Determinación de metales pesados en sangre entera por ICP-MS

RESUMEN: Se analizaron tres estándares de sangre entera utilizando Agilent 7500 ICPMS. Se llevó a
cabo un análisis cuantitativo de cadmio, plomo y mercurio, siguiendo una dilución simple de la sangre
entera. Una sola técnica de preparación consistió en la dilución de la sangre entera con agua
desionizada, acidificando la solución agregándole una pequeña cantidad de la mezcla de los
estándares internos, y agregando oro para estabilizar el mercurio en la solución. La solución analizada
consiste de 20 veces [¿o partes?] de sangre diluida, estándares internos a nivel 1 ppb, y oro al nivel de
las 100 ppb.

INTRODUCCIÓN

Los metales pesados, tales como el cadmio (Cd), el plomo (Pb), y el mercurio (Hg) son altamente
tóxicos; los trabajadores en las industrias eléctricas y de pintura pueden exponerse a estos metales y
se debe monitorear constantemente. Debido a su extrema toxicidad, los metales pesados deben
determinarse en niveles bastante bajos en fluidos biológicos como la sangre y la orina. En el futuro, es
probable que los niveles máximos de concentración permisible en humanos decaigan, aumentando la
demanda de los instrumentos analíticos utilizados.

Para determinar elementos a nivel traza (el cual usualmente se define por estar debajo de los 10
ng/mL), se requieren técnicas analíticas sensibles. La espectrometría de masa por acoplamiento de
plasma inductivo ha sido ampliamente utilizada en la determinación de muchos elementos a niveles
traza y ultra-traza en tejidos y fluidos biológicos.

Estas matrices a menudo requieren un tratamiento previo de muestra extensivo antes del análisis.
Usualmente, es necesario remover la materia orgánica presente en la muestra antes del análisis. La
eliminación de proteína por lo general se llevó a cabo a través de la digestión de muestras biológicas
con ácidos minerales. Otro método mucho más fácil es simplemente diluir la muestra con un diluyente
apropiado. La muestre puede dejar reposar o centrifugar. Los metales traza pueden entonces medirse
en el sobrenadante.

Este método de preparación de muestra tiene muchas ventajas: reduce el riesgo de contaminación
significante de blancos, evita la pérdida de elementos volátiles como el mercurio, es rápido y fácil, y
elimina la necesidad de equipamiento especial de digestión. Cuando es posible, se prefiere usar
dilución simple- se ha observado que el factor de dilución involucrado no compromete los límites de
detección de modo que el método requerido de límites de detección (MDLs) no pueda lograrse. La
alta sensibilidad del Agilent 7500, sin embargo, asegura que los MDLs son extremadamente bajos,
incluso cuando se emplea 1:20 de la dilución.

Es boletín de aplicación describe la determinación del grupo de tres metales pesados en sangre entera
por dilución simple a 1:20, seguido del análisis directo usando el ICP-MS Agilent 7500.

PROCEDIMIENTO

Se analizaron tres materiales de referencia de sangre entera certificados (cada uno certificado por
cada analito) para Cadmio (Cd), Plomo (Pb) y mercurio (Hg). Los estándares de referencia se
prepararon utilizando un solo procedimiento de preparación de muestra, tal como se describe a
continuación.
Se utilizaron reactantes de alto nivel de pureza: 18 Mcm-1 de agua Milli-QTM DI de Millipore (Bedford,
MA) y ácido nítrico – grado Optima, de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Para la preparación de los
calibradores y muestras, se utilizaron estándares de elementos solos: cadmio, germanio, plomo,
mercurio, terbio, e itrio, todos a 1000 ppm de SPEX (Netuchem, NJ) y oro a 100 ppm de SPEX
(Netuchem, NJ).

Solución madre de trabajo de mezcla de estándar interno: Germanio (Ge), Itrio (Y) y terbio (Tb) se
prepararon con soluciones madres de un solo elemento a una concentración de 1ppm, en 5% de ácido
nítrico. El uso de bismuto como un estándar interno no es recomendable debido a su presencia en
algunos medicamentos.

9.48 mL de agua fueron puestos en tubos de ensayos de 10 o 12 mL. Se les agregó 0.5 mL de sangre
entera, seguido de 0.01 mL de la mezcla de estándar interno y 0.01 mL de oro. La secuencia descrita
de agregar las soluciones adecuadas a los tubos de ensayo asegura la precipitación mínima de
proteínas. El sobrenadante puede ser analizado ya sea siguiendo la centrifugación corta (1 minuto) de
la muestra, o después de esperar por lo menos 20 minutos para asegurar el asentamiento del
precipitado en el fondo de los tubos de ensayo. Si se dispone de menos de 0.5 mL de sangre entera,
todos los volúmenes pueden ajustarse. El factor final de dilución debe ser 20-fold1, la concentración
final de los estándares internos 1 ppb, y la concentración final de oro 100 ppb.

Nota: Es posible que ocurra coagulación durante la acidificación, debido a las variaciones naturales de
la sangre humana. En casos severos, se debe poner mucha atención para asegurar que el tubo
nebulizador de absorción no se obstruya.

El mercurio es un elemento típicamente difícil de analizar en una solución, ya que tiende a adherirse
a las superficies del sistema de introducción de muestra. En este caso, una cámara de pulverización
de cuarzo se utilizó, puesto que las cámaras de pulverización hechas de polímeros como PTFE y
RytonTM tienden a sufrir más los efectos de memoria del mercurio que el cuarzo. Además, el uso de
oro en exceso también ayuda en la reducción de los efectos de memoria. La adición de oro a las
muestras, en las cuales se determina el mercurio, fue iniciada por la Agencia de Protección
Medioambiental de los Estados Unidos (US EPA), y es exitosamente usada en cientos de laboratorios
comerciales.

PARÁMETROS DE OPERACIÓN Y ADQUISICIÓN

A lo largo del procedimiento, se utilizó un ICP-MS Agilent 7500 (ya sea el Agilent 7500a o el Agilent
7500i) estándar, equipado con a nebulizador de flujo cruzado (Crossflow) y una cámara de
pulverización de cuarzo. Los parámetros de operación se muestran en la tabla 1. Los parámetros de
adquisición se muestran en la tabla 2.

PROTOCOLO DE ANÁLISIS

Los estándares de calibración (calibradores) y muestra (materiales de referencia certificados) se

cargaron en el automuestrador. El software del programa peri-pump [bombeo periférico] del Agilent
7500 se configuró para aumentar la tasa de absorción de muestra durante los ciclos de lavado para
reducir el tiempo de análisis. Todas las soluciones de lavado contenían oro en concentraciones de 100
ppb. Al final del análisis, los datos fueron automáticamente importados en una base de datos
personalizada. La capacidad del automuestrador es de 270 muestras pacientes más todas las

1
La traducción de esta palabra es 20 veces.
soluciones QA/QC necesarias. Si es necesario, el Agilent 7500 se puede apagar automáticamente al
final del análisis.

RESULTADOS

Se crearon curvas de calibración de 6 puntos en soluciones acuosas (ácido nítrico al 1%). Las
concentraciones apropiadas se encuentran en la tabla 3. Los valores en la lista se muestran en ng/mL.
Microgramos por litro (ug/L) son las unidades preferidas para reportar oligoelementos en tejidos y
fluidos humanos (como se especifica en el documento C38, NCCLS) y los nanogramos por mililitro
(ng/mL) son unidades equivalentes aceptables. Las partes por billón (ppb), que son ampliamente
utilizadas como unidades en mediciones con ICP-MS, son unidades inaceptables para los fluidos
biológicos.

Se analizaron tres materiales de referencia certificados (CRMs) del Centro de Toxicología de Quebec.
Cada CRM de sangre entera se certificó por un solo elemento. Se usaron los siguientes CRMS: para la
determinación de cadmio – C-97-11, para la determinación de plomo – L-98-02, y para la
determinación de mercurio – M-98-01. Los resultados cuantitativos y los valores certificados se
representan en la tabla 4.

Los límites de detección del instrumento (IDLs) y los límites de detección del método (MDLs) se
calcularon y se presentaron en la tabla 5.

Tres límites de detección sigma se calcularon utilizando 7 repeticiones en blanco y curvas de calibrado.
Los MDLs se derivaron aplicando el factor de dilución de la etapa de preparación de muestra. Los MDLs
representan el límite de detención obtenido para la muestra de sangre entera. Como se ilustra, la
sensibilidad del Agilent 7500 y el uso de la dilución simple para evitar la contaminación del blanco por
reactantes se combinan para proveer una técnica extremadamente sensible para la medición de
metales pesados en sangre entera.

CONCLUSIÓN

Se ha demostrado que el Agilent 7500 es una herramienta rápida y muy sensible para el análisis de
múltiples elementos de metales pesados en sangre entera. Tres réplicas de la muestra se midieron en
menos de un minuto. Menos de 1 mL del volumen de la muestra se consumió. El proceso de dilución
simple de la muestra ofrece un tiempo total requerido muy rápido comparado con los métodos más
convencionales de preparación de muestra, incluyendo la eliminación de matriz. La capacidad de
muestra le permite al operador tomar ventaja del alto flujo de muestras posibles con esta técnica: el
automuestrador puede cargarse con 270 muestras, además de cualquier estándar, solución de lavado
y estándares de control de calidad requeridos. La sensibilidad superior del Agilent 7500 proporciona
límites de detección del método a niveles por debajo de los ng/mL en sangre entera, permitiendo la
determinación de oligoelementos a niveles de concentración no disponibles con otras técnicas. Las
capacidades multi-elementales del ICP-MS no se utilizan completamente, ya que con la misma
cantidad de muestra y prácticamente el mismo tiempo de análisis muestra a muestra, muchos otros
metales pesados en sangre entera (incluyendo el talio y el arsénico) pueden determinarse
simultáneamente con el cadmio, plomo y mercurio.