Profesor: PhD.

Gerardo Andrés Caicedo Pineda

INFORME DE LABORATORIO No. #6

Curso: Bioquímica I

Estudiante(s): Sandra Milena Alonso Villate, William Fernando Berdugo Vargas,

Cristian Leonardo Pinto Mora

Título de la práctica: Identificación, propiedades y cinética de la catalasa

1. Breve descripción del trabajo de la práctica (¿Qué hicieron?):

En la práctica se extrajo catalasa a partir de la papa. Para esto, se peló la papa

se cortó y maceró, luego se agregó agua destilada y se filtró. Posteriormente se
utilizó este filtrado (que contenía la catalasa) con el fin de observar la actividad
catalítica. Se prepararon diferentes soluciones con extracto enzimático y H2O2 a
ciertas concentraciones, luego de 5 minutos se adicionaron 2mL de H2SO4. Al
final, se tituló el H2O2 no descompuesto con KMnO4.

2. Objetivo de la práctica (¿Para qué lo hicieron?):

El objetivo de esta práctica fue describir el cambio sufrido por la velocidad de

una reacción catalizada por una enzima al variar la concentración del sustrato y
mediante estos datos determinar la constante de Michaelis y la velocidad máxima
de reacción utilizando dos métodos diferentes: Michaelis Menten y Lineaweaver-
Burk, para finalmente comparar los resultados.

3. Breve descripción de la metodología (¿Cómo lo hicieron?):

Inicialmente se tomó una papa pequeña se peló, se cortó en trozos y

posteriormente se maceró a este se le agrego 100mL de agua destilada, se agitó
durante 10 minutos y se filtró, en el filtrado se encuentra la enzima (catalasa).

Primero se tomaron 5mL de filtrado que contenía la enzima, se puso en baño

maría y se dejó hervir durante unos minutos. Posteriormente se tomaron 5 tubos
de ensayo y se enumeraron, a cada tubo se le agregó solución de peróxido de
hidrogeno 0.1N en los siguientes volúmenes: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 y se completó
el volumen a 5 mL con agua destilada, luego se le agrego 1 mL de la solución de
enzima a cada tubo.

Se preparó un sexto tubo, con un volumen de 2.5 mL de peróxido 2.5mL de agua

destilada y 1 mL de enzima hervida. Se mezcló el contenido de cada uno de los
tubos y se dejó reposar por 5 minutos posteriormente se agregaron 2 mL de

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solución de ácido sulfúrico y se procedió a titular hasta que se observó un color

rosa pálido indicando el punto final.

4. Gráficos y/o tablas y/o valores y explicación de los resultados (¿Qué

obtuvieron?):

Figura N°1.evidencia de los tubos con las muestras y soluciones agregadas

En la figura 1 se observan cada uno de los tubos con sus respectivas cantidades
de extracto de papa y sus respectivas diluciones con peróxido de hidrogeno
diluciones

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concentracion vs velocidad
0.006

0.005
velocidad (M/min)

0.004

0.003

0.002

0.001

0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
concentracion inicial (M

Grafica N°1. Grafica de Lineweaver-Burk

En la gráfica número 1 se observa como la velocidad V que indica el número de

moléculas del sustrato que se convierten en producto, responde a la variación de
sustrato. Con concentraciones crecientes de sustrato [S], la enzima va
acercándose asintóticamente a su velocidad máxima Vmax, pero nunca la
alcanza. Por esta razón, no hay un valor de [S] determinado para la Vmax. De
todas formas, se puede definir un parámetro característico de la enzima
empleando la concentración de sustrato a la cual se alcanza la mitad de la
velocidad máxima (Vmax/2), en este punto la [S] es igual a la Km. Valores bajos
de Km indican que el complejo está unido muy fuertemente y raramente se
disocia sin que el sustrato reaccione para dar producto.

Se observa como no se alcanza una velocidad máxima lo que nos indica que
faltaron datos para determinar la tendencia logarítmica que se encuentra
reportada en la literatura.

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1/concentracion vs 1/velocidad
1000 y = -1.4745x + 869.89
900 R² = 0.806
800
700
1/v (min/M)

600
500
400
300
200
100
0
0 100 200 300 400 500 600
1/C0 (1/M)

Grafica N°2. Gráfica de Lineweaver-Burk

La grafica numero 2 representa la relación de 1/V frente a 1/S, esto es la inversa

de la velocidad frente a la inversa de la concentración, permite identificar la Km
(constante de Michaelis-Menten) y Vmax (velocidad máxima); el punto de corte
con el eje de ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmax, y el de abscisas
es el valor de –1/ Km, siendo la pendiente Km/Vmax.

Como los datos presentan una dispersión significativa los datos hallados no son
confiables lo cual se les atribuye a errores experimentales, que al implementar
los dobles inversos se convierten en errores significativos.

Parámetro Grafico Gráfico %

cinético Michaelis- Lineweaver- error
Menten Burk

Vmax 5,075 x10-3 1.123x10-3 67,87

M/min M/min

Km 2.537x10-3 1.813x10-3 28,53

M M

Tabla N°1.recopilacion de los valores de Vmax y Km por los dos métodos

utilizados

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Los datos obtenidos presen diferencias significativas esto se a atribuye a que en

el método de Michaelis-Menten no se observó la Vmax, por lo tanto, se asumió
como el mayor punto obtenido y que en el método de Lineweaver-Burk los datos
de la gráfica N°2 fueron muy disperso lo que afecta en la ecuación de la recta
estos factores ocasionan los grandes porcentajes de error obtenidos.

La reacción de la catalasa sobre el H2O2, es la siguiente

CATALASA
2H2O2 2H2O + O2

5H2O2 +2KMnO4 5H2O2

¿Qué pasa con el tubo con la enzima hervida?

Ya que la catalasa químicamente es una proteína, podemos desnaturalizarla al

someterla a altas temperaturas.

Al perder la estructura terciaria, perderá también la función y como

consecuencia su función catalítica, por lo que no podrá descomponer el agua
oxigenada y no se observará ningún tipo de reacción cuando hagamos la
experiencia anterior con muestras de tejidos hervidos.

5. Conclusiones de los estudiantes:

La gráfica de Lineweaver-Burk presenta algunos inconvenientes ya que, al

requerir de dobles inversos, algunos pequeños errores experimentales conducen
a grandes errores. Además, el hecho de que a altas concentraciones los puntos
se aglutinen al principio de la gráfica puede dar lugar a cálculos erróneos. Sin
embargo.

La desnaturalización de la catalasa provoca la pérdida de su función,

impidiendo así la transformación del H2O2 en O2 y H2O.

Se demostró que a mayor concentración de sustrato (en el intervalo de

concentraciones manejadas) hay un efecto positivo en la velocidad de reacción.
Se representó gráficamente la actividad enzimática, ajustando al modelo de
MichaelisMenten (gráfica 2); hicimos el ajuste lineal según la representación de
Lineweaver-Burk y de Hanes para estimar los parámetros cinéticos usando
factores de peso.

Las enzimas son biocatalizadores que sirven para acelerar los procesos, son
sustancias de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas siempre que

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sea termodinámicamente posible. La importancia de una enzima es que aceleran

las reacciones, en los vegetales las enzimas constituyen el principal catalizador
de las reacciones indeseables del pardea miento de tipo enzimático lo cual hace
que las frutas o vegetales maduren mucho más rápido

6. Comparación o asociación de los resultados con un artículo científico

(debe ser en inglés y al final se escribe la referencia: Apellido1 N1., …,
Apellidon Nn. Título del artículo. Revista, vol. x, pp. xx-xx, año).

Keilin D., Hartree E. On the mechanism of the descomposition of hidrogen

peroxide by catalase. Royal Society of London, series B, biological sciences, vol
124, N° 837, pp 397-405, 1938.

Chance B. The primary and secondary compounds of catalase and methyl or

ethyl hidrogen peroxide (kinetics and activity). Journal of biological chemestry,
Vol. 179, p.p 1341-1369, 1949.

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