BACTERIOLOGÍA GENERAL

PRÁCTICA CODIGO 602003M

GUÍA DE LABORATORIO No 6
1. TEMAS: ELABORACIÓN DE ANTIBIOGRAMAS - MÉTODO DE KIRBY - BAUER

1.1. OBJETIVOS
1.1.1. Adquirir destreza en la realización de un antibiograma por el método de difusión en disco.
1.1.2. Reconocer los requerimientos de control de calidad al realizar el antibiograma por el método de
difusión en disco.
1.1.3. Leer e interpretar el antibiograma según el aislamiento.
1.1.4. Reconocer los fenotipos de resistencia presentes al interpretar un antibiograma.

1.2. FUNDAMENTO
Los métodos ​in vitro ​de la evaluación de la sensibilidad a los antimicrobianos​, están indicadas para
cualquier bacteria que contribuya a un proceso infeccioso que requiera la administración de tratamiento
antimicrobiano, siempre que su sensibilidad no pueda predecirse a partir de la identificación del
microorganismo. Las pruebas de susceptibilidad se indican sobre todo, cuando se sospecha que el
microorganismo causal pertenece a una especie que es capaz de presentar resistencia a los agentes
antimicrobianos usados comúnmente. Como estos tipos de métodos pueden estar influenciados por
factores ambientales, se han estandarizado para garantizar unos resultados reproducibles y repetibles.

En América, la organización internacional: el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; Instituto
de Estándares Clínicos y de Laboratorio de los Estados Unidos) promueve la formulación y aplicación de
normas y recomendaciones actualizadas para las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos, las
cuales son de consenso voluntario. Estas condiciones estandarizadas son: tamaño del inóculo
bacteriano, medio de crecimiento, pH, concentraciòn de cationes, suplementos de sangre y suero,
contenido de timidina, atmósfera de incubación, temperatura de incubación, tiempo de incubación y
concentraciones de antimicrobianos probados. A pesar de que las condiciones son estandarizadas, se
presentan algunos factores limitantes relacionados con la falta de correlación entre las condiciones de la
prueba ​in vitro y el contexto ​in vivo,​ por tanto un resultado de una prueba de sensibilidad no es predictivo
del resultado de su uso terapéutico. Las limitaciones pueden relacionarse con la difusión del antibiótico en
los tejidos, la unión de los antibióticos a proteínas del suero, presencia de interferencias e interacciones
farmacológicas, respuesta inmune del huésped, enfermedades concomitantes, virulencia, patogenicidad
de la bacteria infectante, la localización y gravedad de la infección.

Se disponen de tres mètodos para evaluar la resistencia: i) los que miden directamente la actividad de los
antimicrobianos, ii) los que detectan directamente la presencia de un mecanismo de resistencia, iii) los
métodos que miden las interacciones entre el antimicrobiano y el microorganismo.

1.2.1. Métodos que miden directamente la actividad de los antimicrobianos:

Requieren que los antimicrobianos y la bacteria infectante se coloquen en el mismo medio ​in vitro​. Esta
medición directa se realiza con métodos de sensibilidad convencional, sistemas comerciales y pruebas
especiales para tamizaje e indicadoras. Los métodos conocidos son: i) antibiograma por dilución (puede
ser dilución en agar o en medio líquido) y ii) antibiograma por difusión en agar.
El antibiograma por dilución permite cuantificar la sensibilidad del microorganismo frente a diferentes
concentraciones del antibiótico determinando la concentración más baja del antimicrobiano que es capaz
de inhibir el crecimiento visible de la bacteria.

1
 El antibiograma por difusión en agar es el más conocido y es el método cualitativo de referencia
mundialmente aceptado, fue el primer método estandarizado por Anderson y más adelante se aprobó el
de Kirby – Bauer. Ambos han sido acogidos. Se ha utilizado para microorganismos comúnmente aislados
y de crecimiento rápido que demuestran una tasa de crecimiento consistente cuando se cultiva en
condiciones estandarizadas. El medio de cultivo que se considera óptimo para realizar estas pruebas
para la mayoría de las bacterias es el Agar Müeller Hinton. La estandarización del método ha permitido
realizar controles exactos de calidad y establecer comparaciones válidas de resultados entre los
diferentes laboratorios que utilizan este procedimiento. Aunque esta técnica es sólo cualitativa, constituye
un medio simple y asequible a la mayor parte de los laboratorios clínicos.

1.2.2. Métodos que detectan directamente la presencia de un mecanismo de resistencia

Se puede realizar mediante pruebas fenotípicas o genotípicas. Las pruebas fenotípicas más comunes son
la detección de betalactamasas y con menor frecuencia la detección de cloranfenicol acetiltransferasa.
Las pruebas genotípicas se pueden realizar cuando son conocidos los genes que codifican los
mecanismos de resistencia.

1.2.3. Métodos que miden las interacciones entre el antimicrobiano y el microorganismo.

Son pruebas diseñadas para determinar la actividad bactericida de los agentes antimicrobianos o para
determinar el efecto antibacteriano de antimicrobianos usados en combinación.

1.3. MATERIALES Y REACTIVOS

Traer por estudiante:

Unas gafas de protección antisalpicaduras, dos pares de guantes de látex desechables, un tapabocas, un
lápiz de cera color blanco, una lupa, una regla, un trapo de tela de 15 cm x 15 cm y 10 toallas
desechables.

Materiales y Equipos suministrados por la Escuela

Aislamientos de ​Proteus mirabilis 18 asas de punta
18 caldo tripticasa Sensidiscos
9 Frascos de descarte con hipoclorito 1% 18 pinzas
400 ml de alcohol para mecheros Antibiogramas para demostración
Escobillones estériles 18 gradillas de icopor
Estándar de McFarland #.0,5 6 Encendedores
18 Mecheros con alcohol

1.4. PROCEDIMIENTO
Deben trabajar en grupos de 3 estudiantes, el profesor le proporcionará para su práctica:
a. Medios de cultivo: 3 agar Mueller Hinton sembrar los sensidiscos indicados por el profesor
b. Un aislamiento de ​Proteus mirabilis
c. Una placa de 96 pozos para la lectura del MIC de un microorganismo
Ir al laboratorio el día miércoles a las 11am, para realizar la siembra masiva en el agar Mueller Hinton

1.4.1. Alistamiento del trabajo

● Agruparse para trabajar tres estudiantes
● Verificar que se encuentra el área de trabajo limpia, organizada y desinfectada.
● Etiquetar los medios de cultivo a inocular:agar Mueller Hinton

2
● Alistar material para la prueba: escobillones estériles e inóculo
1
1.4.2. Siembra en agar Mueller Hinton

1.4.2.1. Preparación del inóculo bacteriano.

a. Con el asa de punta, previamente esterilizada en el mechero, toque tres o cuatro colonias de
apariencia similar de un cultivo puro.
b. Transfiera las colonias a un tubo que contenga 1 a 3 ml. de caldo Tripticasa Soya si parte de un
cultivo con más de 24 horas de incubación o en solución salina si parte de un cultivo con menos
de 24 h de incubación.
c. Incube el tubo de Tripticasa Soya ( 35 – 37º C) hasta que tenga la turbidez del Estándar de
McFarland # 0.5. Alternativamente, ha empleado solución salina, haga suspensión directa hasta
lograr la turbidez del estándar de McFarland # 0.5.
d. Compare la turbidez del inóculo con el estándar. Debe hacerlo observando una línea negra a
través de los dos tubos. Cuando se vea con la misma nitidez en ambos tubos, el inóculo tendrá la
turbidez necesaria. (Figura. 1)
e. Descarte la suspensión si no es empleada dentro de los 15 a 20 minutos después de la
preparación.

Figura 1​: Patrón de líneas para comparar turbidez

Nota​: Es importante que el inóculo sea puro, es decir, que la colonia seleccionada no esté mezclada con
otras colonias de bacterias diferentes.

1.4.2.2. Inoculación del Agar Müeller Hinton.

a. Deje que la placa de agar alcance temperatura ambiente
b. El número placas requeridas por aislamiento bacteriano depende del número de antibióticos que
se debe probar de acuerdo al germen y al sitio de aislamiento de éste.
c. La superficie de la placa de agar debe estar seca antes de hacer el rayado. Si observa humedad
ponga las placas a 35°C antes de la inoculación. Tampoco deben observarse signos de desecación en
los agares.
d. Tome un escobillón estéril e introdúzcalo en el inóculo preparado en el caldo Tripticasa o en la
solución salina. Retire el exceso de líquido presionando el escobillón en las paredes del tubo por encima
de la superficie del líquido.
e. Con el escobillón inclinado, con respecto a la superficie del medio, haga la siembra realizando
estrías en tres direcciones, sin dejar espacios entre las estrías y sin hacer dos veces la misma estría.
(Fig. 2). Estos se hace para lograr obtener un crecimiento confluente. Se recomienda emplear
escobillones de algodón con mango de madera para este procedimiento, los escobillones de materiales
sintéticos no toman suficiente líquido para rayar la superficie del la placa de agar. Se recomienda que no
se usen escobillones con mangos plásticos pues pueden crear salpicaduras al intentar escurrir el exceso
de líquido en el tubo, esto crea un riesgo biológico.
f. Repita el procedimiento usando un nuevo escobillón para cada placa de agar adicional que se
necesite

1
Se siguen recomendaciones del CDC (​http://www.cdc.gov/std/Gonorrhea/arg/B88-Feb-2005.pdf​) y del Manual De
Determinación Antibiótica En Hospitalaria. Procedimientos Para La De Susceptibilidad Patógenos De Importancia 2012. INAS.
Colombia
3
g. Deje secar la placa de agar estriada a temperatura ambiente por 3 a 5 minutos (pero no más de
15 min) para que la humedad se absorba sobre el medio. La superficie del agar debe estar seca antes de
poner los discos.

1.4.2.3. Disposición de los sensidiscos

a. Seleccione los discos que va emplear dependiendo del microorganismo y sitio de aislamiento de
éste
b. Tome los discos de cada tubo con una pinza estéril
c. Asegurándose de que queden a igual distancia del borde que de otro disco y que la distancia
2
mínima de centro a centro de disco no sea inferior a 24mm
d. No se deben poner más de 12 discos en cajas de agar de 150 mm y no más de 6 discos en cajas
de 100 mm​4​. Si se llega a caer en una parte diferente de la superficie del agar debe dejarlo ahí y no
recogerlos y colocarlos nuevamente.
e. Con la ayuda de la pinza, presione ligeramente sobre el disco para asegurar un contacto
uniforme entre el disco y el agar. Colóquelos suavemente sobre la superficie del agar, siguiendo la
distribución de la figura. 3.

Figura. 2: ​Direcciones en la que se debe hacer el rayado de la placa de agar

g. Incube las cajas durante 16 a 24 horas a 35 – 37º C.

h. Lea con una regla los diámetros de los halos de inhibición

1.5. INTERPRETACIÓN

1.5.1. Lectura de las zonas de inhibición en agar Mueller Hinton

Después de la incubación, realizar la lectura de las zonas de inhibición del crecimiento bacteriano que
aparecen como halos alrededor de aquellos discos que hayan logrado inhibir.
a. Mida con una regla el diámetro de cada halo.
b. ​Compare los resultados con los de la tabla de interpretación de los halos de inhibición de las guías
CLSI 2018.
c. En esta tabla se encuentran las cinco categorías de interpretación:
R: Resistente
I: Intermedio
NS: No sensible
S: Sensible
SDD: sensible dosis dependiente

1.5.2. Lectura de la Concentración mínima inhibitoria en caldo Mueller Hinton

Buscar los antibióticos en la tabla de interpretación de los halos de inhibición de las ​Enterobacteriaceae

2
​Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility test. m02a12e. 2018. vol 35. Num 1. pag 22.
4
en el documento del CLSI 2018, con el fin de determinar la categoría de interpretación.

AXO AXO AXO AXO AXO AZT AZT AZT AZT AZT TGC POL
1 2 4 8 16 2 4 8 16 32 0,5 0,5

TAZ TAZ TAZ TAZ TAZ P/T4 P/T5 P/T6 P/T7 P/T8 TGC POL
1 2 4 8 16 8/4 16/4 32/4 64/4 128/4 1 1

FOT FOT FOT FOT FOT F/S2 F/S3 F/S4 F/S5 F/S6 TGC POL
1 2 4 8 16 8/4 16/4 32/4 64/4 128/4 2 2

FEP FEP FEP FEP FEP FEP AMI AMI AMI AMI TGC POL
1 2 4 8 16 32 8 16 32 64 4 4

ETP ETP ETP ETP ETP ETP ETP ETP ETP ETP TGC POL
0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 8 8

IMI IMI IMI IMI IMI IMI IMI IMI IMI IMI CIP CIP
0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 0,5 4

MERO MERO MERO MERO MERO MERO MERO MERO MERO MERO CIP CIP
0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 1 8

DORI DORI DORI DORI DORI DORI DORI DORI DORI DORI CIP POS
0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 2 QC

1.6. TABLA DE RESULTADOS

a. Complete el siguiente cuadro acerca de la lectura del antibiograma

antibiótico
Di Diámetro Categoría de
sc
Clasificación  grupo/  Nombre   Concentraci de la zona interpretación del
o del  categoría  ón del disco  de halo de inhibición
# antibiótico  inhibición
en mm
1
2
3
4
5
6

b. Realizar un dibujo donde represente los resultados de la prueba confirmatoria de resistencia por el
método de difusión en disco.

5
c. Complete el siguiente cuadro acerca de la lectura de la Concentración mínima inhibitoria en caldo
Mueller Hinton
Antibiótico Categoría de
MIC en ug/ml interpretación del
abrevi Clasificación grupo/Cat Nombre resultado
atura egoría
AXO ceftriaxona
AZT aztreonam
TAZ ceftazidima
FOT cefotaxima
FEP cefepime
ETP meropenem
IMI imipenem
MERO meropenem
DORI doripenem
CIP ciprofloxacina

d. Realizar un dibujo donde se represente los resultados de la CIM para el antibiótico Tigeciclina (TGC),
por el método de macrodilución.

e. Realizar un dibujo donde se represente los resultados de la CIM para el antibiótico cefepime (FEP), por
el método de epsilometría o E-test.

1.7. AMPLIACIÓN DE TEMA

❖ Mencione tres semejanzas y dos diferencias entre los métodos del antibiograma por dilución.
❖ Mencione tres semejanzas y dos diferencias entre los métodos dilución en medio líquido y
difusión en agar.
❖ Mencione dos falsas sensibilidades y dos falsas resistencias por el uso de cultivo Mueller Hinton.
❖ Mencione dos causas de error si no se utiliza el inóculo correspondiente a McFarland #0,5.
❖ De acuerdo al documento del CLSI, conteste las siguientes preguntas:
- ¿Qué significan las categorías: Resistente, Intermedio, No sensible, Sensible y sensible dosis
dependiente.

6
 - ¿Cuáles antibióticos no deben ser reportados de rutina para aislamientos de bacterias de líquido
cefalorraquídeo a pesar de que se observen como sensibles en el antibiograma? ¿Porque?
- Mencione un ejemplo de un microorganismo que debe ser confirmado por discrepancia entre la
identificación y la susceptibilidad antimicrobiana..
- Si está trabajando la bacteria ​Proteus mirabilis a partir de una muestra de orina, cuáles serían las
condiciones que necesitaría para el medio, el inóculo y la incubación.
- Si está trabajando la bacteria ​Staphylococcus aureus a partir de una muestra de secreción ocular,
cuáles serían las condiciones que necesitaría para el medio, el inóculo y la incubación.
- Si está trabajando la bacteria ​Bacillus cereus a partir de un hemocultivo, cuales serían las
condiciones que necesitaría para el medio, el inóculo y la incubación.
- En la tabla de resistencias naturales del CLSI, se encuentran los tres microorganismos ​Proteus
mirabilis, Staphylococcus aureus y Bacillus cereus . Si es afirmativo, mencione los antibióticos a
los cuales es resistente natural y clasifique los antibióticos según el mecanismo de acción.
- Al observar la tabla de pruebas de tamizaje y confirmatorias de resistencia del CLSI, encuentra
que hacen referencia a los tres microorganismos ​Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus y
Bacillus cereus​ . Si es afirmativo, mencione cómo se llaman estas pruebas.
- Ubíquese en la tabla de la familia Enterobacteriaceae y empleado los halos de inhibición que se
observan en la figura 3, determine la sensibilidad del microorganismo ​Proteus mirabilis . ​Asuma
que el disco #1 es el de las 12 y el #6 es el del centro.
  antibiótico     
Di Clasificación  grupo/  Nombre   Concentraci Diámetro  Categoría de 
s del  categoría  ón del disco  de la zona  interpretación del 
c antibiótico  de  halo de inhibición
o  inhibición 
# en mm
1 ampicilina
2 cefazolina
3 gentamicina
4 tobramicina
5 imipenem
6 cefotaxima.
Figura. 3: ​Patrón de distribución de los discos sobre la placa de agar

7
❖ ¿Cree Usted que se puede realizar una prueba de susceptibilidad directamente de una muestra
clínica de un paciente? Explique.
❖ ¿Cómo se prepara el estándar de McFarland que se emplea en esta práctica? especifique
reactivos, concentraciones y metodología.
❖ Al obtener el reporte de un urocultivo en la parte inferior, menciona que fenotipos de resistencia
podría encontrar tomando como base el documento del CLSI, qué pruebas confirmatorias realizaría
y como se interpreta el resultado de estas pruebas. Realizar ​un dibujo donde se represente los
resultados de la prueba confirmatoria de resistencia por el método de difusión en disco

Microorganismo aislado : Escherichia coli. Recuento de colonias: >1 x 10​5​ UFC/ml

Antibiótico MIC interpretación Antibiótico MIC interpretación

Amp/sulbactam 16/8 I Cefepime ≥16 R

Amox/clavulánico ≥32/16 R Doripenem 2 I

Ampicilina >32 R Ertapenem ≤0,5 S

Aztreonam ≤4 S Nitrofurantoína ≤32 S

Ceftriaxona ≥4 R Gentamicina ≤4 S

Ceftazidima ≥16 R Meropenem ≤1 S

Cefotaxima ≥4 R Pip/Tazo ≤16/4 S

Cefoxitina ≤8 S Fosfomicina ≤64 S

Cefazolina ≥32 R Trimet/Sulfa ≤2/38 S

Ciprofloxacina 2 I Tobramicina ≤4 S

1.8. Nota final del laboratorio

El pre informe tiene un peso del 20%, el desarrollo del laboratorio un peso del 30% y el informe tiene un
peso del 50%.
RECOMENDACIONES PARA LA PRESENTACIÓN DEL PREINFORME E INFORME
Los documentos deben entregarse en el campus virtual en el link habilitado.
PREINFORME (20%) se entrega individual
El objetivo de realizar el preinforme es que tengan los conceptos básicos previos que le permiten abordar
la práctica de laboratorio.
● La fecha límite de entrega = 9 de mayo de 2018. No se reciben informes después de finalizada la
fecha de entrega.

8
● Deben presentarse de acuerdo a las normas ICONTEC, donde se especifique la ampliación de
tema y la bibliografía. La ampliación de tema (máximo 1500 palabras) y la bibliografía consultada escrita
con normas APA (mínimo dos referencias que no sean webgrafía)..
● Cualquier intento de fraude es considerado como una calificación de 0,0 y será penalizado de
acuerdo al reglamento estudiantil.
● Evaluación:

Item y peso ponderado PREINFORME

1) Cumplimiento (20%)
2) Sigue las normas recomendadas (Icontec u
otras) (10%)
3) Redacción y capacidad de síntesis(30%)
4) Ortografía y gramática(10%)
5) Citación Bibliográfica (10%)
6) Profundidad de la revisión bibliográfica (20%)

✓ INFORME (50%) se entrega en grupos de trabajo

● La fecha límite de entrega = hasta el 2 de mayo de 2018. No se reciben informes después de
finalizada la fecha de entrega.
● Deben presentarse de acuerdo a las normas ICONTEC, donde se especifique una breve
introducción (máximo 300 palabras), los resultados obtenidos, las conclusiones y la bibliografía
consultada escrita con normas APA (mínimo dos referencias que no sean webgrafía). (La
introducción debe ser diferente a la que se registra en la guía de laboratorio) (el número de
conclusiones debe ser acorde al número de objetivos propuestos para la práctica)

● Cualquier intento de fraude es considerado como una calificación de 0,0 y será penalizado de
acuerdo al reglamento estudiantil.
● Evaluación:

Item y peso ponderado INFORME

1) Introducción (20%)
2) Sigue las normas recomendadas (Icontec u
otras) (10%)
3) Redacción y capacidad de síntesis(20%)
4) Ortografía y gramática(10%)
5) Citación Bibliográfica (10%)
6) Profundidad de la revisión bibliográfica (15%)
7) Cumplimiento (15%)
✓
✓ Desarrollo de la práctica (20%)
0 = No se presenta a la práctica
2,5 = Llega tarde a la práctica o no presenta un comportamiento adecuado
5,0 = Cumple con todos los objetivos planteados para la práctica

9
 ✓ Bioseguridad durante el desarrollo de la práctica (10%)
0 = No sigue las normas de bioseguridad recomendadas
2,5 = sigue parcialmente las normas de bioseguridad recomendadas
5 = Sigue totalmente las normas de bioseguridad recomendadas

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