UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE ZOOTECNIA

ESCUELA PROFESIONAL DE ZOOTECNIA

IDENTIFICACION BIOQUIMICA DE BACTERIAS

CURSO : MICROBIOLOGÍA ANIMAL

Docente : Med. Vet. TAFUR ZEVALLOS Lisandro Roger.

Estudiante : LUNA ROSALES, Jeanpier Yojairo

Semestre académico : 2017- II

TINGO MARÍA – PERÚ

2017
 I. INTRODUCCION

Los microorganismos a diferencia de las plantas no son capaces de crear materia

orgánica a partir de elementos inorgánicos, por eso, han de nutrirse a expensa del
medio en que se encuentren, y de ahí que en el interior de estos ocurran una serie
de reacciones de síntesis y de descomposición de sustancias orgánicas, las
cuales reciben el nombre de metabolismo. A partir de estas características
metabólicas se realizan pruebas obtenidas para la identificación de
microorganismos y productos obtenidos de la relación microorganismo-medio.
Otro de los aspectos importantes de la realización de estas pruebas, es que a
partir de estas ayudan a dar una respuesta ante la posible contaminación de los
alimentos por medio de microorganismos patógenos. Las técnicas de bioquímica
han proporcionado una herramienta útil para la detección directa de los
microorganismos contaminantes. La identificación bacteriana se puede realizar por
medio de una serie de análisis que necesitan de diferentes cultivos y
procedimientos para llegar a identificar las especies bacterianas que contaminan
los alimentos o las aguas.

Objetivos

Realizar y analizar las diferentes técnicas de identificación bacteriana.

 II. REVISION BIBLIOGRAFICA

Pruebas bioquímicas. Las pruebas bioquímicas permiten determinar las

características metabólicas de las bacterias objeto de identificación.
Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan la presencia de
una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas
horas. Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo
con una incubación previa de 18 a 48h; a este grupo pertenecen la mayoría de las
pruebas que detectan componentes metabólicos o aquellas que determinan la
sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios de
identificación que contienen el sustrato a metabolizar. No obstante, algunas de
estas pruebas pueden realizarse de forma rápida tras incubación de unas 2-6h; en
general, se trata de reacciones enzimáticas cromogénicas o pruebas
convencionales modificadas (hay discos o tabletas comercializados con substratos
cromogénicos para uso individualizado)

En esquema, la realización de una prueba bioquímica implica:

1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o
inhibidor y luego de la incubación visualizar el crecimiento y la degradación de un
sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador
de la presencia del sustrato, o de algún producto de su degradación.
2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagación que contenga el
sustrato de una enzima inducible y luego de la incubación demostrar la actividad
enzimática.
En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 horas. de incubación) en
un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza
iónica, atmósfera y temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote
de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes
controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa
para ese test.
Si bien existe una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas con fines de
identificación, se enumerarán a continuación solo las que se utilizan más
frecuentemente, agrupadas según el tipo de ensayo y se denominan según su
nombre corriente.

Pruebas que se utilizan en la identificación preliminar, con lectura inmediata:

1. Catalasa. La catalasa es un enzima presente en la mayoría de los
microorganismos que poseen citocromos. Las bacterias que sintetizan
catalasa hidrolizan el peróxido de hidrógeno en agua y oxigeno gaseoso
que se libera en forma de burbujas. El principal objetivo de esta prueba es
separar Micrococacceae (positiva) de Streptococcus spp. y Enterococcus
spp. (negativa).
2. Oxidasa. Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas
oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema
citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo el cual es reducido
por el oxígeno molecular produciéndose agua o peróxido de hidrógeno
seg˙n la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final
de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el
sistema citocromooxidasa solo se encuentra en las bacterias aerobias,
algunas anaerobias facultativas y, excepcionalmente, en alguna
microaerofila (Vibrio fetus), pero las bacterias anaerobias estrictas carecen
de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la
producción de catalasa, ya que esta degrada el peróxido de hidrógeno que
se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya
acumulación es tóxica.
3. Coagulasa. La coagulasa es una enzima producida por Staphylococcus
(S.aureus), es relativamente termoestable, ya que resiste temperaturas de
hasta 60 °C durante 30 min. Probablemente de naturaleza proteica, Es
fácilmente inactivada por las enzimas proteolíticas, Estimula la conversión
de fibrógeno en fibrina (coágulo).
 Comprueba la facultad de un microorganismo de coagular el plasma por
acción de esta enzima.
La prueba coagulasa se utiliza de manera específica en la diferenciación de
especies pertenecientes al género Staphylococcus: S. aureus
(Generalmente de reacción positiva) y S. epidermis (-), por lo general una
prueba de la coagulasa positiva es el criterio de diagnóstico final para la
identificación de Staphylococcus. Frecuentemente esta prueba es utilizada
como índice de virulencia o patogenicidad.

PRUEBA DE MOTILIDAD.

La motilidad se puede observar por un crecimiento turbio lejos de la picadura

realizada en la inoculación de los medios OF o en un medio SIM, este método es
de confianza variable ya que la picadura se pudo haber hecho chueca o irregular
lo que nos darían falso positivo. Para evitar este factor se realiza la técnica de
gota suspendida bacteriana.

Técnica de gota suspendida: Agregar sobre un portaobjetos una gota de solución

fisiológica salina estéril, ponerle un poco de muestra bacteriana, homogeneizar de
tal forma que la gota no se extienda mucho, ponerle encima un cubreobjetos al
que previamente se le a puesto una base de 4 bolitas pequeñas de plastilina con
el objetivo de evitar que aplaste totalmente la gota con bacteria, finalmente
observar al microscopio con un objetivo de 40X.

Se alcanzan haber bacterias muy pequeñas y casi translúcidas moverse a

velocidad variable, observar al menos de 5-10 bacterias recorrer todo el campo de
visión para declarase una motilidad positiva. La mayoría de las bacterias motiles
son de morfología bacilar o sea Bacilos., Pero no todos los bacilos son motiles.
UREASA MEDIO PARA LA PRUEBA

Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la actividad

ureásica.
Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp. De otros miembros de la
familia Enterobacteriaceae. Fundamento

Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo contenido
de nutrientes y alta capacidad buffer.

El extracto de levadura es la única fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y

cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. Las
sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de
pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.

Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrógeno

proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amoníaco y dióxido de carbono.
Estos productos metabólicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo
fenol del amarillo al rojo.

Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros géneros.

Para organismos que hidrolizan la urea lentamente, es recomendable usar el
medio de Christensen (B02-109-05, B02-109-06).

TSI AGAR

Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en

base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido
sulfhídrico.
Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los
nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa
son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato
necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es
la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y
producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y
el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.

Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del
indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de
sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de
hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

SIMMONS CITRATO AGAR

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad

de usar citrato como única fuente de carbono y energía.
Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el
citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son
necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema
buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en
medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los
microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan
sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción
de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato

permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato
da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio
alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de
carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al
azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.
 III. MATERIALES Y METODOS

3.1. Lugar y Fecha.

La presente práctica se desarrolló el día miércoles 22 de noviembre y 5 de
diciembre del presente año en el laboratorio de SANIDAD ANIMAL de la
Facultad de Zootecnia, de La Universidad Nacional Agraria de la Selva, en
la ciudad de Tingo María, Provincia de Leoncio Prado, Departamento de
Huánuco a coordenadas geográficas: Latitud Sur: 9º17’08”, Longitud Oeste:
75º59’52”, a 660 m.s.n.m, con un temperatura promedia de 27º C
aproximadamente.

3.2. Materiales
 Plasma de conejo liofilizado
 Muestra de bacteria estafilococo
 Incubadora
 Asa de siembra
 Agua destilada
 Medio simple
 Tubo de ensayo
 Aguja de inoculación
3.3. Métodos
Prueba de coagulasa
 Mesclar 0.5 ml de plasma de conejo liofilizado con 0.5ml de agua
destilada.
 Deje que el plasma se atempere a 25oC.
 Inocule con una colonia de estafilococo que haya crecido en
medio no inhibitorio.
 Incube a 35oC sin CO2 hasta por 4 horas y observe la formación
del coágulo cada hora. No agite el tubo durante las
observaciones, debe inclinarlo.
  No deje la prueba a 35oC por más de 4 horas puesto que S.
aureus produce una fibrinolisina que puede lisar el coágulo
 Incube por 20 horas adicionales a 25oC para la formación del
coágulo tardía.

Prueba de catalasa

 Tomar un porta objetos y añadir 1 gota de peróxido de hidrógeno

 Tomar una pequeña muestra de bacterias con el asa de siembra
y suspender en el porta objetos junto con la gota de peróxido de
hidrogeno

Prueba de motilidad

 Preparado el agar de medio simple en un tubo de ensayo

 A partir de un cultivo de 18 a 24 horas en medio solido
 Sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta, en
el centro del tubo
 La punción debe abarcar 2 tercios de la profundidad del medio
desde la superficie
 Es importante que la siembra se realice en línea recta
 Incubar durante 24 horas a 35 a 37° C en presencia de oxigeno

Prueba de ureasa
 Preparado el agar para la prueba de ureasa en un tubo de
ensayo
 Se siembra el microorganismo por estría y en pico de flauta no
hacer punción
 Se incuba a 35 a 37° C durante 24 horas.
Prueba de TSI
 Preparado el agar para la prueba de TSI en un tubo de ensayo
 Realizar una punción en el fondo y una estría en el bisel
 Incubar a 35 a 37° C por 18 a 24 horas.

Prueba del citrato

 Preparado el agar para la prueba de TSI en un tubo de ensayo
 Se siembra por estría en el bisel se incuba de 24 a 48 horas a
37° C
 IV. RESULTADOS

INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE COAGULASA

Positivo: Cualquier grado de formación del coágulo antes de 24 horas.
Negativo: No hay formación del coágulo a las 24 horas a 25°C
Reporte como S. aureus si la prueba es positiva y el organismo es catalasa
positivo con colonias de cocos gram-positivos en acúmulos.
Si obtiene un resultado negativo de colonias cremosas, blancas, catalasa
positivas, con cocos gram-positivos en acúmulos, reporte como “estafilococo
coagulasa-negativa”.

INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CATALASA POSITIVA

Si la bacteria tratada para esta prueba da como resultado burbujas en el
Portaobjeto es catalasa positiva y si no presenta burbujas es catalasa negativa.

INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE MOTILIDAD

Si la cepas son móviles producen turbidez del medio en nuestro caso el medio de
nuestro tubo de ensayo se enturbecio entonces se puede decir que las bacterias
que sembramos tenían flagelos
INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE UREASA
Positivo rosado intenso en el pico de flauta en nuestro caso nuestra muestra
resulto positivo

INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE TSI

Bisel acido si se vuelve amarillo la bacteria fermenta lactosa y sacarosa positivo
para nuestra prueba
La aparición de burbujas en el fondo indica que la fermentación de ha producido
con la producción de gas positivo para nuestra prueba
INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CITRATO

Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo

bacteriano y no hay cambio de color ¨negativo para nuestra prueba¨
 V. CONCLUSION

En conclusión se logró aprender los pasos que hay que tener en cuenta para la
pruebas de identificación bioquímica de bacterias como la prueba de catalasa,
coagulasa, motilidad, ureasa, TSI y citrato.
También se logró ver como como se da una prueba de catalasa positiva,
coagulasa positiva prueba de motilidad positiva prueba de ureasa positiva prueba
de TSI positiva y prueba de citrato negativa.

VI. RECOMENDACIÓN

Hay que tener en cuenta que el plasma de conejo liofilizado que utilicemos para la
prueba no debe estar contaminado debe estar en zona estéril libre de
microrganismos.
 VII. BIBLIOGRAFIA

Mac Faddin J. F. 2003. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de

importancia clínica. 3ª edición Médica Panamericana, S. A. De C. V. México

Vullo, D., M. Wachsman, L. Alche. 2000. Microbiología en Práctica. Manual de

laboratorio para la enseñanza de Microbiología básica y aplicada. 1ª edición.
Atlante S. R. L. Argentina

https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiolo
gia/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdf

https://es.scribd.com/doc/50402732/PRUEBAS-BIOQUIMICAS-DE
IDENTIFICACION-BACTERIANA-26-pp