Universidad Autónoma de Chiriquí

Facultad de Ciencias Naturales Y Exactas

Escuela de Química.

Guías de Laboratorio
BIOQUIMICA

Preparado por:

DORIS ENITH DE LEON CARRERA

ROBERTO GUEVARA

DAVID 2007
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIRIQUI
DEPARTAMENTO DE QUIMICA

Experimento 1.
Preparación de Soluciones Amortiguadoras

I. Objetivos:
Al finalizar esta práctica el estudiante estará en capacidad de:

1. Preparar experimentalmente diferentes soluciones

amortiguadoras.
2. Determinar el pH de las soluciones anteriormente preparadas.
3. Establecer la relación entre el pH y un amortiguador.

II. Marco Teórico:

Solución amortiguadora es aquella que se opone los cambios de pH cuando se
agrega ácido o álcali. Tales soluciones se utilizan en muchos experimentos
bioquímicos en los cuales se necesita controlar exactamente el pH.

De la ecuación de Henderson-Hasselbalch, se puede deducir que el pH de una

solución amortiguadora depende de dos factores uno es el de pKa y el otro es
la proporción de sal a ácido. Esta proporción se considera igual a las
cantidades de sal y ácido mezcladas en el intervalo de pH entre 4 y 10, donde
la concentración de hidrogeniones e hidroxilos del medio acuoso es muy baja y
se puede ignorar.

PH = pKa + log 10 [sal] / [ácido]

Tomemos por ejemplo los amortiguadores de acetato que están compuestos

por una mezcla de ácido acético y acetato de sodio:

CH3COOH ↔ CH3COO- + H+
CH3COONa → CH3COO- + Na+

Puesto que el ácido acético está tan solo débilmente disociado, la

concentración de ácido será casi la misma que se agregó a la mezcla; en la
misma forma la concentración de iones acetato puede ser considerada como
igual a la concentración de acetato de sodio añadido a la mezcla, ya que la sal
estará completamente disociada. La máxima capacidad amortiguadora de la
solución se cumple cuando la concentración de la sal es igual a la
concentración del ácido, en este punto pH = pKa. Si el pKa del ácido acético
es 4.8, en la práctica las soluciones amortiguadoras se usan en el intérvalo de
pH entre 3.8 y 5.8, es decir 1 unidad alrededor del pKa. Esto se cumple
generalmente para todas las soluciones amortiguadoras.

Algunas de las soluciones amortiguadoras que se usan más frecuentemente en

el laboratorio se muestran en la Tabla 1. Como se dijo anteriormente, el
intervalo útil para la mayoría de los amortiguadores es de una unidad de pH por
encima o por debajo del valor de pKa.

El amortiguador que se escoja en un momento dado debe seleccionarse con

cuidado, ya que los resultados experimentales pueden deberse a efectos
específicos de los iones utilizados y no al pH. Algunos amortiguadores que
producen reacciones desfavorables son: boratos, citratos, fosfatos y tris.

Tabla 1: Amortiguadores usados en investigaciones biológicas.

Ácido o base Pka pKa pKa

Ácido fosfórico 2.1 7.2 12.3
Ácido cítrico 3.1 4.8 5.4
Ácido carbónico 6.4 10.3 -
Glicil glicina 3.1 8.1 -
Ácido Acético 4.8 - -
Tris 8.3 - -
Hepes 7.6 - -

III. Materiales y Reactivos.

a) Volumétricos 100 mL, vasos químicos, balanza, potenciómetro, buretas,
probetas, papel parafilm, espátulas.
b) Fosfato monobásico de potasio KH2PO4 0.2 M, ácido cítrico, citrato trisódico,
Fosfato dibásico de sodio, hidróxido de sodio y HCl.
Hidróxido de sodio NaOH 0.2 M

IV. Procedimiento

1. Amortiguador de Ácido cítrico/ Citrato de sodio 0.05 M

En un frasco volumétrico de 100 mL coloque x mL de Ácido cítrico 0.05 M y

complete hasta la marca con Citrato de trisódico 0.05 M.

X mL 91 86 80 75 70 65 60 55 50 44 39
pH 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0
X mL 34 29 24 19 14
PH 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0

2. Amortiguador de Fosfato dibásico de sodio 0.2 M Na2HPO4

En un frasco volumétrico de 100 mL coloque x mL de Ácido clorhídrico 0.2
M a 50 mL de Fosfato dibásico de sodio y afore con agua hasta la marca.

X mL 3.5 5.8 9.1 13 18 24 30 35 40 43 45

pH 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.14 7.6 7.8

3.Amortiguador de Fosfato monobásico de potasio 0.2 M KH 2 PO4

 En un frasco volumétrico de 100 mL coloque x mL de Hidróxido de sodio 0.2
M a 50 mL de fosfato monobásico de potasio y diluya hasta 100 mL.

X mL 3.5 5.8 9.1 13 18 24 30 35 40 43 45

pH 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8

4. Capacidad amortiguadora de las soluciones:

 Prepare 8 tubos de ensayo. En los tubos 1 y 2 coloque 5 mL de agua

destilada.
 5 ml de la solución amortiguadora preparada en (1) en los tubos 3 y 4.
 5 mL de la solución amortiguadora preparada en (2) en los tubos 5 y 6.
 5 mL de la solución amortiguadora preparada en (3) en los tubos 7 y 8.
 En todos los tubos añada tres gotas de indicador universal.
 En los tubos impares añada 0,5 de HCI 0.1 M y en los tubos pares
añada 0.5 mL de NaOH 0.1 M.
 Agite los tubos y anote sus observaciones.

V. Actividades:
Resuelva:
1. ¿Cuál es el pH de una mezcla de 5mL de acetato de sodio 0.1 M y 4 mL
de ácido acético 0.1 molar?
2. Cuál es el cambio que ocurre en el pH al agregar a la mezcla anterior
1.0 mL de HCI 0.1M
3. Explique el sistema de amortiguamiento del pH en el plasma de los
mamíferos.

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 EXPERIMENTO 2

PUNTO ISOELECTRICO DE AMINOACIDOS Y PROTEÍNAS

1. Objetivos:

1.1. Determinar los pKa de un aminoácido polar con carga y un aminoácido no

polar, mediante titulación con álcali.

1.2. Estimar el punto isoeléctrico de los aminoácidos polares y no polares del

gráfico de pH vs volumen de base.

1.3. Determinar el punto isoeléctrico de una proteína mediante la técnica de

precipitación.

2. Introducción:

El punto isoeléctrico se define como el pH en el cual el número de cargas

positivas se iguala al número de cargas negativas que aportan los grupos
ionizables de una molécula. En el punto isoeléctrico la carga neta de la molécula
es cero (0). En los aminoácidos los grupos ionizables corresponden a grupos
carboxilos, amino, fenólicos y tiólicos.

Aminoácido Abrev Letra pKa1 pKa2 pKa3

Glicina Gly G 2.35 9.78
Alanita Ala A 2.35 9.87
Valina Val V 2.29 9.74
Leucina Leu L 2.33 9.74
Isoleucina Ile I 2.32 9.76
Metionina Met M 2.13 9.28
Prolina Pro P 1.95 10.64
Fenilalanina Phe F 2.20 9.31
Triptofano Trp W 2.46 9.41
Serina Ser S 2.19 9.21
Treonina Thr T 2.09 9.1
Asparragina Asn N 2.14 8.75
Glutamina Gln Q 2.17 9.13
Tirosina Tyr Y 2.20 9.21 10.46 Fenol
Cisterna Cys C 1.92 10.7 8.37 Sulfhidrilo
Lisina Lys K 2.16 9.06 10.54 ε-Amino
Arginina Arg R 1.82 8.99 12.48 Guanidinio
Histidina His H 1.80 9.33 6.04 Imidazol
Acido aspáratico Asp D 1.99 9.90 3.90 β-COOH
Acido glutámico Glu E 2.10 9.47 4.07 γ-COOH

TABLA 1: Valores de pKa de los grupos ionizables de los á-aminoácidos.

Fuente: http://www.qb.fcen.uba.ar/quimicabiologica/Tabla%20pKa.html

El pI de los -aminoácidos monoamino-monocarboxílicos, siempre está

cercano a pH = 6. Este valor lo podemos calcular con la siguiente ecuación:
 El pI de los á-aminoácidos monoamino-dicarboxílicos se encuentra a un
pH intermedio entre los valores de pKa de los grupos carboxílicos y en el caso de
los á-aminoácidos diamino-monocarboxílicos entre los valores de pKa de los
grupos amino.

Los puntos isoeléctricos proporcionan información útil para razonar sobre

el comportamiento de los aminoácidos y proteínas en solución. Así, la presencia
de grupos ionizables en éstas moléculas tiene importantes consecuencias sobre
la solubilidad.

Los aminoácidos y las proteínas son menos solubles en su punto

isoeléctrico si las demás condiciones permanecen iguales. Esto se debe a que los
iones dipolares no presentan carga neta y cristalizan en forma de sales insolubles
a ese pH.

3. Materiales y reactivos:

3.1. Buretas, soportes, pinzas de bureta, matraces de 125 mL y 250 mL,

pipetas de 25 ml, potenciómetro de pH.

3.2. Soluciones de ác. glutámico y glicina al 0.5% en HCl 0.1M; NaOH 0.2M;
HCl 2%; leche de vaca, de cajita; etanol 95%; éter.

4. Procedimiento:

4.1. Titulación de aminoácidos:

Coloque una alícuota de 25 ml de la solución de aa. en un vaso químico
de 250 mL y proceda a titular con NaOH 0.2 M, con adiciones de 1.0 mL cada
vez, midiendo el pH antes de cada adición con un potenciómetro de pH, hasta
alcanzar el pH de 10. Grafique sus resultados y reporte los valores de pKa de los
aminoácidos analizados y calcule el pI en cada caso.

4.1.1. Punto isoeléctrico y solubilidad: Verifique la solubilidad de varios

aminoácidos en el punto isoeléctrico. Para ello, utilice una pequeña muestra de
cristales del aa. y trátelo de disolver en soluciones de fosfato que se encuentren
en el pH correspondiente al punto isoeléctrico. Compare sus resultados con la
solubilidad en agua.

4.2. Determinación del pI de la caseína de la leche.

Mida 50 mL de leche y colóquelos en un vaso químico de 400 mL. Diluya

con 150 mL de agua destilada. Titule con HCl al 2% hasta alcanzar el pH de 4.8
contra un potenciómetro de pH. Si se tiene cuidado, se observa fácilmente el
punto en el cual empieza a precipitar la proteína de la leche (caseína). Se agita
durante 10 minutos, se deja sedimentar media hora y se anotan los resultados.
4.2.1. Separación de la caseína : (opcional) Se decanta el sobrenadante
de la leche precipitada en el punto 4.2. El precipitado se lava dos veces por
suspensión con 100 mL de agua destilada y nueva decantación. Se succiona
toda el agua por filtración en embudo Büchner. El residuo húmedo se pasa a un
vaso químico y se prepara una suspensión final de caseína en 50 mL de etanol
al 95% y se agita con fuerza durante 5 minutos y se decanta. Se repite otra vez el
extracto con alcohol y luego se extrae dos veces con 30 mL de éter. NOTA:
descarte el éter en un recipiente para residuos orgánicos. Se filtra la
suspensión y se deseca sobre una placa porosa. Se debe obtener un polvo
blanco muy ligero.

4. Cuestionario:

4.1. ¿Por qué no se alcanza el pH 1 con HCl 0.1M en las soluciones en las que
se prepararon los aa.?

4.2. Compare los puntos isoeléctricos de la glicina y los péptidos glicil-glicina y

glicil-glicil-glicina. ¿Qué concluye sobre estos resultados?

4.3. Por qué las moléculas con grupos ionizables se hacen menos solubles en
el punto isoeléctrico.

4.4. En la precipitación de la caseína qué pasaría si se añade muy rápido el

ácido y se alcanza un pH más bajo que 4.8. Qué se debe hacer en este
caso?

4.5. ¿Por qué es necesario lavar la caseína precipitada con alcohol (Etanol
95%) y éter.

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Experimento 3.
Pruebas Cualitativas para aminoácidos y proteínas

I. Objetivos:
Al finalizar el experimento el estudiante podrá:

1. Aplicar pruebas cualitativas generales y específicas que

permitan reconocer grupos químicos de los aminoácidos y
proteínas.

2. Someter soluciones de proteínas a desnaturalización con

agentes físicos y químicos.

II. Marco Teórico:

1. Reacción con la ninhidrina: Los grupos amino libres de los aminoácidos,

de los péptidos y las proteínas reaccionan con la ninhidrina a un pH entre 4 y 8,
para dar un compuesto de intenso color azul púrpura. La prueba también es
positiva con aminas primarias y amoníaco pero sin desprendimiento de CO 2 .
Los aminoácidos prolina e hidroxiprolina dan un color amarillo en lugar del color
púrpura con la ninhidrina.
La reacción es muy sensible y es ideal para la detección de
aminoácidos en cromatogramas y para su cuantificación mediante técnicas
espectrofotométricas de las fracciones que se obtienen de columnas
cromatográficas.

2. Reacción xantoproteica: Los aa, que contienen un núcleo aromático

forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con ácido nítrico
concentrado. Las sales de estos derivados son de color naranja intenso en
medio alcalino. La fenilalanina, la tirosina y en cierto grado el Triptófano, así
como todas las proteínas que los contienen, dan positiva la prueba.

3. Reacción del ácido glioxílico para triptófano: El grupo indólico del

triptófano reacciona con ácido glioxílico en presencia de ácido sulfúrico
concentrado dando un complejo de color púrpura. El ácido acético glacial que
ha sido expuesto a la luz contiene ácido glioxílico.

4. Reacción para el triptófano: Este aminoácido se condensa fácilmente con

varios aldehídos en presencia de ácidos fuertes para dar compuestos
coloreados. En la reacción se utiliza el reactivo de Ehrlich (p-
dimetilaminobenzaldehído al 10% en HCL conc.) que reacciona con un buen
número de compuestos orgánicos tales como indoles, aminas aromáticas y
compuestos ureicos para dar complejos coloreados.
5. Reacciones para cisteína y cistina: Cuando los aa y las proteínas que
contienen grupos tiólicos se calientan en medio fuertemente alcalino, el azufre
presente reacciona para formar sulfuros. Este sulfuro puede detectarse por la
formación de un precipitado negro de sulfuro de plomo por adición de acetato
de plomo.

Los grupos tioles también reaccionan con el nitroprusiato de sodio en presencia

de un exceso de amoníaco para dar un complejo de color rojo.

6. Prueba para Arginina: El aa. Arginina contiene un grupo guanidino en la

cadena lateral, este grupo reacciona con el reactivo de Sakaguchi (a-
naftol/agua de Bromo) en medio alcalino para dar un compuesto de color rojo.

Pruebas generales de las proteínas:

1. Prueba de Biureth: Los compuestos que tienen dos grupos carbamidos (-

CONH-), ya sea unidos directamente o a través de un átomo de carbono o
nitrógeno, dan un color violeta con el sulfato de cobre alcalino (Reactivo de
Biureth). Los tripéptidos son las moléculas más pequeñas capaces de dar una
prueba de Biureth positiva, mientras que esto no ocurre con los aminoácidos.
La prueba de Biureth es una buena prueba general para las proteínas y la
intensidad del color violeta es una medida del número de enlaces peptídicos.
Algunas sustancias como la oxamida pueden dar falsos resultados positivos en
ensayos cualitativos de proteínas.

2. Desnaturalización por calor y pH extremos: La desnaturalización es

cualquier proceso por el cual el arreglo espacial de una proteína cambia de la
estructura ordenada de la molécula nativa a una forma tridimensional
desordenada. Durante la desnaturalización se pierden las estructuras de orden
superior de las proteínas, con pérdida de la actividad biológica. Las enzimas
por ejemplo, que realizan trabajos catalíticos en las células, tienen una
temperatura y un pH óptimo en el cual presentan un máximo de actividad, pero
la actividad disminuye significativamente hacia valores extremos de pH y a
bajas o elevadas temperaturas.

3. Precipitación con cationes y aniones pesados y sales concentradas:

Los cationes de metales pesados y los aniones de elevado peso molecular son
muy usados en la separación de proteínas y en la preparación de filtrados
libres de proteínas. A pH neutro por lo general las proteínas tienen carga neta
negativa y se combinan fácilmente con iones de metales pesados que, al
neutralizar la carga producen la precipitación. A pH por debajo del punto
isoeléctrico en cambio, se combinan con aniones porque presentan carga neta
positiva. Soluciones concentradas de sales, de sulfato de amonio, por ejemplo,
reducen en gran medida la solubilidad de las proteínas, porque compiten por
las moléculas de agua de disponibles para la solvatación y las interacciones
proteína-proteína se hacen más importantes.

III. Materiales y Reactivos.

a). Tubos de ensayo, gradillas, goteros, baño maría.
b).Soluciones al 1% en HCL IM de glicina, tirosina, triptófano, Cisteína, cistina,
prolina, hidroxiprolina, arginina y fenilalanina. Soluciones al 1% de albúmina,
caseína y gelatina. Reactivo de Beirut, HNO3 conc., NaOH 1OM, ác. Acético
glacial, acetato de plomo II al 2%, ac. Pícrico saturado, ác, tricloroacético al
5%.

IV. Procedimiento.
a. Reacción de la ninhidrina:
Coloque 1 mL de la solución de aa. en un tubo de ensayo y ajuste el
pH cerca de la neutralidad; agregue 5 gotas de la solución de
ninhidrina y deje hervir por 2 minutos. Un color azul-púrpura
constituye una prueba positiva. (En el caso de prolina e hidroxiprolina
es amarillo).

b. Reacción xantoproteica:
Agregue volúmenes iguales de ácido nítrico concentrado a
aproximadamente 0.5 mL de la solución de aa., deje enfriar y observe
el cambio de color. Agregue suficiente NaOH 10M para que la
solución sea fuertemente alcalina. El cambio de coloración, de
amarillo a naranja brillante es indicativo de un resultado positivo.
Repita la prueba con una solución de fenol. La fenilalanina debe dar
una reacción negativa o débilmente positiva.

c. Prueba del ácido glioxílico:

A 2 mL de una solución de triptófano añada 2 mL de ácido acético
glacial, luego deje caer lentamente 2 mL de ácido sulfúrico
concentrado por las paredes del tubo, hasta que se formen dos capas.
Si se forma un anillo violeta en la interfase de los líquidos, la reacción
se considera positiva. Ensaye también con glicina y tirosina.

d. Prueba de Ehrlich para triptófano:

Agregue 2 mL del reactivo Ehrlich a 0.5 mL de la muestra. Anote los
colores que se producen. Ensaye con triptófano, glicina, hidroxiprolina
y urea.

e. Reacciones para cisteína y cistina:

Mezcle 1 mL de solución de cisteína con 5 mL de NaOH. Añada luego
unas gotas de solución de acetato de plomo II. Note los cambios.
Caliente hasta ebullición.
Para la prueba de nitroprusiato, combine 0.5 mL de una solución
fresca de nitroprusiato de sodio con 2 mL de la muestra y añada 0.5
mL de hidróxido de amonio. Repita la prueba con cistina, después de
mezclar volúmenes iguales de cistina y NaCN (venenoso, no pipetee y
deje reposar la solución durante unos minutos.

f. Reacción para la arginina:

Mezcle 1 mL de NaOH 10M con 3 mL de la solución de aa. (arginina,
glicina), y agregue dos gotas de a-naftol. Agite fuertemente y añada,
 con mucha precaución y en la cámara de gases, cuatro o cinco gotas
de agua bromo. Note el color formado. Ensaye también con urea.

g. Ensayo de Biureth para proteínas:

A 2mL de la solución de proteína, añada 3 mL del reactivo de Biureth,
mezcle y caliente a 37 ºC durante 10 minutos. Deje enfriar y observe
el color formado. Ensaye con gelatina, caseína y albúmina.

h. Desnaturalización por calor y pH extremos

En tres tubos de ensayo coloque 5 mL de la cada una de las proteínas
y agregue 0.5 mL de HCI 1Mm 0.5 mL de NaOH 1M y 0.5 mL de agua.
Coloque los tubos en baño de agua hirviendo durante 10 minutos y
enfríe s temperatura ambiente. Ajuste los tubos ácidos y alcalinos
hasta la neutralidad. Comente sus observaciones.

A 2 mL de la solución de proteína, agregue lentamente por las paredes

del tubo 2 mL de HNO3 conc. hasta que se formen dos capas, luego
mezcle cuidadosamente los dos líquidos. Anote sus observaciones.

i. Precipitación con cationes de metales pesados

A 2 mL de la muestra de proteína agregue unas gotas de la solución
salina de metal pesado (acetato de plomo y nitrato mercúrico). Añada
un exceso y anote sus observaciones.

Nota: estas soluciones son tóxicas, no las descarte en las tinas

de desagüe.

A 2mL de la solución de proteína añada unas gotas de reactivo acídico

(ác. Tricloroacético, .ac. pícrico saturado). Agregue NaOH diluido y
observe el resultado a medida que sube el pH.

V. Actividades.

 Confeccione un cuadro de resultados para cada prueba e ilustre los

colores obtenidos en los resultados positivos o negativos de las pruebas.
Anote comentarios y posibles explicaciones en los resultados negativos.
 Describa la reacción de la ninhidrina con ácido aspártico, lisina y
glutamina.
 Se tienen cuatro frascos sin rotular, que se sabe contienen soluciones de
los siguientes aminoácidos: glicina, arginina y tirosina y otro con el
tripéptido Gli-Arg-Gli. ¿Cómo los identificaría?
 Enumere cuatro agentes físicos y cuatro agentes químicos que pueden
desnaturalizar las proteínas.
 Investigue cómo afecta la fuerza iónica del medio la solubilidad de las
proteínas.

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Experimento 4.
Separación y cuantificación de fracciones proteínicas
del suero.

I. Objetivos:
1. Aplicar la técnica de precipitación salina selectiva
para separar las diferentes fracciones de proteína
presentes en una mezcla.
2. Determinar el porcentaje de composición de una
mezcla de proteína mediante análisis colorimétrico.

II. Marco Teórico:

El suero es el líquido de color ámbar que se obtiene por

centrifugación y o decantación de la sangre que se ha coagulado. En
el proceso de coagulación se separan todas las proteínas de la
coagulación (fibrinógeno), conjuntamente con las células plasmáticas.

La viscosidad del suero de debe en gran parte a la albúmina,

que constituye el 55% de las proteínas totales. Junto con los
electrolitos, la albúmina participa en la regulación del volumen
sanguíneo, al evitar que el agua que forma parte de la sangre difunda
hacia los espacios intersticiales; también participa en el transporte de
ácidos grasos. Las globulinas comprenden el 38% de las proteínas
plasmáticas y corresponden a los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig)
que liberan las células plasmáticas. La función anticuerpo representa
un crucial mecanismo de defensa contra infecciones virales y
bacterianas de los animales y el hombre. Tres fracciones de
globulinas (alfa, beta y gamma) se pueden cuantificar y caracterizar
por fraccionamiento con soluciones salinas.

III. Materiales y Reactivos.

Reactivos: Suero sanguíneo, Cloruro de sodio 0.9 %, Reactivo
de Biureth, Solución patrón de albúmina, Sulfato de sodio
15.75%, 19.9% y 27.2%, celite.
 Materiales: Tubo de ensayo, Gotero, Pipetas 2, 5 y 10 ml,
Colorímetro, Espátula, Centrifugadora.

IV. Procedimiento.
Determinación de las Proteínas Totales
Tubo Suero Albúmina NaCl 0.9 Biuret Agitar Repos
% h ar
A = 0.1 mL - 1.9 mL 8.0 mL por inversión 10 min.
muestra
A.1 = - 0.1 mL 1.9 mL 8.0 mL por inversión 10 min.
Patrón
A.2= blanco - - 2.0 mL 8.0 mL por inversión 10 min.
Determine la lectura en el colorímetro a 540 nm.

Separación y Determinación de las fracciones de proteínas.

Tubo Suero Na2SO4 Celite Agitar Reposar
B 0.5 10 mL al 15.75 0.5 g por 1 hora
mL % inversión
C 0.5 10 mL al 19.9 0.5 g por 1 hora
mL % inversión
D 0.5 10 mL al 28 % 0.5 g por 1 hora
mL inversión

Centrifugue por 5 min. a 3000 r.p.m.

Decante el sobrenadante y adicione en tubos de ensayo las siguientes cantidades:
Tubo sobrenadante Biuret Agitar Repos
h ar
B.1 2 mL 8.0 mL por inversión 10 min.
C.1 2 mL 8.0 mL por inversión 10 min.
D.1 2 mL 8.0 mL por inversión 10 min.
Determine la lectura en el colorímetro a 540 nm.

Interpretación de los resultados.

La solución de sulfato de sodio al 27.2 % que se adiciona al tubo D,
precipita todas las globulinas y deja en solución las albúminas. La
solución al 19.9% (tubo C) precipita a las beta y gamma globulinas y
deja en solución a la albúmina y las alfa globulinas. La solución al
15.75% (Tubo b), precipita a las gamma globulinas y deja en solución
a las albúminas y a las alfa y beta globulinas. Los resultados
esperados para la cuantificación de las diferentes fracciones de
proteínas en el suero, se resumen en el siguiente cuadro.

Tubo A Proteína total

Tubo D Albúmina
Tubo C - D Alfa globulinas
Tubo B - C Beta globulinas
Tubo A–B Gamma globulinas

VI. Actividades:
Resuelva:
1. Que diferencia hay entre suero y plasma.
2. Cuales son las globulina (Inmunoglobulinas o anticuerpos) mas
abundantes en el plasma. Describa algunas de sus características.
3. Señale la diferencia de solubilidad de las proteínas del suero.

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Experimento 5
Electroforesis de proteínas del suero humano
en gel de poliacrilamida bajo condiciones
desnaturalizantes (sds-page)
 INTRODUCCIÓN

Electroforesis

Electroforesis es la migración de moléculas cargadas en solución como respuesta a la

presencia de un campo eléctrico. La velocidad de migración depende principalmente de la
fuerza del campo, de la carga, forma, masa y tamaño de la molécula, así como de la fuerza
iónica, viscosidad y temperatura del medio en el que las moléculas se estén moviendo. Como
herramienta analítica, la electroforesis es rápida, sensible y simple. La electroforesis es
ampliamente usada para estudiar propiedades de especies cargadas en solución, y como una
técnica de separación.

Matrices de soporte

Generalmente la muestra es corrida en matrices como papel, acetato de celulosa, geles de

almidón, agarosa ó poliacrilamida. La matriz inhibe la difusión osmótica, así como el mezclado
producido por convección térmica., además proveee un registro del proceso electroforético ya
que puede marcarse y usarse para mediciones, autoradiografía ó almacenamiento. Las
matrices de soporte más ampliamente usadas (agarosa y poliacrilamida) proveen además, un
medio para separar moléculas por tamaño, ya que son geles porosos y pueden actuar como
tamices moleculares.

Separación de proteínas

Las proteínas son compuestos anfotéricos, por lo tanto su carga neta está determinada por el
pH del medio en el que están suspendidas. En una solución con un pH por encima de su punto
isoeléctrico, una proteína tiene una carga neta negativa y en un campo eléctrico migra hacia el
ánodo, mientras que migrará hacia el cátodo a pHs por debajo de su punto isoeléctrico. La
carga presente en una proteína es independiente de su tamaño y varía de una proteína a otra,
por lo tanto, la separación electroforética de proteínas bajo condiciones no desnaturalizantes se
realiza en virtud de su carga y tamaño.

Separación de proteínas bajo condiciones desnaturalizantes

El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que desnaturaliza proteínas

“envolviendo” el esqueleto polipeptídico, la unión presenta una relación de masas 1,4:1. El SDS
confiere carga negativa al polipéptido en relación a su longitud. Usualmente es necesario
reducir los puentes disulfuro de las proteínas para permitir la unión cuantitativa del SDS, esto
se lleva a cabo en caliente con 2-mercaptoetanol. En SDS-PAGE, la migración no es
determinada por la carga eléctrica del polipéptido, sino por su peso molecular.

Sistemas de amortiguador continuos y discontinuos

Un sistema continuo tiene un gel de separación sencillo y usa el mismo amortiguador en los
tanques y en el gel, en un sistema discontinuo, un gel de poro grande y no restrictivo, llamado
gel de apiñamiento, es colocado en la parte superior del gel de separación, llamado gel de
resolución. Cada gel está hecho con un amortiguador diferente, y el amortiguador de los
tanques es diferente al de los geles. La mayor ventaja de los sistemas de amortiguador
discontinuos sobre los continuos es que pueden agregarse volúmenes relativamente grandes
de muestras de proteína diluída a los geles sin comprometer la resolución, esto se debe a que
las proteínas son concentradas en zonas extremadamente estrechas durante su migración en
el gel de apiñamiento. La resolución alcanzada con un sistema discontinuo es muy superior a la
obtenida con sistema continuo.
La justificación teórica de proceso electroforético en los sistemas discontinuos será discutida en
la sesión de laboratorio.

Geles de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se obtiene polimerizando monómeros de acrilamida
(CH2=CHCONH2) en cadenas largas y entrecruzándolas con un compuesto bifuncional como
N,N’-metilenbisacrilamida ( CH2(NHCOCH=CH2)2, usualmente llamada bisacrilamida). La
polimerización es iniciada mediante la adición de persulfato de amonio ó riboflavina, y se usa
N,N,N’,N’-tetrametilenetilendiamina (TEMED) como acelerador del proceso de polimerización.
Ambos iniciadores de polimerización generan radicales libres, el persulfato de amonio
espontáneamente en solución (enlace peróxido), y la riboflavina mediante fotodescomposicion.
El tamaño de poro efectivo de los geles de poliacrilamida depende inversamente de la
concentración de acrilamida, y se usan geles con concentraciones de acrilamida desde 2.5%
(moléculas con peso mayor de 106) hasta 30% (polipéptidos con peso de ~2000). Para una
concentración de monómero dada, las propiedades del gel varían con la proporción de agente
entrecruzador usado, al aumentar éste el tamaño de poro decrece, alcanzando un mínimo
cuando representa un 5% de la cantidad total de monómero.

pH

Los límites prácticos de pH para realizar PAGE están entre pH 3 y 10, ya que algunas
reacciones hidrolíticas (como desaminación) ocurren a pHs extremos. La elección del pH para
PAGE depende de dos consideraciones opuestas, a pHs cercanos al punto isoeléctrico de las
proteínas a separar, la diferencia de carga entre ellas es grande, aumentando la posibilidad de
separación, sin embargo, al ser pequeña la carga, los tiempos de corrido son largos, llevando a
un aumento en el ensanchamiento de banda. En SDS-PAGE los complejos polipéptido-SDS
están negativamente cargados en un rango amplio de pH, por lo tanto el pH no es crítico.

Marcaje de las bandas

Las bandas pueden ser evidenciadas mediante diferentes métodos como tinción con
colorantes, revelado “fotográfico”, autorradiografía ó con marcaje fluorescente. En la presente
aplicación se usará marcaje con plata, método altamente sensible y rápido. Las bandas de
proteína son fijadas en la posición final después de la electroforesis precipitando las proteínas
con metanol y ácido acético, las bandas son sensibilizadas con tiosulfato de sodio, que mejora
el contraste entre las bandas teñidas y el fondo del gel, posteriormente el gel se trata con
nitrato de plata, los iones plata se complejan con la proteina, y en un paso posterior, similar al
revelado fotográfico, los iones plata complejados sufren una reducción mucho mas rápida que
los iones plata libres, formando partículas coloidales de plata en las dos superficies del gel,
preferencialmente sobre las bandas de proteína, haciéndolas visibles. Los límites de detección
son del orden de ng de proteina.

Electroforesis de proteínas del suero humano

Las proteínas presentes en el suero humano pueden agruparse en 4 fracciones dependiendo

de su mobilidad electroforética: Albúminas, alpha, beta y gamma globulinas. La mayoría de las
alpha y beta globulinas son sintetizadas en el hígado, mientras que las gamma globulinas son
producidas por linfocitos y células plasmáticas.

Las albúminas del suero pertenecen a una familia multigénica de proteínas que conforman la
mayor fracción de proteínas solubles en el sistema circulatorio, estas desempeñan diversas
funciones fisiológicas, como regulación de la presión osmótica, transporte y distribución de un
gran número de ligandos endógenos y exógenos que incluyen ácidos grasos, aminoácidos,
esteroides, metales como calcio, cobre y zinc y fármacos. Las alpha1 globulinas incluyen a-1-
antitripsina, a-1-antiquimotripsina y a-1-lipoproteína (LDH), entre otras. Entre las alpha2
globulinas están la a-2-macroglobulina (inhibidor de proteasas), haptoglobulina (se une a
hemoglobina libre), proteína C (inhibidor de factores de coagulación), ceruloplasmina
(transportador de cobre) y a-2-lipoproteína (VLDL). Las beta1 globulinas incluyen
transferrina(capta hierro) y hemopexina. Las beta2 globulinas incluyen plasminógeno, b-2-
lipoproteína (LDL) y alguna proporción de IgA. El fibrinógeno también migra en esta región. Las
gamma globulinas consisten en las inmunoglobulinas IgM, IgA e IgG.

La electroforesis es usada para separar las globulinas de las albúminas, ya que los niveles de
cada fracción son de importancia en diagnóstico clínico. La muestra preferida es el suero, ya
que el fibrinógeno contenido en el plasma a menudo obscurece cambios en los niveles de las
beta y gamma globulinas. Otras muestras usadas son el fluido peritoneal u orina.
Mediante la electroforesis pueden separarse y cuantificarse unas 100 proteínas presentes en el
suero, los niveles obtenidos son útiles para diagnosticar gamopatías monoclonales (asociadas
al cáncer), cirrosis, hepatitis autoinmune, artritis reumática, osteomielitis, bronquitis,
leishmaniosis, lepra, leucemia, enfermedades inmunológicas, SIDA, mielomas , desórdenes
renales, carcinomas, infecciones agudas, diabetes, embarazo, estrés, daño celular y
desnutrición entre otros estados clínicos.

MATERIALES Y EQUIPOS

Cámara de electroforesis
Fuente de voltaje
Enfriador a 4°C
Solución stock monómero (Acrilamida 29,2%, bisacrilamida 0,8%)
Amortiguador Tris-HCl 1,5M pH 8,8
Amortiguador Tris-HCl 0,5M pH 6,8
Amortiguador Trisbase-glicina pH 8,3 (5X)
Solución stock SDS 10%
Persulfato de amonio al 10% (recién preparado)
TEMED
Amortiguador reductor para las muestras : SDS 2-mercaptoetanol
Glicerol Azul de bromofenol
Amortiguador pH 6,8
Fijador A (Metanol 50%, ácido acético 5%)
Fijador B (Metanol 50%)
Sensibilizador (Tiosulfato de sodio 0,02%)
Marcador (Nitrato de plata 0,1%)
Revelador (Formaldehído 0,04%, carbonato de sodio 2%)
Enjuage (Acido acético 5%)
Agua desionizada

SECCIÓN EXPERIMENTAL

Preparación del gel

Precaución: La acrilamida es un potente neurotóxico de carácter acumulativo, sus soluciones

no deben pipetearse con la boca!. Para preparar el gel de resolución mezcle 1,75ml de agua
desionizada, 1,25 ml de amortiguador pH 8,8 , 2,0 ml de solución de monómero, 50 l solución
de SDS, degasifique al vacío por 15 minutos y agrege 50ml de solución de persulfato de
amonio y 5 l de TEMED. Vierta la solución resultante al portaplacas como se discute en
ELECTROFORESIS VERTICAL, agregue cuidadosamente un poco de agua sobre la mezcla
anterior para evitar deshidratación del gel y deje polimerizar por 40 minutos. Retire el agua, y
vierta en el portaplacas manteniendo el peine inclinado como se aconseja en
ELECTROFORESIS VERTICAL el gel de apiñamiento preparado con 3,0ml de agua
desionizada, 1,25ml de amortiguador pH 6,8 , 0,67ml de solución de monómero, 50 l de
solución de SDS, 50 l de persulfato de amonio y 10 l de TEMED. Deje polimerizar por 40
minutos.

Preparación de la muestra

La muestra de suero centrifugada y dializada (Opcional) se diluye hasta unas cuatro veces en
el amortiguador reductor y se calienta a 95°C por 4 minutos.
Sembrado de la muestra y corrido de la electroforesis

Después de armada la celda se agrega el amortiguador de corrido (véase ELECTROFORESIS

VERTICAL) y se siembran unos 4ml de muestra en cada reservorio, se tapa la celda y se hace
el corrido a 200V por 42 minutos.

Revelado de la placa

La placa se coloca en los siguientes baños por el tiempo especificado:

- Fijador A, 20min
- Fijador B, 10min
- Agua, 10min
- Sensibilizador, 1min
- Agua, 1min (2 veces)
- Marcador, 20min, 4°C
- Agua, 1min (2 veces)
- Revelador. Se lleva a la intensidad deseada (Usar fondo blanco)
- Enjuage, 1min

PREGUNTAS

1. En electroforesis suelen preferirse los amortiguadores de baja fuerza iónica, ya que

siendo menos conductores llevan la producción de calor a un mínimo, esto es deseable
ya que el calentamiento suele distorsionar las bandas; sin embargo, la fuerza iónica no
debe ser tan baja que precipiten las proteínas. Afectará la fuerza iónica del
amortiguador la separación en condiciones desnaturalizantes? Y en condiciones no
desnaturalizantes?
2. Por qué para asegurar la unión estequiométrica del SDS a las proteínas es necesario
reducir sus puentes disulfuro tratándolas con 2-mercaptoetanol?
3. Discuta la influencia del pH del gel de apiñamiento sobre la calidad de las bandas . El
voltaje sobre el tiempo de corrido y la generación de calor .

4. La cuantificación de las bandas suele realizarse densitométricamente. Consulte en qué

consiste el método.

Visite el simulador que se encuentra en: http://www.rit.edu/%7Epac8612/Electro_Sim.html

REFERENCIAS

- Páginas con información introductoria a la técnica.

http:/www.uct.ac.za/microbiology/sdspage.html
http://member.aol.com/neskander/Electro.html
- Manejo de la celda de electroforesis, receta del fabricante.
Bio-Rad. Mini-PROTEAN II Electrophoresis cell instruction manual

- Muy buen manual, enfoque teórico-práctico sobre las diferentes técnicas usadas en
electroforesis.
Hames, B. D. and Rickwoon, D. Gel electrophoresis of proteins. A practical approach.IRL press
Ltd. 1981

- Acerca de la técnica usada para marcar las bandas.

Scherchenko, A. et al. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained
polyacrylamide gels. Analytical chemistry, Vol. 68, No. 5, 1996

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DEPARTAMENTO DE QUIMICA
Experimento 6.
Actividad Enzimática de la Ureasa
I. Objetivos:
Al finalizar el experimento el estudiante estará en capacidad de:

1. Determinar la actividad enzimática de la Ureasa presente en la harina de

soya.
2. Calcular la Km. de la enzima de los datos de actividad enzimática, frente a
diferentes concentraciones de sustrato.

II. Marco Teórico:

Las enzimas son moléculas de proteínas que tienen la capacidad de
facilitar y acelerar las reacciones químicas que tienen lugar en los tejidos vivos,
disminuyendo el nivel de la energía de activación, propia de las reacciones. Se
entiende por energía de activación al valor de la energía que es necesario
aplicar (en forma de calor, electricidad o radiación) para que dos moléculas
determinadas colisionen y se produzca una reacción química entre ellas.

Características de la acción enzimática:

1- Especificidad de Sustrato: El sustrato es la molécula sobre la que la enzima
ejerce su acción catalítica.
2- Especificidad de acción: Cada reacción esta catalizada por una enzima
específica.

La acción Enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que

representa el estado de transición.
E + S ES E +P

El sustito se une a la enzima a través de numerosas interacciones

débiles como son: puentes de hidrogeno, electrostáticas, hidrófobas, etc., en un
lugar especifico, el centro activo. Este centro es una pequeña porción del la
enzima constituido por una serie de animoácidos que interaccionan con el
sustrato.

La Ureasa es una enzima que convierte la urea en amoniaco a pH

neutro y se puede obtener de fuentes vegetales, específicamente de la harina
de frijol de soya. Participa en el metabolismo del nitrógeno en plantas. Estas
enzimas permiten el estudio de nitrógeno ureico presente en el plasma
humano.
En el estudio de la actividad enzimática de la ureasa, se titula el
amoníaco formado con ácido clorhídrico valorado y se reporta al actividad
enzimática en moles de producto formado por minuto. Se verifican las
siguientes reacciones.

Ureasa
(NH2)2CO 2NH3 + CO2
Urea Amoniaco

NH3 + H2O NH4 OH

NH4OH + HCl NH4Cl + H2O.

III. Materiales y Reactivos.

a). Urea 0.25 M, Amortiguador: KH 2PO4, Ureasa, HCl 0.2 M, indicador rojo de
fenol y azul de timol. Cloruro de mercurio.
b). Tubos de ensayo, Pipetas, Vasos químicos, Gotero, Sistema de titulación

IV. Procedimiento.
Prepare los siguientes tubos de ensayo:
Tubo Urea 0.25 M Amortiguador (mL) Agua (mL) HgCl Enzima
(mL)
1 0.5 4.5 7.0 - Reposar 3.0 mL Reposar
2 1.0 4.5 6.5 - por 5 3.0 mL por
3 2.0 4.5 5.5 - minutos 3.0 mL 30
4 5.0 4.5 2.5 - Todos 3.0 mL minutos
5 7.5 4.5 - - los 3.0 mL A 30 0C.
6 7.5 4.5 - 8 gotas tubos 3.0 mL
Después de los 30 min, adicionar del tubo 1 al tubo 5, 8 gotas de.
HgCl2 Agitar

PRECAUCION: El HgCl2 es toxico y por lo tanto lave muy bien sus

manos al terminar el laboratorio. No desechar las soluciones en
las tinas.
Arme el sistema de titulación
Extraiga alícuotas de 5ml en Erlenmeyer de cada una de las muestras, y
adicione a cada muestra 2 gotas de rojo de fenol y 4 gotas de azul de
timol
Comience a titular las muestras, en el siguiente orden muestra 6,
1,2,3,4 y 5. Hasta obtener una coloración violeta

El calculo de las mili moles de amoniaco por minuto (m mol de NH 3 / min.) se

obtiene de la siguiente manera:

Para:
Tubo 1 =Volumen promedio de HCl x Molaridad de HCl = m mol de NH 3 /
min.

El cálculo de la concentración de sustrato se obtiene de la siguiente manera:

Tubo 1= (Volumen inicial de urea) (concentración inicial de urea) = (Volumen

final de urea) (concentración final de urea).
V. Actividades.
 Construya un gráfico de actividad (moles de urea transformados por
minuto) versus concentración de urea. Grafique también 1/act. Vs 1/
concentración del sustito y calcule la Km de la ureasa.

Recuerde presentar en el informe los cálculos correspondientes.

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Experimento 7.
Estudio de Inhibición de la Fenoloxidasa de la papa

I. Objetivos:
 a. Determinar la actividad enzimática de la fenoloxidasa presente en
extractos de papa.

b. Calcular la Km de la enzima de los datos de actividad enzimática, frente

a diferentes concentraciones de sustrato.

c. Estudiar el tipo de inhibición que ejerce el ácido benzoico sobre la

actividad de la fenoloxidasa de la papa.

II. Marco Teórico:

Las enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son
proteínas. Como catalizadores, las enzimas actúan en pequeña cantidad y se
recuperan indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean
energéticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios
químicos, sino que aceleran su consecución.

La característica más sobresaliente de las enzimas es su elevada

especificidad. Esta es doble y explica que no se formen subproductos: (1)
Especificidad de sustrato. El sustrato (S) es la molécula sobre la que el enzima
ejerce su acción catalítica. (2) Especificidad de acción. Cada reacción está
catalizada por un enzima específico.

La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que

representa el estado de transición.

E + S ES E + P

La velocidad de reacción está dada por la ecuación:

Donde V0 es la velocidad inicial del proceso

V0 = Vmáx [S]
KM + [S]

[S] = concentración de sustrato

KM = constante de Michaelis – Menten

Vmáx = velocidad máxima

Los estudios de inhibición enzimática clásica reversible implican el análisis
gráfico de los recíprocos de las velocidades iniciales 1/V o y de las
concentraciones de sustrato 1/ [S]

III. Materiales y Reactivos.

a).Baño termométrico, tubos de ensayo, gradilla, bureta de 50 mL, goteros,
pipetas de 5 y 10 mL, erlenmeyers de 125 mL, gaza, embudo buchner,
licuadora, espectrofotómetro visible.
b).Pirogalol (1,2,3 trihidroxibenceno) 1 % (solución madre), amortiguador,
citrato 0.1 M de pH 6, NaF 1% -ac., Benzoico 0.02%, Sulfato de Amonio,
solución saturada 60 – 70%. El estudiante debe traer una papa congelada.

IV.Procedimiento.
 Es importante que antes de iniciar el procedimiento de extracción
de la enzima, todos los materiales estén en frío, incluyendo el NaF,
la licuadora y el sistema de filtración previamente lavado con agua
fría. También se recomienda tener los tubos de ensayo listos con
las soluciones necesarias para medir la actividad.

 Corte la papa congelada en trozos de 1 cm por lado. Elimine la cáscara

y coloque los trozos en 200 ml solución de NaF al 1%. Licue a alta
velocidad por dos minutos.
 Filtre inmediatamente en buchner que tenga varias capas de gaza,
aplicando succión. Coloque en el baño con hielo inmediatamente.
 Enumere seis tubos de ensayo y añada los volúmenes en ml de las
soluciones correspondientes, como se detalla en el cuadro.
 Realizar lecturas de % transmitancia cada 30 s, o de acuerdo al tiempo
que señale el profesor.
 Dejar de tomar lecturas cuando las mismas se repiten unas tres veces
seguidas.

1 2 3 4 5 6
SOLUCIONES/TUBO

Estudio de la actividad enzimática sin inhibidor

mL Amortiguador pH 6 4 4 4 4 4 4
 mL Agua destilada 9 7 5 3 1 11
mL de Pirogalol 1% 2 4 6 8 10 -
Ajustar el cronómetro y el espectrofotómetro a 475 nm. Proceder con un tubo a la vez y añadir
la enzima.
mL Enzima 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Estudio de inhibición con ác. Benzoico 0.02%

mL Amortiguador pH 6 4 4 4 4 4
mL Agua destilada 8 6 4 2 0
ml de DOPA 1% 2 4 6 8 10

ml de ác. Benzoico 0.02% 1 1 1 1 1

Ajustar el cronómetro y el espectrofotómetro a 475 nm. Proceder con un tubo a la vez y añadir
2ml de enzima

V. Actividades:

 Construya un gráfico de actividad (Unidades de Absorbancia por

segundo) versus Concentración de Pirogalol.
 Grafique también 1/act. Vs 1 [S] y calcule la Km de la fenolasa.
 Construya un gráfico de actividad (Unidades de Absorbancia por
segundo) versus Concentración de Pirogalol. Con inhibidor. Grafique
también 1/act. Vs 1 [S] y calcule la Km aparente, el tipo de inhibición y
la K del ácido benzoico.

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Experimento 8
Determinación Cualitativa de Carbohidratos.
I. Objetivos:
1. Realizar pruebas cualitativas para detectar carbohidratos con
base en la formación furfural.
2. Ensayar la prueba para azúcares reductores.
3. Realizar pruebas cualitativas para polisacáridos.

II. Marco Teórico:

Los carbohidratos son compuestos orgánicos, formados primordialmente

por carbono, hidrógeno y oxígeno. Se encuentran en muchos productos
naturales y son una de las fuentes principales de energía para los organismos
quimiotróficos.

La unidad fundamental de los carbohidratos son los monosacáridos,

estos son polihidroxialdehídos o polihidroxicetonas.

Los monosacáridos se combinan, con la pérdida de moléculas de agua

uniéndose mediante enlaces glicosídicos, formándose oligosacáridos y
polisacáridos.

En presencia de ácidos no oxidantes, los carbohidratos se deshidratan y

forman furfural si el monosacárido es una pentosa o hidróximetilfurfural, si el
monosacárido es una hexosa.

Cuando la reacción de deshidratación se efectúa con la ayuda del ácido

sulfúrico concentrado y el color se desarrolla con alfa naftol, la prueba se
denomina reacción de Molisch.

Otra prueba basada en la formación de furfural es la prueba de

Seliwanoff. Esta prueba consiste en la reacción del resorcinol (1,3
dihidróxibenceno) con las cetosas deshidratadas por el HCI concentrado. Se
observa la formación de un complejo rojo.

La prueba de Bial se utiliza para identificar pentosas y consiste en

calentar la pentosa con HCI conc. se forma furfural que se condensa con
orcinol en presencia de iones férricos para dar un color verde azuloso.

Prueba para azúcares reductores: Las propiedades reductoras de los

azúcares depende de la presencia de grupos aldehídos o cetonas, reales o
potenciales. Al calentar ciertas soluciones de azúcares, en presencia de
determinados iones metálicos, el grupo carbonilo se oxida y el ión metálico se
reduce.

Algunas de éstas pruebas son: La de Benedict, que identifica

carbohidratos en general y es positiva cuando se observa la aparición de un
precipitado amarillo, anaranjado o rojo ladrillo; y la prueba de Barfoed, que es
similar a la de Benedict, excepto que el reactivo es ligeramente ácido o sirve
para detectar la presencia de monosacáridos.

Los polisacáridos son cadenas muy largas o polímeros de

monosacáridos, lineales o ramificados. Se dividen en heteropolisacáridos y
homopolisacáridos dependiendo si la forman distintos o iguales unidades
simples.

Algunos polisacáridos de reserva importante lo son el almidón formado por

dos constituyentes: amilosa y amilopectina; y el glucógeno llamado “almidón
animal”, se encuentra en el hígado y músculos.

III. Materiales y Reactivos.

a).Tubos de ensayo, gradillas, goteros, probetas, vasos químicos.
b). Soluciones al 1% de glucosa, fructuosa, lactosa, almidón, reactivo de
Benedict, Lugol, alfa –Naftol en etanol, H2SO4 conc., reactivo de Bial, reactivo
de Seliwanoff, reactivo de Barfoed.

IV.Procedimiento.
1. Pruebas basadas en la formación de furfurales

a) Prueba de Molisch: Agregue dos gotas de la solución de alfa-

Naftol a 1 ml de cada una de las sustancias a ensayar. Añada
cuidadosamente por las paredes del tubo aproximadamente 1 ml
de H2SO4 conc., hasta que se forme dos capas. Observe
cuidadosamente cualquier cambio de color en la interfase de los
líquidos. Realice las pruebas con agua, glucosa, lactosa y
almidón.

b) Prueba de Bial para pentosas: En un tubo de ensayo agregue

aproximadamente 1 mL de la sustancia a 2,5 mL de reactivo y
caliente hasta que empiece a hervir. La aparición de una
coloración azul verdosa, indica resultados positivos. Enfríe el
tubo, luego agregue 2-3mL de alcohol amílico y agite. Ensaye
esta prueba con glucosa y xilosa.

c) Prueba de Seliwanoff cetosas. En un tubo de ensayo agregue 2

mL del reactivo de Seliwanoff, adicione 2 gotas del carbohidrato y
caliente durante 1 min. en un baño de agua hirviendo. Observe la
aparición de un color rojo intenso. Ensaye esta prueba con
glucosa y fructuosa.
2. Pruebas para azúcares reductores:

a) Prueba de Benedict: Agregue cinco gotas de la solución de

carbohidratos a 2mL del reactivo de Benedict y coloque en un
baño de agua hirviendo por 5 min. Ensaye la prueba con glucosa,
fructuosa, sacarosa y almidón.
 Repita la prueba de Benedict usando muestras de jugo de frutas
naturales. Anote sus observaciones.

b) Prueba de Barfoed: A 2 mL del reactivo de Barfoed añada 1 mL

del carbohidrato, hierva por 1 min. y deje reposar. Anote sus
observaciones. Ensaye esta prueba con glucosa y sacarosa.

3. Prueba del Yodo:

 El yodo forma complejos coloreados de adsorción con los

polisacáridos; el almidón soluble (amilosa) da un color azul con yodo,
mientras que el glucógeno y el almidón insoluble (amilopectina)
parcialmente hidrolizados reaccionan dando una coloración pardo
rojiza.

 Acidifique con HCI diluido, agregue luego dos gotas de yodo y

compare los colores obtenidos con los de yodo en agua.

 Realice esta prueba con una solución de almidón al 1% y con

materiales como papel, algodón y tela.

IV. Actividades.

Resuelva:
 ¿Qué es un grupo acetal y que es un grupo hemiacetal?

 ¿Por qué la sacarosa no es un azúcar reductor’ Explique.

 Diga qué monosacáridos componen los siguientes polisacáridos:

Almidón, celulosa, inulina, glucógeno, quitina?

 Puede el glucógeno dar positiva la prueba del yodo?

 ¿Qué son las pectinas, que importancia tienen en la industria de jarabes?

 Por qué no debe hervirse mucho tiempo cuando se realiza la prueba de

Barfoed?

 Describa al menos dos pruebas que permitan distinguir:

a) sacarosa de lactosa
b) ribosa de fructuosa
c) amilosa de amilopectina

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DEPARTAMENTO DE QUIMICA
Experimento 9.
Aislamiento del Glucógeno.

I. Objetivos:
1. Extraer el glucógeno presente en una muestra de hígado de pollo.
2. Caracteriz
ar mediante pruebas químicas el glucógeno extraído.

II. Marco Teórico:

El glucógeno es un polisacárido de la célula animal, que se encuentra en
el hígado (10%) y músculos (2%). La estructura del glucógeno y los
polisacáridos similares se puede describir como una ramificación en forma de
abanico de moléculas de gucopiranosa, por medio de enlaces 1-6 en los puntos
de ramificación.

Estructura ramificada de glucógeno.

Presenta ramificaciones cada 8-12 glucosas con una cadena muy larga
(hasta 300.000 glucosas). Se requiere dos enzimas para su hidrólisis
(Glucogenofosforilasa) y alfa (1-6) glucosidasas, dando lugar a unidades de
glucosa. Dado que los seres vivos requieren una parte constante de energía,
una parte importante de metabolismo de los azucares esta relacionado con los
procesos de formación de almidón y glucógeno y su posterior degradación.

III. Materiales y Reactivos.

a)KOH al 50 %, Etanol al 95 %, Reactivo de Molish.
b) 50 de hígado de pollo, cuchillo, 1 matraz erlenmeyer de 250 mL y 500 mL,
probetas de 25 mL, 50 mL, 100 mL, baño maria, plancha, centrifugadora, vasos
químicos, tubos de ensayo.

IV.Procedimiento.
Corte en trozos pequeños 50 g de hígado de pollo
Caliente en un erlenmeyer de 250 mL con mucha precaución y
usando lentes de seguridad 36 mL de KOH al 50 %
 Adicione inmediatamente los trozos de hígado en el erlenmeyer que
contiene el KOH.
Caliente en baño maria durante 40 min. Agite el matraz de ser necesario
Después del calentamiento adicione 30 mL de agua.
Adicione 70 mL de etanol. Agite
El floculado formado es principalmente glucógeno.
Tape y deje reposar por 10 min.
Adicione la mezcla en los tubos de centrifugación.
Centrifugue por 5 min. a velocidad máxima
Recoja el precipitado y ensaye la prueba de Molish.

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DEPARTAMENTO DE QUIMICA
Experimento 10.
Determinación Del Perfil Lipidico.
I. Objetivos:

 Interpretar los valores de lípidos séricos obtenidos en el laboratorio

luego de un ayuno de 12 a 14 horas.
 Interpretar correctamente los intervalos de los valores de los índices
aterogénicos
 Reconocer los factores de riesgo de la aterosclerosis

DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS (TG)

lipoproteinlipasa
Triglicéridos + agua Glicerol + ácidos grasos

Glicerol quinasa
Glicerol + ATP Glicerol – 3P + ADP

Glicerolfosfato oxidasa
Glicerol 3P + O2 Dihidroxiacetona-P + H2O2

peroxidasa
H2O2 + 4-Aminofenazona + p-clorofenol Quinona + agua

La cantidad de esta quinona formada es proporcional a la concentración de

triglicéridos.

Procedimiento:
Preparar los siguientes tubos de ensayo:

Tubo blanco Tubo patrón Tubo muestra

30 uL de agua destilada 30 uL del patrón de 30 uL de suero humano
triglicéridos
3 mL de reactivo de color 3 mL de reactivo de color 3 mL de reactivo de color
enzimático para TG enzimático para TG enzimático para TG

 Homogenizar las muestras e incubar a 37°C durante 5 minutos.

 Leer la absorbancia de patrón y muestras a 500 nm. El color permanece
estable durante 30 minutos.

TRIGLICÉRIDOS (mg/dL): absorbancia de la muestra / absorbancia del patrón

(concentración del patrón)

Valores normales menores de 150 mg/dL

Valores sospechosos mayores de 150 mg/dL
Valores elevados mayores de 200 mg/Dl

DETERMINACIÓN DE COLESTEROL:

Colesterol esterasa
Esteres de colesterol colesterol + ácidos
grasos
 Colesterol oxidasa
Colesterol + O2 colest –4-en-3 ona +
H2O2

Peroxidasa
H2O2 + 4 aminoantipirina + Fenol quinoneimina + 4 H 2O

Procedimento:

Preparar los siguientes tubos de ensayo:

Tubo blanco Tubo patrón Tubo muestra

30 uL de agua destilada
30 uL del patrón de 30 uL de suero humano,
colesterol plasma con heparina o
EDTA
3 mL de reactivo para 3 mL de reactivo para 3 mL de reactivo para
colesterol colesterol colesterol

 Homogenizar las muestras e incubar por 10 minutos a 37°C,

 Leer en el espectrofotómetro antes de 30 minutos a una longitud de
onda de 500 nm.

Colesterol (mg/dL): absorbancia de la muestra / absorbancia del patrón

(concentración del patrón)

Valores normales menores de 200 mg/dL

Valores normales menores de 180 mg/dL para menores de 30 años.

DETRMINACION DE HDL – COLESTEROL

PROCEDIMIENTO:

 Adicionar en un tubo de centrífuga 200 uL suero (plasma con EDTA) y 500

uL de reactivo precipitante, homogenizar la solución y centrifugar a 4000
rpm durante 10 minutos.

 Separe el sobrenadante claro y emplearlo para la determinación de HDL –

Colesterol.

Preparar los siguientes tubos de ensayo:

Tubo blanco Tubo patrón Tubo muestra

300 uL de agua destilada 300 uL del patrón de HDL 300 uL de sobrenadante

– Colesterol
3 mL de reactivo para 3 mL de reactivo para 3 mL de reactivo para
colesterol colesterol colesterol

 Homogenizar e incubar durante 5 minutos a 37°C.

 Leer la absorbancia de la muestra frente al blanco a 500 nm.

CALCULAR:

HDL – Colesterol (mg/dL) = absorbancia de la muestra / absorbancia del patrón

(concentración del patrón) (3,5)

V. Actividades:

 Calcular los tg cuando estos son mayores de 400 mg/l

 Investigue los valores de referencia para colesterol total, colesterol hdl,
colesterol ldl
 Indique la relacion ct/hdl ideal, aterogenesis, aterogenesis galopante.