Extracción y Purificación de ARN

-Separar ARN de proteínas y de ADN

- Prevenir actividad de RNAsas (ribonucleasas)

TOMAR PRECAUCIONES

-Separar ARNm de otros?

Por medio de cromatografía de afinidad= columnas de oligo-dT
celulosa

- Obtención de ARN total o de subfracción celular ?

(núcleo, citoplasma, polisomas)
 Extracción y Purificación de ARN

Obtención de ARN total

Chomczynski P, Sacchi N. Anal Biochem. 1987 Apr;162(1):156-9.

1- HOMOGENEIZACION DE TEJIDO Trizol

•SALES DE GUANIDINIO (potente agente caotrópico, desnaturalizante)

desnaturalización de ribonucleoproteínas y ribonucleasas
• FENOL

2- EXTRACCION CON SV ORGANICOS Cl3CH

3- PRECIPITACION - LAVADO – RESUSPENCION

Chequeo del ARN

1- Electroforesis en gel de agarosa. Visualización al UV: Bromuro de

Etidio

Integridad
ARNr 2 bandas mayoritarias de ARN 28S y 18S (28S/18S =2)
El rRNA 18s tiene 2,0 kb y el rRNA 28s 5,1 kb.
ARNt
ARNm

Contaminación con ADNg

2- ESPECTROFOTOMETRÍA Relación 260nm / 280nm  1,8 - 2

Contaminación proteica
NORTHERN BLOT

UTILIDAD
•Evaluar expresión de un
determinado mensajero
•Tamaño del ARNm
•Detectar mutaciones que
afectan los patrones
normales de splicing
NORTHERN BLOT
SOUTHERN VS. NORTHERN

Purificación de Purificación de ARN

ADN tejido específico

El ARN se degrada mucho

más facilmente
Digestión con ER
TOMAR PRECAUCIONES !!

ELECTROFORESIS EN GEL DE
AGAROSA
WESTERN BLOT
 DOT BLOT

ADN Veo presencia

ADN genómico + sonda

ARN Veo expresión

ARNm + sonda
 DOT BLOT semicuantitativo

1 2 3 4 control

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64
 DOT BLOT de ARN semicuantitativo

Estadíos de embriogénesis (semanas)

2 8 16 24 30

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64
 Microarrays

Representan una herramienta para los estudios de

genómica y/o proteómica que permiten los análisis
cualitativo y cuantitativo, en forma simultánea,
masiva y miniaturizada, de genes y/o productos
génicos.

http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/chip/chip.html
 ¿Qué es?

• Un formato experimental,
• basado en la síntesis o
fijación de sondas, que
representan los genes (o
proteinas, o metabolitos),
• sobre un sustrato sólido
(cristal, plástico, silice,...),
• y expuestos a las molé-culas
diana (la muestra).
 Cómo funciona
• El nivel de hibridación entre
– la sonda específica (probe) y
– la molécula diana (target)

• se indica generalmente
– mediante fluorescencia y se
– mide por análisis de imagen

• e indica el nivel de expresión del

gen correspondiente a la sonda en
la muestra problema
 tipos
• De Proteínas
• De Tejidos

• De DNA
– Arrays de CGH
– SNPs

• De Expresión
– De cDNA
– De oligonucleótidos
 Los cDNAs marcados con
diferentes fluoroforos son
co-hibridizados sobre un
solo soporte de secuencias
impresas

cDNA marcado con Cy5 cDNA marcado con Cy3

Dye-Swap
Posibilita hacer comparaciones
directas entre dos muestras
hibridadas en el mismo soporte
La adquisición de las imágenes se realiza por
medio de equipos de barrido de imágenes con
dos lásers.
 También se
pueden usar para
genotipificación

Estudio de
expresión
 GENE REPORTER

Los genes reporteros son secuencias que codifican para

proteínas de simple detección.
Se usan para determinar actividad promotora y regulatoria o
secuencias codificantes de factores transcripcionales o
regulatorios.
β galactosidasa
Hidroliza sustrato para dar producto que se cuantifica
(por LUMINISCENCIA / FLUORESENCIA / ABSORBANCIA , depenciendo del S)

β glucuronidasa (GUS) LUMINISCENCIA / FLUORESENCIA

luciferasa LUMINISCENCIA / FLUORESENCIA

CAT (cloranfenicol acetil transferasa)

Transfiere grupos acetilos marcados 14C o 3H al cloranfenicol.
La detección se da por cromatografía en capa delgada o
extracción orgánica

Green Fluorescent Protein (GFP) FLUORESENCIA

Fluoresce por irradiación con UV -> se observa con microscopio
de fluorescencia -> Luz azul

SEAP (secreted human placental alkaline phosphatase)

Ensayo de fosfatasa alcalina bioluminiscente
GENE REPORTER

Estudiar regiones regulatorias

GENE REPORTER
GENE REPORTER

Estudiar factores de transcripción

EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)
Objetivo:
detectar proteínas capaces de unirse a secuencias del DNA.

 Fundamento: Las proteínas que se unen específicamente a un

fragmento de DNA marcado retrasan la movilidad del fragmento
durante la electroforesis, resultando en bandas discretas
correspondientes a complejos DNA-proteínas.

 Puede utilizarse para testear unión de proteínas purificadas o de

factores no caracterizados que se hallen en un extracto crudo.

 También permite la determinación cuantitativa de la afinidad,

abundancia, tasas de asociación/disociación y especificidad de unión
de proteínas de unión al DNA.
 Protocolo EMSA
(1) preparación de una sonda de
ADN marcada radiactivamente
(conteniendo un sitio de unión a
una proteína particular?)

(2) reacción de unión

(3) Electroforesis en gel de

ploacrilamida
no desnaturalizante
de los complejos ADN-proteína

(3) Secado y revelado por

autorradiografia
EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)

Estudiar de interacciones DNA-Proteína

EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)
 Ensayo de Competición

Es necesario porque la mayoría de las preparaciones proteicas

contienen proteínas de unión al ADN tanto específicas como
inespecíficas.

 competidor específico = el mismo fragmento de ADN que la

sonda pero sin marcar

 competidor inespecífico = cualquier fragmento de secuencia

no relacionada (pero de tamaño y configuración similar)

Quizás, el mejor competidor sea un fragmento de secuencia idéntica al fragmento de

prueba pero con una mutación/es que se sepa alteran la función (y
presumiblemente el binding)
Ensayo de Competición

` 
 
 Gel Mobility Supershift
Es una variante del EMSA donde se utilizan Ac para identificar las proteínas
presentes en los complejos proteína-ADN.

La adición de Ac específicos puede tener una o varias consecuencias:

-Si la proteína reconocida por el Ac no forma parte del complejo, la adición del
Ac no debe tener ningún efecto.

-Si la proteína que forma parte del complejo es reconocida por el Ac, el
agregado del Ac puede:
bloquear la formación del complejo o
el Ac puede formar parte de un complejo Ac-proteína-DNA y retrasar aún más la
movilidad en el gel (supershift)

Los resultados varían dependiendo de si el Ac se agrega antes o después de la

formación del complejo proteína-DNA.
 Nucleasas
• DNAsa I
Endonucleasa
hidroliza ADN simple o doble cadena
corte en pirimidinas (C ó T).
Utilizada para:
- experimentos en donde sólo debe haber ARN x ej.: retrotranscripción,
- ensayos de interacción DNA-proteína (Footprinting)

• Ribonucleasa A
Endoribonucleasa
degrada ARN simple cadena
corte en pirimidinas (C ó T).
Usada para eliminar ARNs de minipreps y en RPA.

• Nucleasa S1
Exonucleasa
degrada ADN simple cadena
de forma procesiva y no específica de secuencia
DNA Footprinting o ensayo de protección
de DNasaI

Estudiar de interacciones DNA-Proteína

DNA Footprinting o ensayo de protección
de DNasaI
 Protocolo Dnase I Footprinting

 Usando un primer marcado radioactivamente en 5´con 32P

CADA MOLECULA DE ADN SE MARCA EN UN SOLO EXTREMO DE UNA DE LAS
CADENAS

INCUBACIÓN con proteínas (factores de transcripcion?) (SN de lisado celular)

 DIGESTION PARCIAL CON Dnasa I

(se ajusta cc Dnasa I para que corte una sola vez en una sola cadena de
cada fragmento de ADN)

 ELECTROFORESIS (GEL DE POLIACRILAMIDA DESNATURALIZANTE)

RADIOAUTOGRAFIA
Técnicas basadas en reacciones de hibridación en solución:

 ensayo de la S1 nucleasa
Incubación = sonda de ADN + mezcla de ARN total o ARNm a analizar => Hibridización

 ensayo de protección de RNasa (RPA):

Incubación = sonda de ARNc + mezcla de ARN total o ARNm a analizar => Hibridización

Objetivo:

Detectar y cuantificar un ARNm especifico en una mezcla compleja de ARN

total o ARNm

Para cuantificar un ARNm de interés el RPA es preferible al análisis con nucleasa S1

test cuantitativo = Si la hibridación se llevó a cabo en exceso molar de sonda, el número

de moléculas de cRNA protegidas será un fiel reflejo del número de moléculas de
mRNA
 Protocolo RPA

1) Obtención de sondas* de ARN complementario (ARNc) por

transcripcion in vitro
(*marcación radioactiva o con biotina)

2) Incubación de sonda de ARNc en solución con el mezcla de ARN total

o ARNm a analizar = HIBRIDIZACION

3) DIGESTION con RNasas A

Las ribonucleasas A digieren ARN monocadena,

pero no duplexes de RNA.

en los híbridos ARNm-ARNc no son digeridos

( la sonda de ARNc queda protegida de la digestión enzimática)

4) Electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (urea)

RPA
 Protocolo análisis con nucleasa S1
1) Obtención de sondas de ADN sc
- Clonado de fragmento de ADN de interés y liberación del inserto
- Marcación en extremo 5’
- Desnaturalización

2) Incubación de sonda de ADN con el ARNm a analizar (x ej. ARN total

de célula donde se expresa gen de interes) = HIBRIDIZACION de ARNm
con cadena antisense de ADN = heteroduplex ADN-ARN

3) DIGESTIÓN con nucleasa S1 = clivaje progresivo del extremo 3’

“overhanging” del ADN

La nucleasa S1 corta ADN monocadena

(no-apareado)
Se utiliza para digerir la sonda que no haya sido protegida por ARNm

4) Electroforesis en gel desnaturalizante

Análisis con nucleasa S1
 ChIP

Variantes:
Método para el
estudio de
• ChIP-seq
interacciones DNA –
•ChIP-on-chip
Proteína.
•nChIP