MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA

BÁSICA

Sandra Carlina Rivas Zúñiga

Clara Inés Giraldo Aristizábal

Facultad de Ciencias Naturales, Exactas y

de la Educación

Programa de Biología
Manual Práctico de Microbiología

CONTENIDO

i. NORMAS PARA EL DESARROLLO DE LAS PRÁCTICAS

ii. TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS
1. TECNICAS DE TRABAJO EN MICROBIOLOGÍA Y MANEJO DEL MICROSCOPIO
2. OBSERVACION DE MICROORGANISMOS DE DIFERENTES GRUPOS
3. MÉTODOS DE ASEPSIA Y UBICUIDAD MICROBIANA
4. FORMAS, AGRUPACIONES Y ESTRUCTURAS DE CÉLULAS BACTERIANAS
5. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
6. CARACTERIZACION BIOQUIMICA DE ENTEROBACTERIAS
7. DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO Y EL EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES EN
UN CULTIVO BACTERIANO.
8. CULTIVO Y AISLAMIENTO DE HONGOS
9. OBSERVACION MACROSCOPICA E IDENTIFICACIÓN DE DIVERSAS ESTRUCTURAS REPRODUCTIVAS
DE LOS HONGOS
10. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUA
11. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE SUELO
12. ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS
Manual Práctico de Microbiología

i. NORMAS PARA EL DESARROLLO DE LAS PRÁCTICAS

1. PUNTUALIDAD
Las prácticas iniciarán a la hora en punto, ejemplo 7:00 am, 10:00 am, 2:00 pm. El estudiante que no se
presente puntualmente no podrá ingresar al laboratorio, por lo tanto, se le asignará el número de faltas
y la nota para la práctica correspondiente será cero.

2. NORMAS DE BIOSEGURIDAD
 Usar siempre bata de laboratorio de manga larga y puño.
 Usar guantes, gorro quirúrgico desechable y tapabocas.
 Llevar la guía de laboratorio IMPRESA
 Colocar los implementos que no va a usar (maletín, libros, cuadernos, etc) lejos del área de trabajo. El
área de trabajo debe mantenerse despejada.
 Lavar las manos antes y después de realizar la práctica de laboratorio.
 Desinfectar la mesa con alcohol al 70 % antes y después de realizar la práctica
 No comer, beber, ni fumar, dentro del laboratorio
 No llevar ningún implemento a la boca mientras esté en el laboratorio (lápices, lapiceros, dedos)
 Identificar y disponer adecuadamente los diferentes tipos de desechos
 Las personas con cabello largo deben recogerlo
 Debe usarse siempre zapatos cerrados
 Usar pantalones (sin rotos), no usar vestidos ni faldas
 No pipetear sustancias con la boca
 Reportar al profesor o al personal encargado del laboratorio cualquier inconveniente con las
muestras biológicas o con materiales de vidrio
 No usar celulares ni equipos como ipod, mp3, mp4, etc.

NOTA: Si el estudiante no cumple con cualquiera de los ítems mencionados, no podrá ingresar a la sala
de laboratorio para desarrollar la práctica.

3. EVALUACIÓN

Cada práctica de laboratorio se evaluará bajo los siguientes criterios:

Criterio Porcentaje
Desempeño durante el desarrollo de la práctica 30 %

Examen escrito que incluye: concepto, metodología, Resultados, preguntas

70 %
preliminares y complementarias incluídas en la guía

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Manual Práctico de Microbiología
ii. TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos son considerados la forma de
vida más diversa de nuestro planeta. Hay más clases
de microorganismos que plantas, vertebrados e
insectos juntos. Estos pequeños organismos han
existido por billones de años y se han adaptado a casi
cualquier ambiente, pudiendo alimentarse de
materiales inimaginables como metales, ácidos,
petróleo, gas natural, azufre, etc. Los microbiólogos
estiman que menos del 1 % de todas las especies
microbianas han sido identificadas, un gramo de suelo
puede tener 100 millones de bacterias individuales,
una cucharada de comida puede tener 1 millón de
bacterias por cm2. Las bacterias en nuestro cuerpo
representan aproximadamente el 10 % de peso seco.
Los microorganismos viven en comunidades en los
diferentes ambientes que habitan, de modo que el
primer paso en el proceso de identificación a nivel
individual es el aislamiento de un solo tipo de bacteria
o microorganismo particular, para lo cual se require
proporcionar las condiciones físicas, químicas y
nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de
forma controlada bajo condiciones de laboratorio. Un
cultivo que contenga una sola especie de células, no
adulteradas, se llama cultivo puro. Para aislar y
estudiar microorganismos en cultivos puros, se
requiren una serie de instrumentos básicos de
laboratorio y la aplicación de técnicas específicas.
Figura 1. Los microorganismos se han adaptado a
diversidad de ambientes y son fuente de moléculas de
interés médico e industrial
a b
Figura 2. Bacterias: a) En cultivo mixto, b) aisladas en
cultivos puros
Aunque actualmente existen técnicas que no requieren
el aislamiento de microorganismos para su
identificación, (aquellas basadas en el estudio de ARN
y ADN), las técnicas microbiológicas tradicionales de
aislamiento y cultivo, tinciones e identificación de
reacciones metabólicas son aún de gran utilidad.
Dichas técnicas son la base para la identificación de los
microorganismos, para el estudio de su reproducción,
ya sea para aumentarla o disminuirla, para el estudio
de su metabolismo, entre otros. Los investigadores
están convencidos de encontrar en los
microorganismos, nuevas características bioquímicas
útiles en medicina, biocombustibles, industria y más.
Figura 3. Cultivo puro en placa del Hongo Penicillium,
algunas especies son de imoprtancia industrial.
Es importante resaltar, que para tener resultados
satisfactorios, confiables y comparables, es necesario
establecer unas normas. La implementación de las
Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) y el
aseguramiento de la calidad obliga a normalizar todas
las operaciones que se realizan en el laboratorio. Por
ello se presentarán una serie de procedimientos e
instrucciones de trabajo con el fin de dar uniformidad y
consistencia a los resultados con base en las normas
internacionales dictadas por ISO (International
Standard Organization).
TÉCNICAS DE CULTIVO
A. Medios de cultivo. Los temas relacionados con los
constituyentes, tipos y métodos de preparación de
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Manual Práctico de Microbiología
los medios de cultivo se pueden revisar en la guía
número 5
B. Diluciones seriadas. Primero se pesan
asépticamente 10 g de muestra sólida o se miden
10 mL de muestra líquida. Si la muestra es suelo, se
tamizan aproximadamente 100 g de suelo para
retirar sólidos grandes y deshacer terrones. La
pesada suele realizarse en bolsa de plástico o en
papel de aluminio estériles. Se añaden a un
recipiente con 90 mL de diluyente estéril y se
homogeniza durante 2 minutos. Así se consigue el
macerado inicial que es la dilución 1:10 (10-1).
Cuando se trata de un alimento, si es posible es
mejor pesar 25 g de alimento. Añadir 225 mL de
diluyente estéril y proceder como en el caso
anterior. Para preparar las “DILUCIONES
SERIADAS”, añadir 1 mL de macerado inicial
(también llamado dilución madre o dilución 1:10) a
un tubo con 9 mL de diluyente, homogenizar
usando un agitador excéntrico de tubos de ensayo
durante 20 segundos o agitando manualmente. De
esta forma se prepara la dilución 1:100 ó 10 -2.
Repetir la operación anterior transfiriendo 9 mL de
la dilución 1:100 a un tubo con 9 mL de diluyente
para preparar la dilución 1:1000 ó 10 —3. Repetir la
operación anterior tantas veces como sea
necesario hasta conseguir el número de diluciones
deseado. El número de diluciones que se necesita
depende de la carga microbiológica de la muestra.
Por ejemplo, de un alimento del que se sospecha
un número alto de microorganismos/g hay que
hacer más diluciones que de uno poco
contaminado. Para los métodos de ausencia /
presencia no es necesario preparar las diluciones
decimales, éstas se utilizan para los métodos de
contaje.
Figura 4. Diluciones seriadas para el recuento de
microorganismos.
MÉTODOS DE SIEMBRA
1. En profundidad
Se caracteriza porque durante la incubación las
colonias crecen en el interior de la masa del agar.
Con este método de siembra es más fácil observar
reacciones metabólicas bacterianas, tales como:
lipólisis, proteólisis y fermentaciones.
El medio de cultivo preparado en el erlenmeyer
debe estar fundido y a 45 °C. Se realizan diluiciones
decimals sucesivas, 10-1, 10-2, 10-3, las que sean
necesarias para obtener una que contenga de 100 a
200 células. Se toma 1 mL de cada una de las tres
diluciones mayores y se depositan en el centro de
cajas de petri estériles vacías (sin medio de cultivo),
por duplicado. Se vierte el medio de cultivo (15 –
20 mL) en la cajas de Petri y se homogeniza por
movimientos giratorios horizontales en varias
direcciones, teniendo cuidado de no formar
burbujas. Se deja solidificar y se incuba. Para el
recuento se elige de entre todas las placas las dos
correspondientes a aquella dilución que presenten
un número de entre 30 y 300 colonias /placa (esto
proporciona una precisión estadística suficiente), se
utiliza un cuenta-colonias; se pone la placa de Petri
con la base hacia arriba y, si es preciso, se divide en
sectores marcando mediante un lápiz graso a lo
largo de los diámetros. El número de unidades
formadoras de colonia o UFC/g (o mL en muestras
líquidas) de la muestra original será: Número de
UFC/g = Número de colonias x factor de dilución
2. En superficie por extension
Se caracteriza porque durante la incubación las
colonias crecen en la superficie del agar. Se
extiende un inóculo o muestra uniformemente
sobre la superficie de un agar en placa usando un
asa de vidrio, ya sea en forma de L o triangular (asa
Digrasky). Cuando la muestra procede de
ambientes naturales con millones de células, la
técnica involucra la dilución de la muestra hasta
obtener una mezcla que contenga de 100 a 200
células (generalmente se trabaja con diluiones de la
muestra 10-3, 10-4, 10-5) posteriormente O,1 ó 1 mL
de las últimas diluciones, se transfiere al centro de
un agar en placa y la gota se esparce sobre la
superficie (Se realiza para cada dilución una
siembra por duplicado). Para el recuento se elige
de entre todas las placas las dos correspondientes a
aquella dilución que presenten un número de entre
30 y 300 colonias /placa (esto proporciona una
precisión estadística suficiente). El número de
unidades formadoras de colonia o UFC/g (o mL en
muestras líquidas) de la muestra original será:
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Manual Práctico de Microbiología
Número de UFC/g = Número de colonias x factor de
dilución
Figura 5. Siembra por extension y en
profundidad.
TOMA DEL INÓCULO
Una vez que las colonias han crecido, puede ser
necesario su confirmación. Si la muestra proviene de
un medio líquido, el inóculo se toma agitando el
suavemente el asa dentro del mismo, quedando la
muestra adherida por tensión superficial en el extremo
del filamento del asa de siembra. Si el medio es sólido
y se encuentra en superficie la muestra a sembrar
(placa Petri), tome una pequeña porción de cultivo
mediante un ligero roce con el asa de siembra. Si la
muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo
con agar en pico de flauta), hunda el filamento dentro
del medio hasta tomar una pequeña porción de la
misma. Todo el procedimiento se realiza bajo técnicas
de asepsia.
a b
c
Figura 6. Toma de inóculo o muestra a partir de una
colonia a) en placa de Petri, b) en tubo en medio
sólido, c) en tubo en medio liquido.
TRANSFERENCIA
La técnica que se aplica depende de la consistencia de
los medios de cultivo y del tipo de recipiente que los
contiene. Se pueden presentar los siguientes casos:
 Siembra de medio líquido a medio líquido: El
procedimiento se puede realizar con asa en anillo,
aguja o pipeta y en tubos de ensayo, matraces o
frascos.
 Siembra de medio sólido a medio líquido: El
procedimiento se puede realizar con asa en anillo o
aguja y en tubo de ensayo, matraces o frascos.
 Siembra de medio sólido a medio sólido: El
procedimiento se puede realizar con asa o aguja y
en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en
profundidad o en placa Petri, en superficie.
 Siembra de medio líquido a medio sólido: El
procedimiento se puede realizar con asa en anillo,
aguja o pipeta y en tubo de ensayo, ya sea en
superficie o en profundidad o en placa Petri, ya sea
en superficie o por homogeinización.
1. Técnica de transferencia en tubos de ensayo.
a. Técnica para medio liquido: Los dos tubos, el que
contiene el medio de cultivo sin sembrar y el que
contiene los microorganismos a transferir, se
toman con una mano, con las bocas colocadas a la
misma altura. Se sostienen con los dedos índice,
medio y anular apoyándolos en el dedo meñique, y
se los sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la
base para permitir la visualización de toda la
superficie del cultivo. Con los dedos pulgar e índice
(como un lápiz) de la otra mano, se toma la pipeta
estéril o el mango de Koll con su aguja o asa en
anillo y se esteriliza. Se destapan los tubos con los
dedos libres de la mano que sujeta el asa, de la
siguiente manera: el tapón del tubo más alejado
del operador (que es el que contiene la muestra)
entre el dedo meñique y la palma de la mano; el
tapón del tubo más cercano al operador (que
contiene el medio de cultivo estéril) entre el
meñique y el anular. Se flamean las bocas de los
tubos, se toma el inóculo; se siembra; se flamean
nuevamente las bocas de los mismos y se tapan
respetando las procedencias de los tapones y se
quema el asa. Como el inóculo procede de un
medio líquido, antes de realizar la transferencia se
debe agitar el tubo para poner en suspensión a los
microorganismos que pudieran estar depositados.
Si la siembra se realiza en medio líquido, se agita el
tubo sembrado para distribuir homogéneamente el
inóculo. Para realizar la agitación se toma el tubo
cerca del extremo superior con los dedos índice y
pulgar y se golpea suavemente la base del mismo
sobre el dedo índice de la otra mano con una
amplitud de 5 cm. Otra forma consiste en hacer
rotar los tubos entre las palmas de las manos.
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Manual Práctico de Microbiología
b. Técnicas para medio sólido: Cuando el medio de
cultivo a sembrar es sólido, se puede sembrar en
superficie, en profundidad o en profundidad y
superficie.
1) En superficie:
a) Por estría: Introducir el asa en anillo o aguja en el
tubo de agar inclinado hasta el fondo diluyendo el
inóculo en el agua de condensación que se acumula
en esa parte, luego mover el asa suavemente sobre
la superficie del agar con un movimiento en zig-zag
ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior
del medio.
b) Por trazo: Introducir el asa en anillo o aguja en el
tubo de agar inclinado y trazar una línea de siembra
desde la base del pico de flauta hasta el extremo
superior, sin ejercer presión para que no se rompa
el medio.
2) En profundidad:
a) Por punción: El medio de cultivo que se emplea
está solidificado en tubo en forma vertical y la
siembra se realiza con aguja, la que se introduce
con el inóculo rápidamente en el seno del medio y
se retira de la misma forma. La punción se realiza
en el centro del medio o excéntricamente.
3) En profundidad y superficie:
Por punción y estría: Se utilizan para la siembra
tubos con agar inclinado pero con mucho fondo. Se
introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, se
punza el fondo, se retira y se realiza un trazo o
estría en el pico de flauta.
2. Técnica de transferencia en placa Petri. La siembra
en placa Petri, puede hacerse:
1) En superficie:
a. Por estría central: Se levanta la tapa lo
suficiente como para permitir la introducción del
asa con la carga de microorganismos, iniciándose la
estría en el borde del medio más alejado del
operador y se la extiende hasta llegar al centro de
la placa, luego se gira ésta 180º y se continúa
realizando otra estría de la misma manera. Esta
división evita el obstáculo del borde de la placa
b. Por estría en cuadrantes: Se divide la placa en
cuatro sectores y se siembra en estría cada uno de
ellos, partiendo del borde de la placa hacia el
centro. El cuadrante a sembrar debe ser el más
alejado del operador y el inóculo en cada caso
puede ser el mismo (la misma especie) o distinto
(diferente especie) para cada cuadrante.
c. Por diseminación con espátula de Drigalsky:
Se deposita sobre el medio sólido contenido en la
placa, una asada o una gota con pipeta del material
a sembrar, que luego se extenderá por toda la
superficie del medio con una espátula de
DRIGALSKY. *La espátula se introduce
inmediatamente después de su uso en un
recipiente para su esterilización en autoclave o en
formaldehído al 5 %.
TÉCNICAS DE AISLAMIENTO
El objeto es obtener cultivos en estado puro, operación
imprescindible y previa al estudio e identificación de
una especie bacteriana. Se pueden realizar
aislamientos por métodos generales y por métodos
especiales.
1) Métodos generales de aislamiento.
Estos métodos utilizan medios de cultivos sólidos en
placa Petri:
a. Por diluciones sucesivas: se realizan las diluciones
como ya se explicó arriba y se siembra por extensión o
en profundidad.
b. Por agotamiento en superficie en una placa:
Es el método más utilizado. También se conoce como el
método del cuadrante. Se prepara una placa Petri con
el medio de cultivo a la que se le elimina el exceso de
humedad
 Se carga el asa con la muestra, se deposita en un
punto de la superficie del sector (I) cercano al borde
 Se extiende en el mismo con estrías próximas y
paralelas.
 A continuación se quema el asa y se deja enfriar.
 Se gira la placa 90 º, se pasa el asa una vez sobre la
última estría de la región ya inoculada y se arrastra
al sector (II)
 efectuando sobre él la siembra sin superponer las
estrías con las realizadas antes.
7
Manual Práctico de Microbiología
 Se quema nuevamente el asa
 De la misma manera se estría el sector (III).
 Luego de quemar el asa, en el sector (IV) se realizan
estrías con el material que se arrastra de (III), más
amplias y que terminan en el centro de la placa.
siempre aislamiento para observar la uniformidad de
las colonias.
BIBLIOGRAFIA
BaseClear. (Fotografía). Microbial Diversity Studies. [En
línea].
<https://www.baseclear.com/microbiology/next-gen-
technologies/microbial-diversity-analysis>[Citado en 10
de febrero de 2017].

International Organization for Standardization (ISO).

Métodos de análisis microbiológico. [En línea].
Figura 7. Siembra por agotamiento en superficie <www.iso.ch>.[Citado en 10 de febrero de 2017].

Cualquiera sea el método empleado, si se realiza MADIGAN, Michael; MARTINKO, John y PARKER,
correctamente, podrán obtenerse colonias aislada. Jack. Brock Biología de los Microorganismos. 10 ed.
Estas pueden pertenecer a distintas especies Madrid:Prentice-Hall, 2003. 1080 p.
bacterianas, las que generalmente se diferencian
macroscópicamente. En general cada colonia se Public health image library. (Fotografía) [En línea].
considera formada a partir de una célula bacteriana, <http://phil.cdc.gov/phil/home.asp.> [Citado en 10 de
aunque esto no es del todo cierto pues puede darse el febrero de 2017].
caso de que dos o más células den origen a una colonia.
Si todas pertenecen a una misma especie, la colonia
resultante será pura. Caso contrario, la finalidad del
trabajo no se habrá cumplido, no lográndose el
aislamiento.

Para comprobar la pureza de la colonia aislada se

puede realizar una coloración de Gram. Para ello se
pica la colonia y se la identifica con una marca en el
fondo de la placa con un número identificatorio. Se
hace el extendido con una porción de la colonia y si
todas las células observadas coinciden
morfológicamente, se repica el resto de la colonia en
un tubo con agar en estría para obtener un cultivo
puro. A veces la igualdad morfológica en la coloración
de Gram resulta engañosa por existir bacterias de
diferentes especies (pero iguales morfológicamente)
presentes dentro de la colonia seleccionada pero en
muy bajo número debido a su imposibilidad de
desarrollar. Por consiguiente es necesario realizar

8
Manual Práctico de Microbiología
GUÍA No. 1. TECNICAS DE TRABAJO EN MICROBIOLOGÍA Y MANEJO DEL MICROSCOPIO
Objetivo micrométrico adaptado a objetivo del
microscopio
Regla de micrómetro para medir estructuras celulares
INTRODUCCIÓN
El trabajo de laboratorio y muy especialmente el que
se realiza en el laboratorio de microbiología, requiere
cuidado, concentración y buenas prácticas de manejo
de técnicas para obtener resultados confiables. En
muchos casos, los resultados del trabajo en el
laboratorio dependen del buen manejo que se hace de
las técnicas y procedimientos.
El ambiente que nos rodea, está cargado de una gran
variedad de microorganismos, muchos de los cuales
son trasportados por el aire, ya sea a través de
partículas o gotas de agua suspendidas. Estos
organismos provienen de ambientes como suelo,
ecosistemas acuáticos y organismos vivos. Las
personas portan microorganismos en la piel, la boca, el
cabello, las manos y otras partes corporales y pueden
transferirlos fácilmente a otros ambientes. Por lo
expuesto, el trabajo de laboratorio cualquiera que sea
el propósito de este, requiere utilizar técnicas
asépticas para evitar contaminaciones.
De otro lado, un aspecto importante a tener en cuenta
es el manejo adecuado del microscopio, ya que es el
equipo que nos permite descubrir y estudiar el
fascinante mundo de los organismos vivos que a
simple vista no vemos, aquellos que gracias a su
diversidad estructural, fisiológica y genética, pueden
estar presentes en todos los ecosistemas,
desempeñando funciones ecológicas trascendentales.
Los primeros microscopios se denominaron simples,
pues constaban simplemente de una lente biconvexa,
a manera de una lupa común. Con el desarrollo de la
tecnología de los lentes, se logró avanzar hacia los
microscopios compuestos, que generalmente emplean
dos sistemas de lentes separados, consiguiendo con
ello mayores aumentos. Dado que el microscopio
compuesto es un instrumento fundamental en
microbiología, conocer los principios básicos de la
microscopía y la pericia en el empleo y la manipulación
de este instrumento, son requisitos imprescindibles
para cualquier estudio en esta ciencia.
OBJETIVOS
 Conocer el funcionamiento de los diferentes
equipos y el uso de materiales en el laboratorio de
microbiología
 Entrenar al estudiante en el manejo correcto del
microscopio compuesto
 Determinar dimensiones de microorganismos
utilizando el micrómetro ocular en microscopio de
luz
CONSULTAS PRELIMINARES
Se recomienda leer en un texto de microbiología
general los aspectos relacionados con el uso y manejo
correcto del microscopio, así como aspectos
relacionados con técnicas de asepsia, las cuales
incluyen el conjunto de métodos aplicados para la
conservación de la esterilidad como uso correcto de
ropa, instrumental, materiales y equipos estériles.
Los microscopios serán calibrados y ajustados por los
estudiantes, de acuerdo con las instrucciones del
docente.
9
Manual Práctico de Microbiología
MATERIALES 1.1 Manejo del microscopio
 Coloque la placa a observar sobre la platina
Materiales
 Ubique la muestra en el campo visual
Asa bacteriológica (aro y recta) 2
 Coloque el objetivo de 10X en la posición de trabajo
Mechero 1
 Suba la platina hasta el tope
Caja de Petri (vacía) 1
Asa de vidrio 1  Con el tornillo macrométrico descienda hasta
Tubo de ensayo (vacío) 1 lograr un enfoque grueso
Portaobjetos 2  Con el tornillo micrométrico de un enfoque fino
cubreobjetos 2  Utilizando los accesorios de los oculares cuadre
Hisopo 1 distancia interpupilar y dioptrías
Micropipeta 1  Pase a objetivo de 40X, solamente mueva el tornillo
Reactivos micrométrico para ajustar la imagen.
Caja de Petri con medio de cultivo 1  Si va a utilizar objetivos de 60X, 80X y 100X
Tubo de ensayo con medio de cultivo 1 recuerde que debe usar aceite de inmersión, y
Equipos limpiar las lentes con papel de arroz
Microscopios 2 inmediatamente después de retirada la placa, de lo
Objetivo micrométrico 1 contrario daña las lentes.
Ocular micrométrico 1  Al terminar su observación coloque el objetivo de
4X en la posición de trabajo y devuélvalo al
laboratorista.
PROCEDIMIENTO

Reconocimiento de equipos y materiales usados en el

laboratorio de microbiología
Inicialmente, haga un reconocimiento de los diferentes
materiales, equipos y aparatos que se emplean en el
trabajo de laboratorio en microbiología, tales como
autoclave, incubadora, balanza, horno de
esterilización, agitador magnético, baño maría, cabina
de flujo laminar, cajas de Petri, tubos de ensayo, asa
bacteriológica o de Digralski, pipeteadores, asas y
mecheros, entre otros.

Manejo del microscopio

 Coloque la placa a observar sobre la platina
 Ubique la muestra en el campo visual
 Coloque el objetivo de 10X en la posición de trabajo
 Suba la platina hasta el tope
 Con el tornillo macrométrico descienda hasta
lograr un enfoque grueso
 Con el tornillo micrométrico de un enfoque fino
 Utilizando los accesorios de los oculares cuadre
distancia interpupilar y dioptrías
 Pase a objetivo de 40X, solamente mueva el tornillo
micrométrico para ajustar la imagen.
 Si va a utilizar objetivos de 60X, 80X y 100X
recuerde que debe usar aceite de inmersión, y
limpiar las lentes con papel de arroz
inmediatamente después de retirada la placa, de lo
contrario daña las lentes.
 Al terminar su observación coloque el objetivo de
4X en la posición de trabajo y devuélvalo al
laboratorista.
Figura 8. Partes del microscopio
Procedimiento para la inserción, calibración y uso del
micrómetro ocular para medir células
• Colocar un objetivo micrométrico sobre la placa de
la platina y enfocarlo usando el objetivo 10 X y 40
X. Observe la regla: 100 x 0,01 = 1 mm
• Colocar el ocular micrométrico en el ocular
enfocable. Para ello desenroscar primero la parte
inferior del ocular, quitar el anillo que está sobre el
diafragma del ocular y colocar la placa del
micrómetro (con la escala grabada hacia abajo),
colocar nuevamente la parte inferior del ocular.
• Colocar el objetivo micrométrico sobre la platina
del microscopio y enfocar la escala. Ambas escalas
deben aparecer nítidamente definidas. Gire el
ocular para colocar la escala del micrómetro ocular
paralela con respecto a la división del micrómetro
objetivo.
• Situar el objetivo micrométrico (X) próximo y
10
Manual Práctico de Microbiología
paralelo al retículo de ocular (Y).
 Hacer coincidir en un punto ambas graduaciones.
En el ejemplo: 0 y 10 Contar cuántos mm del
objetivo micrométrico (X) equivalen a un
determinado número de intervalos del retículo de
ocular (Y).
 En el ejemplo: 7,8mm del objetivo micrométrico
equivalen a 120 intervalos del ocular micrométrico.
 Determinar el valor de calibración con la fórmula
siguiente:
𝑥 Jack. Brock Biología de los Microorganismos. 10 ed.
= valor de calibración en mm
𝑦 Madrid: Prentice-Hall, 2003. 1080 p.
 X objetivo micrométrico: número de mm, Y
Retículo de ocular: número de intervalos
 Retirar el micrómetro y enfocar el objeto a medir.
 Contar el número de intervalos del retículo que
corresponden al tramo que se desea medir.
 Multiplicar el número de intervalos por el valor de
calibración. El resultado es la longitud absoluta del
tramo medido, en mm
 Registre el valor de calibración para los objetivos
10, 40 y 100X
Figura 9. Bacteria Lactobacillus acidophilus
comúnmente encontrada en la boca de humanos
Figura 10. Uso de micrómetro para medir el alga
Spirogyra.
RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O
ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS.
No se generan residuos
BIBLIOGRAFÍA
BioEd online. (Fotografía). Comparing Sizes of
Microorganisms. [En línea].
<http://www.bioedonline.org/lessons-and-
more/lessons-by-
topic/microorganisms/microbes/comparing-sizes-of-
microorganisms/ > [Citado en 10 de febrero de 2017].
MADIGAN, Michael; MARTINKO, John y PARKER,
HARLEY, John y PRESCOTT, Lansing. Laboratory
Exercises in Microbiology. 5 Ed. New York: The
McGraw−Hill, 2002. 449 p.
The American Phytopathological Society. (Fotografía).
Microscopía Básica-Una Destreza Importante para
Fitopatólogos. [En línea].
<http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/LabExercis
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<http://mmcbiology.wikifoundry.com/page/Food,+Wat
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línea].
<https://en.wikipedia.org/wiki/Lactobacillus_acidophil
us> [Citado en 10 de febrero de 2017].
11
Manual Práctico de Microbiología

REPORTE DE PRACTICA 1

Nombre: ……………………………… Fecha: ………………………………… Programa: …………………………….

1. Ubique las diferentes partes de su microscopio y responda las siguientes preguntas.

a. Cuál es la magnificación de los oculares de su microscopio?

b. Cuál es la magnificación de cada objetivo de su microscopio?

c. Calcule el aumento total para cada combinación objetivo /ocular en su microscopio.

Ocular Objetivo Aumento total

d. Haga una lista del aumento y apertura numérica para cada objetivo de su microscopio

Aumento del objetivo Apertura numérica (AN) del objetivo

e. Observe las escalas vertical y horizontal de la platina. ¿Cuál es la función de estas escalas?

f. Dónde está localizado el diafragma de campo en su microscopio?

g. Cómo puede regular la luz del diafragma de campo?

h. Localice el condensador en su microscopio. ¿Cuál es su función y como puede ser regulado

i. Se puede regular la intensidad de la luz en el microscopio? Explique

12
Manual Práctico de Microbiología
GUÍA No. 2. OBSERVACION DE ORGANISMOS DE DIFERENTES GRUPOS MICROBIANOS
Colonias de algas Volvox
Conidióforos del hongo Aspergillus
Protozoo Amoeba
Células de la bacteria Bacillus
INTRODUCCIÓN
La microbiología se ha definido a menudo como el
estudio de organismos y agentes que son demasiado
pequeños para poder observarlos con el ojo humano a
simple vista. Como los objetos
inferiores a un milímetro de diámetro no pueden
observarse claramente y deben examinarse con
microscopio, la microbiología trata principalmente de
organismos de este tamaño o inferior. Esta ciencia se
ocupa del estudio de virus, bacterias, hongos,
protozoos y algas.
Bacterias: son organismos procariotas y aunque
muchas tienen una morfología similar, existen
importantes variaciones en cuanto a forma, tamaño y
agrupaciones. La mayoría presentan forma de coco o
de bacilo o bastoncillo, pero aparte de estas dos
formas más frecuentes, las bacterias pueden adquirir
una gran variedad de formas como vibrios, espirilos,
espiroquetas, entre otras. Las bacterias pueden existir
como células individuales, pero se asocian también en
agrupaciones características que son útiles para
identificarlas. Pueden observarse por ejemplo, parejas,
cadenas o racimos de células.
Protozoos: son organismos eucariotas unicelulares
generalmente móviles ya sea por pseudópodos,
flagelos o cilios, la mayoría viven libremente en
ambientes de agua dulce o marina, otros se pueden
encontrar en ambientes terrestres sobre materia
orgánica en descomposición y algunos son parásitos de
plantas o animales.
Hongos: son organismos eucariotas, portadores de
esporas con nutrición por absorción, carentes de
clorofila, que se reproducen de forma asexual y sexual.
Su complejidad es variable, y va desde las levaduras
unicelulares microscópicas y los mohos multicelulares,
los cuescos de lobo macroscópicos hasta las setas. Una
levadura es un hongo unicelular con un único núcleo,
suelen tener un tamaño mayor que las bacterias y
suelen ser esféricas u ovoides. Un moho consiste en
filamentos largos, a modo de hilos de células
ramificados llamados hifas cuyo conjunto forma un
micelio.
Algas: son organismos eucariotas que carecen de un
sistema vascular bien desarrollado, poseen clorofila,
realizan fotosíntesis productora de oxígeno, se
encuentran en agua dulce, marina y salobre, en ciertos
ambientes terrestres y sobre objetos inanimados
húmedos. La estructura vegetativa de las algas varía
desde la relativa simplicidad de una sola célula a la
llamativa complejidad de organismos como los quelpos
gigantes. Las algas pueden ser unicelulares, coloniales,
filamentosas, membranosas o tubulares.
13
Manual Práctico de Microbiología
Virus: Son agentes infecciosos con una organización
acelular y relativamente sencilla. Poseen un único tipo
de ácido nucleíco, DNA o RNA rodeado por una
cubierta de proteínas y a veces también por una
membrana. Los virus pueden existir en dos fases:
extracelular e intracelular. Los viriones, la fase
extracelular, no pueden reproducirse de forma
independiente de las células vivas. En la fase
intracelular, los virus existen como ácidos nucleicos
que se replican e inducen al huésped a sintetizar
componentes del virión, para finalmente liberar
partículas víricas completas. Existen cuatro tipos
morfológicos estructurales generales de viriones,
algunas cápsides tienen forma icosaédrica, otras son
helicoidales, muchos virus tienen una envoltura
membranosa y otros se denominan complejos por no
ser ni icosaédricos ni helicoidales.
OBJETIVOS
Observar organismos de diferentes grupos microbianos
e identificar sus principales características.
CONSULTAS PRELIMINARES
Consultar sobre las características generales de los
siguientes grupos microbianos: bacterias, algas,
hongos y protozoos.
MATERIALES
Materiales
Montajes permanentes de cultivos
bacterianos (Bacillus y Staphylococcus );
5
hongos (Rhizopus, Penicillium , levaduras)
Cultivos de bacterias, hongos filamentosos,
2
levaduras, algas y protozoos
Portaobjetos 5 Hifas
Cubreobjetos 5
Equipos
Estereomicroscopio 1 Algas
Microscopios 2
Objetivo micrométrico 1
Ocular micrométrico 1
Los microscopios serán calibrados y ajustados por los
estudiantes, de acuerdo con las instrucciones del
docente.
PROCEDIMIENTO
 Cada grupo de trabajo debe describir las
características macroscópicas de los diferentes
cultivos, utilizando el estéreo microscopio, según
anexo 1.
 Cada grupo de trabajo debe describir las
características microscópicas de los
microorganismos utilizando el microscopio, según
anexo 2.
 Para la observación de algas y protozoos, coloque
una gota del cultivo entregado por el profesor
sobre un portaobjetos, coloque un cubraobjetos,
lleve al microscopio y observe. Anote las
observaciones en el reporte de práctica 2.
OBSERVACIONES, CÁLCULOS Y RESULTADOS
Registre sus observaciones en los anexos 1 y 2, que se
encuentran al final de la guía. Los estudiantes deben
llevar cámara fotográfica el día de la práctica.
RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O
ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS.
Los residuos resultantes corresponden a cultivos
bacterianos, los cuales se inactivan y esterilizan en
autoclave. Una vez terminado el proceso de
esterilización, los residuos se disponen en bolsas
termoresistentes, se dejan enfriar hasta solidificación y
se almacenan temporalmente bajo congelación, La
disposición final se hace mediante el servicio de
recolección de residuos biológicos contratado por la
Universidad con la Administración Municipal.
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Realice una categorización de microorganismos por
tamaños.
Microorganismo Tamaño aproximado
Clamidias
Micoplasmas
Rickketsias
Otras bacterias
Hongos
Esporas
2. A qué se deben las diferencias macroscópicas
observadas entre colonias de bacterias y hongos?
3. Los factores ambientales pueden influir en las
características morfológicas de las células
microbianas? y de las colonias?. Sustente su
respuesta.
BIBLIOGRAFÍA
HARLEY, John y PRESCOTT, Lansing. Laboratory
Exercises in Microbiology. 5 Ed. New York: The
McGraw−Hill, 2002. 449 p.
14
Manual Práctico de Microbiología

Los microbios en la red. (Fotografía). [En línea].

<http://www.losmicrobios.com.ar/microbios/?page_id
=1306> [Citado en 10 de febrero de 2017].

MADIGAN, Michael; MARTINKO, John y PARKER,

Jack. Brock Biología de los Microorganismos. 10 ed.
Madrid: Prentice-Hall, 2003. 1080 p.

Pinterest. (Fotografía). Arte, Microalgas y más!. [En

línea].
<https://www.pinterest.com/pin/46387083034060390
9/ > [Citado en 10 de febrero de 2017].

University of Kentuky. (Fotografía). Amoebas are more

than just blobshttp://www.microscopy- [En línea].
<uk.org.uk/mag/indexmag.html?http://www.microsco
py-uk.org.uk/mag/artsep01/amoeba.html> [Citado en
10 de febrero de 2017].

15
Manual Práctico de Microbiología

REPORTE DE PRACTICA 2.

Anexo 1. Características macroscópicas de cultivos microbianos

Anexo 2. Características microscópicas de los microorganismos

16
Manual Práctico de Microbiología

PRÁCTICA No. 3. MÉTODOS DE ASEPSIA Y UBICUIDAD MICROBIANA

indispensable contar con conocimientos teóricos

acerca de los diferentes métodos de control del
crecimiento microbiano (métodos de esterilización,
desinfección, asepsia, etc.); y con un buen manejo
práctico de los equipos destinados a tal fin, así como
también del flameado de cajas de Petri, tubos y
esterilización de asas a la llama del mechero.

OBJETIVOS

 Comprender la importancia de la asepsia en el

control de la contaminación microbiana en el
laboratorio
 Demostrar la ubicuidad de los microorganismos en
Prácticas de asepsia diversos ambientes, superficies corporales y
objetos inanimados utilizando técnicas de cultivo
en medio sólido.

CONSULTAS PRELIMINARES

Se recomienda leer un texto de microbiología general

sobre la distribución de los microorganismos en
diferentes ambientes y conceptos de técnicas de
asepsia.
MATERIALES
Cultivo de bacterias Actinomycetes que refleja la
Materiales
diversidad microbiológica presente en el ambiente
Cajas de Petri 21
Copos de algodón 9
INTRODUCCIÓN Asa bacteriológica 1
Mechero 1
El término ubicuo significa en todas partes y en el Tubos taparosca (2 agua esteril, 2 sln salina) 4
contexto microbiológico significa que los Reactivos
microorganismos pueden estar en cualquier lugar. Esa Agar nutritivo 15 ml (21 x cajas de petri)
Solución salina fisiológica 10 mL
ubicuidad de los microorganismos se debe tener en
Hipoclorito de Na (5,25%, 2,5%, 0,5%) 100 mL por concentración
cuenta para tomar las precauciones pertinentes e Agua destilada estéril 20mL
impedir que éstos vayan a interferir con el trabajo que Cultivo bacteriano en caldo 1 de 5 mL
estemos realizando en un laboratorio o cualquier otro Equipos
lugar de trabajo. Incubadora 1 para todos los grupos

Los microorganismos como otros seres vivos, son
susceptibles a los cambios de condiciones ambientales
y en la medida en que se han podido adaptar a estos
cambios, se han distribuido en una gran diversidad de
hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre
todo de tipo físico y químico.
Por lo tanto, para limitar su presencia o eliminarlos, y
de esta manera poder desempeñar correctamente las
tareas en un laboratorio de microbiología, es
No hay restricción de seguridad por el uso de este
medio de cultivo. Remitirse al protocolo de
preparación recomendado por el proveedor en el
frasco del medio de cultivo.
La incubadora estará previamente calibrada a la
temperatura requerida, lo cual será realizado por el
auxiliar de laboratorio. Favor no manipular el equipo y
mantenerlo cerrado. Abrir solamente para incluir el
cultivo a incubar.
17
Manual Práctico de Microbiología
PROCEDIMIENTO e. Flamear nuevamente la boca del tubo
1. TÉCNICAS DE ASEPSIA
Uno de los aspectos más importantes en el laboratorio
consiste en aprender el procedimiento para remover o
tomar una muestra para su posterior cultivo y evitar su
contaminación. La muestra puede ser un liquido (ej.
agua, leche) o un microorganismo en cultivo

f. Tapar, retornar el tubo a una gradilla.

Se deben seguir cuidadosamente los siguientes pasos:

a. Mezclar para resuspender las células

g. Inocular un medio de cultivo estéril, líquido o sólido. Si el

medio está contenido en un tubo, flamear la boca. Tapar.

b. Flamear el asa hasta que el alambre se torne rojo

h. Flamear nuevamente el asa y retornarla a su base

c. Remover la tapa y flamear la boca del tubo, mantener la

tapa entre los dedos sin tocar su parte interna.
i. Rotular la muestral con la fecha y nombre. Llevar a
incubación

Para demostrar la importancia de las técnicas de

asepsia realizar los siguientes experimentos:

 Con un asa sin esterilizar tomar una gota de agua

destilada estéril y rayar suavemente la superficie
d. Dejar enfriar el asa, introducir al tubo sin tocar las paredes del agar nutritivo (servido en caja de Petri), como lo
y extraer una muestra de microorganismos (asada) muestra la gráfica, teniendo la precaución de no
romper la superficie del medio de cultivo.

 Limpiar la superficie de la mesa con alcohol al 70%,

encender el mechero y esterilizar el asa de siembra,
dejarla enfriar. Al lado del mechero, destapar
cuidadosamente otro tubo de agua destilada estéril
y con el asa tomar una gota, rayar suavemente la
superficie del medio de cultivo
18
Manual Práctico de Microbiología
 Una vez realice la siembra, esterilice el asa para
desinfectarla. Flamee la boca del tubo de ensayo
para evitar contaminación. Repita el procedimiento
anterior, pero coloque la gota a partir del tubo que
contiene un cultivo bacteriano. En todos los casos,
evite la manipulación libre del asa bacteriológica y
flaméela hasta lograr la esterilización.
 Rotule cada una de las cajas y séllelas con papel
parafilm o similar. Colóquelas en forma invertida en
la incubadora a 35 +/- 2 °C por un periodo de 24
horas.
1. DISTRIBUCION DE MICROORGANISMOS EN
AMBIENTES NATURALES
2.1 MICROORGANISMOS DEL AIRE.
a. Destapar una caja de petri con agar nutritivo en los
siguientes lugares: 1. Sobre la incubadora, 2. En
pasillo, 3. En el baño, 4. Dentro de la cámara de
flujo laminar apagada, 5. Dentro de la cámara de
flujo laminar encendida (realizar el procedimiento
de desinfección previo al uso de la cámara) y 6. Al
lado del mechero encendido
b. Dejarla expuesta por 15 minutos, después tapar
adecuadamente y rotular
c. Incubar a 35 ± 2 ªC durante 24 a 48 horas,
colocando las cajas invertidas.
Los muestreos descritos en los siguientes ítems deben
realizarse teniendo en cuenta las técnicas de asepsia
2.2 MICROORGANISMOS EN SUPERFICIES.
a. Tomar una torunda o copo de algodón humedecido
en solución salina
b. Frotar sobre las siguientes superficies: 1. mesón del
laboratorio sin desinfectar, 2. mesón desinfectado
con etanol al 70%, 3. mesón desinfectado con
hipoclorito al 5,25%, 4. mesón desinfectado con
hipoclorito al 2,5%, 5. mesón desinfectado con
hipoclorito al 0,5%, 6. Pared interna de la
incubadora.
c. Aplicar la torunda sobre un extremo del medio de
cultivo en la caja de Petri
d. Hacer estrías en toda la superficie sin romper el
medio de cultivo
e. Tapar adecuadamente y rotular
f. Incubar a 35 ± 2 ªC durante 24 a 48 horas,
colocando las cajas invertidas.
2.3 MICROBIOTA DEL CUERPO HUMANO.
MANOS: El siguiente procedimiento lo debe
realizar una sola persona
b. Sin lavar las manos, frotar cada uno de los dedos de
las manos haciendo círculos sobre el agar nutritivo.
c. Lavar con agua la mano izquierda, secar con toalla
de papel y frotar los dedos sobre el agar
d. nutritivo.
e. Lavar con agua y jabón la mano derecha, secar con
toalla de papel. Frotar los dedos sobre el agar
nutritivo.
f. Tapar adecuadamente y rotular
g. Incubar a 35 ± 2 ªC durante 24 a 48 horas,
colocando las cajas invertidas.
MUCOSAS: El siguiente procedimiento lo deben
realizar dos personas
a. Frotar con una torunda de algodón humedecida
en solución salina estéril las siguientes mucosas
por persona: fosas nasales, lengua, parpado
inferior. (utilizar una torunda por mucosa
muestreada)
b. Aplicar la torunda sobre un extremo del medio de
cultivo en la caja de petri y hacer estrías en toda
la superficie sin romper el medio de cultivo
c. tapar adecuadamente y rotular
d. Incubar a 35 ± 2 ªC durante 24 a 48 horas,
colocando las cajas invertidas.
OBSERVACIONES, CÁLCULOS Y RESULTADOS
Lleve un registro de todos los cambios observados
sobre el medio de cultivo, describiendo el crecimiento
de las colonias, sus colores, formas y texturas, con
base en los gráficos anexos. Diferencie los resultados
para cada uno de los orígenes de muestras. Para
efectos de descripción del crecimiento de las colonias,
utilice el material anexo.
19
Manual Práctico de Microbiología

REPORTE DE PRÁCTICA 3

El resultado que se espera es que en cada caja de Petri se presenten numerosas colonias de bacterias y hongos.

Qué es una colonia?

Es una masa visible de células que se forma sobre el medio de cultivo, a partir de la division (multiplicación celular)
de una célula. El tamaño, forma y color de una colonia es propio de cada organismo (Madigan et al, 2003).

Colonias

Figura 11. Colonias bacterianas desarrolladas sobre medio de cultivo.

Las colonias se forman porque las células se adhieren al asa o caen sobre el medio de cultivo. En microbiología se
assume que una célula da origen a una colonia después de sucesivas divisiones celulares como lo muestra la figura.

Figura 12. Esquema que representa la formación de colonias de microorganismos cultivables (dibujos de José Mª
Costa).

a b

c d
Figura 13. Estas placas muestran la diversidad de colonias desarrolladas a partir de muestras de diferente origen.
Figuras a y b muestran colonias bacterianas, c y d muestran colonias de hongos.

20
Manual Práctico de Microbiología

Figura 14. Aspectos mcroscópicos más comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio sólido

RESULTADOS
Completar la siguiente tabla para cada ambiente muestreado

Ambiente Microorganism Forma de la Borde Color Número de

o colonia colonias

PREGUNTAS
1. Según los resultados de la práctica de laboratorio, existen diferencias en la abundancia y diversidad de los
microorganismos dependiendo del ambiente muestreado? Por qué?
2. Son similares o diferentes lo microorganismos que se encuentran en cada uno de los ambientes muestreados?
Por qué?
3. Consultar y hacer una lista con nombres científicos de 10 microorganismos comunes en los ambientes de
donde se obtuvieron las muestras
4. Con base en la lista que usted realice, seleccione 3 microorganismos y consulte sobre su clasificación
taxonómica, su metabolismo y su importancia ecológica.

RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS

Los residuos resultantes corresponden a cultivos bacterianos, los cuales se inactivan y esterilizan en autoclave. Una
vez terminado el proceso de esterilización, los residuos se disponen en bolsas termoresistentes, se dejan enfriar
hasta solidificación y se almacenan temporalmente bajo congelación, La disposición final se hace mediante el
servicio de recolección de residuos biológicos contratado por la Universidad con la Administración Municipal.
21
Manual Práctico de Microbiología

BIBLIOGRAFÍA

ALCARAZ, Monica. Manual de prácticas de microbiología. Universidad de Colima, México. 2009. 74 p.

ALEXANDER, Steve; STRETE, Dennis y NILES, Mary. Laboratory exercises in organismal and molecular microbiology.
New York: The McGraw-Hill Companies, 2003. 384 p.

ALZATE, Rubén. Microbiología: Prácticas de laboratorio. Universidad Nacional de Colombia. Sede Palmira. 1996.

Bioil. (Fotografía). Aislamiento e identificación de bacterias con potencial para la degradación de aceite de cocina
desechado de los barrios Francisco Antonio Zea, Belén San Bernardo Y Robledo El Pesebre [En línea].
<https://microdonto.files.wordpress.com/2009/03/morfologia-de-las-colonias-bacterianas.pdf> [Citado en 10 de
febrero de 2017].

LEBOFFE, Michael y PIERCE, Burton. A photographic atlas for the microbiology laboratory. 4 Ed. Morton Publishing
Company. Englewood-USA, 2011. 266 p.

MADIGAN, Michael; MARTINKO, John y PARKER, Jack. Brock Biología de los Microorganismos. 10 ed. Madrid:
Prentice-Hall, 2003. 1080 p.

SEGRA. (Fotografía). Small Molecules Part 3: Drug Discovery and Development. [En línea].
<http://www.segrabiogen.com/knowledgebase/small-molecules-part-3/ > [Citado en 10 de febrero de 2017].

UNIVERSIDAD MIGUEL HERNÁNDEZ DE ELCHE. (Fotografía). TÉCNICAS DE AISLAMIENTO Y RECUENTO. [En línea]. <
https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/tecnicas-de-aislamiento> [Citado en
10 de febrero de 2017].

22
Manual Práctico de Microbiología

PRÁCTICA No. 4. FORMAS, AGRUPACIONES Y ESTRUCTURAS DE CÉLULAS BACTERIANAS

adhieran al vidrio y además coagula proteínas

citoplasmáticas haciéndolas más visibles.
Las coloraciones se clasifican como simples y
diferenciales. Son simples aquellas en las que se usa un
solo colorante solo para determinar la forma y arreglo
de las células bacterianas. Son diferenciales aquellas
en las que se usa más de un colorante para determinar
la presencia de estructuras facultativas como cápsula y
espora, la composición de la pared cellular o la ácido-
resistencia.
Bacilos agrupados como estreptobacilos
OBJETIVOS

 Determinar la morfología cellular, arreglo y

presencia de estructuras facultativas en
diferentes especies bacterianas.
 Comprender la diferencia y aplicación entre
tinciones simples y diferenciales

CONSULTAS PRELIMINARES
Cocos agrupados como estafilococos
El estudiante deberá consultar sobre los colorantes
INTRODUCCIÓN empleados frecuentemente en microbiología para
determinar las características morfológicas y
Dado que los microorganismos son invisibles al ojo estructurales de las bacterias.
humano, los biólogos han desarrollado métodos de
tinción de las células para facilitar la observación de MATERIALES
características como forma, tamaño, arreglo y
estructuras, con el propósito de identificar especies Materiales
bacterianas. Laminas portaobjetos 4
Asa bacteriológica 1
Existe una gran cantidad de colorantes aplicados en la Mechero 1
Goteros 1
microbiología, así como diversas técnicas de
Toallas de papel 2
tinción, dependiendo del tipo de microorganismo que
Bandeja de coloración 1
desea ser estudiado y los propósitos particulares de
Cultivos bacterianos 4
cada estudio.
Reactivos
Azul de metileno 50 ml
Los colorantes son soluciones compuestas por un Cristal violeta 50 ml
solvente como agua o etanol y una molécula coloreada Fucsina fenicada 50 ml
llamada cromógeno. Estas moléculas contienen cargas Lugol de Gram 50 ml
que se unen a las células a través de enlaces Decolorante alcohol – acetona 50 ml
iónicos/covalentes permitiendo su coloración, los Sulfato de cobre 20% 50 ml
Verde malaquita 5% 50 ml
colorantes básicos por ejemplo, tienen cargas positivas
Safranina 0,5% 50 ml
que se unen a las cargas negativas sobre la superficie Tinta china (nigrosina) 50 ml
de las células bacterianas. Son colorantes básicos el Aceite de inmersión 10 ml
azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Equipos
Microscopio 2 por grupo
Los colorantes son aplicados sobre extendidios
bacterianos en un portaobjetos que han sido fijados al
calor. La fijación con calor permite que las bacterias se
Para el desarrollo de la presente práctica se emplearán

23
Manual Práctico de Microbiología
diferentes colorantes y agentes decolorantes, los
cuales serán suministrados por el técnico de
laboratorio. Estos reactivos se entregan ya preparados
según las indicaciones de tinción de cada
procedimiento.
Los colorantes, además de su propiedad de teñir los
materiales y ropas, deben manipularse con cuidado,
pues tienen propiedades tóxicas, ya sea por ingestión o
exposición a través de la piel.
PROCEDIMIENTO
PREPARACIÓN DEL FROTIS O EXTENDIDO
BACTERIANO
1. A partir de medios líquidos (caldos de cultivo,
saliva, leche, etc.).
a. Lave bien el portaobjetos y séquelo. Elimine toda
suciedad y especialmente la grasa usando etanol al
70 % y una toalla de papel. Manéjelo tomándolo
por los bordes.
b. Esterilice el asa poniéndola verticalmente a la llama
del mechero hasta que se ponga al rojo en toda su
longitud. Déjela enfriar al menos 5 segundos.
c. Destape el tubo de cultivo y flamee el cuello del
mismo. Evite colocar la tapa sobre la mesa.
d. Tome con el asa una (o dos) muestra (s) de cultivo.
Evite tocar las paredes del tubo de cultivo con el
asa.
e. Flamee nuevamente el cuello del tubo de cultivo y
tápelo
f. Coloque la suspensión de bacterias en el centro del
portaobjetos. Extienda la suspension hacienda giros
sobre el portaobjetos.
g. Flamee el asa al rojo vivo.
h. Deje secar el frotis por evaporación normal del
agua. No aplique calor
i. Una vez seco, flamee el frotis a la llama del
mechero, así las bacterias quedan firmemente
adheridas al portaobjetos
2. A partir de medios sólidos (agares)
a. Coloque con el asa una gota de agua en el centro
del portaobjetos. Puede usar también un gotero.
b. Esterilice el asa y enfríela introduciéndola en el
borde del medio de cultivo
c. Con el asa saque una pequeña porción de u n a
colonia bacteriana, evite sacar medio de cultivo.
d. Coloque la muestra sobre la gota de agua del
portaobjetos, extiéndala haciendo giros. Si usted
observa que la suspensión no se extiende en la
superficie del portaobjetos, sino que se recoge en
gotas, significa que el porta objetos está engrasado
y deberá repetir el proceso en un porta objetos
completamente limpio.
e. Deje que el frotis se seque al aire
f. Fije el frotis, pasándolo sobre la llama del mechero.
TINCION DE EXTENDIDOS
1. COLORACIONES SIMPLES
La coloración simple es un método que consiste en
teñir utilizando un solo colorante bien sea ácido o
básico, como por ejemplo el azul de metileno, cristal
violeta, safranina y la fucsina. Estos colorantes se
emplean para apreciar la forma, la disposición y el
tamaño pero, no muestran detalles de la estructura
interna.
a. Coloque el portaobjetos en el que realizó el frotis
sobre la bandeja de coloración.
b. Cubra totalmente el frotis con el colorante. Aplique
un solo colorante. Deje actuar el colorante así : si
usa azul de metileno, 5min. Si usa fucsina, 30 seg.
c. Transcurrido el tiempo necesario, lave el
portaobjetos con agua, permita que escurra.
d. Deje secar el portaobjetos al ambiente sobre una
toalla de papel
e. Observe al microscopio. Haga esquemas de forma y
distribución.
2. COLORACION DIFERENCIALES
Las coloraciones diferenciales utilizan dos o más
colorantes, que permiten contrastar o diferenciar a los
organismos según el color que adquieren.
2.1. TINCIÓN DE GRAM
Fue elaborada por el Danés Hans Gram en 1884 para
distinguir entre bacterias Gram-positivas y Gram-
negativas. Además de la reacción Gram, esta tinción
permite determinar la forma y el arreglo de las células
24
Manual Práctico de Microbiología
bacterianas. Es la tinción más importante y más usada
en microbiología y es prácticamente la primera prueba
que se aplica a una muestra para su identificación.
La diferencia en la reacción de coloración entre las
positivas y las negativas se atribuye a la diferencia en
su composición química. Las paredes de las células
Gram-negativas tienen un contenido lipídico más
elevado que las positivas, y aunque en ambas se forma
un complejo cristal violeta-yodo, el alcohol extrae el
lípido de las células Gram-negativas y aumenta por lo
tanto la permeabilidad celular. Esto da como resultado
la pérdida del complejo de colorantes y se colorean de
rojo con la safranina o la fucsina. El mismo es retenido
por las células Gram- positivas, en las cuales la
deshidratación por el alcohol ocasiona una
disminución de la permeabilidad, reteniendo el cristal
violeta tras la decoloración y se observan de color
violeta.
Un microorganismo Gram-positivo puede presentar
una pared sana, al sufrir daño en esta, se vuelve Gram-
negativo; lo cual indica la importancia de la pared para
la retención o escape del colorante. Las características
de coloración de Gram pueden ser atípicas en cultivos
muy jóvenes o muy viejos.
Procedimiento para la tinción:
a. Teñir el frotis o extendido durante 1 minuto con
cristal violeta
b. Lavar con agua destilada
c. Añadir lugol y dejar reposar durante 1 minuto
d. Lavar con agua destilada
e. Decolorar con acetona o una mezcla de partes
iguales de acetona y alcohol. Por 10 segundos
f. Lavar con agua destilada
g. Hacer la coloración de contraste con safranina
durante 1 minuto
h. Lavar con agua destilada
i. Secar al ambiente y observar al microscopio
Figura 15. Bacterias con tinción Gram. Células
moradas: Gram-positivas. Células rosadas: Gram-
negativas.
2.2. COLORACIÓN DE CÁPSULA
Esta tinción es usada para detector bacterias que
pueden producir una cápsula cuya presencia
incrementa la virulencia en algunos microbios como
Bacillus anthracis y el Streptococcus pneumoniae. La
cápsula es una envoltura extracellular compuesta de
polisacáridos o polipéptidos resistentes a la tinción y
por eso exige el empleo de métodos de tinciones
especiales con el empleo de colorantes ácidos y
básicos. El colorante ácido tiñe el fondo alrededor de
las células mientras que el colorante básico tine las
células. La cápsula aparece como un halo claro o
transparente alrededor de las células. Las bacterias no
capsuladas no presentan dicho halo.
El método mas frecuentemente empleado se
denomina de Anthony y consiste en el siguiente
procedimiento:
Tomar una pequeña muestra a partir de una colonia de
Klebsiella pneumoniae, mezclar con una gota de leche
desnatada (suero), extender con un porta objetos en
ángulo recto. Esta preparación no debe fijarse con
calor para evitar la degradación de la cápsula, en lugar
de esto el suero actúa como un material que permite
la adherencia de las células al vidrio.
Realice el siguiente procedimiento:
a. Secar al ambiente
b. Colorear con solución acuosa de cristal violeta al
1%, durante 2 minutos.
c. Lavar con solución de sulfato de cobre al 20%
d. Secar al ambiente y observer al microscopio.
Figura 16. Células bacterianas con capsuladas. La
cápsula se observa como un halo transparente.
Otro procedimiento se basa en el uso de tinta china y
cristal violeta, de la siguiente manera:
a. Tomar una pequeña porción de una colonia de
Klebsiella pneumoniae
b. Mezclar con una gota de tinta china sobre el
25
Manual Práctico de Microbiología
extremo de un portaobjetos.
c. Extender usando otro portaobjetos en ángulo recto
d. Secar al aire o ligeramente con calor
e. Teñir con cristal violete por 1 min.
f. Lavar con agua
g. Secar al ambiente y observer al microscopio.

a-b c
d
Figura 17. Las esporas se observan como bacilos
pequeños verdes dentro de la célula color rosado

e f g OBSERVACIONES, CÁLCULOS Y RESULTADOS

Anote sus observaciones en un cuadro como el que se
indica a continuación:
Comparar el resultado entre ambos procedimientos.
.
2.3. COLORACION DE ESPORAS
Lista de
Esquemas y
Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium Bacteria Técnica Colorantes
Observaciones
forman estructuras internas de resistencia conocidas usados
como endosporas, las cuales se caracterizan por ser
muy resistentes a las altas temperaturas, a los
productos químicos tóxicos y a las condiciones muy
secas. Los colorantes sencillos no penetran la pared de Cuadro 1. Bacterias y características observadas
la espora, pero mediante el uso de colorantes fuertes mediante las coloraciones.
como el verde de malaquita y la aplicación de calor, se
facilita la coloración de la espora. Es conveniente PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
aplicar un colorante de contraste, la safranina, de esta
forma las esporas aparecerán verdes y la célula 1. A qué se debe la coloración de células? ¿Cómo
bacteriana roja.
actúa un colorante ácido? ¿uno básico?
2. Cuáles son las ventajas y las desventajas de una
a. Realizar un extendido de células de Bacillus cereus
tinción simple
con una gota de agua
b. Fijar al calor 3. En qué difiere una tinción simple de una tinción
c. Cubrir el extendido con una tira de papel filtro. Gram?
d. Bañar todo el portaobjetos con solución acuosa de 4. Cómo se correlaciona la presencia de cápsula con la
Verde Malaquita al 5%. virulencia de una bacteria patogénica?
e. Calentar al vapor durante 3 a 6 minutos sin dejar 5. En qué difiere una espora bacteriana de una espora
secar. fúngica?
f. Enjuagar con agua corriente y retirar el papel.
6. Por qué son más difíciles de colorear las esporas
g. Contra colorear con solución de Safranina al 0.5 %
durante 30 seg. que las células vegetativas?
7. Clasifique las siguientes bacterias como Gram
positivas o Gram negativas: Proteus vulgaris,
Clostridium tetani, Staphylococcus aureus,
Salmonela sp., Streptococcus pneumoniae, Bacillus
cereus, Pseudomonas sp, Thiobacillus sp.

26
Manual Práctico de Microbiología
RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O
ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS
Los residuos resultantes corresponden a cultivos
bacterianos, los cuales se inactivan y esterilizan en
autoclave. Una vez terminado el proceso de
esterilización, los residuos se disponen en bolsas
termoresistentes, se dejan enfriar hasta solidificación y
se almacenan temporalmente bajo congelación, La
disposición final se hace mediante el servicio de
recolección de residuos biológicos contratado por la
Universidad con la Administración Municipal.
Los excesos de colorantes de los procedimientos de
tinción deben recogerse en envases plásticos
colocados por debajo de las bandejas de tinción. Una
vez desactivados químicamente, deben disponerse
según las instrucciones del Comité de Seguridad.
Las placas bacteriológicas se colocan en recipientes
plásticos con detergente para su limpieza. La
disposición final de estos materiales se hace en la red
de drenaje del laboratorio.

BIBLIOGRAFÍA

ALEXANDER, Steve; STRETE, Dennis y NILES, Mary.

Laboratory exercises in organismal and molecular
microbiology. New York: The McGraw-Hill Companies,
2003. 384 p.

Hemtecks. (Fotografía). N e w s p i n o n g r a m
stain bacteria. [En línea].
<https://hemtecks.wordpress.com/2015/06/12/new-
spin-on-gram-stain-bacteria/> [Citado en 10 de febrero
de 2017].

LEBOFFE, Michael y PIERCE, Burton. A photographic

atlas for the microbiology laboratory. 4 Ed. Morton
Publishing Company. Englewood-USA, 2011. 266 p.

MADIGAN, Michael; MARTINKO, John y PARKER,

Jack. Brock Biología de los Microorganismos. 10 ed.
Madrid: Prentice-Hall, 2003. 1080 p.

27
Manual Práctico de Microbiología
PRÁCTICA No. 5. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Medios de cultivo comerciales
Medios de cultivo preparados. Agares y caldos.
Medios de cultivo selectivos y diferenciales.
INTRODUCCIÓN
Los medios de sultivo son una mezcla de nutrientes
que en concentraciones adecuadas y en condiciones
físicas óptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos. En el laboratorio de microbiología
son muy útiles porque aseguran la exactitud,
confiabilidad y reproducibilidad de los resultados
obtenidos.
Un microorganismo necesita para crecer nutrientes
que le aporten energía y elementos químicos para la
síntesis de sus constituyentes celulares. La elaboración
de medios de cultivo requiere proporcionar los
elementos antes citados en una forma asimilable. Así,
por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono
orgánico para los heterotrofos y como CO2 para los
autotrofos, el N en forma de NH4, de NO3 - o de NO2 -
o en forma de aminoácidos a los que se pueda tomar
su grupo amino; el P debe estar en forma de PO4 3-, el
S procede de aminoácidos sulfurados o de SO4 2-, etc.
Además, en ciertos casos, es necesario añadir a los
medios de cultivo algunos aminoácidos o vitaminas
que determinados tipos de microorganismos no
pueden sintetizar.
Los medios de cultivo son preparaciones utilizadas
para muchos propósitos, como: aislamiento e
identificación de microorganismos, prueba de
esterilidad, análisis de agua, ambientales, alimentos y
productos bacteriológicos y prueba de sensibilidad a
los antibióticos.
COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Aunque los diferentes medios contienen gran cantidad
de sustancias dependiendo del microorganismo que se
desee aislar, básicamente están compuestos de:
Peptonas: Varían de pureza y calidad dependiendo
del tipo de hidrólisis realizada. Los álcalis tienden a
destruir el contenido vitamínico de la proteína y
también hacen perder parte de los aminoácidos; la
hidrólisis enzimática conserva las vitaminas y
aminoácidos; la caseína pura no contiene
carbohidratos y tiene alto contenido vitamínico y de
triptófano.
Ej. Una peptona, caseína digerida por la tripsina no
sirve para las pruebas de fermentación, pero si para
detectar producción de indol, la caseína hidrolizada
por ácido no tiene triptófano ni carbohidratos y puede
utilizarse en ensayos de contenido vitamínico en suero
por no tener vitaminas; la peptona de la gelatina
obtenida por acción enzimática no tiene carbohidratos
ni triptófano puesto que no están presentes en la
gelatina pura. Las peptonas de leche, carne y levaduras
contienen los carbohidratos respectivos, presentes en
el material original y por lo tanto no deben utilizarse
en pruebas de fermentación.
Infusión y extractos: Son de carne y otros tejidos; se
trata del material de origen proteico, soluble en agua,
sin acción enzimática. Las proteínas mismas se
coagulan por el calor, afortunadamente la acción
enzimática microbiana y el tiempo de incubación
aumentan la facilidad de utilización.
Agentes solidificantes: Agar, Gelatina, Agarosa, Agar
noble.
Agentes selectivos: Son generalmente colorantes,
tales como Cristal violeta o verde brillante, que inhiben
bacterias Gram positivos o como NaCl, Azida de sodio,
Citrato de Sodio, Telurito de potasio y Lauryl sulfato de
sodio que inhiben Gram negativos.
28
Manual Práctico de Microbiología
El pH también se emplea como agente selectivo. Por mezcla de las colonias cuando se hace la siembra. El
ejemplo, un pH de 8.0-9.0 es selectivo para bacterias secado de la superficie también previene la
como Vibrio chlolerae. contaminación; se lleva a cabo en la estufa incubadora
a 37 °C durante 20 minutos aproximadamente,
Agentes antimicrobianos. Algunos medios contienen quitando la tapa de la caja y colocando el medio con la
agentes tales como antibióticos o biocidas, que actúan superficie hacia abajo. Después del secado las cajas se
como agentes antimicrobianos. pueden guardar en refrigeración envueltas en bolsas
plásticas hasta por tres meses, dependiendo del medio
CUIDADO Y RECOMENDACIONES: de cultivo. Los medios que contienen antibióticos
deben utilizarse en corto tiempo.
Los medios de cultivo pueden prepararse a partir de
sus componentes o según las recomendaciones del OBJETIVOS
fabricante, cuando este se consigue comercialmente
 Preparar medios de cultivo teniendo en cuenta la
hay varias reglas que se deben guardar para asegurar
importancia de los componentes, de la exactitud
la buena calidad del medio preparado.
en la preparación y las técnicas de asepsia para
El agua utilizada debe ser destilada, bidestilada o evitar su contaminación.
desmineralizada, proveniente de un sistema adecuado
de destilación; su medida debe ser exacta y en ningún CONSULTAS PRELIMINARES
momento con aproximaciones que generalmente se
Los estudiantes deberán consultar en cualquier texto
traducen en una alteración de la consistencia del
de microbiología aspectos generales sobre los medios
medio, especialmente cuando se trata de agares, cuyos
de cultivo.
agentes solidificantes requieren tratamiento exacto.
Si los ingredientes necesarios para preparar el medio MATERIALES
de cultivo son deshidratados deben permanecer en
Materiales
remojo durante 15 minutos, con la finalidad de
Erlenmeyer 250 ml 1
permitir una hidratación total de las moléculas, lo cual
Tubos de ensayo con tapa rosca 6
evita el calentamiento excesivo que conduce Cajas de Petri 3
generalmente a evaporación y descomposición del Asa bacteriológica 1
medio. Espátula 1
Antes de someterse a la acción del autoclave el medio Papel aluminio (porción) 1
Cultivo bacteriano 1
debe estar completamente disuelto. No disolverlo con
la temperatura del autoclave, pues generalmente el Reactivos
exceso de calor produce un medio con grumos debido Agar McKonkey 30 ml
Agar TSI 10 ml
a una deficiente disolución.
Agar OF 10 ml
Los medios de cultivo que contienen yema de huevo, Agar para Lisina descarboxilasa 10 ml
Agar citrato de Simmonds 10 ml
carbohidratos, urea o cualquier nutriente, no pueden
Agar SIM 10 ml
ser esterilizados en autoclave; estos medios se Caldo MRVP 10 ml
preparan esterilizando por separado lo que conocemos Agar SS 30 ml
como base (se esteriliza en autoclave) y los Agar Urea 10 ml
suplementos por filtración o vapor fluente; la mezcla Reactivo de Kovac´s 10 ml
de los componentes se realiza cuando la base se ha Reactivo de Barrit 10 ml
enfriado entre 45 y 50 °C. Rojo de Metilo 10 ml
Equipos
Los medios Agar SS y bismuto de sulfito, entre otros, Balanza de precisión 1
no pueden ser esterilizados en autoclave. Incubadora 1
Autoclave 1
En todo caso, deben leerse detenidamente las
Plancha de calentamiento con
recomendaciones del fabricante, las cuales vienen agitación
1
especificadas en el envase del medio de cultivo. Magneto y sacamagnetos 1
Todos los medios de cultivo después de preparados y No hay restricción de seguridad por el uso de estos
vertidos en la caja de petri estériles, deben ser medios de cultivo. Remitirse al protocolo de
secados, con la finalidad de eliminar el exceso de agua preparación recomendado por el proveedor en el
que queda en la superficie para evitar la coalescencia y embase del medio de cultivo.
29
Manual Práctico de Microbiología
PROCEDIMIENTO
BIBLIOGRAFÍA
Para cada uno de los medios de cultivos deshidratados
o de otros componentes que están dispuestos en
LEBOFFE, Michael y PIERCE, Burton. A photographic
exhibició n, anote los siguientes datos: Nombre,
atlas for the microbiology laboratory. 4 Ed. Morton
composición, usos, preparación. Destape el envase y
Publishing Company. Englewood-USA, 2011. 266 p.
determine (sin tocar su contenido): color, olor, textura
(cristales, gránulos, polvo). Realice esta observación
MADIGAN, Michael; MARTINKO, John y PARKER,
del medio lo más rápido posible, pues los medios de
Jack. Brock Biología de los Microorganismos. 10 ed.
cultivo son altamente higroscópicos (absorben
Madrid: Prentice-Hall, 2003. 1080 p.
humedad).
Quimirel. (Fotografía). [En línea].
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS
<http://quimirel.com.co/web/index.php/2013-11-18-
COMERCIALES
18-19-24/template-features> [Citado en 10 de febrero
Efectúe los cálculos correspondientes para preparar 60 de 2017].
mL de cada uno de los medios comerciales en un
erlenmeyer. Siga las instrucciones de la etiqueta del RAMOS, Michelle. Microorganismos. Condiciones
frasco. Esta cantidad será distribuida de la siguiente generales para el cultivo de microorganismos.
forma: (Fotografía). [En línea].
<http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com.co/201
Medio de cultivo
Cantidad 4/10/condiciones-generales-para-el-cultivo.html>
(mL)
[Citado en 10 de febrero de 2017].
Agar TSI 6

6 En tubo
Agar Lisina descarboxilasa
inclinado
Agar Citrato de Simmonds 6
Agar Urea 6

Agar SIM 6 En tubo en

Agar OF 6 columna

En caja de
Agar McKonkey 15
Petri
Agar SS 15

Caldo MRVP 5 En tubo

Servir los medios de cultivo en los tubos de ensayo, los

medios SS y McKonkey dejarlos en los erlenmeyers.
Esterilizar los medios de cultivo en la autoclave a 121
°C por 20 min. Después de que los medios de cultivo
salgan del autoclave deje enfriar hasta
aproximadamente 50°C y vierta los medios SS y
McKonkey (15mL) en cajas de Petri. Dejar enfriar los
tubos según las indicaciones del docente, rotular y
guardar en la nevera hasta la siguiente práctica.

RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O

ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS.
No se generan residuos.

30
Manual Práctico de Microbiología

PRÁCTICA No. 6. CARACTERIZACION BIOQUIMICA DE ENTEROBACTERIAS

inmóviles o con flagelos perítricos, pero no

esporulados. Debido a que son morfológicamente tan
similares, se utilizan pruebas bioquímicas para
identificarlas.

Son organismos ubicuos de distribución,

encontrándose en el suelo, el agua, la vegetación y
formando parte de la flora bacteriana normal de casi
todos los animales, incluido el ser humano. Son tan
communes, frecuentes e importantes que
Agar TSI para diferenciar bacterias fermentadoras probablemente sean las bacterias mejor estudiadas.
de glucose, de lactosa y reductoras de sulfuro.
Varios géneros de esta familia son patógenos
importantes del ser humano, responsables de diversas
enfermedades: Escherichia coli, gastroenteritis;
Salmonella, fiebre tifoidea y gastroenteritis; Shigella,
disentería bacilar, Klebsiella, neumonía.OBJETIVOS
Realizar pruebas bioquímicas para la identificación de
cepas conocidas de bacterias Enterobacteriaceae para
lograr una rápida y correcta identificación de género y
especie.
Liberación de Indol por acción de la enzima
Triptofanasa OBJETIVOS
INTRODUCCIÓN identificar género y/o especie de cepas puras de
La identidad inicial de un organism bacteriano puede Enterobacterias mediante pruebas bioquímicas.
ser sugerida por 1) la procedencia de la muestra, 2) su
aspecto microscópico y la tinción Gram, 3) su patrón CONSULTAS PRELIMINARES
de creciemiento en medios selectivos, diferenciales,
Los estudiantes deberán consultar sobre las
enriquecidos o característicos y 4) sus propiedades
características de las enterobacterias y su importancia
hemolíticas, metabólicas y de fermentación en
como agentes patógenos y también como
diversos medios de cultivo. Después de examinar las
bioindicadores de la calidad bacteriológica del agua.
características microscópicas y de crecimiento de un
cultivo bacteriano puro, se pueden realizar pruebas
MATERIALES
específicas llamadas bioquímicas.
Materiales
Las pruebas bioquímicas permiten determinar las Cajas de Petri 2
características metabólicas de las bacterias objeto de Tubo de ensayo con tapa 16
Asa bacteriológica 1
investigación. Fueron diseñadas para la identificación
Mechero 1
rápida de bacterias Enterobacteriaceae (más de 5500 Cultivo bacteriano 1
cepas) y otras bacterias Gram-negativas (más de 2300 Reactivos
Agar McKonkey 1
cepas). Algunas pruebas se aplican también para la Agar TSI 1
identificación de bacterias Gram-positivas. Agar OF 1
Agar para Lisina descarboxilasa 1
Agar citrato de Simmonds 1
Las pruebas se aplican inoculando una cepa pura en un Agar SIM 1
Caldo MRVP 2
medio de cultivo sintético, cuyo color puede cambiar Agar SS 1
durante la incubación o después de la adición de Agar Urea 1
Reactivo de Kovac´s 10 mL
reactivos. Los cambios de color revelan la presencia o Reactivo de Barrit 10 mL
ausencia de una reacción química. Rojo de Metilo 10 mL
Equipos
Incubadora 1
La familia Enterobacteriaceae está compuesta por
bacilos Gram negativos anaerobios facultativos, rectos, No hay restricción de seguridad por el uso de los
31
Manual Práctico de Microbiología
medios de cultivo. El equipo deberá estar previamente mismas convenciones que el TSI.
calibrado a la temperatura requerida por el auxiliar de
laboratorio. Favor no manipular el equipo y
mantenerlo cerrado. Abrir solamente para incluir el
cultivo a incubar.

PROCEDIMIENTO
Realizar las siguientes pruebas bioquímicas:
Figura 19. Lisina decarboxilasa. En el centro tubo
TSI: Contiene glucosa, (0.5-1% fenol), sacarosa y control. A la izquierda reacción positive, a la derecha
lactosa. Además rojo de fenol, que indica fermentación reacción negative.
y sulfato ferroso, para demostrar la producción de H 2S.
La siembra se hace punzando con el asa recta en Citrato de Simmons: Contiene citrato como única
profundidad y en estría en la superficie (agar fuente de carbono y sales de amonio como fuente de
inclinado). nitrógeno, no contiene aminoácidos. Las bacterias que
pueden utilizar el citrato también extraen nitrógeno
Reacción Interpretación con la producción de amonio que alcaliniza el medio de
cultivo. El indicador de pH es azul de bromotimol. Se
Fondo ácido* superficie Fermentación de glucosa
siembra solamente en superficie.
inclinada alcalina (K/A)
Interpretación: La prueba es positiva cuando se
Todo el medio ácido* Fermentador de glucosa,
observa crecimiento con un color azul intenso. La
lactosa (A/A)
prueba es negativa cuando no se observa crecimiento
Burbujas Aerógenos ni cambio de color.
Ennegrecimiento del fondo Productor de H2S
Medio alcalino** No fermentador de
azúcar (K/K)
** alcalino – rojo *Acido-Amarillo

Figura 20. Citrato de Simmonds. En el centro tubo

control. A la izquierda reacción positiva, a la derecha
reacción negativa.

Urea de Christensen: Si la bacteria posee la enzima

ureasa, hidroliza urea del medio liberando amonio y
Figura 18. Resultados en TSI. De izquierda a derecha: CO2, el indicador utilizado es rojo de fenol. Se siembra
control, K/K, K/A, A/A y producción de gas, K/A y solamente en superficie.
producción de H2S
Interpretación: La prueba es positiva cuando se
observa cambio de color amarillo a rosado. La prueba
Lisina decarboxilasa: La decarboxilación es el
es negativa cuando no hay cambio de color.
proceso por el cual las bacterias que poseen la
enzima decarboxilasa específica son capaces de atacar
a los aminoácidos en su grupo carboxilo (-COOH),
dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico.
Se siembra igual que el TSI.
Interpretación: La prueba es positiva cuando hay
cambio de color del púrpura a amarillo apagado
(producido por la cadaverina); la prueba es negativa
cuando no hay cambio de color. Se reporta con las

32
Manual Práctico de Microbiología
Figura 21. Urea de Christensen. En el centro tubo
control, a la izquierda reacción positive, a la derecha
reacción negativa.
Prueba de Indol y movilidad: La movilidad se
observa en el medio SIM por desplazamiento
alrededor de la línea de inoculación, realizada en
profundidad y en el centro del agar. Las bacterias que
poseen la enzima triptofanasa, son capaces de
hidrolizar y desaminar el triptófano con la producción
de indol, ácido pirúvico y amonio. Se siembra con el
asa recta, punzando el agar en profundidad, con
cuidado de sacar el asa por el mismo sitio de entrada.
Interpretación: Después de la incubación por 18-24
horas adicione 2 a 3 gotas del reactivo de Kovac´s a los
tubos con medio SIM, la presencia de indol se destaca
por la formación de un anillo rojizo en la superficie del
tubo. La movilidad se observa por desplazamiento del
crecimiento alrededor de la línea de inoculación.
Algunos microorganismos producen ennegrecimiento
del medio por formación de sulfuro de hidrogeno.
A B
Figura 22. Medio SIM. A) A la izquierda reacción
negativa para Indol, a la derecha reacción positiva para
Indol. B) A la izquierda motilidad positiva, a la derecha
motilidad negativa.
Reacción del rojo de Metilo: Sembrar con el asa un
tubo con caldo MRVP, incubar por 24- 48 horas,
pasado este tiempo adicionar 5 gotas de la solución
rojo de metilo.
Algunas bacterias utilizan la glucosa con gran
formación de ácido, de forma que el valor del pH del
medio desciende a menos de 4.4. Otras bacterias
producen menos ácido, reduciendo en menor cantidad
el pH del medio. Esta distinción puede hacerse a través
del rojo de metilo, que presenta color amarillo por
encima del pH 5.1 y color rojo cuando el pH desciende
a 4.4.
Figura 23. Rojo de metilo. A la izquierda reacción
positiva, a la derecha reacción negativa.
Ensayo de Voges Proscaver: Sembrar con el asa un
tubo con caldo MRVP, incubar por 24- 48 horas,
pasado este tiempo adicionar 4-6 gotas de la solución
de sulfato de cobre. En caso positivo se presenta un
viraje a rojo después de algunos minutos.
A partir de la glucosa, numerosos microorganismos
forman acetoína (acetilmetilcarbinol), 2,3 butanodiol ó
diacetilo. La demostración de estos productos
metabólicos se lleva a cabo con los reactivos de
O´MEARA, mejorado por Levine y col (1932) con
sulfato de cobre ó con el reactivo de BARRIT (1936).
Figura 24. Prueba de Voges-Proskauer. A la izquierda
reacción negativa, a la derecha reacción positiva.
Agar Mc Conkey: Tome una colonia del cultivo
microbiano suministrado y proceda a realizar una
siembra por estrías en agar Mc Conkey, medio
diferencial que permiter caracterizar las colonias
fermentadoras de lactosa de las que no lo hacen.
Incubar a 37 °C por 18 - 24h.
Interpretación:
Microorganismo Desarrollo Color de la colonia
Enterobacter aerogenes Bueno rosa-rojo
Escherichia coli Bueno rosa-rojo (precipitado biliar)
salmonella enteritidis Bueno incolora
Shigella dysenteriae Bueno incolora
Staphylococcus aureus Inhibido __
33
Manual Práctico de Microbiología
a
d b
c se almacenan temporalmente bajo congelación, La
Figura 25. Cultivo de enterobacterias en agar
McConkey. a) Escherichia coli, b) Enterobacter
aerogenes, c) Shigella sonnei, d) Proteus mirabilis. a y b
producen color rosado debido a la formación de ácido
por fermentación de lactosa. c y d no fermentan
lactosa. Note que alrededor de E. coli se precipitan
sales biliares.
Agar Salmonella – Shigella: Tome una colonia del
cultivo microbiano suministrado y proceda a realizar
una siembra por estrías en agar para Salmonella –
Shigella. Incubar 24 – 48 horas a 35 ºC. Observar y
describir el crecimiento después del período de
incubación.
Interpretación:
RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O
ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS
Los residuos resultantes corresponden a cultivos
bacterianos, los cuales se inactivan y esterilizan en
autoclave. Una vez terminado el proceso de
esterilización, los residuos se disponen en bolsas
termoresistentes, se dejan enfriar hasta solidificación y
disposición final se hace mediante el servicio de
recolección de residuos biológicos contratado por la
Universidad con la Administración Municipal.
BIBLIOGRAFÍA
LEBOFFE, Michael y PIERCE, Burton. (Fotografías). A
photographic atlas for the microbiology laboratory. 4
Ed. Morton Publishing Company. Englewood-USA,
2011. 266 p.
MADIGAN, Michael; MARTINKO, John y PARKER,
Jack. Brock Biología de los Microorganismos. 10 ed.
Madrid: Prentice-Hall, 2003. 1080 p.

Microorganismo Desarrollo Color de la colonia Color del medio

Proteus mirabilis satisfactorio Incolora Amarillo
Enterobacter aerogenes satisfactorio Crema-rosa Rojo
salmonella enteritidis satisfactorio Incolora Amarillo
Salmonella typhimurium satisfactorio Incolora Amarillento
Shigella flexneri satisfactorio Incolora Amarillento
Enterococcus faecalis Inhibido __ __
Escherichia coli Nulo-moderado Rosa-rojo Rojo

d b

Figura 26. Cultivo de enterobacterias en agar

Salmonella-Shigella. a) Escherichia coli, b) Shigella
flexneri, c) Salmonella typhimurium, d) Enterococcus
faecalis.

RESULTADOS
Realizar la identificación, a nivel de género o especie
de la enterobacteria sembrada, con base en los
resultados de las pruebas bioquímicas, usar la figura
27. como guía o consultar más literatura.

34
Manual Práctico de Microbiología

Figura 27. Características bioquímicas de las Enterobacterias.

35
Manual Práctico de Microbiología
PRÁCTICA No. 7. DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO Y EL EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES EN
UN CULTIVO BACTERIANO
Espectrofotómetro
Curvas de crecimiento bacterial para evaluar el
efecto antibacterial de partículas de plata
Efecto inhibidor de la luz uv sobre el crecimiento
bacteriano
INTRODUCCIÓN
Las bacterias, al igual que los demás seres vivos
requieren de una serie de condiciones o factores
ambientales para el desarrollo celular y conformación
de poblaciones y comunidades. Los factores pueden
diferenciarse en abióticos, referidos a aquellos
relacionados con aspectos propios del medio donde se
desarrollan, como la temperatura, el pH, los gases
respiratorios (O2 y CO2), las radiaciones (lumínicas,
sonoras, electromagnéticas), la presión (atmosférica,
hidrostática, osmótica) y la presencia de nutrientes y
en bióticos, referidos a aquellos relacionados con las
interrelaciones que se dan entre las diversas
poblaciones y comunidades.
Cuando los microorganismos encuentran condiciones
propicias para su desarrollo o se adaptan a las nuevas
condiciones del medio, ocurre inicialmente un
crecimiento en masa celular y posteriormente, en el
número de células a medida que avanza el tiempo.
Estos cambios pueden representarse mediante una
curva, la cual ha sido denominada curva de
crecimiento.
LA CURVA DE CRECIMIENTO. Las cuatro fases (de
latencia, logarítmica, estacionaria y muerte) de una
población bacteriana pueden ser determinadas
midiendo la turbidez de la población en un cultivo en
caldo. La turbidez no es una medida directa del
número de bacterias pero es una medida indirecta de
la biomasa que puede ser cuantificada mediante un
espectrofotómetro.
Figura 28. Curva de crecimiento bacteriano en cultivo
cerrado o monofásico.
La construcción de una curva de crecimiento completa
(incremento y disminución en número de células versus
tiempo) requiere medir la turbidez de alícuotas de un
cultivo en agitación a intervalos de tiempo definidos,
por un período largo de tiempo (varias horas). La
población bacteriana es graficada para determinar la
medida de su crecimiento o desarrollo. La curva
resultante se puede usar para trazar los estados del
ciclo de desarrollo, esto hace posible determinar la tasa
de crecimiento de una bacteria particular bajo
condiciones estandarizadas en términos de su tiempo
de generación (g), que es el tiempo que requiere
bacteria para doblar su población.
36
Manual Práctico de Microbiología
La determinación gráfica del tiempo de generación se
hace mediante una extrapolación en la fase
logarítmica, como se muestra en la figura 28.
bacteriano medio sólido.
CONSULTAS PRELIMINARES
1. Cuáles son los factores ambientales determinantes
del crecimiento y desarrollo bacteriano?
2. Cuál es el principio de operación de un
espectrofotómetro?
3. Qué es la densidad óptica de un cultivo bacteriano?

No hay restricción de seguridad por el uso de los

medios de cultivo. La incubadora y el baño de maría
deberán estar previamente calibrados a la
temperatura requerida. No manipular el equipo y
mantenerlo cerrado. Abrir solamente para incluir el
cultivo a incubar.

MATERIALES
Figura 29. Determinación gráfica del tiempo de
Materiales
generación. Cajas de Petri 10
Tubo de ensayo con tapa 2
Por ejemplo, seleccionar dos puntos (0,2 y 0,4) sobre la Asa bacteriológica 1
escala de absorbancia (A) que representa una Mechero 1
duplicación del valor de turbidez, extrapolar al eje X y Cultivo bacteriano 1
anotar los valores para calcular el tiempo de Reactivos
generación, asi: Agar nutritivo 150 ml
Tiempo de generación = t(A de 0,4) – t(A de 0,2) Caldo nutritivo 10 ml
Tiempo de generación = 90 min – 60 min Equipos
g = 30 min Incubadora 1
Espectrofotómetro 1
Este cálculo también puede realizarse a partir de la Baño de María 1
gráfica utilizando el log10 de la absorbancia versus el Cámara flujo laminar con luz UV 1
tiempo. Una vez hallado el valor de g se puede calcular
el valor de la velocidad de crecimiento (k), el cual es PROCEDIMIENTO
igual a 1 / g.
1. DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO
Los tiempos de generación y las velocidades de DE UN CULTIVO BACTERIANO.
crecimiento cambian notablemente según la especie y a. Transfiera con el asa bacteriológica una porción de
las condiciones ambientales y son muy importantes en cultivo bacteriano a un tubo de ensayo
investigación básica y aplicada, por ejemplo para conteniendo cinco (5) mL de caldo nutritivo.
evaluar el efecto de algunos componentes sobre los Prepare dos cultivos (2 tubos de ensayo) para
microorganismos, ya sea inhibiéndolos o aumentando obtener una réplica.
su tasa de reproducción; en la industria, para optimizar b. Determine el porcentaje de transmitancia (%T) de
las condiciones óptimas de un cultivo para la los cultivos inicialmente preparados en la parte
producción de metabolitos (antibióticos, alcoholes, anterior, utilizando el espectrofotómetro
nucleótidos) o de biomasa, en tal caso los cultivos previamente calibrado a 660 nm.
pueden ser manejados para mantener indefinidamente c. Coloque los cultivos a incubar en “baño de maría” a
una fase, a lo cual se denomina cultivo continuo. 35 - 37 ºC, realizando agitaciones suaves cada cinco
minutos para asegurarse de distribuir las células y
OBJETIVOS los nutrientes.
d. Realice lectura del porcentaje de transmitancia de
 Establecer la curva de crecimiento de un cultivo sus cultivos en el espectrofotómetro cada 10
bacteriano en caldo. minutos hasta obtener la curva de crecimiento de
 Identificar el efecto de algunos factores su cultivo.
ambientales en el desarrollo de un cultivo e. Convierta el porcentaje de transmitancia obtenido
37
Manual Práctico de Microbiología
en cada lectura a el valor de densidad óptica (D.O.)
del cultivo, aplicando la fórmula: D. O. = 2 – log %T
f. Con los valores convertidos realice la curva de
crecimiento de su cultivo bacteriano, cruzando las
variables tiempos versus densidad óptica.
termoresistentes, se dejan enfriar hasta solidificación y
se almacenan temporalmente bajo congelación, La
disposición final se hace mediante el servicio de
recolección de residuos biológicos contratado por la
Universidad con la Administración Municipal.

2. DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE ALGUNOS BIBLIOGRAFÍA

FACTORES AMBIENTALES EN UN CULTIVO
BACTERIANO.
a. Inocule los medios de cultivo sólidos (agar
nutritivo) proporcionados con la bacteria a
estudiar.
b. Asegúrese de realizar una buena distribución de
células sobre la superficie del medio de cultivo. A
cada grupo se le proporcionarán los siguientes
medios:
 Agar nutritivo con las siguientes concentraciones
salinas: 0,5%, 5%, 10% y 15% de NaCl.
 Agar nutritivo con pH modificado a: 4, 7, 8, 9
 Agar nutritivo estándar el cual será irradiado con
luz ultravioleta durante 5 minutos.
 Antes de realizar la irradiación, debe cubrir una
mitad de la caja de cultivo con una cartulina.
 Una vez termine la irradiación, tape su cultivo y
llévelo a la incubadora.
HARLEY, John y PRESCOTT, Lansing. Laboratory
Exercises in Microbiology. 5 Ed. New York: The
McGraw−Hill, 2002. 449 p.
PRESCOTT, Lansing; Harley, John y Klein, Donald. A.
Microbiología. 5 ed. Madrid: McGraw-Hill
Interamericana, 2004. 1236 p.
The Pennsylvania State University (Figura). Bacterial
Growth Curve. [En línea].
<https://online.science.psu.edu/micrb106_wd/node/6
122> [Citado en 10 de febrero de 2017].
WU, Ch., ZHANG, G., XIA, T., LI Z et al. 2015. Bioinspired
synthesis of polydopamine/AG nanocomposite
particles with antibacterial activities Materials. Science
and Engineering: C, Vol. 55, no. 1.

Precaución: no se exponga a la luz ultravioleta ni mire

directamente a la lámpara

 Incube sus cultivos a 35 ± 2 ªC durante 24.

OBSERVACIONES, CÁLCULOS Y RESULTADOS

Realice la curva de crecimiento para su cultivo,

señalando las diferentes fases de la curva y explicando
las posibles desviaciones con relación a lo esperado
teóricamente.

Al finalizar el período de incubación de los agares,

realice sus observaciones, anote los resultados y realice
un análisis teniendo en cuenta el efecto, desde el
punto de vista fisiológico, de los factores ambientales
(pH, presión osmótica e irradiación) sobre el desarrollo
de las bacterias

RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O

ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS.

Los residuos resultantes corresponden a cultivos

bacterianos, los cuales se inactivan y esterilizan en
autoclave. Una vez terminado el proceso de
esterilización, los residuos se disponen en bolsas
38
Manual Práctico de Microbiología
PRÁCTICA No. 8. CULTIVO Y AISLAMIENTO DE HONGOS
Hongo descomponedor Basidiomycota
Hongo parasito de vegetales
Micelio de hongo cultivado in vitro
INTRODUCCIÓN
Los hongos tienen gran importancia en los ecosistemas
por ser los principales descomponedores de materia
orgánica compleja y por formar asociaciones
beneficiosas con otros organismos. Para los seres
humanos los hongos también revisten gran
importancia tanto en terminos de beneficio como de
perjuicio, son fuente de enzimas y drogas pero
también son la principal causa de enfermedades de las
plantas, animales y seres humanos.
En el 2002 se estimaban unas 1.5 millones de especies
sobre la tierra, solo con 90000 de estas descritas. En el
2011 las estimaciones basadas en datos de
secuenciación de ADN sugieren que hay unas 5.1
millones de especies.
Colectar, aislar y cultivar hongos a partir de muestras
ambientales, es importante dada la necesidad de
identificar especies, revisar taxonomía, evaluar roles
en el ambiente y descubrir cepas para control
biológico, remediación ambiental y para procesos
industriales.
Casi cualquier material natural tendrá una comunidad
de hongos desarrollándose sobre este, para aislarlos
existen numerosas técnicas que son efectivas para
obtener el especimen deseado mientras se excluyen
muchos otros. Las técnicas de aislamiento se dividen
en dos grandes categorías, métodos directos y
métodos selectivos. Ambos a su vez, están divididos
en numerosos subtipos.
TÉCNICAS PARA AISLAR HONGOS
Transferencia Directa. El término “directo” se aplica a
técnicas que involucran la transferencia de un hongo
desde su ambiente natural a un cultivo puro in vitro.
Las formas de realizarlo son las siguientes: A partir de
una pequeña muestra del habitat o sustrato y bajo un
estereoscopio para observar con mayor facilidad el
desarrollo del o los hongos, a) capturar esporas con la
ayuda de un asa recta previamente esterilizada, b)
capturar esporas por adhesion a una porción fina de
agar ligada a la punta del asa, también puede realizarse
humedeciendo sutilmente la punta del asa con
glicerina, transferir esporas a una caja de Petri sobre un
medio de cultivo. Tener en cuenta que una muestra
puede contener más de un hongo, lo cual abre la
posibilidad de capturar esporas de más de una especie.
Una vez realizada la transferencia, se incuba el cultivo
durante 3 a 5 días para permitir el desarrollo de una
colonia.
Cámara húmeda. El aislamiento directo de un hongo a
menudo es más efectivo si un sustrato natural se
mantiene en humedad por una a varias semanas para
permitir el desarrollo y esporulación de este. El método
involucra el uso de una cámara húmeda, la cual
consiste de un recipiente (plástico o vidrio) con un
tendido de algodón, papel absorbente, arena o suelo
estéril, humedecidos con agua estéril, la muestra se
coloca sobre el material húmedo por varias semanas.
Una vez se presenta el desarrollo de los hongos, se
puede remover esporas del especímen de interés
usando un estereoscopio y un asa como se explicó
arriba.
Las cámaras se pueden usar con diversidad de
materiales, como madera, hojas, tallos en
descomposición, estiércol, semillas, frutas, hongos
viejos, insectos, tela, alimentos, etc. Las cámaras son
39
Manual Práctico de Microbiología
útiles para descubrir la causa de una patología puede aprovechar para ailarlos. Esto se hace
particular, ya que facilita la esporulación abundante en presentando una sustancia particular (cebo) al
el área afectada del organismo que la causa. ambiente para que sea colonizada y poder aislar el
hongo de interés. Los cebos pueden ser porciones de
Siembra directa. Algunas veces es conveniente colocar madera, insectos, plástico, cabello, trozos de zanahoria,
el material de interés directamente sobre un medio de manzana, arroz, o cualquier otra sustancia. El cebo se
cultivo. Una pequeña muestra se coloca sobre la sumerge en un hábitat particular o en una cámara
superficie de un agar o se sirve el agar fundido sobre húmeda. Cuando se logra el aislamiento, el hongo de
esta. Después de incubar por varios días se desarrollan interés puede ser transferido a un agar para lograr un
colonias de hongos de una o varias especies que deben cultivo puro.
ser transferidas a cultivos puros. Esta técnica es usada
con muestras de suelo, con hojas o partes de un tejido OBJETIVOS
vegetal con lesiones ocasionadas por hongos, en cuyo  Cultivar cepas puras de hongos mediante la
caso se obtienen pequeñas porciones de tejido técnica de repique y microcultivo.
infectado, se realiza una desinfección con agentes  Aislar hongos fitopatógenos a partir de muestras
químicos, se lava con agua destilada estéril y se vegetales infectadas mediante siembra directa
siembran estas pequeñas muestras sobre un medio de sobre agar PDA.
cultivo para permitir el desarrollo de colonias fúngicas.
CONSULTAS PRELIMINARES
Dilución y siembra. En esta técnica se macera y se Consultar sobre los métodos para aislar y cultivar
pesa 1 g (peso seco) del material a ser estudiado y se hongos unicelulares y multicelulares y su aplicación.
mezcla con 9 mL de agua estéril u otro diluyente para
obtener una muestra diluída 10 veces o con una MATERIALES
dilución 10-1. 1 mL de esta solución es transferido a un
Materiales
segundo recipiente que contenga 9 mL del diluyente
Cajas de Petri 3
para obtener una dilución 10-2. El proceso se repite
Asa bacteriológica 1
hasta obtener el número de diluciones requeridas de Mechero 1
manera sucesiva. Se pipetea 1 mL de cada dilución Pinza de punta plana 1
sobre cajas de Petri y se adiciona agar fundido sobre Cámara húmeda 1
estas, se mezcla suavemente para obtener una Bisturí 1
dispersión apropiada de la muestra. Alternativamente, Cultivo de hongos 1
se pipetea 1 mL de cada dilución sobre la superficie de
Reactivos
un agar y se esparce. Después de pocos días de
Agar PDA (Papa dextrosa agar) 45 ml
incubación aparecen colonias en densidades variables
Hipoclorito de sodio (0,5%) 10 ml
dependiendo de la dilución sembrada. Se puede
calcular el número de esporas presentes en la muestra
Equipos
original, a partir de placas que presenten entre 40 –
Incubadora 1
100 colonias, se realiza el conteo y con el dato se
realiza el siguiente cálculo: esporas /g de muestra = No hay restricción de seguridad por el uso de este
colonias contadas/ dilución. medio de cultivo. Remitirse al protocolo de
preparación recomendado por el proveedor en el
Existen varios fectores que influyen sobre el resultado embase del medio de cultivo. El hipoclorito de sodio
de esta técnica, como una inapropiada dispersion de debe manipularse con cuidado para evitar afectaciones
esporas, presencia de masas de esporas o inhibición en la piel y ropa del estudiante. El equipo deberá estar
por antagonismo. Para mayor exactitud se recomienda previamente calibrado a la temperatura requerida.
trabajar con muchas repeticiones, al menos 10 o más. Abrir solamente para introducer el material a incubar.
Esta técnica es usada con frecuencia en estudios de
hongos de suelo, aunque los hongos aislados no PROCEDIMIENTO
representan la totalidad de flora existente, si permite
hacer la comparación entre diferentes suelos sobre una TECNICAS DE CULTIVO
base estadística
A partir de cultivos puros en medio sólido:
Cebos. Muchos hongos tienen requerimientos 1. A partir de los cultivos suministrados en
especiales en cuanto a nutrientes, carácterística que se laboratorio, seleccione un hongo en cultivo puro.
40
Manual Práctico de Microbiología
2. Bajo técnicas de asepsia y con ayuda del asa recta
remueva una pequeña porción del cultivo en el
borde de la colonia y colóquela ahora en el centro
de una caja con agar PDA.
3. Incube a 28 °C por ocho días.

Figura 30. Procedimiento para el cultivo de hongos a

partir de cepas puras.

4. Mida el diámetro de la colonia todos los días y Figura 31. Procedimiento para preparar el microcultivo
realice la curva de crecimiento (tiempo vs en cámara húmeda.
diámetro). Realice el mismo procedimiento con los
hongos cultivados por los otros grupos. TÉCNICA DE AISLAMIENTO POR SIEMBRA DIRECTA

En microcultivo en cámara húmeda: A partir de frutas y hortalizas afectadas

1. Corte una porción de agar PDA de 1. Corte 5 cuadrados de 1mm, teniendo cuidado de
aproximadamente 1 cm2, con un bisturí estéril y cortar parte sana y parte enferma del tejido.
colóquelo sobre el portaobjetos contenido en la 2. Llévelos a una caja de Petri y agregue hipoclorito al
cámara húmeda que se le ha suministrado (la 0,5%
cámara húmeda consiste en una caja de petri que 3. Deje actuar durante un minuto y luego enjuáguelos
contiene papel filtro en el fondo, un triángulo de con agua destilada por tres veces
vidrio que sirve de soporte para un porta objetos y 4. Retire el agua completamente
un cubreojetos, todo el montaje ha sido 5. Con un asa coloque en una caja de Petri con PDA,
previamente esterilizado). uno de los cuadrados en el centro y los otros en las
2. Inocule la superficie del cuadrado de agar con el esquinas.
asa estéril, tomando una porción (esporas o hifas) 6. Lleve a incubar por 5 – 7 días a 28°C.
de uno de los hongos suministrados.
3. Con la pinza estéril tome el portaobjetos y
colóquelo sobre el agar inoculado.
4. Añada 2 a 3 mL de agua destilada estéril, al papel
filtro, con el fin de obtener una atmósfera húmeda.
5. Incube la cámara a 25-28 °C, durante 5 a 7 días,
tiempo en que se debe continuar humedeciendo el
papel diariamente hasta que el hongo haya crecido,
es responsabilidad del grupo revisar el montaje
durante los 7 días de incubación.
6. Al día 7, retire el portaobjetos de la cámara
húmeda, por el borde del cubreobjetos agregue Figura 32. Procedimiento para aislar hongos a partir de
una gota de azul de lactofenol. Observe al muestras vegetales.
microscopio e identifique las estructuras
microscópicas como hifas y esporas.

41
Manual Práctico de Microbiología
RESULTADOS
3. Cual es la composición del medio de cultivo
empleado y cual es la indicación general de uso?
4. Comparar las gráficas de crecimiento de los hongos
sembrados por todos los grupos de trabajo. Las
especies de hongos cultivadas tienen la misma
velocidad de reproducción? Por qué?
5. Describir las colonias que se desarrollan a partir de
las muestras vegetales. Cuántas colonias
diferentes se desarrollaron? Presentan
pigmentación? Cuántos cultivos puros se podrían
obtener?
6. Investigar cuáles son los hongos comúnmente
patógenos para el vegetal que su grupo sembró.
Organizar una galería de imágenes sobre las
características macroscópicas y microscópicas de
estos hongos.

RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O

ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS.
Los residuos resultantes corresponden a cultivos de
hongos, los cuales se inactivan y esterilizan en
autoclave. Una vez terminado el proceso de
esterilización, los residuos se disponen en bolsas
termoresistentes, se dejan enfriar hasta solidificación y
se almacenan temporalmente bajo congelación, La
disposición final se hace mediante el servicio de
recolección de residuos biológicos contratado por la
Universidad con la Administración Municipal.

BIBLIOGRAFÍA

BLACKWELL, M. (2011). The fungi: 1, 2, 3 … 5.1 million

species?. American Journal of Botany. 98(3): 426–438.

MADIGAN, Michael; MARTINKO, John y PARKER,

Jack. Brock Biología de los Microorganismos. 10 ed.
Madrid: Prentice-Hall, 2003. 1080 p.

MALLOCH, David. The mycology web pages. How

moulds can be isolated. [En línea].
<http://website.nbm-
mnb.ca/mycologywebpages/Moulds/Isolation.html>
[Citado en 10 de febrero de 2017].

Kirkhouse Trust. Isolation of a fungal pathogen and

producing inoculum [En línea].
<https://www.youtube.com/watch?v=F92GEhJaubc>
[Citado en 10 de febrero de 2017].

42
Manual Práctico de Microbiología
PRÁCTICA No. 9. CARACTERÍSTICAS MACROSCOPICAS Y MICROSCÓPICAS DE LOS HONGOS
Colonias fúngicas macroscópicas sobre agar PDA
Conidióforo, estructura reproductiva microscópica
productora de esporas
INTRODUCCIÓN
Los hongos actualmente están clasificados en 3 reinos:
Protozoa, el cual comprende el phylum Myxomycota,
Chromista, el cual comprende el phylum Oomycota y
Eucomycota, el cual comprende los phylum
Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota,
Glomeromycota, Microsporidia y Zygomycota, siendo
asi el que agrupa la mayor diversidad de especímenes
de importancia ecológica, clínica, industrial y agrícola.
Debido a la importancia que los hongos revisten, su
identificación taxonómica es un área bien desarrollada,
principalmente con base en la identificación
macroscópica y microscopica de las diversas
estructuras que estos presentan en cultivo in vitro.
Sin embargo, para muchos hongos las características
morfológicas no son fácilmente distinguibles o más aún
muchos no son cultivables, en cuyo caso se hace
necesario el uso de técnicas para realizar la
identificación a nivel molecular. Las técnicas
moleculares empleadas consisten en secuenciación de
diferentes genes amplificados mediante PCR, como el
gen de la β-tubulina II, el de la Calmodulina,
subunidades de la ARN polimerasa, el de la quitinasa,
entre otros, pero regiones del ADN ribosomal, como
los ITS1 y 2 y 5.8S son los más empleados para
identificación a nivel de especie de un amplio rango de
hongos.
En esta práctica se realizará una descripción de la
morfología macroscópica de algunos hongos (la cual
puede variar dependiendo del medio de cultivo
utilizado), así como la observación de las estructuras
reproductivas microscópicas, con el fin de entender la
diversidad morfológica que estos presentan y su valor
taxonómico.
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS CLAVES EN LA
IDENTIFICACIÓN DE HONGOS
Características del cultivo
 Textura de la superficie: glabrosa, afelpada,
polvorosa, granular, vellosa, algodonosa.
 Topografía de la superficie: plana, elevada,
amontonada, plegada, rugosa, cerebriforme.
 Pigmentación de la superficie: blanca, crema,
amarilla, café, rosada, gris, negra, etc.
 Pigmentación del reverso: ninguna, amarilla, café,
rojo, negro, etc.
 Tasa de desarrollo / diámetro de la colonia: < 5 cm
en 14 día o > 5 cm en 15 días.
 Temperatura de desarrollo: 37 °C, 28 °C, 40 °C, 45
°C.
TEXTURA: La define la altura del micelio aéreo y se
describe como: algodonosa, granular o polvosa,
afelpada y glabrosa.
Textura algodonosa: Se caracteriza por un micelio
aéreo denso y muy alto, con aspecto de algodón.
43
Manual Práctico de Microbiología
Figura 33. a) colonia algodonosa de Colletotrichum sp,
b) colonia vellosa, algodonosa de C. coccodes
Textura granular o polvorosa: con facilidad se
desmenuzan por la excesiva producción de conidias.
Con frecuencia estos dos términos se intercambian, sin
embargo la textura granular es más rugosa semejante
al azúcar granulado, mientras que la polvosa parece
harina.
Figura 34. a) colonia granulosa-pulverulenta de
Aspergillus clavatus, b) colonia pulverulenta de A.
flavus
Textura afelpada: Produce micelio aéreo bajo, con
aspecto de felpa o terciopelo.
Figura 35. a) colonia afelpada-aterciopelada de a)
Penicillium sp, b) Aspergillus sp
Textura glabrosa o cerosa: No producen micelio
aéreo, por lo tanto tienen una superficie pareja.
Generalmente se presentan en las colonias de
levaduras.
Figura 36. colonias cerosas de a) Malassezia slooffiae,
b) Exophiala spinifera
TOPOGRAFÍA: Describe las desigualdades presentes en
la superficie de la colonia, se observa generalmente
por el reverso de la caja, debido a que usualmente el
micelio encubre esta característica. Se describe como
verrucosa o cerebriforme, rugosa y lisa.
Topografía rugosa: tiene pliegues irregulares que
irradian el centro de cultivo.
b
Figura 37. colonias rugosas de a) Basidiobolus
ranarum, b) Cladosporium cladosporioides
Topografía verrucosa o cerebriforme: Posee una
superficie delgada que semeja un cerebro.
Figura 38. Colonias cerebriformes a) Blastomyces
dermatitidis, b) Rhodotorula sp.
Topografía lisa: No posee irregularidades en su
superficie.
Figura 39. colonia lisa de a) Mucor cicinelloides,
b)Rhizopus arrhizus
Estructura de la hifa
 Septada o aseptada
 Ramificada o no ramificada
 Pigmentada o no pigmentada
 Ancho uniforme o irregular
 Compuesta de artroconidios o pseudohifa
Estructura de reproducción
 Sexual: Zigosporangio, ascocarpo, basidio
 Asexual: esporangios y conidios
 Presencia de estruturas de diagnostico especiales:
cleistotecios, peritecios, apotecios, ascostroma o
44
 Manual Práctico de Microbiología
seudotecio (propios de Ascomycetos). Picnidios
a b
cuidado pues todos los colorantes tienen propiedades
tóxicas por exposición con la piel o ingestión.
Igualmente, debe protegerse la ropa y utensilios de los
estudiantes.

PROCEDIMIENTO

1. DESCRIPCIÓN E IDENTIFICACIÓN MACROSCÓPICA

DE LOS HONGOS

Se suministran cultivos de mohos y levaduras para la

descripción y diferenciación de estos dos grupos de
c hongos. Observar la textura, topografía y pigmentación
presente en el anverso y reverso de las colonias,
Figura 40. a) Cleistotecios en hoja de acelga, b)
anotar estas características en el cuadro que se
apotecios sobre rama de frambuesa, c) c y d peritecios,
suministra.
d) Picnidios en hoja de tomate.
2. DESCRIPCIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS
Tipo de conidio (espora asexual inmóvil formada
directamente a partir de una hifa o célula
MICROCULTIVO EN CÁMARA HÚMEDA
conidiógena o esporógena)
 Tamaño y forma de las esporas o conidios
1. Retirar el portaobjetos que se dejó en incubación
 Tamaño, forma y arreglo de las esporas
durante 8 días en cámara húmeda.
2. Adicionar unas gotas de azul de lactofenol en el
OBJETIVOS
borde del cubreobjetos, permitir que el colorante
penetre hasta alcanzar el cultivo del hongo, por
 Examinar estructuras somáticas y reproductivas de
capilaridad.
los hongos
3. Observar al microscopio, usar la figura 42 como
 Comprender la importancia de la caracterización de
guía y realizar una descripción de las estructuras
las estructuras somáticas y reproductivas para
microscópicas del hongo, por ejemplo:
identificación taxonómica de los hongos

CONSULTAS PRELIMINARES

Consultar sobre la estructura general de los hongos

unicelulares y multicelulares y las coloraciones
d empleadas para el estudio microscópico de estos
organismos.

MATERIALES
Materiales
Porta y cubreobjetos 5
Asa bacteriológica 1
Mechero 1
Cinta adhesiva transparente 5 cm
Figura 41. Identificación de estructuras microscópicas
Cultivo de hongos-levaduras 1
de un moho
Cultivo de hongos-moho 1
Reactivos 4. Realizar la descripción de todos los microcultivos
Azul de lactofenol 10 ml preparados durante la práctica anterior.
Equipos
Microscopio 2 por grupo TÉCNICA DE LA CINTA ADHESIVA (para mohos)
d
El reactivo será suministrado por el Técnico de
1. Colocar una gota de azul de lactofenol en el centro
Laboratorio. Su manipulación debe hacerse con
45
Manual Práctico de Microbiología
del porta objetos.
2. Tomar unos 8 cm de cinta adhesiva transparente
entre los dedos pulgar e índice, con el adhesivo
hacia fuera.
3. Presionar suavemente el lado adhesivo de la cinta
sobre la superficie del moho.
4. Colocar la cinta con el lado adhesivo hacia abajo y
pegarla sobre el porta objeto con el colorante.
5. Observar al microscopio con los objetivos 10X y
40X.
6. Realizar este procedimiento con varios hongos
OBSERVACIÓN DE LEVADURAS
1. Para el montaje de placas de levaduras, coloque una
gota de azul de lactofenol en el centro del porta
objetos.
2. Luego, tome inoculo con el asa previamente
esterilizada y realice un frotis de forma similar a los
extendidos para observación de bacterias.
3. Cubra con un cubreobjetos y observe al
microscopio
OBSERVACIÓN DE PLACAS PERMANENTES DE
HONGOS
Los residuos resultantes corresponden a cultivos
fúngicos, los cuales se inactivan y esterilizan en
autoclave. Una vez terminado el proceso de
esterilización, los residuos se disponen en bolsas
termoresistentes, se dejan enfriar hasta solidificación y
se almacenan temporalmente bajo congelación, La
disposición final se hace mediante el servicio de
recolección de residuos biológicos contratado por la
Universidad con la Administración Municipal.
Las placas para observación microscópica se colocarán
en un recipiente plástico con detergente para su
limpieza.
BIBLIOGRAFÍA
Atlas de identificación micológica. Galería virtual de
hongos de importancia para el ser humano, con un
enfoque morfológico. (Fotografías). [En línea].
<https://atlasdemicologia.wordpress.com/>[Citado en
10 de febrero de 2017].
Berkeley University of California. Fungi: More on
Morphology. [En línea].
<http://www.ucmp.berkeley.edu/fungi/fungimm.html>
[Citado en 10 de febrero de 2017].

De las placas entregadas por el profesor realice los
dibujos correspondientes señalando cada una de las
partes observadas.
OBSERVACIONES, CÁLCULOS Y RESULTADOS
KIDD, S, HALLIDAY, C; ALEXIOU, H y ELLIS, D.
Descriptions of Medical Fungi. 3 Ed. Newstyle Printing,
Australia. (Fotografías). [En línea].
<http://www.mycology.adelaide.edu.au/docs/fungus3-
book.pdf> [Citado en 10 de febrero de 2017].

Registre sus observaciones en una tabla como se indica Los microbios en la red. (Fotografía). [En línea].
a continuación: <http://www.losmicrobios.com.ar/microbios/?page_id
=1306> [Citado en 10 de febrero de 2017].
Nombre del hongo:
MADIGAN, Michael; MARTINKO, John y PARKER,
Aspecto Aspecto Esquema Jack. Brock Biología de los Microorganismos. 10 ed.
Macroscópico Microscópico Madrid: Prentice-Hall, 2003. 1080 p.
Textura: Tipo de hifa:
The National Institute of Open Schooling (NIOS).
Morphology and general properties of fungi. (Figura).
Topografía: Tipo de conidia: [En línea].
<http://www.nios.ac.in/media/documents/dmlt/Micro
biology/Lesson-51.pdf> [Citado en 10 de febrero de
2017].
Color: Otras:
Universidad de Antioquia. Aprende en línea.
Plataforma académica para pregrado y posgrado.
(Fotografías). [En línea].
http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/mod/
page/view.php?id=100815 [Citado en 10 de febrero de
RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O 2017].
ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS.
46
Manual Práctico de Microbiología
gos de importanc

Figura 42. Estructuras microscópicas de los hongos

47
Manual Práctico de Microbiología
PRÁCTICA No. 10. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUA
Equipo de filtración para análisis de aguas
Colonias de coliformes sobre agar EMB
INTRODUCCIÓN
La determinación de la calidad bacteriológica reviste
gran importancia en el ámbito de la salud pública ya
que permite garantizar la inocuidad del agua destinada
al consumo evitando así epidemias gastrointestinales.
El agua destinada al consumo humano puede ser
contaminada por las agua residuales o por desechos
humanos y animales que pueden contener
microorganismos patógenos (principalmente
intestinales) como son, los causantes de la fiebre
tifoidea (Salmonella typhi), la disentería (Shigella
dysenterieae) o el cólera (Vibrio cholerae) entre otros.
Para detectar el riesgo de contaminación del agua con
microorganismos patógenos se utilizan
microorganismos indicadores de contaminación que
reúnen las siguientes características: a) Se encuentran
como flora normal en la fuente de contaminación, es
decir, en la materia fecal, independientemente de que
haya o no microorganismos patógenos. b) Son más
resistentes y sobreviven en el agua más tiempo que los
patógenos. c) Su detección en el laboratorio es
relativamente rápida, fácil y confiable.
Las bacterias coliformes reúnen las características
anteriores, ya que se encuentran en grandes
cantidades en el tracto intestinal del hombre y de los
mamíferos, y por lo tanto, en sus heces es fácil
diferenciar las especies coliformes de origen fecal de
las que no lo son. Existen varios métodos para
establecer la presencia y cuantificar las densidades
poblacionales de los organismos coliformes, siendo
empleados el denominado sustrato definido y
filtración por membrana, como métodos oficiales para
el análisis de aguas potables en nuestro país
(Resolución 2115 de 2007).
Existen otros grupos microbianos que son indicadores
de otros tipos de contaminación: Bacterias mesófilas
aerobias que reflejan la exposición de la muestra a la
contaminación en general, la existencia de condiciones
favorables para la multiplicación de microorganismos y
la presencia de materia orgánica. La determinación de
bacterias mesófilas aerobias también es rutinaria en el
análisis bacteriológico del agua. Streptococcus de
origen fecal, que son más abundantes que los
coliformes en el tracto intestinal y heces de los
animales, pero sobreviven menos que los coliformes
porque prácticamente no se multiplican en el agua, por
ello su predominio en el agua indica contaminación
fecal proveniente de animales o contaminación
relativamente reciente. Clostridium perfringens que
también se encuentra en la flora normal intestinal y
por ser esporulado, resiste la presencia de sustancias
tóxicas que se encuentran en aguas residuales de
industrias; por eso es indicador de contaminación fecal
en este tipo de aguas, en las que otros
microorganismos no sobreviven.
48
Manual Práctico de Microbiología
OBJETIVOS PROCEDIMIENTO
 Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua 1. MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA
mediante el recuento de mesófilos aerobios,
microorganismos coliformes totales, coliformes La filtración por membrana es el mecanismo mediante
fecales y Escherichia coli. el cual se atrapan en la superficie de una membrana,
 Explicar el concepto microbiológico de indicador de generalmente de celulosa, microorganismos cuyo
contaminación. tamaño es mayor que el tamaño del poro 0.45 um,
 Diferenciar los organismos coliformes totales de los esto gracias a que una bomba eléctrica ejerce una
microorganismos coliformes fecales. presión diferencial sobre la muestra de agua haciendo
 Aplicar las técnicas de cuantificación de que se filtre. Los contaminantes de tamaño menor que
microorganismos totales y comparar con las el específico del poro atraviesan la membrana o se
técnicas de determinación de viables. quedan retenidos en su interior, las bacterias quedan
en la superficie de la membrana y luego esta es llevada
CONSULTAS PRELIMINARES a un medio de enriquecimiento selectivo, en la práctica
se utilizará el medio de cultivo Agar ENDO, el cual
Consulte la normatividad nacional (Res. 2115 de 2007) promueve el crecimiento y la identificación de
referente a la calidad microbiológica de las aguas y coliformes.
establezca cuales son los límites permisibles para las
aguas de consumo humano y la frecuencia y a. TOMA DE LA MUESTRA
características de los muestreos del agua para estos
propósitos.  La muestra debe ser colectada en frascos de vidrio
o de polipropileno autoclavable, de boca ancha
MATERIALES estériles. No debe llenarse el frasco por completo,
debe quedar una cámara de aire para poder
Materiales
homogeneizar la muestra antes de procesarla. La
Frascos de 100 mL estériles 2
misma debe conservarse a 4ºC hasta ser analizada.
Frascos estériles para dilución 2 El período máximo de conservación de la muestra
Tubos de ensayo tapa rosca 9 en frío es de 6 - 8 horas.
Filtros de membrana de nitrocelulosa de 0,45  Tomar una muestra de 100 mL de agua tratada
5
um para consumo humano y 100 mL de agua de
Equipo de filtración al vacío 1 piscina. A cada muestra adicionar 0.1 mL
Cajas de Petri 5 de solución de tiosulfato de sodio al 3% por 120ml
de muestra, neutraliza concentraciones de hasta 5
Pinzas estériles 1
mg/L de cloro residual para evitar que los agentes
Mechero 1
clorados y el cloro continúen la inhibición o
Reactivos destrucción de los microorganismos después de la
Agar ENDO 40 mL toma de la muestra o durante el análisis o incubación de
Caldo Fluorocult 90 mL las muestras. Esperar 15 min.
Agua peptonada estéril al 1% y pH neutro 700 mL  Si la muestra es de agua de ríos, arroyos, lagos o
Etanol al 70 % 100 mL reservorio, recolectar la muestra por lo menos 15
cm por debajo de la superficie y si es posible en
Equipos contra corriente.
Bomba de vacío 1
Baño María 1 b. ANÁLISIS DE AGUA TRATADAS
Incubadora a 35 - 37 º C 1
Incubadora a 44,5 º C 1  Para cada muestra, filtrar 100 mL de agua en el
Cuenta colonias 1 aparato de filtración directamente sin realizar
dilución de la muestra. Para diferenciar coliformes
El equipo deberá estar previamente calibrado a la totales de fecales se filtrarán dos muestras de agua
tratada y dos muestras de agua de piscina.
temperatura requerida. Favor no manipular el equipo y
mantenerlo cerrado. Abrir solamente para incluir el
cultivo a incubar.

49
Manual Práctico de Microbiología
 Remover el filtro con una pinza estéril y colocarlo
sobre el medio de cultivo ENDO contenido en la
caja de Petri. Consulte la composición y
características de este medio.
 Incubar una de las cajas de Petri a 35 ºC durante 18
- 24 horas para el recuento de coliformes totales
 Incubar la otra caja de Petrí a 44,5 ºC durante 18 -
24 horas para el recuento de coliformes fecales u
organismos termotolerantes.
 Después del período de incubación contar las
colonias o Unidades Formadoras de Colonias (UFC)
formadas sobre el filtro de membrana que
presenten color rojo.
Figura 43. Colonias de coliformes en agar ENDO.
c. ANÁLISIS DE AGUA CRUDA O NO TRATADA
 Preparar diluciones de la muestra, pues
seguramente contendrán altas densidades
poblacionales que no permitirán un buen
aislamiento o separación de las colonias. Para tal
efecto, tomar 25 mL de la muestra y diluirla en 225
mL de agua peptonada para obtener 250 mL de la
-1
dilución 10
-1
 Posteriormente, medir 25 mL de la dilución 10 y
mezclar con 225 mL de agua peptonada para
obtener 250 mL de la dilución 10-2.
-2
 Medir 25 mL de la dilución 10 y mezclar con 225
mL de agua peptonada para obtener 250 mL de la
dilución 10-3
 Monte el aparato de filtración, coloque el filtro de
membrana con una pinza estéril y filtre 100 mL de
muestra.
 Para cada dilución deberá filtrar dos muestras para
diferenciar coniformes totales de fecales.
 Remueva el filtro con una pinza estéril y colóquelo
sobre el medio de cultivo Agar Endo contenido en
la Caja de Petri.
 Incube una de las cajas de Petri a 35 ºC durante 18
– 24 horas para la determinación de coliformes
totales
 Incube la otra caja de Petrí a 44,5 ºC durante 18 –
24 horas para la determinación de coliformes
fecales u organismos termotolerantes.
d. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
 Método de filtración por membrana: cuando el
recuento de colonias está entre 20-200, los
resultados se expresan de la siguiente forma: Si
hemos analizado una muestra sin diluir: Recuento
de colonias = UFC / volumen de muestra filtrada.
Si hemos analizado una muestra diluida: Recuento
de colonias x Factor de dilución inverso = UFC/
volumen de muestra filtrada.
𝑻𝒐𝒕𝒂𝒍 𝒅𝒆 𝒄𝒐𝒍𝒊𝒇𝒐𝒓𝒎𝒆𝒔/𝟏𝟎𝟎𝒎𝑳 = UFC x factor de dilución
de la muestra
 Cuando se obtienen recuentos de más de 200
colonias sobre una misma membrana pueden dar
resultados erróneos debido a la superpoblación,
ya que lo que aparece como una colonia puede
ser originado por varias bacterias bajo
condiciones de hacinamiento. En estos casos
debemos volver a muestrear el agua y analizar
muestras más diluidas.
50
Manual Práctico de Microbiología
 Por otra parte, un número de colonias inferior a
10 ó 20 por membrana es poco fiable como base
para establecer cuantitativamente
concentración bacteriana de la muestra. Por
ejemplo, la obtención de 2 colonias a partir del
análisis de 1 ml de un agua, no nos permite
afirmar que esa agua contenía 200 colonias en
100 ml. En estos casos conviene repetir el análisis
filtrando un volumen de muestra mayor.
calidad microbiológica de las aguas evaluadas.
 Para el método de sustrato definido la
la determinación cuantitativa de las bacterias se
efectúa con la tabla NMP/100mL. Para el recuento
de los coliformes totales se leen positivo los tubos
que dan color azul (figura 42)

 Los resultados deben expresarse en Unidades

Formadoras de Colonias (UFC)/ 100 mL.

3. MÉTODO DE SUSTRATO DEFINIDO

Figura 44. Coliformes totales
Este método se basa en la utilización de medios
cromogénicos los cuales contienen nutrientes tales
 Para los coliformes fecales son positivos los que
como peptonas, aminoácidos, extracto de levadura,
presentan fluorescencia en presencia de luz
minerales y vitaminas, además de inhibidores,
ultravioleta (figura. 43).
gelificantes y sustrato cromogénico o cromógenos. Se
ha comprobado que los sustratos cromogénicos son
una herramienta potente en la identificación de
microorganismos, debido a la detección de enzimas
específicas producidas por los microorganismos en
estudio. El principio de los medios cromogénicos son
los sustratos cromogénicos como ONPG, X-Gal, o X-Glu
junto con una selectividad específica del medio. Los
microorganismos de estudio se caracterizan por tener
sistemas de enzimas específicas que son responsables
de la escisión del sustrato en el interior del cromógeno.
Con el fin de separar el sustrato, la unión entre las dos Figura 45. Fluorescencia de coliformes fecales
partes del cromógeno se rompe por la enzima. De ese
modo, los cromóforos son liberados y pueden ser  A los tubos que presentan fluorescencia se debe
detectados visualmente mediante la observación de un agregar 0.2 mL de reactivo de Kovac´s para
cambio de color en el medio. confirmar la presencia de E. coli, evidenciada por la
formación de un halo fucsia (figura 46) en la parte
4. Preparar diluciones de la muestra. Para tal efecto, superior del caldo de 2 a 10 segundos, indicando la
tome 1 mL de la muestra y dilúyala en 9 mL de agua formación de indol.
-1
peptonada para obtener la primera dilución 10 .
5. Posteriormente, preparar diluciones seriadas (10-2 y
10-3, etc.) según la carga microbiana que se
presuma tenga la muestra problema
6. Tomar 3 tubos que contengan 9 mL de caldo
fluorocult LMX y en cada uno añadir 1mL de la
dilución 10-1.,, repetir el procedimiento con las
diluciones siguientes (10-2 y 10-3)
7. Incubar a 37°C±0.5 de 24 a 48 horas.
Figura 46. Anillo rojo que indica la presencia de E. coli
OBSERVACIONES, CÁLCULOS Y RESULTADOS
 Comparar sus resultados con las normas y concluir
 Para el método de filtración por membrana calcular sobre la calidad microbiológica de las aguas
la población final de bacterias aplicando las evaluadas.
fórmulas explicadas arriba. Comparar sus
resultados con las normas y concluir sobre la

51
Manual Práctico de Microbiología
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS se señalan características, instrumentos básicos y
frecuencias del sistema de control y vigilancia para la
1. Por qué es importante distinguir entre coliformes calidad del agua para consumo humano.
fecales y no fecales?
2. Cuáles son los microorganismos patógenos
(bacterias, virus, protozoos) transmitidos por el agua?

RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O

ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS.

Los residuos resultantes corresponden a cultivos

bacterianos, los cuales se inactivan y esterilizan en
autoclave. Una vez terminado el proceso de
esterilización, los residuos se disponen en bolsas
termoresistentes, se dejan enfriar hasta solidificación y
se almacenan temporalmente bajo congelación, La
disposición final se hace mediante el servicio de
recolección de residuos biológicos contratado por la
Universidad con la Administración Municipal.

BIBLIOGRAFÍA

APHA. Method 9222. Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewaters, American
Public Health Association, NW, Washington DC, 1992
(1992)

APHA. Method 9060 A. Standard Methods for the

examination of water & wastewater. Sample collection,
dechlorination. American Public Health Association,
NW, Washington DC, 1997 (1997)

LEBOFFE, Michael y PIERCE, Burton. A photographic

atlas for the microbiology laboratory. 4 Ed. Morton
Publishing Company. Englewood-USA, 2011. 266 p.

MADIGAN, Michael; MARTINKO, John y PARKER,

Jack. Brock Biología de los Microorganismos. 10 ed.
Madrid: Prentice-Hall, 2003. 1080 p.

Ministerio de la protección social, Ministerio de

ambiente, vivienda y desarrollo territorial. Colombia.
Resolución número 2115 de 2007. Por medio de la cual

52
Manual Práctico de Microbiología
PRÁCTICA No. 11. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE SUELOS
El suelo es un sustrato vivo y dinámico
Horizontes del suelo y sus componentes biológicos
INTRODUCCIÓN
El suelo es considerado por muchos expertos como el
mayor sustrato utilizado para la producción agrícola y,
si bien esta definición es acertada, este sustrato
presenta características especiales, por lo que además
es posible definirlo como el sustrato vivo y dinámico
más abundante en términos de diversidad biológica,
donde se desarrollan muchas formas de vida, entre
ellas las plantas. Aunque no es evidente a simple vista,
el suelo constituye uno de los ecosistemas más
variados pues contiene una gran diversidad de
organismos vivos. Si se toma un gramo de suelo es
posible encontrar entre 1.000 y 10.000 millones de
células, siendo los microorganismos, los que más
abundan tanto en número como en diversidad de
especies. Cuando se hace referencia a bacterias,
hongos y virus asociados a la agricultura convencional,
generalmente estos organismos se relacionan con las
enfermedades de los cultivos. Sin embargo, en
la agricultura ecológica se hace mención a una trilogía
donde coexisten plantas, suelo y organismos en
conjunción con factores bióticos y abióticos que
modulan el sistema productivo y en donde con certeza
son más las bacterias, hongos y virus benéficos que los
patógenos.
En el suelo conviven seres vivos de diferente tamaño y
naturaleza, modificando el ambiente para sostener el
sistema productivo. A diferencia del hombre, que lleva
los microrganismos consigo donde quiera que vaya, las
plantas modifican su relación con los microorganismos
a lo largo del tiempo debido a los cambios fisiológicos y
por ende a las modificaciones en los metabolitos o
productos exudados a traves de la raíz. En presencia de
la semilla y posteriormente de la planta, el ambiente
del suelo cambia y se hace favorable para ciertos
grupos de microorganismos, en especial muy cerca de
la raíz. Este ambiente se conoce como la rizósfera y
provee condiciones químicas y físicas especiales que
favorecen la actividad y multiplicación de ciertos
grupos de microorganismos, mientras la raíz se
encuentre activa. A medida que la raíz entra en
senescencia, los exudados cambian y con ellos las
especies y actividad de los microorganismos de la
rizósfera.
Asimismo, en condiciones de bajos niveles de
nutrientes o materia orgánica o en presencia de altas
concentraciones de iones metálicos (Cu++) o
contaminantes orgánicos (agroquímicos o
hidrocarburos), los microrganismos del suelo, aunque
de manera lenta, son capaces de adaptarse mediante
diferentes mecanismos (por ejemplo, bombas de iones
en membrana), participando así de los procesos de
recuperación de suelos y manteniendo una condición
de diversidad especial para cada ecosistema. Los
microorganismos juegan un papel esencial en el
mantenimiento de la calidad, la salud y fertilidad de
suelo. Influyen en la disponibilidad y ciclaje de
nutrientes en el suelo, proveen estructura, aportan en
el control de organismos patógenos, degradan
contaminantes orgánicos y favorecen la huella de
carbono en el suelo. Sin embargo, no son las mismas
especies de microorganismos las que se encuentran
asociadas a las plantas que crecen en zonas desérticas,
que aquellos que se encuentran presentes en la selva
tropical.
Muchas son las técnicas microbiológicas empleadas en
53
Manual Práctico de Microbiología
el estudio de suelos pero hoy en día los estudios de
microbiología, si bien son importantes, se Consulta bibliografía sobre la biota microbiana del
complementan con herramientas de ciencias como la suelo, en cuanto al tipo y cantidad de grupos
bioquímica, la biología molecular, la bioinformática y la funcionales.
agricultura de precisión, entre otras; disciplinas que
permiten realizar análisis más completos y ya no solo
de microorganismos o plantas de manera aislada, sino MATERIALES
que han favorecido la generación de índices de calidad Materiales
de suelo y el conocimiento más certero de las
Cajas de Petri 12
relaciones entre la calidad del suelo y la respuesta de
los cultivos. Tubos de ensayo 5
Erlenmeyer 250 ml 1
Pipetas estériles 5
Muestra suelo 10 g
Palín 1
Balde plástico 1
Tamiz (2 mm) 1
Mechero 1
Reactivos
Agar nutritivo 30 ml
Agar PDA 30 ml
Agar Actinomicetes 30 ml
Agar SRS 30 ml
Agar FBN 30 ml
Agar CRYMA 30 ml
Hipoclorito de sodio 5% 100 ml
Agua peptonada 0.1% 100 ml
Equipos
Cuenta colonias 1
Incubadora 1

PROCEDIMIENTO

1. TOMA DE MUESTRAS DE SUELO

 Demarcar el transecto o área de toma de muestra y
hacer una caracterización del terreno: vegetación
dominante, pendiente, presencia de erosión,
cultivos, estado de cultivo o actividad sobre el
Figura 47. Grupos funcionales de microorganismos en terreno, altura (m.s.n.m) y si es posible
el suelo temperatura del suelo.

OBJETIVOS
 Aislar y cultivar poblaciones de microorganismos
presentes en el suelo.
 Realizar recuentos de microorganismos presentes
en el suelo.
 Identificar relaciones de antagonismo en los suelos.

CONSULTAS PRELIMINARES  Luego se procede a tomar en zig-zag o al azar de 8-

10 submuestras de suelo a una profundidad de 0 -
54
Manual Práctico de Microbiología
20cm, debido a que en esa zona se localiza la
mayor abundancia y actividad microbiana, retirar
primero la capa vegetal y hacer un hueco de 30x20
cm, tomando la muestra en forma de V con un
palín. Debe tenerse la precaución de desechar el
material acumulado en los bordes del palín.
 Estas submuestras se depositan en un balde donde
luego se homogenizan sin tocarlas con las manos y
en un sitio sombreado, se empacan en bolsas
nuevas 0,5 Kg, cuidando de no crear anaerobiosis y
se rotulan. Colocar las muestras en un sitio fresco
(puede ser en una hielera) para evitar perdida de
humedad y modificaciones de temperatura.
Los utensilios: palín, balde y machete se desinfectan
entre transecto y transecto con solución de hipoclorito
comercial al 5% enjuagando con bastante agua.
2. DETERMINACIÓN DE POBLACIÓN MICROBIANA DE
BACTERIAS, HONGOS- LEVADURAS Y plástica esta parte y organizar la porción aérea para
ACTINOMICETOS DEL SUELO Y GRUPOS
FUNCIONALES
 Tamizar en condiciones de asepsia la muestra de
suelo por tamiz de malla de 2mm. Se determina la
humedad total del suelo para hacer la respectiva
corrección a peso seco, con este fin se seca
aproximadamente 10 gramos de suelo a 105 °C por
12 horas, se vuelve a pesar y se repite hasta que el
peso de la muestra se estabilice.
 Realizar diluciones seriadas de cada muestra de
suelo, tomando 10 g.p.h de suelo (después de
realizar la corrección a peso seco) en 90 ml de agua
-1
peptonada al 0.1% (dilución 10 ), agitar por 30
-3
minutos y realizar la segunda dilucion (10 )
tomando 0.1 mL de la primera en 9.9 mL de
Solución salina, agitar por cinco minutos y tomar
-3
0,1ml de dilución 10 en 9.9 mL de Solución salina
-5
para llegar a una dilución de 10 . De esta dilución
tomar 1mL y agregarlo en 9mL de solución salina
-6
para llegar a la dilución 10 .
-5 -6
 A partir de las dos últimas diluciones 10 y 10 ,
sembrar 0,1ml en cajas de Petri por duplicado con
Agar nutritivo (AN) (conteo de bacterias), papa
dextrosa agar (PDA) (para hongos y levaduras),
Agar para Fijadores biológicos de nitrógeno (FBN),
Agar para Actinomycetes, y Agar para
solubilizadores de fósforo (SRS).
 Estas cajas se incuban a 28 ºC durante 5 a 7 días.
 Realizar conteo de ufc. según las normas
estándares, conteo entre 30 y 300 ufc para
bacterias y entre 10 y 20 para hongos. Contar
número total de colonias, número de colonias con
morfología diferente, número de colonias para
cada morfología; estos datos sirven para estimar
índices de diversidad de poblaciones del suelo,
partiendo del supuesto que cada morfología de
colonia diferente pertenece a una especie
diferente.
3. PROCESAMIENTO DE RAICES PARA DETERMINAR
PRESENCIA DE MICROORGANISMOS RIZOSFERICOS
(Rhizobium y Agrobacterium)
 Tomar muestra de la planta de interés con
una pala estéril, cavando alrededor de ella unos
15cm y a 20cm de profundidad (o según el tamaño
de la raíz y la planta), tratando de no dañar las
raíces y recuperando la mayor cantidad de raicillas,
envolver en papel periódico ligeramente húmedo la
parte de la raíz, colocar dentro de una bolsa
su posterior identificación botánica si fuese
necesario.
 Una vez en el laboratorio separar la raíz de la parte
aérea, descartando los restos de suelo envolver en
papel periódico o aluminio y conservar en nevera
en la parte de abajo hasta su análisis.
 Lavar las raíces con agua destilada para descartar
todo el suelo
 Con una pinza separar los nódulos cuidando de no
dañarlos y llevarlos a una caja de Petri con agua
destilada estéril por 1hora
 Pasarlos a hipoclorito por 3 minutos
 Lavar de 3 – 5 veces con agua destilada estéril
 Tomar cada nódulo y apretarlo sobre un extremo
55
Manual Práctico de Microbiología
de medio CRYMA (en el medio sólo debe quedar el
jugo del nódulo, sin material vegetal)
 Con el asa realizar una siembra por estrías
 Sellar, rotular y llevar a incubadora por 8 días a
28°C.
disposición final se hace mediante el servicio de
recolección de residuos biológicos contratado por la
Universidad con la Administración Municipal.
BIBLIOGRAFÍA

4. PRUEBA DE ANTAGONISMO MADIGAN, Michael; MARTINKO, John y PARKER,

Jack. Brock Biología de los Microorganismos. 10 ed.
 Después de las 24 horas de incubación, escoja 4 Madrid: Prentice-Hall, 2003. 1080 p.
colonias diferentes de bacterias que crecieron en el
agar nutritivo y denomíneles A, B, C, y D. Con el asa
bacteriológica transfiera porciones de la colonia a
nuevas cajas de Petri con Agar Nutritivo, realizando
la siembra de la siguiente manera:

 Incube a 28 ºC por 5 – 8 dias y observe si se

presentó antagonismo, el cual se caracteriza por la
inhibición del crecimiento de la bacteria.

OBSERVACIONES, CÁLCULOS Y RESULTADOS

Establezca el número de colonias (UFC) en cada una de

las cajas de Petri por el método de recuento en placa y
realice los cálculos para establecer el número de
organismos por miligramo de suelo (Revisar guía Nº
10)

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

1. ¿Cual es la composición de los medios de cultivo

empleados y cuál es la indicación general de uso?

2. ¿Cuál es la función en el suelo de cada uno de los

grupos microbianos estudiados en la práctica?

RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O

ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS.

Los residuos resultantes corresponden a cultivos

bacterianos, los cuales se inactivan y esterilizan en
autoclave. Una vez terminado el proceso de
esterilización, los residuos se disponen en bolsas
termoresistentes, se dejan enfriar hasta solidificación y
se almacenan temporalmente bajo congelación, La

56
Manual Práctico de Microbiología
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS
Algunos microorganismos presentes en los alimentos
son patógenos para el consumidor
INTRODUCCIÓN
La investigación sobre los productos alimenticios o sus
constituyentes requiere especial atención para
detectar aquellos microorganismos que los deterioran
o que son patógenos para el consumidor. El examen
microbiológico permite obtener pautas para el
establecimiento de normas de higiene aplicables
durante la producción, y de métodos eficaces de
conservación.
Microorganismos indicadores: Este término se aplica a
cualquier grupo taxonómico, fisiológico o ecológico de
microorganismos cuya presencia proporcione
evidencia indirecta de que los alimentos estuvieron
expuestos a condiciones que pudieron determinar la
llegada de microorganismos peligrosos o permitir la
proliferación de especies patógenas o toxigénicas. Los
organismos patógenos son de gran utilidad tanto para
determinar la calidad bacteriológica de los alimentos
como la garantía que ofrecen al consumidor.
Escherichia coli y coliformes: Son organismos que
habitan en el tracto digestivo de los hombres y otros
animales. Su presencia en un alimento indica
contaminación directa o indirecta de origen fecal. La
presencia de E. coli advierte el riesgo de que pudieran
estar presentes bacterias patógenas entéricas, entre
ellas algunas de los géneros Salmonella, Shigella y
Vibrio; así como virus entéricos y parásitos diversos.
Los otros coliformes (especies de varios géneros de la
familia Enterobacteriaceae), son buenos indicadores
de limpieza y desinfección inadecuadas, o de una
manipulación o tratamiento incorrecto de los
alimentos. La presencia de niveles altos de coliformes
en un alimento tratado, no indica necesariamente un
contacto inmediato con heces o con superficies
contaminadas con heces. Indica que pudieron existir
circunstancias favorecedoras de la multiplicación de
estos microorganismos introducidos probablemente
por deficiente limpieza o desinfección.
Streptococcus salivarus se ha utilizado como indicador
de contaminación oral, debido a que está casi siempre
presente en la boca humana. Staphylococcus aureus,
su presencia se interpreta como contaminación
proveniente de la piel, la boca o las fosas nasales de los
manipuladores. Clostridium botulinum y Clostridium
perfrigens: La presencia de esporas en alimentos
enlatados no ácidos, es señal de que posiblemente el
tratamiento térmico fue insuficiente.
OBJETIVOS
 Determinar la calidad del producto en términos de
contaminación microbiana.
 Establecer el número y tipo de microorganismos
que se encuentran en distintos alimentos.
CONSULTAS PRELIMINARES
Consulte acerca de las causas de contaminación de los
alimentos y las enfermedades de origen alimentario
prevalentes.
57
Manual Práctico de Microbiología
MATERIALES  Pesar 10 gramos reprentativos de la muestra del
alimento y agregarlos al vaso estéril del
Materiales
homogenizador. Si el contenido de la muestra no es
Tubos de fermentación para homogéneo (como sucede en un plato precocido
12
NMP congelado), deberá tomarse una muestra de 10 g a
Cajas de Petri 4 partir de un macerado de todos los componentes o
se analizan separadamente cada uno de ellos, según
Tubo de ensayo para dilución 3 la finalidad del análisis.
 Añadir al vaso estéril 90 ml de agua peptonada, de
Frasco para dilución 1 este modo se obtiene una dilución 10–1.
 Homogenizar el alimento y hacer las diluciones
Pipetas estériles 5 ml 5
inmediatamente. Comenzar la homogenización con
Mechero 1 un número bajo de revoluciones y en pocos
Reactivos segundos pasar a muchas revoluciones, o aumentar
Agar EMB 120 mL gradualmente en pocos segundos hasta alcanzar las
revoluciones máximas. Controlar cuidadosamente
Agar SS 120 mL
el tiempo de homogenización, de tal forma que no
Agar APC 120 mL supere los 2 minutos a revolución alta. Esperar 2-3
Agar Cristal Violeta Rojo Neutro min. hasta que desaparezca la espuma formada. Se
120 mL
Bilis glucosa debe tener presente que desde el momento que se
Agar base OGY 120 mL mezclan muestra y diluyente debe evitarse
Caldo Triptona 10 ml cualquier retraso innecesario.
 Medir 1ml de la dilución 10–1 evitando la formación
Reactivo de Kovac´s 10 ml
de espuma y pasarlo a un tubo con 9ml de agua
Equipos peptonada, para obtener la dilución 10–2. Agitar
Incubadora 2 esta dilución y las subsiguientes enérgicamente 25
Baño María 1 veces. Repetir esta operación utilizando las
diluciones progresivamente mas concentradas para
preparar las diluciones 10–3, 10–4, 10–5, 10–6 o las
PROCEDIMIENTO necesarias dependiendo del alimento a analizar.

1. PREPARACION DE LA MUESTRA 2. RECUENTO DE MICROORGANISMOS

 Una vez tomada la muestra debe iniciarse el análisis
tan pronto como sea posible. La muestra debe
refrigerarse a 0 – 5 °C si no puede ser estudiada
inmediatamente después de su llegada al
laboratorio. Si la muestra está congelada,
descongelarla en su envase original (o en el
recipiente en el que llegó al laboratorio) durante un
tiempo máximo de 18 horas en una nevera a 2 – 5
°C. Si la muestra congelada puede ser facilmente
triturada (como sucede con los helados), no es
necesario descongelarla.
Figura 49. Desarrollo de colonias sobre medios de
cultivo selectivos

a. Microorganismos Mesófilos Aerobios

 Preparar la muestra y las diluciones de los

homogenizados tal como se recomendó en el
numeral 1.
 Pipetear por duplicado en cajas de Petri, alicuotas
Figura 48. Toma de muestra. de 1ml de las diluciones: 10–1, 10–2, 10–3. Se
aconsejan 6 diluciones en los casos en que no se
58
Manual Práctico de Microbiología
conozca previamente el número aproximado de
microorganismos presentes en el alimento, pero
puede modificarse siempre que lo aconseje la
cantidad de organismos esperada.
 Inmediatamente verter en cada caja de 10 a 15ml
de agar para recuento, fundido y mantenido a 45°C.
 Mezclar la muestra con el agar, girando suavemente
las cajas en el sentido de las agujas del reloj 5 veces.
 Como prueba de esterilidad verter medio de cultivo
sobre una caja de Petri sin muestra (marcar =
control)
 Dejar las cajas sobre la mesa hasta solidificación del
agar
 Invertir las cajas e incubar a 31°C por 48 ± 3 horas.
 Realizar la lectura y el cálculo de resultados
 Comparar con las normas microbiológicas y dar la
recomendación pertinente
b. Recuento de bacterias coliformes Totales
Figura 48. Colonias de coliformes
 Preparar la muestra y las diluciones de los
homogenizados tal como se recomendó en el
numeral 1.
 Pipetear por duplicado en cajas de Petri, alicuotas
de 1ml de las diluciones: 10–1, 10–2, 10–3.
 Inmediatamente agregar en cada caja de 10 a 15ml
de agar Cristal Violeta Rojo Neutro Bilis glucosa
cajas mantenido a 45°C.
 Mezclar las diluciones con el medio
 Como prueba de esterilidad verter medio de cultivo
sobre una caja de Petri sin muestra (marcar =
control)
 Dejar las cajas sobre la mesa hasta solidificación del
agar
 Una vez solidificado el medio de las cajas recubrirlas
con aproximadamente 5ml de medio (capa virgen)
 Después de solidificada esta nueva capa, invertir las
cajas e incubar a 31°C por 20 – 24 horas.
 Realizar la lectura y el cálculo de resultados
 Comparar con las normas microbiológicas y dar la
recomendación pertinente
c. Recuento de Mohos y Levaduras
 Preparar la muestra y las diluciones de los
homogenizados tal como se recomendó en el
numeral 1.
 Pipetear por duplicado en cajas de Petri, alicuotas
de 1ml de las diluciones: 10–1, 10–2, 10–3.
 Inmediatamente agregar en cada caja de 10 a 15ml
de medio oxitetraciclina-gentamicina glucosa
extracto de levadura.
 Mezclar las diluciones con el medio
 Como prueba de esterilidad verter medio de cultivo
sobre una caja de Petri sin muestra (marcar =
control)
 Dejar las cajas sobre la mesa hasta solidificación del
agar
 Invertir las cajas e incubar a 28°C por 5 días.
 Realizar la lectura y el cálculo de resultados
 Comparar con las normas microbiológicas y dar la
recomendación pertinente
d. Recuento de termófilos
 Los microorganismos termófilos son importantes
en los alimentos conservados o preparados
térmicamente por su alta resistencia al calor. Este
recuento determina si el tratamiento térmico del
alimento fue óptimo.
 El procedimiento para este recuento es muy similar
al utilizado para los mesófilos, la diferencia radica
en la temperatura de incubación, que en este caso
es de 55 °C +/- 2 °C por 72 horas.
e. Recuento de Salmonella y Shigella
 Pipetear por duplicado en cajas de Petri con agar
Salmonella-Shigella (SS) alicuotas de 1ml de las
diluciones: 10–1, 10–2, 10–3. Se aconsejan 6 diluciones
en los casos en que no se conozca previamente el
número aproximado de microorganismos presentes
en el alimento, pero puede modificarse siempre
que lo aconseje la cantidad de organismos
esperada.
 Inmediatamente verter en cada caja de 10 a 15ml
de agar SS fundido y mantenido a 45°C.
 Mezclar la muestra con el agar, girando suavemente
las cajas en el sentido de las agujas del reloj 5 veces.
 Como prueba de esterilidad verter medio de cultivo
sobre una caja de Petri sin muestra (marcar =
control)
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Manual Práctico de Microbiología
 Dejar las cajas sobre la mesa hasta solidificación del
agar Recuento total: 33 x 10-2 UFC/g o mL
 Invertir las cajas e incubar a 31°C por 48 ± 3 horas.
 Realizar la lectura y el cálculo de resultados  Pero si el recuento mayor contiene dos veces o más
 Comparar con las normas microbiológicas y dar la el menor, en este caso se informará el recuento del
recomendación pertinente menor, ejemplo:

OBSERVACIONES, CÁLCULOS Y RESULTADOS Dilución 10-1 160 y 170

 Seleccionar las cajas correspondientes a la dilución (160 + 170)

∗ 10 = 1650
que contenga entre 30 y 300 UFC, contar las 2
colonias que aparezcan en las cajas, sacar la media
aritmética de los dos recuentos y multiplicar por el Dilución 10-2 33 y 37
inverso del factor de dilución.
 Si las cajas de dos diluciones consecutivas (33 + 37)
∗ 100 = 3500
presentan recuentos de menos de 30 y mayores de 2
300 UFC, calcular el recuento para cada una de las
diluciones y sacar el promedio entre las dos, El menor de los dos valores es el recuento total: 16 x
ejemplo: 10-2 UFC/g o mL

Dilución 10-1 330 y 350  En caso de que no aparezcan colonias en las cajas
correspondientes a la dilución mas concentrada,
(330 + 350) informar el recuento total como menor de 1
∗ 10 = 3400 multiplicado por el factor de dilución inverso.
2

Dilución 10-2 26 y 28 EXPRESION DE LOS RESULTADOS

(26 + 28) Solamente deben informarse 2 dígitos, el primero y el

∗ 100 = 2700 segundocomenzando por la izquierda del promedio de
2
los recuentos, los otros dígitos serán reemplazados por
Promedio: ceros.
(3400 + 2700) Ejemplo: 523000 se informa como 52x104 UFC/g o mL
= 3050
2 Si el tercer dígito de la izquierda es 5 o mayor
aproximar a la unidad siguiente superior. Ej: 83600 se
Recuento total: 30 x 10-2 UFC/g o mL informa como 84x103 UFC/g o mL

 Si las cajas de dos diluciones consecutivas están Concluir sobre la calidad microiológica del alimento
dentro del rango de 30 y 300 UFC, calcular el analizado respecto a la norma técnica colombiana.
recuento para cada una de las diluciones e informar Explicar las causas de por qué el alimento cumple o no
el promedio de los dos valores obtenidos, ejemplo: con la norma.

Dilución 10-1 280 y 290 RECUPERACIÓN, DESACTIVACIÓN Y/O

ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS.
(280 + 290)
∗ 10 = 2850
2 Los residuos resultantes corresponden a cultivos
bacterianos, los cuales se inactivan y esterilizan en
Dilución 10-2 35 y 40 autoclave. Una vez terminado el proceso de
esterilización, los residuos se disponen en bolsas
(35 + 40) termoresistentes, se dejan enfriar hasta solidificación y
∗ 100 = 3750
2 se almacenan temporalmente bajo congelación, La
disposición final se hace mediante el servicio de
recolección de residuos biológicos contratado por la
Promedio: Universidad con la Administración Municipal.
(2850 + 3750)
= 3300
2
60
Manual Práctico de Microbiología
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