentraciones adicionadas fueron 10, 20 y 30 mg L-1 de
cada ácido. Ácido fórmico y propiónico presentan los mayores porcentajes de recuperación de los
ácidos estudiados. La disminución de los porcentajes puede corresponder a la disminución del
exceso del reactivo derivatizante, lo que causó una disminución de la recuperación.
La precisión fue evaluada considerando un mismo bio-oil, realizando 3 diferentes derivatizaciones e

inyectando cada una por duplicado (n=6), logrando desarrollar un método con una alta precisión.
Tabla 6.8 Principales parámetros analíticos obtenidos en la determinación de azúcares en muestras

de bio-oil.
Parámetros analíticos Arabinosa Xilosa Levoglucosano Celobiosano
Ecuación de la recta y=0.0045x - y=0.0079x - y=0.0127x - y = 0.0161x -

instrumental 0.0074 0.0253 0.0709 0.0302
R 0.9966 0.9855 0.9977 0.9899
a -1
LD (mg L ) 3.6 3.8 2.16 15.2
Rango lineal (mg L-1) LCb-80 LC-80 LC-200 LC-200
% Recuperación
100±2 99±3 103±3 101±4
(muestras de bio-oil)
Precisión intermedia 2.5 1.9 1.6 8.4
a
Límite de detección (LD), calculado como 3*S y/x /m, donde Sy/x corresponde al error típico de la curva de
calibración, considerando los primeros 4 puntos y m corresponde a la pendiente.
b
LC: limite de cuantificación.

Capítulo 6
A diferencia de los ácidos orgánicos, lo azúcares presentan parámetros analíticos más favorables,
tanto en linealidad del rango de concentración estudiado, en recuperación y en precisión intermedia.
La obtención de estos resultados puede ser explicada por la estabilidad que presentan los azúcares al
formar los derivados silanizados.
En la Figura 6.7 se muestra el cromatograma en modo SIM, obtenido de una muestra de bio-oil.
Para todos los compuestos estudiados la resolución fue mayor a 2. A los 15 minutos se puede
observar la señal correspondiente al reactivo BSTFA, el cual, como se mencionó con anterioridad
en un exceso sobre un 70 % v/v puede afectar la resolución de las señales correspondiente tanto al
estándar interno y el ácido propiónico. También se puede observar que al emplear la detección en
sistema SIM, se favorece la selectividad, ya que la formación de derivados silanizados no es
selectiva a ácidos o azúcares, si no que a una amplia gama de grupos funcionales.

Figura 6.7 Cromatograma de la determinación de ácidos orgánicos y azúcares en bio-oil. Señales:
(1) ácido fórmico-TMS: (2) ácido acético-TMS; (3) ácido propiónico-TMS; (4) ácido isobutírico-
TMS (estándar interno 100 mg L-1); (5) ácido glicólico-TMS y (6) ácido láctico-TMS; (7) 2,5-
anhidro-D-manitol-TMS (estándar interno 100 mg L-1); (8) levoglucosano-TMS; (9) celobiosano-
TMS.
9
8
7
5
4
3
2
1
Capítulo 6
Si bien la metodología desarrollada fue optimizada para ácido fórmico, ésta presenta características
aceptables para los otros ácidos orgánicos presentes en bio-oil. La principal desventaja es el tiempo
de extracción (50 minutos) más el tiempo en la separación cromatográfica (72 minutos),
disminuyendo el número de muestras que puedan ser analizadas por unidad de tiempo. Sin
embargo, el desarrollo de una metodología con una alta selectividad y la opción de determinar 2
familias de compuestos de forma simultánea, implica un gran avance respecto a las metodologías
que actualmente se aplican para el análisis de bio-oil. En este sentido, en la Tabla 6.9 se presentan
los resultados obtenidos para 3 muestras de bio-oil, aplicando la metodología que actualmente se
utilizada para análisis de bio-oil, es decir inyección directa en un sistema GC/MS y la metodología
desarrollada en este trabajo.
Tabla 6.9 Comparación de resultados obtenidos en el análisis de bio-oil, para ácidos orgánicos y
azucares, ambos por GC/MS.
Compuestos Bio-oil L Bio-oil Q Bio-oil R

Ácido acético (% p/p)
Método derivatización con BSTFA 2.5 2.6 2.9
Método por inyección directa 1.7 2.4 3.2
Ácido propiónico (% p/p)
Método por inyección directa 0.1 0.1 ND
Levoglucosano (% p/p)
Método por inyección directa 1.8 2.3 1.2
*No detectado.
Los resultados obtenidos se evaluaron estadísticamente mediante un test t, en el cual la hipótesis

nula considera que no hay diferencia significativa entre los resultados obtenidos por ambos
métodos. Sin embargo la comparación se realizó sólo para el ácido acético y levoglucosano, ya que
son los dos compuestos que se han detectado y cuantificado en los tres bio-oil por ambas
metodologías. Previamente se verificó la igualdad de varianzas. El valor-p para ambos compuestos
fue superior a 0.05. El resultado demuestra que no hay diferencia significativa (a un nivel de
confianza del 95 %) entre los resultados obtenidos por ambas metodologías.
De igual forma, se realizó el contraste t para los azúcares levoglucosano y celobiosano

determinados por HPTLC y GC/MS previa derivatización. En la Tabla 6.10 se muestra la
comparación del análisis de diferentes bio-oil. Al igual que en la comparación anterior, se verificó
la igualdad de varianzas mediante el contraste F.

Capítulo 6
Tabla 6.10 Comparación de resultados obtenidos en el análisis de bio-oil por HPTLC y GC/MS
previa derivatización. En la determinación de levoglucosano y celobiosano.
HPTLC (% p/p) GC/MS (% p/p)

Muestras de bio-oil crudo
Levoglucosano Celobiosano Levoglucosano Celobiosano
Bio-oil (atrapa niebla) 1.6 0.8 1.5 0.3
Bio-oil (ciclón) 1.7 0.9 2.1 0.4
Bio-oil N°1 1.3 0.7 1.5 0.3
Bio-oil K 2.3 1.2 2.8 0.5
La comparación estadística se realizó mediante de la misma forma anterior. El valor-p calculado

para levoglucosano y celobiosano fue de 0.462 y 0.001 respectivamente. El resultado muestra que
no hay diferencia significativa (a un nivel de confianza del 95 %) entre los resultados obtenidos por
ambas metodologías para el caso del levoglucosano, a diferencia del celobiosano, en el cual hay una
diferencia en ambos resultados. Esta diferencia se puede atribuir a que los resultados obtenidos por
la metodología desarrollada por HPTLC, puede presentar un error en la cuantificación debido a que
el celobiosano es el azúcar que presenta un menor Rf, con un desplazamiento cercano a la siembra
de la muestra, aumentando la probabilidad de que el azúcar se desplace en conjunto con otros
compuestos, causando un error por exceso en la cuantificación. Otra explicación puede ser debido a
que las condiciones de la reacción de derivatización no son suficientes para silanizar todo
celobiosano, lo que causaría un error por defecto en la cuantificación, sin embargo, este efecto en
parte se vería reflejado en los porcentajes de recuperación (ver Tabla 6.8) obtenidos para el
celobiosano.
6.6 Conclusiones
La determinación de ácidos orgánicos mediante inyección directa de bio-oil (sin tratamiento previo)
en un sistema HPLC-UV, no permite la determinación de estos compuestos debido a la presencia de
una gran variedad de compuestos químicos que interfieren en la detección UV, disminuyendo
considerablemente la selectividad del método. Sin embargo, si se puede aplicar este método para
estimar el porcentaje de ácido fórmico y ácido acético en muestras de destilados y en fracciones
orgánicas de bio-oil, previa extracción líquido-líquido.
Se logró implementar una metodología que permitió la determinación simultánea de ácidos

orgánicos y azúcares en bio-oil, usando un sistema GC/MS previa derivatización con BSTFA, la
cual contó con características analíticas satisfactorias para el objetivo propuesto. Además fue
posible aumentar la selectividad realizando una derivatización de los compuestos y usando un
detector de masas trabajando en modo SIM. Si bien la reacción de derivatización no es específica
para ácidos o azúcares, se puede optimizar la reacción hacia la formación de estos derivados.
La principal desventaja es el tiempo requerido para realizar tanto la reacción de derivatización,

como la separación cromatográfica (aproximadamente 130 minutos). En comparación con la

Capítulo 6
inyección directa en GC/MS sin tratamiento de muestra, la cual toma un tiempo de separación de
112 minutos.
Los resultados obtenidos comparando GC/MS (inyección directa) y HPTLC son considerados
estadísticamente iguales. Sin embargo, si bien es posible determinar celobiosano por GC/MS,
previa derivatización, las concentraciones detectadas por este método fueron menores a las
obtenidas por HPTLC. Es posible atribuir esta diferencia, principalmente a que en la determinación
por HPTLC, el celobiosano puede coeluir con un interferente (aparte de la glucosa).
Esta metodología desarrollada aporta un avance tecnológico en la determinación de compuestos en

bio-oil, principalmente por la determinación selectiva de los compuestos de interés, tanto en
azúcares y en ácidos orgánicos, logrando un aporte en el desarrollo de procesos industriales
destinados a la extracción de productos químicos desde el bio-oil, además fue posible determinar
especies como ácido láctico y glicólico, que si bien no presentan una opción como productos
químicos, si pueden ayudar al conocimiento de las diferentes reacciones que ocurren en el bio-oil.
Además es posible ampliar esta metodología a otros ácidos o azúcares que se requieran determinar.

Capítulo 6
6.7 Bibliografía

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Capítulo 6
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Capítulo 7
CAPÍTULO 7
DETERMINACIÓN DE ALDEHÍDOS DE BAJO PESO MOLECULAR EN BIO-OIL POR

HPLC-UV Y POR GC/MS, PREVIA DERIVATIZACIÓN/EXTRACCIÓN SIMULTÁNEA
POR HS-SPME
En este capítulo se desarrollaron metodologías analíticas para la determinación de aldehídos de bajo

peso molecular en muestras de bio-oil, orientado principalmente a lograr mayor selectividad
mediante el desarrollo de una nueva tecnología basada en SPME.
7.1 Resumen
En la presente sección se evalúan dos caminos para la determinación de aldehídos, el primero
mediante HPLC-UV previa derivatización con 2,4-DNPH y el segundo por GC/MS previa
derivatización con PFBHA. En este último caso se evalúan además diferentes métodos de
extracción. El método de HPLC-UV presenta baja selectividad, además, de ciertos problemas
relacionados con la reacción de derivatización. El método propuesto basado en GC/MS y la
derivatización/extracción automática in-situ sobre la fibra, muestra alta selectividad, rapidez y
sencillez en la determinación de aldehídos de bajo peso molecular, en especial para el formaldehido,
analito que hasta ahora había presentado dificultades mayores para su determinación.
7.2 Introducción
La aplicación directa del bio-oil como combustible está limitada por el alto porcentaje de agua y
oxígeno presentes en él, y también por el alto contenido de especies como los ácidos orgánicos,
aldehídos, azúcares y otros compuestos con varios grupos funcionales1-3.
En el corto plazo, la ampliación de la producción industrial de bio-oil depende de su utilización para

la fabricación de productos químicos y materiales de mayor valor agregado que los combustibles 1.
En general un alto contenido de especies oxigenadas reactivas hace que el bio-oil sea inestable y
corrosivo. Esta inestabilidad del bio-oil se debe a diversas reacciones químicas que tienen lugar
cuando se encuentra almacenado, donde aldehídos y ácidos se consideran los principales
compuestos reactivos3. La inestabilidad se puede manifestar en (1) un lento incremento de la
viscosidad del bio-oil durante el almacenamiento, comunmente llamado “envejecimiento” (2) un
rápido incremento de la viscosidad al aplicar calor, produciendo polimerización y separación de
fases formando un tipo de goma y carbón, (3) evaporación de los compuestos volátiles y la
oxidación de compuestos al contacto con el aire4.
Por otra parte, la expansión del uso de sistemas de pirólisis rápida para la producción de bio-oil
expone cada vez más a un elevado número de personas a potenciales peligros para su salud.
Estudios vigentes han evaluado los peligros producidos por la exposición prolongada al líquido de
pirólisis de la madera. La toxicidad del bio-oil depende de su composición, la cual es función del
proceso de pirólisis y la materia prima empleada. Sobre la base de las concentraciones de
determinados compuestos del bio-oil y los niveles de exposición, se puede concluir que algunos
aldehídos (formaldehído, acroleína), furanos y fenoles, pueden requerir prevención debido a su
toxicidad. La proyección de la toxicidad oral aguda sería de alrededor de 700 mg/kg de peso
Capítulo 7
corporal5. En especial la presencia de formaldehido y acetaldehído podría causar efectos adversos a

largo plazo5.
Considerando estos aspectos, es necesaria la remoción de estos compuestos desde el bio-oil. Sin
embargo, estos compuestos pueden ser utilizados a nivel industrial. El formaldehído puede
reaccionar con especies fenólicas para formar resinas fenol-formaldehido6-8.
Unos de los aldehídos que se encuentran en mayor concentración en el bio-oil es el

hidroxiacetaldehído (HAA), el cual está principalmente en la fase acuosa, predominantemente como
hidrato, lo que disminuye notablemente su volatilidad. Su principal uso es para producir un efecto
dorado en los alimentos y para la producción de sabores, reaccionando con aminas o amoniaco9.
Además es utilizado para elaborar productos artificiales con acción bronceadora, de la piel9.
La determinación de HAA se realiza principalmente por inyección directa en GC/MS (ver capítulo
4). Se ha reportado su determinación por HPLC-IR10, 11, del cual no se presentan cromatogramas ni
los parámetros analíticos correspondientes. Además se ha reportado la determinación por 13C NMR,
mediante una extracción de la lignina pirolítica seguida por una extracción con dietiléter. Esta
determinación permite tanto la cuantificación como la identificación de los principales monómeros
y dímeros del HAA en el bio-oil12.
El formaldehído y el acetaldehído al igual que el HAA, se pueden determinar por HPLC-IR11, con
los inconvenientes indicados en el párrafo anterior. Además se ha reportado su identificación por
GC/MS, pero sin éxito en la cualificación por la coelución con el solvente empleado.
En este capítulo, se evalúa la determinación de los principales aldehídos por HPLC-UV, previa
derivatización con 2,4-dinitrophenylhidrazina (DNPH). Además, considerando la complejidad de la
muestra, se desarrolló una metodología basada en SPME y GC-MS mediante la modificación
química del recubrimiento de una fibra de microextracción en fase sólida (SPME) con o-(2, 3, 4, 5,
6-Pentafluorobenzyl) hydroxylamine hydrochloride (PFBHA), realizando la extracción en el
espacio de cabeza de la solución. Por último esta metodología fue comparada con una metodología
basada en la derivatización de aldehídos en solución y su posterior extracción directa desde su
espacio de cabeza, seguido por la separación mediante GC-MS.
En cuanto a la determinación de aldehídos por HPLC, ésta se encuentra ampliamente descrita en

diferentes matrices como aire, agua, bebidas alcohólicas, alimentos entre otras13-17, principalmente
realizando una reacción de condensación entre los grupos carbonilos con 2,4-DNPH, generando
compuestos coloreados que pueden ser determinados a una cierta longitud de onda. Esta reacción es
catalizada en medio ácido y tiene como resultado final la formación de 2,4-dinitrofenilhidrazonas.
En la Figura 7.1 se presenta la reacción para la formación de hidrazonas.
Capítulo 7
Figura 7.1 Reacción del 2,4-DNPH con grupos carbonilos. R1 y R2 pueden corresponder a H,
grupos alquil o aril.
Para muestras de bio-oil, se ha reportado el uso de esta metodología en la determinación de

aldehídos10. Sin embargo no se informan las condiciones de derivatización y separación, los
parámetros analíticos ni un cromatograma de dicha determinación. Por esta razón, se evaluaron y
optimizaron las condiciones propuestas en diferentes trabajos publicados.
Es posible realizar la formación de hidrazonas con aldehídos de bajo peso molecular a temperaturas
cercanas al ambiente, entre 15 a 25 °C y con tiempos de reacción de 30 minutos, en un medio ácido
empleando ácido fosfórico16, 17,19. Considerando la variabilidad de aldehídos que se desean
determinar es necesaria la optimización de esta reacción de derivatización. Para tal efecto se deben
evaluar los parámetros como tiempo de reacción, temperatura de reacción y pH de la solución.
a) Tiempo de reacción: tiempo en que los aldehídos reaccionan cuantitativamente para formar
hidrazonas. En la mayoría de las publicaciones, este tiempo no supera los 30 minutos.
b) Temperatura de reacción: En este método la temperatura de reacción tiene una mayor

incidencia por la presencia de HAA, el cual con temperatura mayor puede separar el dímero
y afectar la derivatización. En la mayoría de la bibliografía se describe la determinación de
aldehídos alifáticos sin aplicación de temperatura. La desventaja es que a mayor
temperatura se puede producir la descomposición de las hidrazonas formadas.
c) pH de la reacción: La reacción de derivatización es catalizada en medio ácido

(principalmente ácido fosfórico), ya que favorece el ataque nucleofílico del grupo –NH2 al
grupo carbonilo. En literatura se ha demostrado que el pH tiene una gran incidencia en el
tiempo de reacción. A pH cercanos a 1.8 la reacción puede tener lugar en sólo 30 minutos19.
En relación a la determinación de aldehídos mediante GC, la EPA (Environmental Protection

Agency) describe la determinación de grupos carbonilos en agua, mediante la derivatización con o-
(2,3,4,5,6-pentafluorobencil) hidroxilamina clorhidrato (PFBHA) y posterior separación por
cromatografía de gases con detección por captura de electrones (método 556)20. Este método
propone la extracción líquido-líquido de las oximas generadas usando n-hexano como solvente. Un
esquema de la reacción de derivatización con PFBHA se muestra en la Figura 7.2. Esta reacción
genera oximas volátiles y térmicamente estables21. El uso de PFBHA como reactivo derivatizante
permite establecer selectividad analítica y permite el uso de detectores convencionales. La
Capítulo 7
derivatización está basada en una cinética de reacción de primer orden, permitiendo la

cuantificación de los analitos, siendo utilizado como método de screening para la identificación de
ciertos aldehídos en muestras de aire22.
Figura 7.2 Reacción de derivatización para formación de oximas, mediante la reacción de

PFBHA con grupo carbonilos22.
F F
O
+
C
F CH2 H R
O
F NH2
Aldehído
PFBHA R= H, HCHO
F F
F F F F
F CH2 O H F CH2 O R
F N C F N C
R H
PFBHA- Carbonil-oxima
Cabe señalar que en la reacción de derivatización cuando R no corresponde a H (Figura 7.2),

genera los 2 compuestos (E, Z), los cuales corresponden a los isómeros de cada aldehído. Por lo
tanto, en el cromatogramas se observan dos señales de cada aldehído, a excepción del
formaldehído.
Una de las desventajas del uso de la extracción líquido-líquido es la baja recuperación de las
oximas generadas en la fase acuosa mediante un solvente orgánico específico, lo que afecta al
rendimiento de la reacción. El proceso de tratamiento de muestra, derivatización y extracción,
puede ser simplificado empleando SPME en conjunto con el reactivo derivatizante PFBHA.
Se han propuesto varios enfoques en el uso de la SPME en esta reacción, principalmente porque
permite realizar una derivatización en diferentes etapas. En la Figura 7.3 se muestra un esquema
de las posibilidades que ofrece esta técnica.
Capítulo 7
Figura 7.3 Esquema de las estrategias de derivatización posibles utilizando SPME. (Modificación
esquema propuesto por J. Pawliszyn)25.
Estrategias de
derivatización en
SPME
Derivatización de la Extracción de analitos por Simultanea

muestra, seguida por SPME, seguida por una Extracción / on-fibre
SPME derivatización on-fibre derivatización
Paso 1
Paso 1 Paso 1
Añadir reactivo
Exponer la fibra en la Exponer la fibra en la solución del
derivatizante a la
solución de la muestra, para reactivo derivatizante, para la
solución de la muestra y
la extracción de los analitos modificación química de la fibra
procede la reacción
Paso 2
Paso 2
Exponer la fibra en la Paso 2
Exponer la fibra en la solución de
solución de la muestra, Exponer la fibra en la
la muestra, para la reacción de
para la extracción de los solución del derivatizante
derivatización en la fibra
analitos derivatizados
Paso 3
Desorción y análisis
La primera opción, que corresponde a la derivatización en la solución de la muestra, y

posteriormente la extracción, puede ser aplicada principalmente a muestras que no presenten
problemas de complejidad de la matriz. Esto debido a que la fibra del SPME puede sorber tanto los
aldehídos derivatizados, como los otros compuestos presentes en la matriz.
La segunda opción, que corresponde a la extracción de los analitos por SPME y posteriormente
derivatización en la fibra, al igual que el primer caso, presenta el inconveniente que la matriz de la
muestra contenga una alta concentración de otros compuestos, que pueden tener afinidad por la
fibra empleada, lo cual puede ser una fuente de interferencias.
La tercera opción contempla realizar una modificación química de la fibra del SPME, exponiendo
primero la fibra en la solución del reactivo derivatizante, para luego exponer esta fibra modificada a
la muestra. Este método presenta la ventaja de poder ser utilizado en muestras de alta complejidad,
más aun cuando el reactivo derivatizante presenta una alta selectividad.
Capítulo 7
Considerando los antecedentes anteriormente presentados para el análisis de aldehídos, en primer

lugar se desarrolló e implementó una metodología basada en extracción/derivatización de forma
simultánea, lo que permite aumentar la selectividad especialmente al ser realizada en modo espacio
de cabeza (HS).
En bibliografía se ha descrito la extracción/derivatización on-fiber para determinación de aldehídos

usando PFBHA (Figura 7.4), la cual involucra la sorción del derivatizante en el recubrimiento de la
fibra, seguido por la derivatización de los aldehídos en la fibra (on-fiber) y la posterior desorción en
el sistema cromatográfico22. Denominado en este trabajo como OFD-HS-SPME-GC/MS.
Figura 7.4 Etapas de las constantes de distribución propuestas en las cuatro etapas de la
derivatización on-fiber22.
k1
PFBHA + S PFBHA * S Sorción (A)
k-1
PFBHA * S PFBHA + S Desorción
k2
Carbonil + S Carbonil * S Sorción (B)
k-2
Carbonil * S Carbonil + S Desorción
K*
Carbonil + PFBHA * S Oxima * S Reacción (C)
k3
Oxima * S Oxima + S Desorción (D)
La primera etapa (A) consiste en la sorción del PFBHA en la superficie de la fibra (S), en la cual la
sorción de este reactivo es significativamente mayor que la desorción (k 1 >>> k-1)22. La segunda
etapa (B) considera la posibilidad que los carbonilos ocupen espacios de la fibra. Esta etapa se
considera nula (k2 = 0), entendiendo que la capacidad de sorción de la fibra está completa con el
PFBHA22. La tercera etapa (C), se refiere a la velocidad de reacción de los grupos carbonilos
(gaseosos) con el reactivo PFBHA (en la fibra) 22. El grupo aromático del PFBHA (ver Figura 7.2)
proporciona la mayor afinidad con el recubrimiento de la fibra, dejando a la hidroxilamina
disponible para la reacción con los grupos carbonilos que se acercan. La cuarta etapa (D), considera
la posibilidad de la desorción (a temperatura ambiente) de la oxima formada. Los estudios
demuestran que la afinidad de la oxima por el recubrimiento de la fibra es muy alta, por lo que K3
tiende a cero22.
Por otra parte, considerando que las etapas involucradas en el proceso mencionado pueden afectar
la reproducibilidad del método y que el trabajo en un sistema HS otorga mayor selectividad que la
inyección directa, se desarrolló una segunda metodología, en la cual se realizó la derivatización de
los aldehídos en la solución de la muestra y la extracción de las oximas generadas se hizo por el
sistema HS25. Sin embargo, se debió considerar que la selectividad se ve afectada, ya que sería
posible extraer mejor los analitos volátiles en el bio-oil. Esta última metodología, correspondiente a
Capítulo 7
la derivatización de aldehídos en la solución de la muestra y su extracción mediante el sistema HS,

fue denominada con la abreviación D-HS-GC/MS.
7.3.1 Reactivos
Formaldehído 37%, valeraldehído, 2,4-dinitrophenylhidrazina (DNPH), metanol y acetonitrilo
(ambos grado HPLC), fueron adquiridos en Merck (Darmstadt, Germany). Acetaldehído 99.5 %,
propionaldehído 97 %, 2-furaldehído, glicolaldehído (dímero) y o-(2, 3, 4, 5, 6-Pentafluorobenzyl)
hydroxylamine hydrochloride > 99 % (PFBHA), fueron adquiridos en Sigma-Aldrich (St. Louis,
MO, USA). Agua desionizada (18 mΩ) fue obtenida por un sistema Millipore Milli-Q (Bedford,
MA, USA).
7.3.2 Materiales
Fibras para SPME manual, polyacrylato 85 µm (PA), polydimethylsiloxane/divinylbenceno 85 µm
(PDMS/DVB), carboxen/polydimethylsiloxano 75 µm y fibras para SPME StableflexTM para
autosampler, polydimethylsiloxane/divinylbenceno 65 µm (23GA), fueron adquiridas a Supelco
(Bellefonte, PA, US). Placa agitadora y calefactora RTC-basic y control de temperatura ETS-D4
fuzzy fueron adquiridos a Kika labortechnik (Alemania).
7.3.3 Instrumentación y condiciones cromatográficas
Sistema HPLC-UV
Sistema HPLC Merck-Hitachi compuesto por autosampler L-2200, bomba L-2130, detector UV L-
2400. Columna Shim-Pack VP-ODS 25 cm x 4,6 mm. Programa de integración Graphics versión
6.20 de Varian Inc. El gradiente utilizado consistió en 45 % de acetonitrilo, 55 % de agua por 1
minuto, incrementando linealmente hasta 65% de acetonitrilo (durante 5 minutos), quedando
constante hasta los 9 minutos, decrece hasta 60 % de acetonitrilo en 16 minutos y permanece
constante hasta los 25 minutos. Un flujo de 1.5 ml min -1, detección a 360 nm, y volumen de
inyección de 10 µL.
Sistema GC/MS
Compuesto por un cromatógrafo de gases HP 6890 Series Hewlett-Packard (Palo Alto, CA, USA)
equipado con un inyector split/splitless, detector de selectivo de masas HP 5973 y autosampler
Combi PAL CTC-G6500 (CTC Analytics AG, Zwingen, Suiza). El sistema es controlado por HP
ChemStation G1701AA, versión A.03.00 y el programa Cycle composer software 1.4.0, para el
autosampler.
En la separación cromatográfica se utilizó la columna VF-1701 (14% cyanopropyl/phenyl, 86%

polydimethylsiloxane) de 60 m × 0.25 mm I.D, 0.25 µm film. Helio electrónico grado 6.0
(99.9999%) con un flujo de 2 mL min−1. La detección se realizó en modo SCAN.
Se utilizaron dos programas de temperaturas, dependiendo de la técnica de
derivatización/extracción.
Capítulo 7
La abraviatura D-HS-GC/MS, corresponde a la determinación de aldehídos por GC/MS previa

derivatización con PFBHA en solución y posterior extracción de los derivatizados usando sistema
espacio de cabeza (HS).
La abreviatura OFD-HS-SPME-GC/MS corresponde al proceso simultaneo de

derivatización/extracción “on-fiber” de aldehídos empleando un sistema de microextracción en fase
sólida (SPME) en modalidad HS.
Rampa de temperatura para sistema D-HS-GC/MS: Temperatura inicial de 80 °C, con un

incremento de 3 °C min−1 hasta 150 °C (rampa 1), 40 °C min−1 hasta 280 °C (rampa 2), y una
limpieza a 280 °C por 5 min. La temperatura del inyector fue de 260 °C con un volumen de
inyección de 1000 µL utilizando el sistema Split 250:1.
Rampa de temperatura para sistema OFD-HS-SPME-GC/MS: Temperatura inicial de 45 °C, con

un incremento de 3 °C min−1 hasta 150 °C (rampa 1), 40 °C min−1 hasta 280 °C (rampa 2), y una
limpieza a 280 °C por 5 min. Temperatura del inyector fue de 260 °C, utilizando el sistema split
250:1.
7.3.4 Preparación de estándares y tratamiento de muestras de bio-oil
Sistema HPLC-UV
Todos los estándares de aldehídos fueron preparados en acetonitrilo y almacenados a 4 °C.
a) Preparación de reactivo derivatizante: 5 mg de 2,4-DNPH fueron disueltos en 5 mL de una

solución que contiene 1.25 mL de HCl, 3.12 mL de agua y 625 µL de acetonitrilo. Esta
solución se mantuvo a temperatura ambiente.
b) Preparación de muestras de bio-oil: 250 µL of bio-oil fueron disueltos en 4 mL de
acetonitrilo/agua 50/50 v/v. Es necesario realizar diluciones posteriores, empleando la
misma solución de acetonitrilo/agua.
c) Derivatización de muestras y estándares: 100 µL de 2,4-DNPH fueron añadidos a 500 µL
de las respectivas soluciones.
Sistema GC/MS
Todas las soluciones, incluido el patrón interno (valeraldehído), fueron preparadas con metanol y
almacenadas a una temperatura inferior a -10 °C. Las diluciones sucesivas se realizan sólo con
agua. La preparación de estas soluciones en agua se realizó en el momento del análisis. El PFBHA
se preparó a concentración de 50 mg mL-1 en metanol/agua 50/50 % v/v. Es recomendable la
preparación de este reactivo en el momento del análisis.
El tratamiento de las muestras de bio-oil consistió en la precipitación de la lignina pirolítica
adicionando agua en una razón 1/10 bio-oil/agua. Posteriormente la muestra fue centrifugada para
facilitar la separación de la lignina. Estas muestras fueron diluidas empleando agua como solvente.
Considerando la hidratación de los aldehídos, fue necesario preparar las muestras en el momento
del análisis.
Capítulo 7
a) Derivatización de aldehídos en bio-oil por HS-GC/MS

Se agrega 1.0 mg mL-1 del reactivo derivatizante PFBHA al vial de 2 mL que contiene una alícuota
adecuada de bio-oil, con una concentración de 100 µg L-1 del estándar interno. El volumen total
corresponde a 2 mL y el vial debió ser sellado herméticamente con tapas magnéticas
b) Derivatización de aldehídos en bio-oil por HS-SPME-GC/MS

La derivatización “on-fiber” requiere la preparación del derivatizante en un recipiente aparte de la
muestra, donde 3.0 mg mL-1 de PFBHA se mezclan con 2 mL de agua en un vial de 20 mL, Por otro
lado, la muestra se preparó en un recipiente de 20 mL conteniendo una alícuota adecuada de bio-oil
y estándar interno en una concentración de 100 µg L-1. Ambas soluciones deben ser selladas
herméticamente empleando tapas magnéticas.
7.3.5 Optimización de metodologías D-HS-GC/MS y OFD-HS-SPME-GC/MS
Ambas metodologías fueron optimizadas mediante una construcción de un diseño experimental. El
programa estadístico empleado fue el MODDE 7.0, proporcionado por el Dr. David Contreras de la
Facultad de Química de la Universidad de Concepción.
7.4 Resultados y discusión
7.4.1 Determinación de aldehídos por HPLC previa derivatización con 2,4-DNPH

Los compuestos que se evaluaron por esta metodología corresponden a los aldehídos de bajo peso
molecular (formaldehído, acetaldehído), HAA, y 2-furaldehído como compuesto mayoritario del
grupo de los furanos. Estos dos últimos, como ya se describió en el capítulo 4, también pueden ser
determinados por GC/MS.
Optimización de la reacción de derivatización

Considerando que formaldehído y acetaldehído son compuestos que se encuentran presentes en el
bio-oil y actualmente no hay una metodología propuesta para su determinación, la optimización de
esta reacción se focalizó en la obtención de las hidrazonas de estos compuestos. No obstante
también se tomó en consideración la determinación de HAA y 2-furaldehído.Se evaluaron
diferentes tiempos de reacción entre 15 a 45 minutos a temperatura ambiente y pH 1.8. Por otro
lado, se evaluaron temperaturas entre 20 y 40 °C, manteniendo un tiempo de reacción de 30
minutos.
Las condiciones óptimas encontradas fueron 35 °C por 30 minutos, para formaldehido, acetaldehído
y 2-furaldehído. No obstante, en la literatura se reportan tiempos y temperaturas menores para la
determinación de formaldehído y acetaldehído, principalmente. Esta diferencia se debe a que el bio-
oil contiene 2-furaldehído, el cual es un compuesto de estructura y características químicas
diferentes a los aldehídos alifáticos de bajo peso molecular, por lo tanto, la reacción tendrá lugar en
condiciones que aumenten tanto la cinética de reacción como el tiempo necesario para la
derivatización de este compuesto.

Capítulo 7
En la Figura 7.5 se muestra un cromatograma de mezcla de estándares de aldehídos, donde es

posible observar adecuada resolución (mayor a 2 para todos los pares de compuestos). En la Tabla
7.1 se muestran los principales parámetros analíticos determinados con una mezcla de estándares.
Figura 7.5 Cromatograma por HPLC-UV de 2,4-dinitrofenilhidrazonas de estándares de aldehídos

en condiciones óptimas. Señales: 1 = HAA-DNPH, 2 = formaldehído-DNPH, 3 = acetaldehído-
DNPH y 4 = 2-furaldehído-DNPH.
3 4
100
50
1
2.241
7.322
8.450
-19
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0
Minutes
Tabla 7.1 Parámetros analíticos de la curva de calibración instrumental de aldehídos por HPLC-
UV, previa derivatización con 2,4-DNPH.
Rango lineal Limite de deteccióna

Aldehídos Ecuación de la recta R
mg L-1 mg L-1
HAA 40 - 125 y=5.4735x-204.03 0.996 > 25
Formaldehído 1.5 - 7.0 y=481.8x + 108.5 0.985 0.98
Acetaldehído 0.5 - 20 y=15.56x + 32.42 0.956 2.73
2-furaldehído 5.0 - 40 y=26.45x + 57.18 0.978 1.28
a
Límite de detección calculado a partir del S y/x obtenido de la curva de primeros cuatro puntos.
El HAA presenta una curva polinomial de coeficientes y = -5E-06x4 + 0,0007x3 + 0,0205x2 -

0,7391x - 0,1003, presentando linealidad sólo desde 40 mg L-1 hasta 125 mg L-1 (ver Tabla 7.1).
Esto puede deberse a que esta especie forma diferentes hidratos estables en solución acuosa, el alto
porcentaje de agua que contiene el bio-oil influye negativamente en la posibilidad de derivatizar el
HAA a temperatura ambiente. Es por esta razón se observó que a mayores temperaturas se produjo
un aumento del rendimiento en la formación de hidrazonas. La desventaja es que a altas
temperaturas el derivatizado es mucho más inestable, en especial del formaldehido.
Por otra parte el método muestra un rango lineal estrecho para formaldehido, lo que representa un
inconveniente dado que este compuesto se encuentra en altas concentraciones en bio-oil (1.0-3.5 %
en peso)2. El método no presenta problemas de linealidad para acetaldehído ni 2-furaldehído,
mostrando un rango lineal de trabajo aceptable. Sin embargo el límite de detección del acetaldehído
es alto, por lo que la dilución del bio-oil deberá ser menor para lograr cuantificar este compuesto.

Capítulo 7
No obstante una menor dilución del bio-oil interfiere en la cuantificación del formaldehído, por lo
que el método no es apropiado para la cuantificación de simultánea de ambos compuestos en esta
matriz.
Se evaluó la derivatización en de bio-oil crudo, para lo cual fue necesario encontrar la razón óptima
de los solventes agua y acetonitrilo para la solubilización del bio-oil, encontrándose como
proporción óptima una mezcla 50/50 v/v. En la Figura 7.6 se muestra un cromatograma de una
muestra de bio-oil crudo, derivatizado con 2,4-DNPH, a 360 nm.
Figura 7.6 Cromatograma HPLC/UV de 2,4-dinitrofenilhidrazonas de aldehídos presentes en una

muestra de bio-oil crudo. Señales: 1 = HAA-DNPH, 2 = formaldehído-DNPH, 3 = acetaldehído-
DNPH y 4 = 2-furaldehído-DNPH.
mVolts
200
2
6.759
150
100
1
50
4.627
4
7.132
8.302
9.768
7.967
7.346
7.704
9.191
2.239
3
8.465
8.586
8.909
10.392
13.770
5.835
10.513
5.549
12.291
10.868
14.621
5.436
13.328
16.475
3.794
15.306
15.611
3.633
4.305
5.181
3.231
6.517
2.508
1.826
-20
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0
Minutes
En el cromatograma de una muestra de bio-oil se observa que es posible la separación de los

aldehídos, sin embargo la resolución respecto a interferentes no es suficiente (aproximadamente
1.0). Esto es debido a que la selectividad de esta derivatización es baja, considerando que participan
todas las familias químicas que poseen el grupo carbonilo y además, las especies que pueden
presentar una absorción a 360 nm.
En la bibliografía se describe que esta metodología se ha aplicado a diferentes tipos de muestras con
resultados satisfactorios, en especial muestras atmosféricas. No obstante para muestras de bio-oil se
observan varias limitaciones, entre las cuales está que las reacciones de derivatización en la
solución de bio-oil deben competir con las sucesivas reacciones que se pueden producir al emplear
un catalizador a pH muy ácido. Además no tan sólo el HAA puede estar presente como dímero y los
aldehídos en general pueden formar hidratos en medio acuoso. Por otra parte, si bien no se observan
problemas en la coelución de esta especie con otros compuestos, la resolución es baja y de todas
maneras es necesaria la confirmación de la presencia de estos aldehídos mediante una técnica más
selectiva.

Capítulo 7
Considerando los inconvenientes en la aplicación de esta metodología, a continuación se desarrollan

y evalúan dos metodologías para la determinación de aldehídos de bajo peso molecular en muestras
de bio-oil mediante GC/MS previa derivatización con PFBHA, una en modalidad espacio de cabeza
(HS) y la segunda mediante microextracción en fase sólida (SPME) previa modificación química
de la fibra de extracción posterior derivatización/extracción, todo ello realizado de manera
automática.
7.4.2 Determinación de aldehídos de bajo peso molecular por GC/MS previa derivatización
con PFBHA. Comparación de procedimientos de derivatización en solución y derivatización
en fibra (D-HS-GC/MS y OFD-HS-SPME-GC/MS respectivamente)
Ambas metodologías fueron optimizadas mediante diseño experimental y junto con ello se utilizó
como patrón interno valeraldehído con el objetivo de minimizar el error asociado a la inyección de
la muestra y a la reacción de derivatización.
Como se mencionó con anterioridad, ambas metodologías propuestas para la determinación de

aldehídos en bio-oil presentan varias etapas, las cuales pueden afectar la reproducibilidad del
método, en mayor proporción la que utiliza la técnica de microextracción en dase sólida. Este
inconveniente puede ser disminuido empleando un sistema de introducción de muestra automático.
Además cabe destacar que en trabajos publicados, la optimización de los métodos en que evaluaban
la derivatización de aldehídos “on-fiber” (empleando PFBHA) se realizó evaluando
individualmente cada parámetro o factor24, 28. En este trabajo se empleó un diseño experimental para
la optimización de los métodos propuestos.
7.4.2.1 Optimización del método D-HS-GC/MS
Para la optimización de esta metodología se empleó un diseño central centrado en las caras con
puntos estrellas y 4 puntos centrales, con un total de 18 experimentos.
Considerando que el procedimiento consiste en la derivatización en la solución de la muestra los

factores experimentales evaluados fueron los siguientes:
a) Temperatura de derivatización y extracción: corresponde a la temperatura a la cual la

derivatización tiene lugar y la temperatura a la cual las oximas formadas se encuentren en la
fase HS. Se ha demostrado que el incremento de la temperatura favorece significativamente
la reacción, disminuyendo los tiempos de reacción. La ventaja de esta reacción es que las
oximas formadas son térmicamente estables. El principal inconveniente es que usa agua
como solvente, por lo cual la temperatura no excedió los 85 °C. El rango evaluado fue entre
35 – 85°C.
b) Tiempo de derivatización: corresponde al intervalo de tiempo en el cual la muestra es

agitada en el sistema. El objetivo es favorecer la reacción de derivatización y facilitar la
distribución de las oximas entre la fase acuosa y gaseosa. El tiempo evaluado para estos
compuestos es entre 5 -70 minutos.

Capítulo 7
c) Agitación: La agitación en los procedimientos de extracción presenta gran importancia, al

estar directamente relacionados en la difusión de las especies formadas hacia la fase HS. El
rango de agitación. Se evaluó un rango entre 250-700 rpm.
Los resultados obtenidos se analizaron sólo para el formaldehído y el acetaldehído. El

propionaldehído estaba en bajos niveles de concentración en las muestras de bio-oil. En la Figura
7.7 se presenta el gráfico de los coeficientes de los factores obtenidos para el formaldehído, junto
con su error estándar. En la Figura 7.8 se presenta el mismo gráfico para el acetaldehído.
Figura 7.7 Gráfico de coeficientes del modelo que describe la derivatización/extracción de

formaldehido en muestras de bio-oil por D-HS-GC/MS.
2000000
1500000
1000000
Abundancia
500000
-500000 X1 X3X3
-1000000
X3
X2
Donde: X1 es tiempo de reacción, X2 temperatura y X3 agitación.
Ecuación de la optimización para el formaldehido:

y = 2.458+06 (± 295601) + 558143 X1 (± 198918) - 793458 X2 (± 209268) - 53309 X3 (± 214856) –
1.478+06 X32 (± 357597)
El formaldehído es el compuesto que muestra mayor variabilidad según muestran los resultados,
debido principalmente a que este compuesto presenta mayor volatilidad, afectando el equilibrio
entre la fase acuosa y la fase HS, por esta razón, al aumentar la temperatura se produce una
disminución de la formación de oxima.

Capítulo 7
Figura 7.8 Gráfico de coeficientes del modelo que describe la derivatización/extracción del
acetaldehído en muestras de bio-oil por D-HS-GC/MS.
30000
20000
10000
Abundancia
C1 0
-10000 X1 X2
-20000
X3
-30000
-40000
X3X3
Donde: X1 es tiempo de reacción, X2 temperatura y X3 agitación.
Ecuación de la optimización para el acetaldehído:

y = 55527 (± 6202.1) + 15111 X1 (± 4173) + 24421 X2 (± 4391) – 12977 X3 (± 4508) – 32186 X32
(± 7503)
El acetaldehído presenta menor variabilidad que el formaldehido. Además se observa que la

temperatura de la reacción tiene un efecto positivo sobre la formación y la extracción de las oximas
generadas.
Ambos modelos obtenidos fueron validados por el test ANOVA al 95 % de confianza (valor-p <
0.05). Las condiciones óptimas del método fueron temperatura 80 °C, 60 minutos de reacción y
agitación de 350 rpm. En la figura 7.9 se muestra un cromatograma de una muestra de bio-oil,
previa formación de las oximas (aldehído-PBHA), en las condiciones optimizadas obtenido por esta
metodología.

Capítulo 7
Figura 7.9 Cromatograma de una muestra de bio-oil por D-HS-GC/MS, en modo SCAN. Señales: 1
= formaldehído-PFBHA oxima; 2 = acetaldehído-PFBHA oxima; 3 = propionaldehído-PFBHA
oxima and 4 = valeraldehído-PFBHA oxima (estándar interno).
Como se mencionó anteriormente (ver Figura 7.2), para las señales correspondientes al
acetaldehído, propionaldehído y el estándar interno (valeraldehído), se observan 2 señales
cromatográficos, las cuales corresponden a los isómeros de cada aldehído. Para efecto de la
cuantificación, y obtención de los parámetros analíticos se consideraron las sumas de las áreas de
ambas señales obtenida para cada aldehído.
Tanto para el formaldehído, acetaldehído, propionaldehído y el patrón interno, se obtiene una alta
resolución de las señales cromatográficas mayor a 2.5. Además se observa una alta selectividad del
método propuesto. Ésta se evaluó a través de la comparación de los espectros de masas obtenidos
para cada señal cromatográfica tanto de la solución estándar como de la muestra de bio-oil. Esto
permitió realizar la detección en modo SCAN. La mayor abundancia tanto para los aldehídos
derivatizados y reactivo derivatizante (PFBHA) corresponde al m/z = 181. Por esta razón se
descartó el uso del sistema SIM.
Posterior a la optimización de esta metodología, se procedió a la optimización de la metodología

OFD-HS-SPME-GC/MS.

Capítulo 7
7.4.2.2 Optimización del método OFD-HS-SPME-GC/MS

El modo de extracción/derivatización, mediante empleo de una fibra polimérica, presenta algunas
ventajas con respecto a la D-HS-GC/MS. Esta corresponde principalmente a la alta selectividad que
permite, con lo cual se puede lograr la exclusiva derivatización de los aldehídos más volátiles,
además de la reducción del tiempo de análisis. La principal desventaja se presenta al estar dividida
en dos etapas de extracción. La primera consiste en la modificación química de la fibra a emplear.
Para ello el reactivo PFBHA deben ser extraídos desde la fase acuosa hacia el recubrimiento de la
fibra. La segunda etapa contempla la extracción de aldehídos desde la fase acuosa mediante HS
hacia la fibra que contiene adherido o absorbido (dependiendo del tipo de recubrimiento) el reactivo
derivatizante. En la Figura 7.10, se presenta un esquema de las dos etapas involucradas y las
diferentes fases.
Figura 7.10 Esquema propuesto de las etapas y fases involucradas en la extracción/derivatización

de aldehídos “on-fiber”.
Etapa 1 Etapa 2
Aldehídos-
PFBHA Fase polimérica PFBHA
PFBHA Fase gaseosa Aldehídos
PFBHA Fase acuosa Aldehídos
El recubrimiento polimérico de la fibra también es un factor que debe ser evaluado. En literatura se
presenta como recubrimiento más adecuado la fibra recubierta con DVB/PDMS 22-29, en la etapa de
sorción del derivatizante PFBHA en la fibra.
En este trabajo se evaluaron diferentes fibras, con respecto a la matriz de la muestra, considerando
la gran cantidad de compuestos volátiles que están presentes en el bio-oil y que pueden presentar
una sorción en la fibra, produciendo la desorción del reactivo derivatizante e impidiendo la
formación de las oximas correspondientes.
Además, el uso de un sistema de inyección automático favorece la reproducibilidad que se puede

obtener. Los principales inconvenientes son el realizar en forma reproducible las dos etapas que
contempla este procedimiento, para lo cual no hay un sistema de inyección automático de muestra
que pueda realizar ambas etapas de forma automática. Para superar esta limitante en el presente
trabajo se creó un sistema virtual con el mismo sistema de inyección, el cual permitió realizar
ambas etapas de forma automática.

Capítulo 7
Primeo se evaluó el tipo de recubrimiento polimérico y el uso de un sistema automático, lo cual se

realizó mediante un diseño experimental, optando por una única etapa, lo cual se detalla a
continuación junto con el posterior diseño y optimización de la metodología.
Elección del tipo de recubrimiento polimérico de la fibra para OFD-HS-SPME-GC/MS
Como ya se indicó, se han publicado trabajos donde se evaluaron diferentes recubrimientos

poliméricos para el análisis de aldehídos usando un método de derivatización/extracción
simultánea22-24. Las fibras evaluadas corresponden principalmente a fibras mixtas y fibras como
DVB/PDMS/DVB. La fibra PDMS/DVB proporcionó la mejor retención del reactivo PFBHA, y de
la oxima formada22-24. No obstante, el bio-oil contiene una gran diversidad de compuestos
orgánicos, que pueden competir con el reactivo derivatizante por dicha la fibra. Esto no ha sido
evaluado, ya que en los trabajos mencionados esta tecnología se aplicó a muestras de menor
complejidad como muestras de agua y bebidas alcohólicas. Por ello se evaluó la capacidad de
extracción de diferentes compuestos que están presentes en bio-oil usando diferentes
recubrimientos poliméricos y diferentes temperaturas, mediante la modalidad de derivatización “on-
fiber”. En la Figura 7.11, se muestran gráficos con las abundancias de los compuestos extraídos por
las diferentes fibras.
Figura 7.11 Evaluación de los diferentes recubrimientos poliméricos a distintas temperaturas de

extracción. (A) 30 °C; (B) 40 °C y (C) 60°C.
Evaluación de diferentes recubrimientos poliméricos en muestra de

bio-oil a 30 °C por HS-SPME-GC/MS
(A)
38500000
CAR/PDMS PA
33000000
DVB/PDMS
27500000
Abundancia
22000000
16500000
11000000
5500000
0
Compuestos

Capítulo 7
Evaluación del recubrimiento poliméricos en muestras de bio-oil a

40 °C por HS-SPME-GC/MS
(B)
38500000 CAR/PDMS
33000000 PA
DVB/PDMS
27500000
Abundancia
22000000
16500000
11000000
5500000
Compuestos
Evaluación de diferentes recubrimientos poliméricos dn bio-oil a

60 °C por HS-SPME-GC/MS
(C)
CAR/PDMS
38500000 PA
33000000 DVB/PDMS
Abudancia
27500000
22000000
16500000
11000000
5500000
0
Compuestos
Los compuestos del bio-oil que presentan una mayor sorción en los recubrimientos poliméricos,
corresponden a compuestos fenólicos y sus derivados, junto con compuestos aromáticos en general.
Considerando que las fibras de SPME que combinan más de un recubrimiento son las más
adecuadas para la determinación de una amplia gama de compuestos, el recubrimiento PDMS/DVB
no tan sólo puede extraer compuestos por medio de la absorción (recubrimiento PDMS), sino que
también por adsorción, debido a la porosidad del DVB. Estas características en conjunto con un
aumento de la temperatura favorecen la extracción de gran parte de los compuestos del bio-oil, en
especial considerando que a la muestra de bio-oil no se le realiza un tratamiento previo.
De la Figura 7.11, se puede observar que el recubrimiento que presenta mayor sorción de los
compuestos del bio-oil, corresponde al CAR/PDMS, y en menor grado la fibra PDMS/DVB. Si bien
ambas fibras presentan características de polaridad media, la CAR/PDMS presenta mayor afinidad
con compuestos apolares. En el caso del recubrimiento con PA, a medida que aumenta la

Capítulo 7
temperatura es posible la sorción de compuestos con mayor polaridad como los fenoles y derivados
fenólicos.
Considerando este análisis, el recubrimiento PDMS/DVB es el que presenta una menor sorción de
los compuestos del bio-oil que pueden afectar en la etapa de derivatización/extracción de las oximas
formadas.
De esta forma, fue posible determinar que el recubrimiento polimérico de DVB/PDMS, cumplió
satisfactoriamente tanto como el mejor recubrimiento en la etapa de sorción de reactivo
derivatizante (PFBHA) y en la menor sorción de compuestos volátiles del bio-oil, los que pueden
causar una disminución de la eficiencia del método propuesto.
Implementación de una secuencia automática para la determinación de aldehídos por OFD-HS-

SPME-GC/MS
La principal limitante de esta metodología es que se realiza en dos etapas, usando diferentes
recipientes. En una primera fase del trabajo, esta metodología se realizó en modo manual,
empleando una placa calefactora con control de temperatura, para lo cual se colocó el vial que
contenía el PFBHA. Posteriormente se introdujo la fibra en el espacio de cabeza. Una vez
transcurrido el tiempo de extracción se retiró la fibra y rápidamente se cambió el vial por el que
contenía la muestra de bio-oil, colocando la fibra modificada en el espacio de cabeza de la muestra.
Después de la derivatización/extracción se procedió a la desorción de la fibra en el sistema

cromatográfico. De esta forma no fue posible mantener un control exacto de los tiempos de cada
etapa, además de ser poco factible la implementación de esta metodología como un análisis de
rutina. Considerando este aspecto se optó por desarrollar este procedimiento en forma automatizada
en el sistema de inyección automático del GC/MS. Sin embargo, este aparato no posee la opción de
realizar dos extracciones con SPME con una sola desorción en el sistema cromatográfico. Para ello
fue necesario implementar un sistema de desorción virtual con el software Cycle Composer. Para
ello se indicó mediante las coordenadas X, Y, Z que posterior a la modificación de la fibra, ésta no
realice desorción en el inyector cromatográfico, si no que ésta sea en un sistema virtual, en el vial
de la muestra (momento en que se produce la derivatización/extracción) y posterior a ello la
inyección en el GC-MS. Para esto fue necesario el desarrollo de 2 métodos. En la Tabla 7.2 se
exponen los parámetros del sistema de inyección automático para el método A (etapa 1) y el método
B correspondiente a la etapa 2.

Capítulo 7
Tabla 7.2 Métodos propuestos para la realización de forma automática del método OFD-HS-
SPME-GC/MS.
Método A Método B
Pre incubation time (m:ss) 3:30 0:30
Incubation temperature (°C) 40 40
Agitator speed (rpm) 250 250
Agitator on time (m:ss) 0:05 0:05
Agitator off time (m:ss) 0:02 0:02
Vial penetration (mm) 31 31
Extraction time (m:ss) 10:00 30:00
GC-Iny 2 (virtual GC-Iny 1(real
Desorb to
injector) injector)
Injection penetration (mm) 44 54
Desorption time (m:ss) 0:05 11:00
Como se mencionó con anterioridad, el software no presenta la opción de “no desorb” la fibra en el
inyector e ir a la búsqueda de otro vial. No obstante la creación de un sistema virtual indicado como
GC-Iny 2 (método A), permite indicar la desorción en un vial.
La principal ventaja que presenta realizar esta metodología en forma automática, es que el tiempo
de espera de la fibra para ser expuesta en un segundo vial para la derivatización, disminuye en gran
medida los problemas de reproducibilidad presentados en forma manual, además de lograr realizar
una secuencia de muestras sin la intervención del analista y permitir la implementación de este
método como análisis de rutina.
Con este proceso automatizado es posible realizar un diseño experimental uniendo ambas etapas del
proceso en una etapa global.
Optimización mediante diseño experimental del método OFD-HS-SPME-GC/MS
Para la optimización de esta metodología también se empleó un diseño central, centrado en las caras
con puntos estrellas y además 4 puntos centrales, con un total de 30 experimentos.
Para la optimización de estas etapas se tuvo en cuenta los parámetros que tienen directa relación con
los procesos físico-químicos involucrados. La extracción por HS-SPME nos obliga a considerar un
sistema trifásico (fase acuosa, gaseosa o HS y la fase polimérica, ver Figura 7.10). De esta manera
la primera etapa de modificación química consta de las siguientes variables:
a) Tiempo de extracción: La cantidad de analito (PFBHA) extraído por la fibra depende de las
constantes de distribución en cada una de las fases. En literatura, el tiempo de extracción
del PFBHA es entre 5 y 10 minutos. En el presente trabajo el tiempo se evaluó entre 5 y 30
minutos.

Capítulo 7
b) Concentración del PFBHA: La finalidad de la primera etapa es la modificación del

polímero de la fibra con el derivatizante, el que debe quedar adsorbido o absorbido en
cantidad suficiente, de tal forma que no sea una limitante en la posterior reacción de
derivatización. En literatura se utiliza una alta concentración del reactivo (17.0 mg mL-1),
concentración que eleva excesivamente el costo de análisis. Por ello, en base a este dato se
evaluó diferentes niveles de concentración de este reactivo, entre 0.5 y 17.0 mg mL-1. En
concentraciones de 0.5 mg mL-1, se observó la disminución de la abundancia de los
aldehídos derivatizados, de tal forma que se optó por el rango entre 1.0 y 10 mg mL-1.
c) Temperatura de extracción: Esta variable, posee una gran importancia en la extracción,

principalmente por favorecer la evaporación del PFBHA desde la fase acuosa a la fase
gaseosa. Sin embargo, un aumento puede significar la desorción de las moléculas ya
adsorbidas en el recubrimiento polimérico. En literatura se propone desde temperatura
ambiente hasta los 50 °C. En el presente trabajo se evaluó el rango entre 27 y 50 °C.
La segunda etapa correspondiente a la derivatización on-fiber. Se utilizaron los mismos conceptos

físico-químicos considerados en la primera etapa. En la Tabla 7.3 se muestra un resumen de las
variables involucradas en ambas etapas.
a) Temperatura de derivatización: En literatura se proponen temperaturas alrededor de 40 °C,

en este diseño el rango propuesto fue entre 35 y 60 °C.
b) Tiempo de derivatización: El tiempo en este caso es mayor que el implicado en la etapa 1.

El rango evaluado fue entre 5 y 60 minutos.
La agitación al igual que en el caso de HS, cumple un papel fundamental en la distribución de los
compuestos entre las diferentes fases, en esta metodología la agitación no puede superar los 250
rpm, por la posibilidad de una rompimiento de la fibra polimérica. Por lo tanto, este parámetro se
mantiene constante en ambas etapas.
Tabla 7.3 Variables empleadas en el diseño experimental para la optimización de la metodología

OFD-HS-SPME-GC/MS.
Variables experimentales Identificación -1 +1
PFBHA mg mL-1 X1 1.0 10.0

Temperatura de sorción PFBHA en la fibra (°C) X2 27.0 50.0
Tiempo de sorción del PFBHA en la fibra (min) X3 5.0 30.0
Tiempo de derivatización (min) X4 5.0 60.0
Temperatura de derivatización (°C) X5 35.0 60.0

Capítulo 7
En este método fue posible la evaluación de los tres compuestos estudiados. Las Figuras 7.12, 7.13
y 7.14 muestran los gráficos de los coeficientes del modelo que describe la respuesta con su
respectivo error estándar.
Los tres modelos obtenidos fueron validados por el test ANOVA al 95 % de confianza (Valor-p <
0.05).
Figura 7.12 Gráfico de coeficientes del modelo que describe la respuesta para la determinación de
formaldehído en muestras de bio-oil por OFD-HS-SPME-GC/MS.
500 X4 *X5
X1* X4
Abundancia
0
X4 *X4 X1 *X5
X2 X3
X1 X2 *X3
-500
X4 X5
Modelo matemático propuesto para la derivatización/extracción para el formaldehído

y = 970.5 (± 59.5) – 295.1 X1 (± 44.3) - 4.4 X2 (± 44.3) + 87.8 X3 (± 44.3) – 429.5 X4 (± 44.3) –
425.2 X5 (± 44.3) + 410.1 X42 (± 74.2) + 332.7 X1* X4 (± 47.0) + 188.1 X1* X5 (± 47.0) – 350.5 X2*
X3 (± 47.0) + 434.3 X4* X5 (± 47.0).
En una reacción de derivatización, el reactivo derivatizante debe encontrarse en exceso. Aunque los
rangos de concentración evaluados en este diseño presentan un exceso de reactivo con respecto a
los aldehídos, el efecto de este parámetro es negativa (Figura 7.12), aunque cabría de esperar lo
contrario. Una posible explicación este fenómeno podría ser la sobresaturación de la fibra con
reactivo desfavoreciendo la derivatización/extracción de los aldehídos. En el caso del formaldehído,
por sus características físico-químicas, se derivatiza rápidamente, por lo cual la etapa de la sorción
del reactivo derivatizante no presenta una mayor significancia, en conjunto con la etapa de
derivatización, lo cual tanto el tiempo y la temperatura, pueden provocar una desorción de los
compuestos derivatizados o del mismo derivatizante, disminuyendo el rendimiento de la
derivatización/extracción.

Capítulo 7
acetaldehído en muestras de bio-oil por OFD-HS-SPME-GC/MS.
X4 *X5
600
Abundancia X 1* X 4
0
X2 X4 *X4 X1 *X5
X3
X1 X2 *X3
-600
X4 X5
Modelo matemático propuesto para la derivatización/extracción del acetaldehído

y = 936.2 (± 110.6) – 366.8 X1 (± 82.4) + 179.1 X2 (± 82.4) + 34.8 X3 (± 82.4) – 532.6 X4 (± 82.4)
– 508.8 X5 (± 82.4) + 596.5 X42 (± 137.9) + 437.3 X1* X4 (± 87.4) + 297.3 X1* X5 (± 87.4) – 338.7
X2* X3 (± 87.4) + 666.6 X4* X5 (± 87.4)
Para el acetaldehído, al igual que el formaldehído es posible apreciar que la concentración del
PFBHA presenta una efecto negativo en el rendimiento de la derivatización/extracción, por lo tanto
se postula que la sobresaturación del recubrimiento de la fibra puede afectar la determinación de los
compuestos en general. Sin embargo, en este modelo se aprecia que la temperatura de sorción del
PFBHA tiene un efecto significativo, lo que se puede atribuir en mayor grado a la propia
variabilidad del método.
Considerando que los analitos estudiados presentan una alta volatilidad, es posible postular que
tanto la temperatura como el tiempo de derivatización presenten una significancia negativa, ya que
ambos pueden favorecer la desorción de los compuestos ya derivatizados en la fibra. No obstante,
ambos parámetros en conjunto influyen positivamente el mayor rendimiento por esta metodología.

Capítulo 7
propionaldehído en muestras de bio-oil por OFD-HS-SPME-GC/MS.
500 X4 *X5
X1* X4
Abundancia
0
X2 X3 X4 *X4 X1 *X5
X2 *X3
-500
X1
X4 X5
Modelo matemático propuesto para la derivatización/extracción del propionaldehído

y = 678.5 (± 79.8) – 335.9 X1 (± 59.5) + 152.7 X2 (± 59.5) + 66.1 X3 (± 59.5) – 442.5 X4 (± 59.5) –
478.9 X5 (± 59.5) + 445.9 X42 (± 99.5) + 321.4 X1* X4 (± 63.1) + 182.8 X1* X5 (± 63.1) – 222.1 X2*
X3 (± 63.1) + 385.6 X4* X5 (± 63.1)
Los tres analitos estudiados, mantienen un compartimiento similar, lo cual fue esperable al tratarse
de compuestos de características físico-químicas similares.
El formaldehído presenta valores óptimos de temperaturas en la etapa de reacción inferiores a los

del acetaldehído y propionaldehído. Además de un menor tiempo de reacción. Además, este
aldehído presenta la mayor volatilidad, logrando su derivatización a temperatura ambiente y un
tiempo de 15 minutos. Temperaturas altas y tiempo excesivos favorecerán la desorción de la oxima
formaldehído-PFBHA en la etapa 2. Por ello fue necesario llegar a un compromiso, en que
temperatura y tiempo de reacción fueran lo suficientemente altos para determinar acetaldehído y
propionaldehído, sin presentar o afectar demasiado la determinación del formaldehído. En la Tabla
7.4 se resumen los parámetros operativos óptimos de la metodología.
Tabla 7.4 Parámetros operativos óptimos para la determinación de aldehídos por OFD-HS-SPME-
GC/MS.
Variables experimentales Valores óptimos
PFBHA (mg mL-1) 1
Temperatura de sorción PFBHA en la fibra (°C) 40
Tiempo de sorción del PFBHA en la fibra (min) 10
Tiempo de derivatización (min) 30
Temperatura de derivatización (°C) 40

Capítulo 7
Como medidas de índole técnicas, es necesario que las temperaturas involucradas sean iguales,
debido a que el horno no presenta un sistema de enfriamiento, lo que significaría esperar un mayor
tiempo entre la etapa 1 y 2, siendo posible la desorción del PFBHA en el recubrimiento de la fibra.
Además, es necesario que el material empleado para la disolución de la muestra de bio-oil, presente
un mayor volumen, ya que en la agitación con la fibra en el interior del vial, puede contaminar
irreversiblemente la fibra con bio-oil. Para prevenirlo, los recipientes de vidrio empleado son de 20
mL.
En la Figura 7.15 se muestra un cromatograma típico de una muestra de bio-oil, realizado en

modalidad SCAN bajo las condiciones optimizadas, tanto en el recubrimiento de la fibra, la
automatización de las etapas involucradas en el análisis y la optimización de éstas.
Figura 7.15 Cromatograma de aldehídos de bajo peso molecular por OFD-HS-SPME-GC/MS.

Señal: 1 = oxima formaldehído-PFBHA; 2 = oxima acetaldehído-PFBHA; 3 = oxima
propionaldehído-PFBHA y 4 = oxima valeraldehído-PFBHA (estándar interno).
Al igual que en el análisis de bio-oil por D-HS-GC/MS, todas las señales cromatográficas presentan
una alta resolución con un valor superior a 2.5. Además las señales cromatográficas fueron
comparadas con los espectros de masas de los estándares de aldehídos utilizados, logrando una
determinación con un alto grado de selectividad. Para efectos de cálculos de los parámetros
analíticos y la posterior cuantificación de los aldehídos presentes en la matriz de bio-oil, se optó por
considerar el área de ambas señales de cada aldehído. Con ambas metodologías optimizadas, se
determinaron los parámetros analíticos, que se resumen en la Tabla 7.5.

Capítulo 7
7.4.2.3 Determinación de parámetros analíticos y cuantificación de muestras de bio-oil por D-

HS- GC/MS y OFD-HS-SPME-GC/MS.
Los principales parámetros analíticos evaluados para ambas metodologías se presentan en la Tabla
7.5, La evaluación de la recuperación se realizó adicionando una mezcla de aldehídos a una bio-oil,
en dos niveles de concentración 50 y 100 µg L-1. La reproducibilidad intermedia fue determinada
utilizando tres diferentes bio-oil, analizados por triplicado (n=9).
Tabla 7.5 Principales parámetros analíticos obtenidos en ambas metodologías.
OFD-HS-SPME-GC/MS D-HS-GC/MS
Formaldehído Acetaldehído Propionaldehído Formaldehído Acetaldehído Propionaldehído
Ecuación de la y=0.0107x + y=0.0162x + y=0.0182x + y = 0.0305x y = 0.0213x – y = 0.0331x -
recta 0.1982 0.0093 0.2143 - 0.0303 0.4547 0.8298
R 0.9970 0.9831 0.9871 0.9989 0.9835 0.9769
LD (µg L-1) 0.2 4.4 6.4 1.2 7.1 15.2
Linealidad LCa-200 LC-200 LC-200 LC-350 LC-350 LC-350
Recuperación
89.9 84.7 81.8 89.5 73.5 66.1
en bio-oil (%)
Precisión
intermedia 8.1 6.8 11.5 8.4 5.2 23.3
(RSD)
a
LC: Límite de cuantificación.
Ambas metodologías presentan aceptables parámetros analíticos considerando que son

metodologías en que el resultado depende de la optimización de los procesos físicos-químicos
involucrados. Los limites de detección para los tres aldehídos determinados, fueron menores en la
metodología que emplea SPME, pero a su vez el rango de trabajo es menor empleando esta técnica.
Sin embargo tanto el rango lineal como el límite de detección permiten la cuantificación de
propionaldehído, especie que no fue posible cuantificar en ciertos bio-oil por encontrarse en niveles
no detectables. Las recuperaciones obtenidas por el método OFD-HS-SPME-GC/MS, presentan un
mejor porcentaje que las obtenidas por D-HS-GC/MS, esto puede corresponder a que las
condiciones de la derivatización/extracción por el sistema HS no fueron las óptimas, en especial
para el propionaldehído el cuál presenta el valor más bajo de recuperación.
La precisión intermedia se mantuvo similar para formaldehído y acetaldehído por ambas

metodologías, por lo tanto la posible desventaja que se postuló al principio de este capítulo sobre la
reproducibilidad del método OFD-HS-SPME-GC/MS puede ser descartada, considerando que los
valores determinados son satisfactorios.
Considerando las diferencias de las metodologías desarrolladas. Se analizaron 8 muestras de bio-oil

por ambas metodologías. Los resultados obtenidos de la cuantificación de las muestras de bio-oil, se
muestran en la Tabla 7.6.

Capítulo 7
Tabla 7.6 Comparación del análisis de muestras de bio-oil crudo por ambas metodologías. Los
aldehídos no detectados se abreviaron como ND.
Formaldehído (% wt) Acetaldehído (% wt) Propionaldehído (% wt)

Bio-oil
D-HS OFD-HS-SPME D-HS OFD-HS-SPME D-HS OFD-HS-SPME
1 1.6 ± 0.3 1.9 ± 0.2 0.08 ± 0.03 0.03 ± 0.01 0.03 ± 0.02 0.012 ± 0.007
2 0.8 ± 0.2 1.3 ± 0.3 0.03 ± 0.01 0.01 ± 0.01 ND LD > LC
3 1.8 ± 0.3 2.2 ± 0.2 ND 0.03 ± 0.01 ND LD > LC
4 0.9 ± 0.1 1.7 ± 0.2 0.09 ± 0.04 0.12 ± 0.07 ND 0.04 ± 0.01
5 1.1 ± 0.3 1.7 ± 0.2 0.07 ± 0.01 0.04 ± 0.01 ND 0.010 ± 0.005
6 3.2 ± 0.5 3.6 ± 0.4 ND 0.05 ± 0.01 ND 0.023 ± 0.007
7 2.1 ± 0.4 2.4 ± 0.3 0.06 ± 0.01 0.02 ± 0.01 ND 0.014 ± 0.003
8 2.3 ± 0.4 2.0 ± 0.2 0.11 ± 0.04 0.03 ± 0.01 ND 0.010 ± 0.003
Los valores (±) corresponden a la desviación estándar de cada determinación. La abreviación ND
corresponde a compuestos con niveles bajo el límite de detección. LD >LC corresponde a concentraciones en
niveles trazas, que se encuentran entre el límite de detección y el de cuantificación.
El propionaldehído no es posible cuantificar en estas muestras de bio-oil por D-HS-GC/MS, por

encontrarse en bajos niveles de concentración en estas muestras. Además cabe mencionar que por la
alta sensibilidad de estas técnicas el bio-oil debe ser diluido por lo menos 200 veces, si se utiliza
una dilución menor de la muestra para cuantificar el propionaldehído, la cuantificación del
formaldehído no sería posible, ya que se encontraría fuera de la linealidad del método.
Con la metodología OFD-HS-SPME-GC/MS es posible cuantificar los tres aldehídos, debido a la

mayor sensibilidad que presenta. Sin embargo, la principal desventaja que presenta esta técnica es la
vida útil de la fibra, esto debido a que el bio-oil al contener varios compuestos orgánicos volátiles
necesita un proceso de limpieza de la fibra después de cada inyección. Además, fue posible detectar
un efecto memoria entre los análisis. Considerando estos efectos, fue necesario implementar un
proceso de limpieza más prolongado. Sin embargo, la exposición de la fibra a altas temperaturas por
tiempos prolongados reduce la vida útil de esta, se registraron alrededor de un máximo de 20
muestras de bio-oil por fibra, sin que ésta presente señales de deterioro.
7.5 Conclusiones
Aunque se reporta en bibliografía la determinación de aldehídos por HPLC-UV previa
derivatización con 2,4-DNPH, no es la mejor opción para la determinación de aldehídos en
muestras de bio-oil debido a las interferencias que la afectan. En bibliografía no se detallaban las
condiciones de reacción y separación empleadas. Sin embargo, en el presente trabajo se comprobó
que dicho método no es lo suficientemente selectivo. Además, las condiciones de reacción (pH
ácido) pueden causar sucesivas reacciones indeseadas en la matriz de bio-oil, impidiendo la
adecuada derivatización de estas especies. Aún bajo las condiciones más favorables el método
presentaba un bajo rango lineal para el formaldehído y no era lineal para el hidroxiacetaldehído.
Como alternativa, se desarrolló una metodología más selectiva, con tratamientos de muestras que no
implican la adición de catalizadores a pH extremos, empleando la SPME como técnica de
derivatización y extracción, comunmente llamada derivatización “on-fiber” con el reactivo PFBHA.

Capítulo 7
La implementación de una metodología basada en la microextracción en fase sólida y el uso del

sistema HS mostraron un potencial analítico adecuado para el análisis de muestras de bio-oil. La
aplicación de un diseño experimental facilitó la optimización de los factores que influyen en las
etapas involucradas, junto con la automatización de la técnica. Así fue posible obtener una buena
reproducibilidad del método Además, se desarrolló una metodología en la cual la derivatización se
realiza en la solución de la muestra y la extracción de las oximas formadas es por sistema HS.
Ambas metodologías cumplen satisfactoriamente con la selectividad requerida. Sin embargo, el

método OFD-HS-SPME-GC/MS, presenta una mayor sensibilidad, y mejores porcentajes de
recuperación, siendo posible determinar selectivamente aldehídos de bajo peso molecular. Debido a
la complejidad de las muestras de bio-oil, la vida útil de las fibras utilizadas no supera las 20
inyecciones.
En el caso de la determinación de otros aldehídos de mayor peso molecular, es posible emplear este
método con la condición de re-evaluar los tiempos y temperaturas de reacción, ya que estos
parámetros son óptimos sólo para aldehídos de bajo peso molecular. No obstante uno de los
aldehídos de interés en bio-oil, el hidroxiacetaldehído, no fue posible de determinarlo por esta
metodología, por las diferentes estructuras que presenta en solución acuosa, los cuales dificultan su
derivatización, por lo que este aldehído debe ser cuantificado por el método de inyección directa por
GC/MS.

Capítulo 7
7.6 Bibliografía
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2. New Hampshire Office of Energy & Planning, Bio-oil Opportunity Analysis,
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7. M. Wang, M. Leitch, C. Charles, Synthesis of phenolic resol resins using cornstalk-derived
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8. C. Xu, M. Leitch, Production of Bio-phenols and Phenolic Resins/Adhesives from
Agricultural and Forest Biomass, Lakehead University, Ontario Canada, (2010).
9. J. Stradal, Patente US Nº 5.393.542. (1995)
10. A. Oasmaa, D. Meier, Norms and standards for fast pyrolysis liquids. Round robin test,
Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 73 (2005) 323-334.
11. A. Oasmaa, D. Meier, Characterisation, Analysis, Norms & Standards, Thermonet-Pyne SG
Report. http://www.combio-project.com/download/PDF/Thermonet_ Final_Report. pdf.
12. D. Lesueur, V. Castola, A. Bighelli, L. Conti, J. Casanova, Quantification of
Hydroxyacetaldehyde in Biomass Pyrolysis Liquid Using 13C NMR Spectroscopy,
Spectroscopy Letters, 40 (2007) 591–602.
13. S. Erhard, Determination of higher carbonyl compounds in used frying fats by HPLC of
DNPH derivatives, Anal Bioanal Chem 372 (2002) 644–648
14. D. Cardoso, S. Bettin, R. Reche, B. Lima, D. Franco, HPLC–DAD analysis of ketones as
their 2,4-dinitrophenylhydrazones in Brazilian sugar-canespirits and rum, Journal of Food
Composition and Analysis 16 (2003) 563–573
15. Y-L. Lin, P-Y. Wang, L-L. Hsieh, K-H. Ku, Y-T. Yeh, C-H. Wu, Determination of linear
aliphatic aldehydes in heavy metal containing waters by high-performance liquid
chromatography using 2,4 dinitrophenylhydrazine derivatization, Journal of
Chromatography A, 1216 (2009) 6377–6381
16. A. Saczk, M. Okumura, F. de Oliveira, M. Zanoni, N. Stradiotto, Determination of
Aldehydes and Ketones in Fuel Ethanol by High-Performance Liquid Chromatography with
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Capítulo 7
17. T. Wang, H. Tong.W, X.Y. Yan, L.Q. Sheng, Yang J, S.M. Liu, Determination of Volatile
Carbonyl Compounds in Cigarette Smoke by LC-DAD, Chromatographia 62 (2005) 631-
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18. M. Vogel, A. Büldt, U. Karst, Hydrazine reagents as derivatizing agents in environmental
analysis – a critical review, J. Anal. Chem. 366 (2000) 781–791.
19. A. Saczk, L. Okumura, M. Firmino, M. Boldrin, N. Ramos, Rapid and sensitive method for
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20. US Environmental Protection Agency, Determination of carbonyl compounds in drinking
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21. C. Deng, N. Li, X. Zhang, Development of headspace solid-phase microextraction with on-
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22. P. Martos, J. Pawliszyn, Sampling and Determination of Formaldehyde Using Solid-Phase
Microextraction with On-Fiber Derivatization, Anal. Chem. 70 (1998) 2311-2320.
23. B. Cancho , F. Ventura , M.T. Galceran, Determination of aldehydes in drinking water
using pentafluorobenzylhydroxylamine derivatization and solid-phase microextraction,
Journal of Chromatography A, 943 (2001) 1–13.
24. B. Pacolay, J. Ham, J.R. Wells, Use of solid-phase microextraction to detect and quantify
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25. J. Pawliszyn, Handbook of Solid Phase Microextraction, Chemical Industry Press, China,
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26. Z. Li, L. Jacobus, P. Wuelfing, M. Golden, G. Martin, R. Reed, Detection and
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headspace gas chromatography, Journal of Chromatography A, 1104 (2006) 1–10.
27. J. Beránek, A. Kubátová, Evaluation of solid-phase microextraction methods for
determination of trace concentration aldehydes in aqueous solution, Journal of
28. D. Saison, D. De Schutter, F. Delvaux, Determination of carbonyl compounds in beer by
derivatisation and headspace solid-phase microextraction in combination with gas
chromatography and mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 5061–
5068.
29. Q. Wang, J. O’Reilly, J. Pawliszyn, Determination of low-molecular mass aldehydes by
automated headspace solid-phase microextraction with in-fibre derivatization, Journal of
30. J. Kozie, J. Noah, J. Pawliszyn, Field Sampling and Determination of Formaldehyde in
Indoor Air with Solid-Phase Microextraction and On-Fiber Derivatization, Environ. Sci.
Technol. 35 (2001) 1481-1486.

Conclusión General
CONCLUSIÓN GENERAL
Las metodologías analíticas desarrolladas en el marco de esta tesis representan un avance para el
estudio del bio-oil. Siendo el principal objetivo de este trabajo incrementar la selectividad analítica,
debido a la alta complejidad de la matriz, fue posible también desarrollar metodologías con
adecuada sensibilidad, logrando límites de detección que permiten cuantificar los analitos de interés
en muestras que presentan una alta dilución.
La determinación de compuestos en el bio-oil por inyección directa en GC/MS/FID es una buena

opción en la caracterización general del bio-oil, por lo cual será siempre una herramienta muy útil
en ese sentido. Sin embargo, algunos analitos de interés no pueden ser determinados por esta
metodología, por presentar propiedades físico-químicas que los hacen incompatibles con la
inyección directa. Cabe destacar que ésta permite cuantificar hidroxiacetaldehído, cuya
determinación por otras metodologías alternativas se ve dificultada por presentarse en diferentes
formas químicas en solución.
Por otro parte, debido a la presencia de interferentes en el bio-oil, es necesario implementar

métodos de pre-tratamiento de la muestra, que permitan una resolución de las posibles
interferencias y el análisis de diferentes grupos de compuestos por separado.
Mediante cromatografía liquida de alta resolución, en la modalidad de fase inversa en serie con
exclusión iónica y detección directa al UV a 210 nm, es posible la determinación por inyección
directa de ácidos orgánicos (fórmico, acético y propiónico) en fracciones de bio-oil obtenidas por
destilación. Ello no requiere un tratamiento previo de la muestra, sin embargo esta metodología no
es aplicable a muestras de bio-oil crudo, por los interferentes que éste contiene.
La determinación de los principales azúcares por HPTLC, muestra una metodología sencilla, en la
cual no se necesita un tratamiento de la muestra de bio-oil y además puede ser utilizada en las
diferentes fracciones obtenidas a partir de bio-oil crudo, incluyendo la lignina pirolítica. No
obstante, es necesario emplear un método de screening para la determinación de la presencia de
glucosa, ya que ésta, de estar presente a concentraciones mayores en bio-oil, pueden interferir en la
determinación del celobiosano.
La cromatografía gaseosa permite la determinación del mayor número de compuestos volátiles en

bio-oil. Sin embargo, algunos analitos de interés presentan incompatibilidad con el sistema
cromatográfico. Ello se supera en la mayoría de los casos mediante su derivatización. La
determinación de aldehídos empleando el sistema OFD-HS-SPME-GC/MS permite mejorar la
selectividad y sensibilidad de dos pasos críticos, la extracción de los compuestos más volátiles y la
derivatización de los aldehídos de bajo peso molecular. Con este método es posible la
determinación de formaldehído en bio-oil, cuya determinación es especialmente relevante desde el
punto de vista toxicológico.
Los ácidos orgánicos y azúcares se pueden determinar de forma simultánea por GC-MS mediante la
derivatización con BSTFA, logrando la cuantificación de ácidos orgánicos (fórmico, propiónico,
Conclusión General
acético, láctico entre otros) y azúcares (levoglucosano y celobiosano, entre otros). Tanto la OFD-
HS-SPME-GC/MS como la GC-MS previa derivatización con BSTFA permiten incrementar el
número de analitos a determinar. En el caso de los aldehídos alifáticos, es posible incluir
compuestos con mayor número de carbonos. En la derivatización con BSTFA se puede determinar
un mayor número de azúcares y ácidos de interés, junto con otros compuestos que puedan ser
derivatizados.
Dependiendo del objetivo del análisis del bio-oil, las metodologías propuestas pueden ser
empleadas de forma individual o en forma combinada con la caracterización general del bio-oil por
inyección directa en GC/MS. De esta forma es posible la cuantificación de los compuestos en el
bio-oil que presentan un alto interés a nivel industrial.
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Desarrollo de metodologías Analíticas para la

Thesis · October 2011

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TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALITICAS PARA LA CARACTERIZACIÓN

CATHERINE VALESKA TESSINI ORTIZ

Profesor Tutor Dr. Dietrich von Baer von Lochow

Departamento de Análisis Instrumental

Dr. Dietrich von Baer von Lochow

Dra. Claudia Mardones Peña

Dr. Alex Berg Gebert

Dr. Edward Fuentes Pérez

Dr. Carlos Peña Farfal

Decano Facultad de Farmacia

Dr. Carlos Calvo Monfil

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica iii

El presente trabajo de investigación ha sido realizado en el Departamento de Análisis Instrumental

La investigación desarrollada se ha financiado a través de los proyectos PFB-27/PCS 003,

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica iv

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica v

CAPÍTULO 2 Hipótesis y objetivos.................................................................................................26

CAPÍTULO 3 Estrategia analítica y material de estudio ..................................................................28

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica ii

CAPÍTULO 5 Desarrollo de metodología analítica para la determinación de azúcares en bio-oil por

CAPÍTULO 6 Determinación de ácidos orgánicos en bio-oil por HPLC-UV y su determinación

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica iii

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica iv

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica v

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica vi

Tabla 1.1 Productos y rendimientos típicos, obtenidos en distintas condiciones de pirólisis……….3

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica vii

Figura 1.1 Diagrama general propuesto en la pirólisis rápida de biomasa…………………………..4

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica viii

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica ix

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica x

En la presente tesis se desarrollaron y evaluaron diferentes metodologías para la determinación de

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica xi

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica xii

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica xiii

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica xiv

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica 1

c) Biomasa residual húmeda: Procede de vertidos biodegradables formados por aguas

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica 2

Tabla 1.1 Productos y rendimientos típicos, obtenidos en distintas condiciones de pirólisis 6.

Liquido Carbón Gas

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica 3

Figura 1.1 Diagrama general propuesto en la pirólisis rápida de biomasa7.

Considerando que el producto principal de la pirólisis rápida de biomasa forestal es el bio-oil, es

Figura 1.2 Procesos de conversión térmica, productos principales y sus aplicaciones 7.

El bio-oil se obtiene por despolimerización y fragmentación rápida y simultánea de celulosa,

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica 4

También se produce la degradación de hemicelulosa, entre 200-260 °C, generando principalmente

Líquido oscuro, de color café. Dependiendo de la materia prima inicial y el

El líquido contiene cantidades variables de agua, que van desde un 15 % en

La complejidad y la naturaleza del bio-oil, provoca un comportamiento

Modificado de: A. Bridgwater, Bio-Energy Research Group, Aston University, 2004

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica 5

El bio-oil posee capacidad calorífica (alrededor de 16 – 17 MJ Kg-1), y una gran variedad de

Tabla 1.3 Algunas Propiedades físicas del bio-oil8.

Parámetros Valor típico Rango

Doctorado en Ciencias y Tecnología Analítica 6

Tabla 1.4 Principales compuestos presentes en el bio-oil9.

Compuestos Porcentaje en peso