PUNTAJE NOTA

UNIVERSIDAD ANDRES BELLO

FACULTAD CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Nombres: Carolina Acuña Iturra

Gabriela Jofré Gutiérrez

1.- Objetivo del práctico (2 ptos)

-Conocer las técnicas básicas de bioseguridad y asepsia para trabajar en el laboratorio de
microbiología.
-Comprender y analizar el procedimiento de cómo realizar una siembra bacteriana en
distintos medios de cultivo.
-Observar e interpretar las distintas características morfológicas coloniales y bacterianas
tanto macroscópica como microscópicamente.
-Aprender a realizar tinciones a través de un uso correcto de sus procedimientos.

2.- Resultados de las técnicas de siembra

Dibuje en el espacio asignado, el resultado de su siembra y describa lo observado. En caso
de que no obtenga resultados satisfactorios, discuta brevemente las posibles causas.

a) Siembra en agar sangre

Observaciones (5 ptos):
El agar sangre es medio de cultivo del tipo no
selectivo, utilizado en la recuperación de
bacterias y hongos. Se cultivó Staphylococcus
Aureus, cepa bacteriana que se clasifica como
Gram positivo, haciendo este medio perfecto
para su crecimiento. Se utilizó la técnica de
Siembra en cuadrantes que pretende obtener
colonias aisladas que permitan la observación
macroscópica de la muestra, haciendo posible
un análisis de la morfología colonial posterior.
En este caso, fue exitosa tanto la elección de
fue exitosa tanto la elección de la cepa a
cultivar ya que pudo crecer convenientemente, como la técnica de siembra, obteniendo
en el cuadrante final hileras de colonias aisladas y fácilmente diferenciables. Entre las
características de la morfología colonial destaca su aspecto opaco, color amarillento,
cuyos bordes son redondos, de superficie convexa y textura cremosa.
b) Siembra en agar McConkey:
Observaciones (5 ptos):
Para el cultivo en Agar McConkey, fue
necesario seleccionar una cepa bacteriana
del tipo Gram negativo, ya que este medio se
define como selectivo para Gram positivo
(que impide su crecimiento) , y diferencial en
cepas del tipo Gram negativo, colaborando
así en su crecimiento.
Para obtener colonias aisladas de Proteus
Vulgaris se procedió a hacer una siembra en
cuadrantes, obteniendo desde el tercer
cuadrante colonias aisladas de aspecto
transparente, circular, con una elevación que
pareciera ser convexa, apariencia de la superficie pretendiendo ser brillante, una
consistencia de aspecto más bien friable y en cuyos bordes se puede apreciar una
presentación del tipo entero.

c) Siembra en agar nutritivo:

Observaciones (5 ptos):
El agar nutritivo posee concentraciones de
nutrientes estandarizados permitiendo que
sea útil para el crecimiento y cultivo de gran
variedad de bacterias, en esta ocasión,
estas condiciones favorables sumado al mal
uso de la técnica aséptica colaboraron en el
crecimiento de dos cepas bacterianas, ya que
se observan dos colonias bacterianas de
características morfológicas notablemente
distintas. Si bien hay una zona de clara
contaminación (cercano al tercer cuadrante),
la siembra en cuadrantes sobre el agar
nutritivo permitió obtener colonias aisladas de Enterococcus exitosamente, cumpliendo
con el objetivo de esta técnica. Se observan colonias aisladas en el último cuadrante con
cualidades morfológicas regulares tales como: color blanco de aspecto brillante,
elevación redonda, densidad opaca, puntiformes y una consistencia más bien cremosa.
d) Siembra en tubo en profundidad:
Observaciones (5 ptos):
El uso de tubos en profundidad es utilizado
para obtener colonias bacterianas visibles
comprobando principalmente sus condiciones
limitantes de oxígeno.
La siembra en tubos en profundidad expone
a la cepa bacteriana de estudio, en este caso,
correspondiente a Enterococcus, a un medio
Anaeróbicas. Como resultado se pudo
dilucidar que si hubo crecimiento bacteriano,
sin embargo, de poca densidad, por lo tanto,
se concluye que Enterococcus es una cepa
capaz de resistir condiciones en ausencia de
oxígeno, sin ser la condición anaeróbica su medio preferente, esto debido a que denota
un crecimiento, pero de carácter escaso. Se observan colonias más bien opacas, de
color blanco, pero sin poder ser definidas según su borde y superficie, ya que estas no
se encuentran aisladas.

e) Siembra en tubo tendido:

Observaciones (5 ptos):
Para la siembra en tubo tendido, se buscó
exponer la misma cepa ocupada
anteriormente (Enterococcus), pero para esta
oportunidad a condiciones aeróbicas,
esto es, presencia absoluta de oxígeno.
Se observa que esta cepa bacteriana tiene un
mayor crecimiento en condiciones aeróbicas,
ya que en esta oportunidad se observan
colonias más definidas y en mayor cantidad
al contrastarlo con la situación anterior.
Debido a que se hizo uso de la siembra con
asa de platino, la superficie del agar quedó
impregnada de pequeñas colonias de color blanco con cierto aspecto brillante, pero de
densidad opaca, sin embargo, resulta difícil poder diferenciar entre colonias ya que
fue posible tener un cultivo con todas las colonias aisladas.
f) Siembra en tubo semitendido:
Observaciones (5 ptos):
La siembra en tubo semitendido es utilizada
para exponer cepas bacterianas a condiciones
aeróbicas y anaeróbicas simultáneamente.
Para Enterococcus se observa que si bien hay
crecimiento bacteriano en ambas condiciones
(en presencia y ausencia de oxígeno),
se muestra cierta tendencia para preferir
condiciones aeróbicas, reafirmando los
resultados obtenidos anteriormente con la
misma cepa, pero sometida a ambos medios
aislados. Además, es posible observar iguales
morfologías coloniales descritas previamente.
Tras el análisis de los resultados obtenidos en medios anaeróbicos y aeróbicos, ya sea
estén aislados o de manera simultánea es posible concluir que Enterococcus es un tipo
de bacteria anaerobia facultativa, ya que demuestra crecimiento en ambas condiciones,
pero con preferencia predominante por el medio aeróbico.

3.- Resultados de las técnicas de esterilización y asepsia

Dibuje en el espacio asignado, el resultado de su siembra y describa lo observado. En caso
de que no obtenga resultados satisfactorios, discuta brevemente las posibles causas.

a) Esterilización del asa

(2 ptos) Observaciones (5 ptos):
En esta esterilización se sometió el asa de
siembra a flameado hasta su incandescencia,
(esto es esterilización por calor seco)
produciendo la desecación de la célula
efectos tóxicos por procesos oxidativos y
fusión de las membranas. Primeramente, se
dividió el agar en dos marcando con un lápiz
un sector con la letra “s” en donde se sembró
con asa de platino una muestra obtenida de
una suela de zapato, luego se prosiguió a
esterilizar el asa con flameado y luego a
sembrar en el sector con la letra “c”. Se
observó crecimiento de colonias en ambos sectores, pero hubo una menor cantidad de
estas colonias en el sector con flameado. En ambos lados se obtuvo una descripción
morfológica de las colonias similares, con bordes ondulados, un color blanco, brillo
opaco y forma irregular.
b) Alcohol
(2 ptos) Observaciones (5 ptos):
El alcohol es utilizado como agente
Desinfectante. Su principal forma de acción
antimicrobiana es a través de la
desnaturalización de las proteínas, de esta
forma se permite las rupturas de las
membranas. En este agar primeramente se
dividió en dos y se marcó un sector con la
Letra “s” en donde se sembró una muestra de
La suela de un zapato obtenida con una
tórula, posteriormente se adhirió alcohol a
esta tórula y se prosiguió a sembrar en el
sector del agar con la letra “c”. se visualizó la
morfología de las colonias en ambos sectores de características similares, cuya forma
era ondulada, con un color blanco opaco, pero las colonias del sector con alcohol se
ven más pequeñas y menos abundantes.

c) Yodo
(2 ptos) Observaciones (5 ptos):
El yodo es un desinfectante y antiséptico
halogenado cuya acción produce oxidación e
inactivación de los componentes celulares. En
el siguiente agar se dividió en dos sectores
uno con la letra “s” en el que se sembró una
muestra de la mesa del laboratorio a través
del dedo índice. Se prosiguió a incorporar
yodo al dedo que tenía la muestra y
posteriormente se sembró en el sector del
agar con la letra “c”. Se observó distintas
morfologías de colonias, en el sector sin yodo
se visualizan 4 tipos de colonias distintas, una
con borde entero y color amarillentos, otra con borde filamentoso y color amarillento,
otra con borde ondulado y color blanco, por último, una con borde lobulado y color
Amarillento. En el sector del agar con yodo hay presencia de todas las colonias menos
Aquella con borde lobular, indicando escasa eliminación de microorganismos por yodo.
d) Cloro
(2 ptos) Observaciones (5 ptos):
Esta técnica de desinfección resultó la más
efectiva en este práctico; el cloro es un
compuesto halógeno que somete a los
microorganismos a un estrés oxidativo,
oxidando compuestos como DNA y proteínas,
para así provocar daños irreversibles en
bacterias, hongos y micobacterias, dejando
viables a algunos virus y esporas bacterianas.
En esta ocasión se tomó una muestra de
mucosa bucal la cual se dispuso en la sección
con un “s” sin el desinfectante y “c” con el
desinfectante (cloro). Tras su aplicación sobre
un agar nutritivo (con ayuda de una tórula estéril) se logró obtener como resultado la
ausencia casi por completo de colonias microbianas en el sector donde se aplicó el
desinfectante (“c”) en contraposición del sector que no está expuesto a desinfección
(“s”), en el que se pueden observar colonias pequeñas de aspecto puntiforme.

4.- Análisis macroscópico:

A partir de su cultivo en agar nutritivo (placa de Petri) realice la descripción macroscópica
del agente, completando los siguientes cuadros informativos (8 ptos).

Enterococcus
Nombre bacteria

Puntiforme
Forma

Entero
Borde

Redonda
Elevación

Blanco
Color

Opaco
Brillo
Cremosa
Consistencia

Cremosa y brillante
Superficie
5.- Análisis microscópico:
Tinciones. Dibuje lo observado y describa sus observaciones: color, forma y agrupación y
cualquier otra observación relevante. Indique el aumento utilizado.

a) Tinción de Gram: Observaciones (5 ptos):

La tinción Gram consiste en utilizar colorante
cristal violeta (tipo catiónico) que tiñe
bacterias del tipo Gram positivo gracias a su
alta penetrancia en dichas paredes celulares
y con ayuda de un mordiente, el colorante
podrá ser fijado en estas. Luego la muestra
debe ser lavada y teñida con un colorante de
contraste: safranina que será capaz de teñir
aquellas bacterias que no lo estaban tras el
lavado, las de tipo Gram negativo quedando
así bacterias color fucsia tal como se observa
en la fotografía, por lo tanto, en este frotis es
posible concluir que Proteus Vulgaris es tipo
Gram negativo. En el análisis microscópico se utilizó microscopio óptico con aumento
total de 1000X y aceite de inmersión para obtener un ángulo de refracción mayor, y por
consiguiente una mejor visualización. Fue posible observar una alta densidad de Proteus
Vulgaris, la cual muestra una morfología bacilar y agrupación principalmente en diplos.

b) Tinción de cápsula:
Observaciones (5 ptos):
Para la observación de cápsula es necesario
generar una tinción del tipo negativa, esto
quiere decir que se obtendrá una tinción de
todo el frotis, exceptuando aquello de interés
es decir, todo aquello menos las bacterias
correspondientes a Klebsiella sp. que se verán
de color fucsia por la Fucsina, y la cápsula que
quedará exenta de tinción observándose
como contornos o “halos” blancos.
Las bacterias observadas son de forma bacilar
de tamaño más bien pequeño y disposición
en cadenas o estreptobacilos, inferido desde
la disposición de las cápsulas observadas en hileras una al lado de la otra.
Para el análisis microscopio se hizo uso del microscopio óptico, con un aumento total de
1000X (10X desde los oculares y 100X por lente objetivo); además se hizo uso de aceite
de inmersión, por su alto índice de refracción, colaborando en una mejor resolución.
c) Tinción de esporas:
Observaciones (5 ptos):
Para un examen microscópico de esporas
bacterianas, es necesario utilizar una técnica
tintorial donde se utilizan las tinciones de
verde de malaquita y safranina para su
contraste. En este caso, por motivos de
tiempo no fue posible la realización de esta
tinción, sin embargo, nos fue posible observar
una muestra preparada por otro grupo a
través de un microscopio óptico haciendo uso
de un aumento total de 1000X (10 del ocular
más 100X del lente objetivo). Es posible
observar una muestra de Bacillus, bacterias
con forma de bacilos de color fucsia debido a la safranina, con sus correspondientes
esporas, las cuales son dilucidados por su característico color verde proveniente de su
afinidad con el verde de malaquita. En cuanto a la agrupación bacteriana se ven
eventuales cadenas o estreptobacilo, sin embargo, es una mera aproximación.

6.- Responda las siguientes preguntas.

Ocupe sólo el espacio designado

a) Investigue qué es una infección nosocomial y cuáles son los patógenos bacterianos
más prevalentes que producen este tipo infección en Chile (7 ptos).

También denominadas infecciones intrahospitalarias (IIH), adquiridas durante la

asistencia sanitaria en hospital o cualquier centro de salud(1), y que no estaban presentes
ni en el periodo de incubación ni cuando el paciente ingresa, manifestándose tras 48 horas
después de la asistencia y hasta 72 horas después del alta, incluyendo además toda
infección post-quirúrgica dentro de los primeros 30 días, afectando al aumento de
morbilidad y mortalidad asociada(2). En chile se notifican aproximadamente 70000 casos
de IIH anuales, prolongando la estadía hospitalaria y el uso de camas, en 5 días promedio.
Esto trae repercusión en el elevado costo que afectan al paciente, familia, hospital y
comunidad. La localización más frecuente de IIH en Chile son en el tracto urinario (42%),
heridas operatorias (24%), neumonías (11%), bacteriemias (5%), distribuyendo la etiología
microbiana entre los siguientes gérmenes patógenos, Cocáceas (+): 21%, Enterobacterias:
16%, Virus: 55% y Hongos: 3%(3).
En las infecciones del tracto urinario los 3 agentes etiológicos más importantes:
Escherichia coli, P.aeruginosa y Klebsiella pneumoniae. En heridas operatorias están:
Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Streptococcus coagulasa (-). En neumonías
encontramos: Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus
aureus. Por último en bacteriemias: Staphylococcus aureus, Streptococcus coagulasa (-) y
Klebsiella pneumoniae(4).
b) Indique la clasificación, utilidad y componentes principales de los siguientes medios
de cultivo (6 ptos, 2 ptos c/u)

a) Agar sangre:

Es un medio enriquecido y diferencial, adecuado para cultivar diversos

microorganismos, incluyendo los que tienen una mayor exigencia para su desarrollo.
Lo compone un medio base, más un agregado de sangre al 5 % generalmente de oveja.
Este agar aporta muchos factores de crecimiento y permite observar la capacidad
hemolítica de los microorganismos patógenos según los halos hemolíticos alrededor
de las colonias que se pueden clasificar en hemólisis alfa, beta o gamma(5).

b) Agar McConkey:

En un medio selectivo y diferencial utilizado para aislar bacilos Gram negativos,

fermentadores o no de lactosa. Contiene sales biliares y violeta cristal que inhiben el
crecimiento de bacterias no entéricas Gram positiva, además contiene lactosa y un
indicador de pH rojo neutro que servirán para comprobar, con el cambio de color en el
medio, la fermentación o no de aquella azúcar(6).

c) Agar nutriente:

Es un medio de cultivo simple y sólido, compuesto de caldo luria y agar corriente,

utilizado para propósitos generales como el aislamiento y crecimiento de
microorganismos con escasos requerimientos nutricionales, este puede ser enriquecido
con sangre, carbohidratos u otras sustancias para enriquecerlo(7).

7.- Bibliografía (3 ptos)

(1) Samuel Kaba Akoriyea, epidemiología de la infección nosocomial en

neurocirugía(2009), Universidad de Santiago De Compostela, Santiago de
compostela, p.8
(2) https://medicinainterna.wikispaces.com/Infecciones+Intrahospitalarias
(3) http://www.hrrio.cl/documentos/eLearningIIH/profesionales/infeccionesintrahosp
italaria.pdf
(4) http://www.bibliotecaminsal.cl/wp/wp-content/uploads/2016/01/iih.pdf
(5) Forbes, B., Sahm, D., Weissfeld, A. Diagnóstico Microbiológico(2009), Editorial
Médica Panamericana, 12ª edición, Buenos Aires, p.98
(6) http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8770
(7) Rodríguez, E., Gamboa, M., Hernández, F., García, J. Bacteriología general:
Principios y prácticas de laboratorio (2005), Editorial Universidad de Costa Rica,
Costa Rica, p.118