EXTRACCION DE ADN Y DETECCIÓN DEL PROVIRUS DE LEUCOSIS BOVINA A

TRAVÉS DE PCR ANIDADA

C. A. Sepúlveda P, J. E. Salcedo P.

Laboratorio de biología molecular, marzo de 2018

Universidad Cooperativa de Colombia – UCC – Bucaramanga, Colombia

Introducción

La leucosis bovina apareció en el país hace más de 40 años. Desde ese momento los
ganaderos descubrieron que su hato estaba en riesgo por otra patología, la cual no ha
sido erradicada; todo lo contrario, los casos de infección han aumentado (Cotrino, V.
2015).

El virus de la leucosis bovina pertenece a la familia reto-viridae, posee una transcriptasa-

reversa responsable de la síntesis de una copia de ADN a partir de ARN viral. El ADN
formado (provirus) se integra al genoma del hospedero y se conserva en el núcleo de
diversas células (Evermann, 1992).

La manifestación clínica de la leucosis bovina comienza después de dos años de edad

como anemia emaciación e infertilidad. El signo más evidente es el aumento bilateral más
o menos simétrico de los ganglios linfáticos explorables, la exoftalmia puede considerarse
como una manifestación especifica de la enfermedad así como masas tumorales
subcutáneas en diferentes localizaciones (linfoadenopatías) (Chamizo, 2005; Malatestinic,
2003; Shell et ál., 2004).

La PCR se ha utilizado para la detección temprana del virus de la leucosis bovina en

animales de seis meses para evitar reacciones falsas positivas, causadas por la
transferencia pasiva de inmunoglobulinas a través del calostro. Otra ventaja radica en la
capacidad para detectar el virus en animales inmunotolerantes, además, muestra una
sensibilidad de 96% y una especifidad del 45% con respecto a la prueba de IGDA
(Agresti et ál., 1993; Fechner et ál., 1996)
El desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ideado por K. Mullis, es un
método sencillo con el cual es posible la “amplificación in vitro” de segmentos de DNA,
utilizando un serie sucesiva de incubaciones a diferentes temperaturas de una mezcla de
reacción catalizada por DNA-polimerasa termoestable. Dicho método esta precedido por
la extracción de ADN

El ADN se encuentra en los núcleos celulares, siendo liberado mediante rompimiento de

la membrana celular por la acción de un detergente iónico. Las proteínas son removidas
por medio de una alta concentración salina y el ADN es recuperado por precipitación con
Isopropanol. En un tiempo de 1 a 2 horas se obtiene entre 5 y 15 g de DNA de alta
calidad a partir de 350 l de sangre total, con la ventaja de no utilizar solventes orgánicos
tóxicos. CorpoGen DNA 2000 es un kit diseñado para el aislamiento de ADN humano de
alta calidad a partir de muestras de sangre. Este kit puede ser utilizado en el aislamiento
de ADN a partir de sangre de mamíferos, sin necesidad de introducir modificaciones. El
ADN obtenido es apto para estudios de PCR, Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de
Restricción (RFLPs), Amplificación Aleatoria de ADN Polimórfico (RAPDs), etc.

La reacción en cadena de la polimerasa se realiza en tres etapas que constituyen un ciclo,

que repite durante un número determinado de veces. El tiempo, la temperatura y el
número de ciclos son factores determinantes en los resultados de la PCR. Para la
visualización del gen amplificado por la técnica de PCR, es necesaria la evaluación de los
productos por la técnica de electroforesis que por medio de un medio poroso y en un
campo eléctrico permite la separación de las moléculas de acuerdo a su carga eléctrica y
masa molecular. Visualizando finalmente por transiluminador de luz UV.

Dicha visualización nos permite determinar de una manera mas efectiva la presencia del
provirus y diagnostica efectivamente la enfermedad.

Materiales

 Equipos
- Microcentrífuga.
- Vortex.
- Micropipetas 100-1000ul.
 - Puntas para micropipetas.
- Cámara de electroforesis horizontal.
- Termociclador.

 Materiales y reactivos
- Hielo.
- Isopropanol.
- Viales de 2mL
- Sangre con anticoagulante 2-5ml.
- Kit de extracción de DNA 2000 de CORPOGEN.
- Taq polimerasa.
- Nucleótidos.
- ClMg.
- Agarosa.
- Buffer de carga.
- Colorante AZ-Vision Amresco.

Metodología

 Primera fase práctica: extracción de ADN de leucocitos en muestras de sangre

(kit para aislamiento de ADN, CORPOGEN®).

- Se tomó una muestra de 2 a 5ml de sangre sobre anticoagulante EDTA.

Suministrada por la docente.
- Se tomaron 400 l de leucocitos y se transfirieron a un vial de 1.5 ml.
- Se lavaron las muestras cuatro(4), veces con 1000 l de solución de lavado N° 1,
para eliminar por lisis celular la mayoría de los glóbulos rojos, se agito con Vortex
durante 20 seg entre lavado y lavado, luego se centrifugo a 14000 rpm x 1 minuto
cada lavado, a – 4 ºC y se eliminó el sobrenadante por inversión.
- Luego se adicionaron 500 l de la solución N° 2, se agito por 1 minuto hasta
homogenizar.
- Se adicionaron 500l de la solución salina N° 3, para desproteinizar la
preparación, agitando en Vortex por 20seg, hasta homogenizar, y se incubo en
hielo durante 5 minutos para facilitar la preparación de proteínas.
- Paso seguido se centrífugo en la microcentrífuga a 14000 rpm x 10 minutos.
- Se tomó con Micropipeta 1000l del sobrenadante, teniendo cuidado de no
llevarse el precipitado y transferirlo a un nuevo vial de 1.5ml.
- Finalmente se precipito el ADN añadiendo 600l de Isopropanol, agitando
suavemente por inversión, generalmente se aprecia la formación de la malla de
ADN.

 Segunda fase práctica: Protocolo de extracción de ADN de los provirus de

leucosis enzoótica bovina. Utilizando el Kit DNA2000® de corpogen s.a.
Para esta segunda fase se utilizaron muestras proporcionadas por la docente.

PCR anidada para la amplificación de la porción de 444 pb del gen de los provirus
de leucosis bovina.

Para la mezcla de la PCR semianidada se trabaja un volumen de 26l, la tabla

siguiente describe los volúmenes y concentraciones de los reactivos.

Nota: se trabajaron los volúmenes por 5, para tener la cantidad necesearia de

mezcla para todos los grupos de laboratorio.
 Programación del termociclador.

Fuente: Jiménez, A. P.

 Evaluación de los amplificados por Electroforesis en Gel de Agarosa al 1.5%

- Se colocó 1,5g de agarosa en el frasco Scott, con 100mL de TAE 1X. o Buffer de
corrido.
- En microondas, esta mezcla se calentó hasta que la agarosa se disolvió en el
tampón.
- Se añadieron 10 uL de colorante AZ- Visiom Amresco, y se mezcló suavemente.
- La solución se vertió en la cámara de electroforesis horizontal. Colocando
previamente los peines y dejando que el gel se enfrié y así solidifique.
- Se vertió la solución de TAE 1X o Buffer de corrido dentro de la cámara de
electroforesis, el gel debe quedar ligeramente sumergido en el tampón el cual
conduce la corriente desde un extremo del gel al opuesto.
- Se tomó con Micropipeta 3l del buffer de carga y 7l de ADN de la muestra.
- Se colocó cada muestra en un carril, y se adiciono patrón de peso molecular.
- Se prendió la fuente de poder y conecto la corriente eléctrica a 75 voltios durante 1
hora y 20 minutos.
- Finalmente se colocó el gel en el transiluminador UV, y observamos los patrones
de bandas, comparando con el patrón de peso molecular.
Resultados y discusión

 En la extracción de ADN realizada se utilizó el kit (CorpoGen DNA 2000) el cual

está diseñado para el aislamiento de ADN humano de alta calidad a partir de
muestras de sangre; esta extracción fue realizada satisfactoriamente y no se
efectuó la cuantificación de dicha muestra obtenida (ver figura 1).

Figura 1. Hebra de ADN.

Fuente. Autores

 La primera amplificación de la PCR anidada (porción 444 pb del gen de los

provirus de leucosis bovina) fue suministrada por la docente. El producto de la
primera amplificación se empleó como molde para la segunda reacción o PCR
semianidada, la cual amplifico la porción de 444pb del gen env glicoproteína de
envoltua, con los iniciadores específicos: 5´ CCC-ACAAGG-GCG-GCG-CCG-GTT-
T 3´, 5´GCG-AGG-CCG-GGT-CCA-GAG-CTG-G 3´. Después de realizada la
amplificación se realiza una evaluación por Electroforesis en Gel de Agarosa al
1.5% (ver figura 2).
 Figura 2. Electroforesis en Gel de Agarosa al 1.5%

Fuente. Autores

Superior 100 patrón de peso molecular 100 pares de bases, 25 patrón de peso molecular
25 pares de bases, 100 patrón de peso molecular 100 pares de bases, A1X muestra
equivocada, A2 muestra PCR realizada, A3 muestra PCR realizada (nuestro grupo de
trabajo), A4 muestra PCR realizada, R reactivo, R+H2O reactivo y agua.

Inferior 100 patrón de peso molecular 100 pares de bases, 25 patrón de peso molecular
25 pares de bases, J1 muestra suministrada positiva, J2 muestra suministrada positiva,
J3 muestra suministrada positiva, J4 muestra suministrada positiva, K muestra
suministrada positiva, G muestra suministrada positiva, I muestra suministrada positiva, B
muestra suministrada positiva, A1 muestra PCR realizada.

la evaluación de los productos obtenidos por la técnica de electroforesis nos permitió

conocer que las muestras procesadas en la práctica de laboratorio fueron realizadas
correctamente ya que nos muestran un peso molecular que coinciden con (porción 444 pb
del gen de los provirus leucosis bovina) lo cual afirma la presencia del proviros en las
muestras suministradas. Datos que serán evaluados para posibles diagnósticos.
Referencias

Agresti, A.; Ponti, W.; Rocchi, M.; Meneveri, R.; Marozzi, A.; Cavalleri, D.; Peri, E.; Poli,
G.; Ginelli, E. 1993. Use polymerase chain reaction to diagnose bovine leukemia
virus infection in calves at birth. Am J Vet Res. 54 (3): 373-378.

Chamizo, E.G. 2005. Leucosis Bovina Enzootica: Revisión. Revista Electrónica de

Veterinaria REDVET, Vol VI, No 7.

Evermann, J. 1992. Understanding BLV infection. How far we have come in a decade. Vet.
Med. 87: 246.

Fechner, H.; Kurg, A.; Geue, L.; Blankenstein, P.; Mewes, G.; Ebner, D.; Beier, D. 1996.
Evaluation of polymerase chain reaction (PCR) application in diagnosis of bovine
leukaemia virus (BLV) infection in naturally infected cattle. Zentralbl Veterinarmed
B 43 (10): 621-630.

Jiménez, A. P. 2011. Guía para diagnóstico de leucosis enzootica bovina. Laboratorio de

biología molecular veterinaria. Universidad cooperativa de Colombia – UCC.

Malatestinic, A. 2003. Bilateral exophthalmos in a Holstein cow with lymphosarcoma. Can.

Vet. J. 44 (8): 664-666.