Técnicas de coloración bacteriana

Practica nº3

Molinares Mendoza Antoni, Rojas Catalán Carlos, Simanca Casseres Neider.

Profesor:

ANTONIO INSIGNARES

Universidad del Atlántico

Facultad de química y farmacia

Programa de farmacia

2017-1

Resumen

En esta práctica se realizó la tinción diferencial, técnica que se usa para diferenciar los
microorganismos. En práctica se busca adquirir destreza en la técnica de coloración de
Gram así como diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativa y sus
diferentes aplicaciones. Para empezar la práctica se limpió el portaobjeto, lo cual es
esencial para la preparación del frotis y remover la grasa o aceite de dedos que puede
estar sobre este, lavándolo con agua y detergente y enjuagándolo con alcohol al 95%.
Luego se procedió a realizar el frotis, para realizar esto se colocó una gota de solución
salina al 0.85% y con la ayuda de un asa de inoculación estéril se tomó una muestra de
una colonia. Posteriormente homogenizar las células con la gota de solución salina y con
movimientos circulares realizar un esparcido de aproximadamente un centímetro de
diámetro, dejar secar y fijar al calor para evitar la pérdida de la muestra durante la tinción.
Luego de realizar la fijación se debe cubrir el extendido con cristal violeta y dejarlo actuar
durante un minuto y lavar el exceso con agua. Seguido a esto se cubre el extendido con
lugol durante un minuto y vuelva a lavar con agua. El siguiente procedimiento es decolar
con alcohol acetona durante aproximadamente 30 segundos y lave con agua.
Posteriormente cubra el extendido con safranina durante un minuto lave y seque y
observe en el microscopio.
 Introducción

La tinción es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a una

superficie, el uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los
microorganismos y poder realizar la observación en un microscopio óptico. Dado que las
bacterias son casi incoloras, no presentan contaste con el medio en el cual se encuentran
suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo, de acuerdo
a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción: Simple y Diferencial,
enfocándonos principalmente en nuestro caso en la tinción diferencial, en donde el
colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas o entre partes
de una misma célula, estas técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos reactivos
complementarios para la tinción.

Ejemplos: Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-Neelsen, etc. Los colorantes más utilizados
son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, los cuales son catiónicos y se combinan
fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos
nucleicos y los polisacáridos ácidos

Tinción de Gram: Esta tinción es denominada así por el bacteriólogo Christian Gram,
quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos, gram positivas y gram negativas, lo que no tiene
nada que ver con su carga eléctrica.

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las

diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares.

Tinción de Ziehl-Neelsen: Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen

ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les
confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción
con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente.

Objetivos

1. Conocer métodos para la tinción de la pared bacteriana.

2. Diferenciar el tipo de forma que tienen las bacterias.
3. Identificar el tipo de agrupación y tinción de las bacterias observadas en el microscopio
 Metodología

Primero que todo se debió lavar el portaobjeto para poder remover la grasa de los dedos
que podría tener este. Se dejó secar hasta que estuvo listo para usarlo. Luego se preparó
el frotis añadiendo una gota de solución salina al portaobjeto y tomando una muestra de
una colonia con un asa de inoculación, previamente esterilizada con mechero, dicha
muestra se homogenizo con la solución salina esparciéndola con movimientos circulares
de aproximadamente un centímetro de diámetro y se dejó secar. Luego se realizó la
fijación en calor, pasando rápidamente dos a tres veces el frotis sobre la llama del
mechero.

Posteriormente se realizó la tinción:

• Cubrir el extendido con cristal violeta, dejarlo actuar durante un minuto y lavar el exceso
con agua.

•Añadir lugol, el cual actúa como mordiente, durante un minuto. Lavar con agua.

• Decolorar con alcohol acetona durante 20-30 segundos y lave con agua.

• Cubrir el extendido con safranina. Dejar actuar durante un minuto. Lave, seque y observe
en el microscopio con el objetivo de inmersión.

En el microscopio se observara la forma y arreglo del microorganismo.

 Resultados

Para poder observar claramente bacterias en un microscopio es necesario teñir su pared

ya que si no la teñimos lo más probable es que no veamos nada, luego del proceso de
fijación de bacterias en un porta objeto, se procede a realizar la tinción siguiendo el
procedimiento descrito anteriormente. Después de esto ya podemos observar las
bacterias en un microscopio óptico donde se usa el objetivo 100x y aceite de inmersión
para aumentar la luminosidad y poder observar la muestra, se utiliza este objetivo por que
las bacterias son muy pequeñas y no se diferencia su forma en otro objetivo de menor
aumento. Al mirar la muestra en el microscopio observamos:

En la anterior imagen podemos apreciar las bacterias con forma de cocos ordenados en
racimos, y por su coloración violeta podemos identificar estas bacterias como Gram
positiva.

Conclusión

En la anterior práctica de laboratorio aplicamos el proceso de tinción de la pared

bacteriana de bacterias con el fin de identificar la forma, tamaño y como están ordenadas
las bacterias, donde primero fijamos las bacterias en un porta objeto y luego procedimos
a la tinción con distintos colorantes, todo esto con el fin de poder observar las bacterias
en el microscopio óptico que en este caso fueron cocos dispuestos en racimos y son Gram
positiva lo cual lo identificamos por el color que presenten estas bacterias.

Bibliografía
- http://www.pucmmsti.edu.do/websise/estudiante/materias/201220132/ST-
BIO-231-P-071/BIO-231%20PRACTICA%202%202-12-13.pdf

- https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnolo
gia.pdf

Preguntas

¿Por qué es esencial que el colorante primario y el contra tengan colores

contrastantes?
El colorante primario se encarga de teñir todas las células y luego se decolora con
alcohol acetona con el objetivo de realizar un contraste de color, al añadir el colorante
contra le da a las células decoloradas un color que contraste con el del colorante
primario. El colorante contra no puede ser absorbido por las células con el colorante
primario. De esta manera se pueden diferenciar las células según el colorante que han
absorbido.

¿Cuál es la ventaja de la técnica de tinción diferencial frente a la de tinción

simple?
Mediante esta técnica se nos permite visualizar la morfología de las bacterias, como
también otras características, como puede ser la composición de la pared bacteriana,
además dentro de la tinción diferencial encontramos el método de Tinción de Gram,
que permite clasificar las bacterias en dos grandes grupos (Gram + , Gram -). El
distinto comportamiento de la tinción de Gram es la distinta composición de la pared
celular.

Diga cuál es la función de Cada uno de los siguientes reactivos en una

tinción diferencial:

Tinte Primario: Su función es impartir color a todas las células.

Contratinte: Le da a las células decoloradas un color que contrasta con el del
colorante primario. El colorante de contraste no puede ser absorbido por las
células que no han perdido el colorante primario. De esta manera, tipos de
células o sus estructuras se pueden distinguir unas de otras en función del
colorante que es absorbido.
Agente Decolorante: Puede decolorar la célula completa o parte de ella
Mordiente: Aparte de matar bacterias, incrementa la afinidad del colorante
primario con la célula, formando complejos insolubles con este
Supongamos que el laboratorio de hoy fue aplazado y se realiza la
próxima semana con el cultivo de B. cereus que tiene 9 días de
antigüedad. Al realizar la tinción de Gram usted observa células teñidas
de color violeta intenso y otras de color rosa, proponga una explicación
a este resultado.
Esto se debe a que luego de estar las bacterias en un tiempo prolongado en
un medio de cultivo empiezan a aparecer bacterias u hongos no deseados en
nuestro cultivo como puede ser el moho y al aparecer estos nuevos individuos
su pared puede ser Gram positiva o negativa lo que interfiere en los resultados
esperados. Para evitar esto los cultivos donde tomaremos la muestra no debe
tener tantos días de antigüedad.