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1.1.INTRODUCCION
Un cambio del color original del medio (morado) hacia amarillo en el fondo indica una
reacción ácida por la fermentación de una pequeña cantidad de glucosa en el medio. Si el
microorganismo produce lisina descarboxilasa, la acción de esta enzima sobre la lisina dará
lugar a la cadaverina, la cual provocará un cambio de pH hacia la alcalinidad dando un
color morado que sobrepasa la acidez debida a la glucosa. Así pues, un fondo amarillo
indica que no se produce lisina descarboxilasa y un color morado que si es producida.
1.2.OBJETIVOS
1.2.1. Objetivos Generales:
Observaremos algunas reacciones bioquímicas relacionadas con la
fisiología bacteriana
1.2.2. Objetivos Específicos:
Aprenderemos su utilización para la identificación de algunos
microorganismos que son capaces de provocar la descarboxilacidon de los
aminoácidos por inducción de enzimas específicas.
1.3.MARCO TEORICO:
1.3.1. Uso:
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente
Salmonella spp., basado en la decarboxilación y desaminación de la lisina y en la
producción de ácido sulfhídrico.
1.3.2. Fundamentos:
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los
nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono
fermentable y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de
la enzima decarboxilasa y deaminasa.
El citrato de hierro y amonio y el tiosulfato de sodio son los indicadores de
la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el
indicador de pH (su color es amarillo a pH igual o menor a 5.2 y violeta a
pH igual o mayor a 6.8) y el agar es el agente solidificante.
Los microorganismos fermentadores de glucosa acidifican el medio y
provocan el viraje del color púrpura al amarillo.
1.3.5. Instrucciones:
Suspender 35 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5 minutos. Calentar
agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolución completa.
Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar y
dejar solidificar en posición inclinada (pico de flauta profundo).
1.3.7. Almacenamiento:
Medio de cultivo deshidratado a 10-35 ºC.
Medio de cultivo preparado a 2-8 ºC.
1.4. PROCEDIMIENTO:
1.4.1. Siembra: A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio y
mediante el uso de aguja de inoculación, inocular el medio de cultivo,
picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del mismo.
1.4.2. Incubación:
En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 18-24 horas.
Decarboxilación de la lisina:
Desaminación de la lisina:
Producción de SH2:
1.5.1. Limitaciones:
1.5.2. Precauciones:
Solamente para uso diagnóstico in vitro. Uso profesional exclusivo.
No utilizar el producto si al recibirlo su envase está abierto o dañado.
No utilizar el producto si existen signos de contaminación o deterioro, así
como tampoco si ha expirado su fecha de vencimiento.
Utilizar guantes y ropa protectora cuando se manipula el producto.
Considerar las muestras como potencialmente infecciosas y manipularlas
apropiadamente siguiendo las normas de bioseguridad establecidas por el
laboratorio.
Las características del producto pueden alterarse si no se conserva
apropiadamente.
Descartar el producto que no ha sido utilizado y los desechos del mismo
según reglamentaciones vigentes.
La fermentación implica un proceso anaeróbico propio del catabolismo (una parte del
metabolismo) que ofrece como resultado la conformación de un compuesto orgánico. Se dice
que este procedimiento es anaeróbico ya que no requiere de oxígeno.
Es importante establecer que este proceso fue descubierto por el químico francés Louis Pasteur
(1822 – 1895), conocido también por haber llevado a cabo importantes avances en el ámbito
de la química y la microbiología tales como la pasteurización o la teoría germinal de lo que son
las enfermedades infecciosas.
2.1.OBJETIVO:
Fermentación de Carbohidratos en Frutas por Bacterias.
2.2.HIPÓTESIS:
La fermentación de carbohidratos por bacterias será más rápida en la
muestra con sacarosa, que en la muestra normal.
2.3.MARCO TEORICO :
La fermentación es un proceso catabólico de oxidación incompleta,
totalmente anaeróbico, siendo el producto final un compuesto orgánico.
Estos productos finales son los que caracterizan los diversos tipos de
fermentaciones. Fue descubierta por Louis Pasteur, que la describió como
la vie sans l´air (la vida sin el aire). La fermentación típica es llevada a cabo
por las levaduras. También algunos metazoos y protistas son capaces de
realizarla. El proceso de fermentación es anaeróbico ya que se produce en
ausencia de oxígeno; ello significa que el aceptor final de los electrones del
NADH producido en la glucólisis no es el oxígeno, sino un compuesto
orgánico que se reducirá para poder reoxidar el NADH a NAD+. El
compuesto orgánico que se reduce (acetaldehído, piruvato) es un derivado
del sustrato que se ha oxidado anteriormente.
2.5.METODOLOGÍA:
2.5.1. MATERIALES:
2 Frascos esterilizados
Espátula
Tamiz
Tiras para medir pH
2.5.2. REACTIVOS:
Jugo de frutas
Saliva
Agua
Sacarosa
2.6.PROCEDIMIENTO:
Prepara el jugo de frutas, licuado y ya previamente lavado
Colocar el jugo en los frascos esterilizados (colando el jugo de frutas)
Medir el pH de la muestra (antes y después del experimento)
Anadir la saliva (enjuagándose la boca en el jugo)
Verter la mitad de la muestra en el otro frasco esterilizado
Añadir a una muestra sacarosa
En cubar por 24 horas a 37°
2.7.RESULTADO:
Antes de encubar
El pH de la muestra del jugo de manzana dio 4
Después de encubar.
2.8.ANTES DE ENCUBAR
IMÁGENES:
DESPUÉS DE ENCUBAR
2.9.CONCLUSIÓN:
En este caso con el experimento de fermentación, en ambas muestras no hubo un
cambio a simple vista, para saber si se fermento más rápido la muestra con sacarosa.
Aunque se sabe que la fermentación con sacarosa sea más rápida.
La prueba de oxidasa es una prueba usada en microbiología para determinar si una bacteria
produce alguna de las citocromo c oxidasas.1 La prueba hace uso de discos impregnados con
el reactivo N,n,n,n-tetrametil-p-fenilendiamina (o TMFD) o N,N-Dimetil-p-fenilendiamina (o
DMFD), el cual también es un indicador redox. El reactivo pasa de azul oscuro a granate al ser
oxidado, y se vuelve transparente al ser reducido. Las bacterias oxidasa positiva poseen
citocromo oxidasa o indofenol oxidasa (una hemoproteína).2 Ambas catalizan el transporte de
electrones de compuestos donantes (NADH) a receptores de electrones (por lo general el
oxígeno). En la prueba, el reactivo TMFD actúa como donante artificial de electrones para la
enzima oxidasa. El reactivo oxidado forma el compuesto coloreado de indofenol azul. El
sistema citocromo esta normalmente presente solo en los organismos aerobios capaces de usar
el oxígeno como aceptor final de hidrógeno. El producto final de este metabolismo puede ser
agua o peróxido de hidrógeno
3.1.PRUEBA DE LA OXIDASA.
Esta prueba esta basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada
citocromoC oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.
Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del
proceso de respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en
la membrana celular bacteriana, en las siguientes lineas se dara una breve
explicación de la cadena respiratoria solo con la finalidad de entender de donde
proviene y que realiza la enzima citocromoC oxidasa, entiendase que todo este
proceso tiene la finalidad de producir ATP.
En la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los
electrones desde sus sustratos hasta llegar al citocromoC, la enzima llamada
citocromoC oxidasa le quita electrones al citocromoC, estos electrones son
transferidos por la enzima al oxígeno siendo este el último aceptor de electrones en
la cadena respiratoria, finalmente debido a que el oxígeno tiene un exceso de
electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando dos posibles productos:
Agua o peróxido de hidrógeno.
3.2.METODOLOGÍA
3.2.1. Siembra
En tubo: a partir de un cultivo puro, hacer una suspensión densa en
0.2 ml de agua destilada estéril, y agregar un disco de OX.
En portaobjetos: humedecer el disco de OX con una gota de agua y
luego colocar sobre él la colonia en estudio. (ésta metodología se
realiza cuando se tiene escaso número disponible de colonias en
estudio).Incubación
Generalmente dentro del minuto, y a temperatura ambiente se
detectan los resultados positivos. Una reacción lenta, pasado los 2
minutos, debe considerarse negativa.
Utilizar como control positivo Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853, y como control negativo Escherichia coli ATCC 25922.
3.3.RESULTADOS
Positivo: observación de color rojo-fucsia en el disco y/o solución.
Negativo: el disco permanece sin cambio de color.
Microorganismo Oxidasa
Pseudomonas aeruginosa +
Neisseria spp. +
Aeromonas spp. +
Vibrio spp.* +
Moraxella +
Familia Enterobacteriaceae -
3.3.1 EJEMPLO
V: metschnikovil y V. gazogenes son oxidasa (-)
Limitaciones
Almacenamiento
Presentación
X 25 Discos B12-403-24
Tetrametil-p-fenilendiamina.
Dimetil-p-fenilendiamina.
Indofenol.
El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil-p-
fenilendiamina al 1%, es el más común y recibe el nombre de reactivo
de Kovacs. Este reactivo se puede impregnar en discos o fragmentos de
papel filtro grueso. En el comercio ya se venden tiras o discos
impregnados con el reactivo.
Fundamento básico: El reactivo de Kovacs es incoloro pero al ponerlo
en contacto con la enzima citocromoC oxidasa cambia a un color morado
debido a que el tetrametil-p-fenilendiamina es una amina aromática y la
oxidación de esta produce quinolonas de color morado-azulado. Para
mayores detalles checa la bibliográfia en especial el libro de Mac Fadin.
3.6.CLASIFICACIÓN
La prueba separa en las posibles cepas Oxidasa positiva u oxidasa negativa.
Oxidasa positiva
Significa que la bacteria si posee citocromo c oxidasa, por lo que puede usar
oxígeno en la producción de energía con una cadena de transporte de
electrones. Un ejemplo de identificación pre-eliminar es la identificación de
los géneros Neisseria y Moraxella, el cual Neisseria es un diplococo y
Moraxella un coco y cocobacilo no fermentador que puede confundirse con
Neisseria y los dos son Gram-negativosoxidasa positiva. Muchos Gram-
negativos, como los bacilos curvados como Helicobacter pylori, Vibrio
cholerae y Campylobacter jejuni son oxidasa positiva.
Oxidasa negativa
Las enterobacterias son las típicas oxidasa negativa.4 El que no la poseen
significa que no puede usar el oxígeno en la cadena de transferencia de
electrones o aplican una citocromo diferente para transferir electrones al
oxígen
3.8.MODO DE EMPLEO
Transferir una colonia bien aislada sobre la zona cuadrada de la tira, bien
tocándola directamente o bien con un asa de siembras (de platino, plástico
o madera, nunca de nicrom).
Esperar 30 segundos.
Observar el color de la zona inoculada. La aparición de un color azul oscuro
indica prueba positiva. La ausencia de viraje evidente en los primeros 30
segundos indica prueba negativa, sin duda. Atención, existen cepas oxidasa-
lentas (1 minuto) de Pseudomonas y de Legionella.
Eliminar las tiras usadas mediante autoclavado, incineración o inmersión
prolongada (más de 6 horas) en un desinfectante.
3.9.CONTROL DE CALIDAD
Realizar el control de calidad, con una colonia de Pseudomonas aeruginosa MKTA
9027, que servirá como control positivo, y con una colonia de cualquier
Enterobacteriacea, por ejemplo Escherichia coli MKTA 25922, que servirá como
control negativo. NOTA: La última revisión de Bergey separa a otros géneros
algunas especies de Pseudomonas oxidasa variables. Para éstas, realizar una prueba
O/F (MICROKIT BCT812), ya que siguen siendo oxidativas no fermentadoras.
Un antibiótico, considerando la etimología es una sustancia química producida por un ser vivo
o derivado sintético, que mata o impide el crecimiento de ciertas clases de microorganismos
sensibles, generalmente son fármacos usados en el tratamiento de infecciones por bacterias, de
ahí que se les conozca como antibacterianos.
Los antibióticos se utilizan en medicina humana, animal y horticultura para tratar infecciones
provocadas por gérmenes. Normalmente los antibióticos presentan toxicidad selectiva, siendo
muy superior para los organismos invasores que para los animales o los seres humanos que los
hospedan, aunque ocasionalmente puede producirse una reacción adversa medicamentosa,
como afectar a la flora bacteriana normal del organismo. Los antibióticos generalmente ayudan
a las defensas de un individuo hasta que las respuestas locales sean suficientes para controlar
la infección Un antibiótico es bacteriostático si impide el crecimiento de los gérmenes, y
bactericida si los destruye, pudiendo generar también ambos efectos, según los casos.
4.1.MECANIMO DE ACCION:
Debido a que los antibióticos tienen efectos sobre una diversidad de bacterias, sus
mecanismos de acción difieren basados en las características vitales de cada
organismo y que, por lo general, son objetivos que no existen en las células de
mamíferos.
4.3.INHIBIDORES DE ß-LACTAMASAS:
Estos fármacos se fijan a las ß-lactamasas bacterianas inactivándolas, evitando así
la destrucción de los antibióticos ß-lactámicos por dichas enzimas. A su vez, deben
estar asociado en forma fija a otros ß-lactámicos, dado que carecen de acción
antimicrobiana intrínseca (Amoxicilina + Ácido Clavulánico, Ampicilina +
Sulbactam). Los inhibidores de las ß-lactamasas tienen mayor eficacia contra las ß-
lactamasas codificadas por plásmidos que aquellas de tipo cromosómico.