UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI

CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU

CURSO DE FARMÁCIA

TEMA 1: Teste de Esterilidade

Teste de bacteriostase e fungistase

Fernanda Rocha

Linicene Rosa do Nascimento

Divinópolis, MG

2018
INTRODUÇÃO

Quando se fala em produção de medicamentos e seus insumos,

correlatos, cosméticos e seus adjuvantes, têm importância fundamental o
controle da contaminação para que não se afete a qualidade do produto e,
principalmente, a segurança do paciente, sendo que produtos que contém
contaminantes microbiológicos nem sempre apresentam alterações sensoriais
evidentes (PINTO et al., 2010).

A esterilização é o processo no qual se verifica a destruição, inativação

ou remoção de todas as formas viáveis de microrganismo, incluindo esporos,
fungos, protozoários e vírus, mas não garantir a inativação de endotoxinas
(BAIRD, 2004; Brasil, 2010).

O teste de esterilidade tem como um de seus objetivos, garantir que

qualquer atividade bacteriostática ou fungistática inerente ao produto não tenha
influência adversa sobre a confiabilidade do teste (BRASIL, 2010).

A realização do teste de validação para bacteriostase e fungistase deve

ser feita quando o teste de esterilidade for realizado pela primeira vez para um
produto e sempre que tiver modificações na formulação do produto e/ou nas
condições experimentais do teste. Esta validação deve ocorrer antes do
produto ser submetido ao teste de esterilidade (BRASIL, 2010).

Existem dois métodos nos quais se baseiam os procedimentos para o

teste de esterilidade, que estão descritos a seguir: Filtração em membrana,
onde se transfere o conteúdo do(s) frasco(s) teste em dispositivo de filtração e
adiciona não mais que 100 UFC do microrganismo teste à última alíquota do
fluido estéril utilizado para lavagem da membrana. Inoculação direta, onde o
conteúdo do(s) frasco(s) teste sã transferidos para frascos contendo meios de
cultura e adicionado 100 UFC do microrganismo teste aos meios (BRASIL,
2010).

A análise dos testes é feita pela presença ou ausência de crescimento

microbiológico. Se ocorrer crescimento e este for compatível com o do controle
positivo, mediante condições ideais para o teste; considera-se que a atividade
antimicrobiana foi satisfatoriamente eliminada, e o teste pode ser prosseguido.
Se não foi observado crescimento, ou o mesmo, não foi compatível com o
observado no controle positivo, mediante condições ideais para o teste;
considera-se que a atividade antimicrobiana não foi satisfatoriamente
eliminada, então se deve propor modificações nas condições do teste para
diminuir a atividade, e em seguida repetir o teste de validação (BRASIL, 2010).

No decorrer do período de incubação até o térmico, é preciso avaliar se

houve evidências macroscópicas de crescimento microbiano, para isso devem-
se realizar testes para averiguar se a amostra cumpre o requisito de
esterilidade (BRASIL, 2010).

Algumas condições podem invalidar o teste de esterilidade, são elas:

falha na revisão dos procedimentos analíticos utilizados durante o teste; falhas
nos dados de monitoramento microbiológico da área de realização do teste;
crescimento microbiano observado nos controles negativos, dentre outros
(BRASIL, 2010).

Para realizar a amostragem devem-se utilizar quantidades determinadas

pela monografia individual do produto ou conforme especificado na
Farmacopeia 5ª edição. A quantidade mínima necessária para cada meio de
cultura também é especificado na Farmacopeia.

ESTUDO DE CASO

O teste de esterilidade por filtração por membrana está sendo

desenvolvido para uma pomada oftálmica de cloridrato de oxitetraciclina e
sulfato de polimixina B, cuja composição é: cloridrato de oxitetraciclina, sulfato
de polimixina B, óleo mineral e petrolato branco.

O ensaio para testar a bacteriostase e fungistase do produto foi

realizado segundo o procedimento: o produto foi disperso em miristato de
isopropila (1%) com auxílio de aquecimento (40°C). Em seguida, a mistura foi
filtrada através da membrana e três porções de 200 mL de Fluido de lavagem
III foram utilizadas para lavar a membrana. Na última porção do Fluido de
lavagem, foi adicionado 0,1 mL de suspensão de microrganismo teste contendo
aproximadamente 100 células. A membrana foi inoculada nos tubos contendo
os meios de cultura. Para obtenção dos tubos controle, o mesmo procedimento
descrito anteriormente foi realizado, com exceção da adição do medicamento.
Após o período de incubação, a turvação do meio de cultura dos tubos
contendo a membrana na qual foi filtrado o medicamento foi comparada à
turvação dos tubos controle. Os resultados obtidos estão apresentados nas
tabelas abaixo.
QUESTÕES

3.1 Qual a importância da realização dos controles do ambiente?

O controle do ambiente garante que os resultados obtidos pelo analista, para

os testes de bacteriostase e fungistase, tanto do controle quanto amostral,
sejam realizados por procedimentos e operações adequados para os testes,
através do controle de partículas e fluxo de ar, adequação da paramentação e
higiene do local e funcionários, isso tudo contribui para a diminuição das fontes
de contaminação. (BRASIL, 2010)

3.2 Qual o objetivo do controle negativo da membrana?

Esse controle é realizado para confirmar a ausência de microorganismos na

membrana, na qual será realizado o processo de filtração. Ele avalia também
se o processo de esterilização foi eficiente para eliminar os microrganismos da
membrana (BRASIL, 2010)

3.3 Qual o objetivo do controle negativo do fluido de membrana?

O controle negativo é realizado para confirmar a ausência de crescimento

microbiano nos fluidos e solventes utilizados. Conforme descrito na
Farmacopéia 5ª ed., os fluidos utilizados não devem apresentar atividade
antimicrobiana nas condições do teste.

3.4 Qual o objetivo de utilizar o miristato de isopropila no teste de

esterilidade?
Óleos e soluções viscosas devem ser diluídos em solvente estéril adequado
como, por exemplo, miristato de isoproprila, desde que demonstrado não
possuir atividade antimicrobiana nas condições do teste. A utilização foi para
dispersão do produto que tem caráter lipofílico em diluente aquoso. Entretanto,
a utilização desse solvente deve ser efetuada com critério, uma vez que
apresenta toxicidade para os microrganismos.( BRASIL , 2010; BRUM, 2009;)
3.5 Quais as características que o miristato de isopropila deve possuir
para que possa ser empregado no teste de esterilidade?

O miristato de isoproprila é um solvente estéril, não deve possuir atividade

antimicrobiana nas condições do teste. Ele deve ser esterilizado antes do uso,
por filtração em membrana, e seu extrato aquoso deve apresentar pH não
inferior a 6,5.

3.6 Avalie cada um dos controles realizados - justificar.

Controle do ambiente (contagem de partículas viáveis e totais suspensas no
ar e controle de superfícies - de acordo com a especificação):
Neste caso, é verificado se o ambiente da área de realização do teste
encontra-se adequado para a realização do teste, uma vez que, a
probabilidade de contaminação durante o teste é reduzida.

Controle da membrana (negativo):

Neste caso, é verificado se as membranas utilizadas no teste estão em
condições consideradas adequadas para a realização do mesmo.

Controle do fluido de lavagem (negativo):

Neste caso, observa-se se o fluido de lavagem, o qual será utilizado para
realizar as lavagens da membrana esta em condições adequadas de
esterilidade para tal processo na qual garanti a eficácia do fluido de lavagem
pois não foi observado microrganismo.

Controle negativo dos meios de cultura (fluido tioglicolato e caldo

caseína-soja - negativo):
Neste caso, é possível observar se todos meios de cultura apresentam-se
isentos de microrganismos, ou seja, a condição de esterilidade deve ser
mantida tanto no fluido tioglicolato quanto no caldo caseína-soja comprovando
a eficiência da esterilidade.

Controle positivo dos meios de cultura (fluido tioglicolato e caldo

caseína-soja - positivo):
Neste caso, todos os meios de cultura ao serem contaminados apresentarão
condições de crescimento aos microrganismos, o que inviabiliza obtenção de
resultado falso-negativo durante a realização do teste.

3.7 Parecer em relação ao procedimento para execução do teste de

esterilidade para pomada oftálmica de cloridrato de oxitetraciclina e
sulfato de polimixina B – justificar detalhadamente.
Olhando as tabelas com os resultados referentes à bacteriostase e fungistase
para o meio caldo caseína-soja (tabela 2) podemos ver que no tubo 2 (amostra)
o Bacillus subtilis teve o seu crescimento inibido diante da presença da pomada
oftálmica, uma vez que, não foi verificada a presença de turvação ao comparar
com o tubo 1 (controle). Nos resultados referentes à bacteriostase e fungistase
no fluido tioglicolato (tabela 3) é possível observar que no tubo 2 (amostra) o
Staphylococcus aureus e o Clostridium sporogenes não apresentaram
crescimento diante da pomada oftálmica, o que é verificado devido à ausência
de turvação.
Percebeu-se que a pomada oftálmica apresentou atividade antimicrobiana
contra alguns dos microrganismos, sendo este, um fator capaz de interferir no
resultado do teste de esterilidade. Diante das considerações abordadas é
possível afirmar que o procedimento para execução do teste de esterilidade da
pomada oftálmica de cloridrato de oxitetraciclina e sulfato de polimixina B
houve interferência da amostra, no caldo caseína –soja para o Bacillus subtilis
ATCC 6633 e no fluido tioglicolato para os microorganismos Sthyloccus aureus
ATCC 6538 e Clostridium sporogenes ATCC 1904, essas condições analíticas
mostram que a amostra encontram-se inapropriadas para a realização do teste
de esterilidade pois tem interferente.

3.8 Como farmacêutico responsável pelo controle de qualidade

microbiológico, qual seria sua sugestão para o analista quanto ao
procedimento do teste de esterilidade para a pomada oftálmica de
cloridrato de oxitetraciclina e sulfato de polimixina B – justificar
detalhadamente.
Como farmacêutica, orientaria o analista a aplicar vários procedimentos que
poderiam como por exemplo: fazer uma diluição da amostra ou identificar os
possíveis interferentes e adicionar substâncias que neutralizem os
componentes. Em seguida deve-se realizar o reteste de bacteriostase e
fungistase com a amostra, se todos os tubos do reteste apresentarem turvação
semelhante do controle, só então pode-se continuar a executar os teste de
esterilidade.

REFERÊNCIAS

BAIRD RM. Sterility Assurance: Concepts, Methods and Problems. In Russell,

Hugo & Ayliffe's Principles and Practice of Disinfection, Preservation & Sterilization.
4 ed. Oxford: Blackwell Pub., 2004. p.526-539.

BATISTUZZO, J.A; ITAYA, M; ETO, Y. Formulário Médico-Farmacêutico. São

Paulo/SP: Tecnopress, 4ª Ed. 2011.
BRASIL. Farmacopeia Brasileira. 5ª ed. Brasília: Agência Nacional de Vigilância
Sanitária, 2010. v.1. 546p.
BRUM, Ricardo Cristiano de Souza. Padronização e validação da técnica do Limulus
Amebocyte Lysate (LAL) semi-quantitativa e quantitativa para o biofármaco
alfainterferona 2b humana recombinante. p. 115 , 2009.

PINTO TJA; KANEKO TM; PINTO AF. Controle biológico de qualidade de

produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. 3. Ed. São Paulo: Atheneu, 2010.
780p.