Docente: Camilo Andrés Correa-Cárdenas

20 de Septiembre del 2017

 

GUÍA 4
Diversidad Microbiana del Suelo:
aislamiento y recuento de microorganismos de la
familia Pseudomonadaceae mediante diluciones
seriadas y extensión en placa

PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN

¿Hay diferencias en la diversidad microbiana obtenida en diferentes tipos de suelo?

¿Hay relación entre la diversidad microbiana y la perturbación del suelo?
¿Hay diferencias en la concentración de microorganismos en el suelo entre las
diferentes diluciones obtenidas?
¿Se pueden encontrar diferencias macro y microscópicas entre los representantes de
Pseudomonas spp?

HIPÓTESIS

El tipo de suelo tiene un efecto en la diversidad microbiana.

La perturbación del suelo tiene un efecto en la diversidad microbiana.
El tipo de dilución tiene un efecto en la concentración microbiana.
Hay diferencias macro y microscópicas entre los representantes de Pseudomonas spp.

OBJETIVOS

• Conocer la utilidad que tiene el método de siembra por extensión en placa en

el laboratorio de microbiología
• Realizar la técnica extensión en placa para conocer los microorganismos que
podemos encontrar en una muestra de suelo.
• Familiarizarnos con el procesamiento de una muestra de suelo, realización de
diluciones y recuento en placa de microorganismos.
• Estimar la diversidad de las comunidades microbianas del suelo a partir de los
índices de Margalef, Menhinick, Simpson y Shannon.
• Reconocer y diferenciar la morfología macro y microscópica de los
microorganismos provenientes de una muestra de suelo, principalmente de la
familia Pseudomonadaceae.

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos del suelo cumplen funciones ecológicas determinantes

en los diferentes ecosistemas, de tal forma que transforman componentes
orgánicos e inorgánicos que definen las propiedades químicas del suelo y lo
que denominamos fertilidad de un suelo. La humificación es un proceso que
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depende principalmente de los microorganismos y que consiste en la
transformación química y biológica de la materia orgánica en humus (Paul,
2014; Weil et al., 2016).

Dentro de los principales microorganismos del suelo, encontramos

representantes del dominio Bacteria como los filos Proteobacteria (ej:
Pseudomonas sp.) y Actinobacteria (ej: Streptomyces sp) que se ha
caracterizado por presentar potencial bio-prospectivo y biotecnológico en el
área de biorremediación y producción de antibióticos respectivamente
(Barka et al., 2016; Vinas et al., 2005).

En la naturaleza, los microorganismos generalmente se encuentran en

poblaciones, formando parte de comunidades de gran complejidad, por lo
que uno de los objetivos de estudio más importantes en microbiología es
aislarlos. El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza,
en la mayoría de los casos, mediante la técnica de estría cruzada para
producir colonias aisladas en cultivos sólidos y así, obtener un cultivo puro o
axénico, también conocido como cepa, que contiene un solo tipo de
microorganismo con la misma composición genética; pero antes se puede
aplicar alguna otra técnica de siembra por el extendido en placa (Arcos et
al., 2009; Benson, 2001; Harley−Prescott, 2002).

En una comunidad microbiana del suelo se puede hacer una estimación de

diversidad ecológica donde a mayor perturbación ecológica de un suelo o
ambiente, menor será la diversidad microbiana de dicho suelo (Singh et al.,
2014; Sutton et al., 2013).

En primer lugar se debe hacer un recuento de la unidades formadoras de

colonia (UFC)/mililitro en cada ambiente y segundo se debe hacer una
caracterización de la diversidad a partir de dos parámetros que son riqueza
y abundancia relativa de la comunidad microbiana, donde la riqueza hace
alusión al número total de morfotipos de la comunidad y la abundancia
relativa se refiere al número total de individuos de cada morfotipo (Begon et
al., 2006).

A continuación se presentan los principales índices de diversidad ecológica

que se han usado en varios estudios para interpretar la diversidad a partir de
los morfotipos encontrados en los diferentes medios de cultivo (Haegeman et
al., 2013; Müller et al., 2002):

Margalef:

DMg = (S - 1) / ln N
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Donde
S = total de especies muestreadas.
N = total de individuos de todas las especies.

Valores altos indican alta diversidad y bajos, baja diversidad.

Menhinick:

DMn = S / √N

Donde
S = total de especies muestreadas.
N = total de individuos de todas las especies.

Nuevamente, valores altos indican gran diversidad y bajos, poca diversidad.

Simpson:

                                                                         

Donde
pi = frecuencia de la i-ava especie muestreada.
pi = ni/N abundancia relativa de especie i
ni = Número de individuos de especie i .....i = 1, 2, 3,...,S
S = total de especies muestreadas.

0 ≤ D ≤ 1 ; siendo más diversas las regiones donde D ~ 0 y menores donde D ~ 1.

Dado lo confuso que puede ser la relación inversa entre la diversidad y el valor de D,

se prefiere a veces utilizar la versión modificada de este ( ), llamada índice de

diversidad por los estadísticos:

Shannon-Wiener:

Donde
pi = frecuencia de la i-ava especie muestreada.
S = total de especies muestreadas.

Los microorganismos de la familia Pseudomonadaceae se caracterizan por

crecer en medios selectivos y diferenciales como King B. En este medio puede
ser visible el pigmento difusible al medio como la pioverdina (fluoresceína), que
junto con la piocianina, piorrubina ó piomelanina les permiten a los
representantes de esta familia realizar “quórum sensing”, ser virulentos y
colonizar muy bien un ambiente hostil y competitivo actuando como
bactericidas(Delcaru et al., 2016; Jayaseelan et al., 2014; King et al., 1954).
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METODOLOGÍA PRÁCTICA

Materiales:

Cajas de Petri (6 King B, 4 AN y 1 PDA) 1 micropipeta 100μl – 1000

10g de muestra de suelo 4 puntas azules para micropipeta
3 tubos con agua peptonada estéril 1 Shot con 90ml de agua estéril
4 hisopos y 1 rastrillo estériles 1 Balanza de precisión
1 Espátula 1 Vidrio de reloj

Llevar siempre al laboratorio:

Bata blanca de laboratorio, manga larga Guantes

Gorro Tapabocas
Marcador sharpie Toallas de papel
**Cinta de enmascarar

Procedimiento

1. Pesar 10 g de suelo y vaciar en un matraz o Erlenmeyer con 90 ml de

solución estéril (agua peptonada).
2. Homogenizar colocando la muestra (botella con agua y suelo) en el
“shaker” o agitador durante 10 minutos o haciendo círculos suaves
sobre la mesa de trabajo con la botella.
3. Rotular material: matraz, tubos cajas de Petri con: Apellido de
integrante del grupo, grupo del curso o profesor, práctica suelo y
dilución: 10-1, 10-3, 10-5.
4. A partir del matraz anterior donde se disolvió la muestra de suelo que
es la dilución 100, hacer un pase de 1ml en el tubo de vidrio que
contiene 9 ml de agua peptonada estéril para obtener la dilución 10-1
(ver figura 1).
5. Hacer vortex o mezclar por inversión.
6. Seguido a esto hacer un pase de 0,1ml de la dilución 10-1 al tubo que
contiene 9,9ml y así obtener la dilución 10-3. De nuevo hacer vortex.
7. Por último, hacer un pase de 0,1ml del tubo 10-3 al tubo que contiene
9,9ml y así obtener la dilución 10-5. De nuevo hacer vortex. SON
DILUCIONES SERIADAS CAMBIANDO DE PUNTA DE LA MICROPIPETA PARA HACER
CADA DILUCIÓN.
8. Después de realizar las diluciones, transferir 0,1ml a las cajas de Petri
para siembra en superficie, iniciando con la de mayor dilución. (ver
figura 1).
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9. Homogenizar con el hisopo o rastrillo el volumen agregado del tubo
de 10-5 a las cajas de Petri con King B de 10-6 mediante la técnica de
extendido en placa.
10. Realizar exactamente lo mismo del paso 9 pero con las dos cajas de
Petri con Agar Nutritivo marcadas con 10-6.
11. Hacer el pase de 0,1ml del tubo de 10-3 a las dos cajas de Petri de
King B, las dos cajas de Agar Nutritivo marcadas con 10-4 y la caja de
PDA.
12. Homogenizar el inoculo sembrado con el hisopo o rastrillo mediante la
técnica de extendido en placa o masivo en superficie.
13. Realizar el mismo procedimiento del paso 9 y 11 pero con las dos
cajas restantes de King B, partiendo de un pase de 0,1ml del tubo con
dilución 10-1 a las cajas con 10-2 y homogenizando mediante
extendido en placa. PARA LOS PASOS 8-13 DEBE USAR UNA MISMA PUNTA POR
LO QUE DEBE ASEGURARSE INICIAR LOS PASES O TRANSFERENCIAS DESDE LA MAYOR
DILUCIÓN PARA NO ALTERAR LOS FACTORES DE DILUCIÓN.
14. Cubra las cajas con vinipel ó parafilm.
15. Disponga a incubar a 30-37ºC las cajas de King B y AN para el
crecimiento bacteriano, mientras la caja de PDA debe ir en la
incubadora a 25ºC para el crecimiento de hongos. TODAS LAS CAJAS DE
PETRI SE UBICAN DE FORMA INVERTIDA PARA EVITAR QUE EL AGUA FORME UN TAPETE
MICROBIANO.

Figura 1. Esquema de diluciones para extendido en placa.

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A los 8 días (en la siguiente práctica):
Hacer lectura o recuento de microorganismos de cada placa así:
1. Hacer la descripción macroscópica de cada una de las cajas
comparándolas según la dilución hecha.
2. Hacer observación microscópica de las colonias más
representativas.
3. Seleccionar algunas colonias bien características y hacerles un
pase en Agar Sangre y King B mediante la técnica de
agotamiento. Para seleccionar las cepas que producen
fluoresceína puede hacer uso de una lámpara UV y reportar
fluorescencia.
4. Completar el siguiente cuadro:

Dibuje o tome fotografías de las estructuras microscópicas observadas

(hifas, micelio, esporas, bacterias, levaduras) en el montaje realizado para
tal fin e indique a que microorganismo pertenecen en el siguiente cuadro:

Indique si es: bacteria G(+) Descripción

o G(-) macroscópica
Hongo o levadura Colonia color, textura, forma

Objetivo utilizado:
Aumento:

RESULTADOS & DISCUSIÓN

Preguntas que deben ser resueltas en su informe tipo artículo científico en forma
de discusión de resultados:

A. Defina la importancia ecológica de los principales géneros de

bacterias, hongos y levaduras que se encuentran en el suelo.
B. ¿Qué diferencia básica en su crecimiento presentan los mohos y las
levaduras?
C. Defina el término inóculo
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D. Investigue la composición química de los medios usados en el
laboratorio: King B, PDA y AN. Explique qué tipo de medios de cultivo
son con base en composición y uso.
E. Investigue ¿cómo se reporta un conteo en placa de colonias o
microorganismos provenientes de una muestra?, es decir ¿cómo se
escribe la lectura de las placas realizadas en el laboratorio?
F. ¿Cuál es la diversidad (riqueza y abundancia) microbiana entre los
suelos evaluados? ¿Qué relación existe entre la perturbación del suelo
y la diversidad microbiana?
G. ¿Cuál es el número de UFC reportadas en King B, AN y PDA a partir de
muestras microbiológicas del suelo?
H. ¿Cómo se puede diferenciar las diferentes Pseudomonas spp. a partir
de técnicas microbiológicas clásicas?
I. ¿Qué pasa con la concentración microbiana a mayor dilución?

CONCLUSIONES

¿Se logró responder o no las preguntas de investigación y los objetivos de la

práctica?

REFERENCIAS
Arcos, Y., García, Y., Polanco, D., Vásquez, C. (2009). Manual de Prácticas Microbiología
general y laboratorio. Universidad de Antioquia, Medellín.

Barka, E. A., Vatsa, P., Sanchez, L., Gaveau-Vaillant, N., Jacquard, C., Klenk, H. P., ... & van
Wezel, G. P. (2016). Taxonomy, physiology, and natural products of
Actinobacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 80(1), 1-43.

Begon, M., Townsend, C. R. H., John, L., Colin, R. T., & John, L. H. (2006).Ecology: from individuals
to ecosystems.

Benson. 2001. Microbiological Applications Lab Manual. Eighth Edition. The McGraw−Hill.
Companies.

Brock. Madigan Michael T., Martinko John M., Parker Jack. 2006. Biología de los
Microorganismos. 10º edición. Pearson.

Delcaru, C., Alexandru, I., Podgoreanu, P., Ditu, L. M., Cristea, V. C., Bleotu, C., ... & Lazar, V.
(2016). Modulation of quorum sensing genes expression in Pseudomonas aeruginosa
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Haegeman, B., Hamelin, J., Moriarty, J., Neal, P., Dushoff, J., & Weitz, J. S. (2013). Robust
estimation of microbial diversity in theory and in practice. The ISME journal, 7(6), 1092.

Harley−Prescott. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology, Fifth Edition. III. The McGraw−Hill
Companies. Exercises 13, 14, 15, 16 y 17.
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1159-1168.

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Paul, E. A. (2014). Soil microbiology, ecology and biochemistry. Academic press.

Singh, B. K., Quince, C., Macdonald, C. A., Khachane, A., Thomas, N., Al-­‐‑Soud, W. A., ... &
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specialized functions. Environmental microbiology, 16(8), 2408-2420.

Sutton, N. B., Maphosa, F., Morillo, J. A., Al-Soud, W. A., Langenhoff, A. A., Grotenhuis, T., ... &
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