UNPRG-FCCBB: Manual de Prácticas de Microbiología del Suelo

PRÁCTICA 4
EFECTO ANTAGÓNICO DE Streptomyces spp. FRENTE A Fusarium
verticillioides CAUSANTE DE PUDRICIÓN EN Zea mays L.
1. Introducción
Los actinomicetos son microorganismos ubicuos, que se encuentran en la mayoría de
sustratos naturales, ampliamente distribuidos en hábitats diferentes: suelo, agua marina, agua
dulce, aire, estiércol, fango de los ríos y fondo de los lagos. Son saprófitos y algunas especies
producen enfermedades a las plantas, animales domésticos e incluso al hombre. Se encuentran
en casi todos los tipos de suelo y bajo condiciones extremas disminuyen levemente la
concentración de su población. Su número varía en gran proporción según el caso, pero es
común encontrarlos en suelos fértiles en una concentración de 106 ufc g-1 de suelo seco
(Balakrishna et al., 2012).

Los actinomicetos como Streptomyces spp. son considerados como rizobacterias

promotoras de crecimiento en plantas (PGPR), a través de mecanismos directos e indirectos
(Stechman, 2011; Cabrera & Paredes, 2013; Núñez & Vásquez, 2013; Infante & Zurita, 2013;
Aguilar & Deza, 2014; Julón, 2014; Paredes, 2014). Streptomyces junto a Bacillus y
Pseudomonas son considerados los más eficaces en el control de enfermedades radiculares y
foliares de plantas (Fernández & Vega, 2001). Las PGPR promueven el control biológico a
través de la competencia por un nicho ecológico o por nutrientes, interacción directa con el
patógeno (parasitismo y lisis enzimática), antibiosis, producción de sideróforos e inducción de
resistencia sistémica en las plantas (Hernández et al., 2006; Bhattacharyya & Jha, 2012).

Las especies de Streptomyces son cualitativa y cuantitativamente importantes en la

rizósfera y pueden colonizar las raíces en presencia de la microbiota nativa. Algunos
Streptomyces son aislados de semillas, hojas, tubérculos e inclusive existen estreptomicetos
endofíticos, que colonizan en nichos ecológicos similares a los fitopatógenos. Estos
microorganismos que se establecen y multiplican en las raíces son ideales por su antagonismo
como agentes de biocontrol de hongos y bacterias fitopatógenas. Streptomyces canescens, S.
citreofluorescens, S. hygroscopicus, S. lydicus, S. violaceusniger y S. griseoviridis, además
de tener capacidad para colonizar la superficie vegetal, presentan mecanismos de antibiosis,
degradación de fitotoxinas, síntesis de proteínas extracelulares, como quitinasas y glucanasas,
que degradan el constituyente mayoritario de las paredes celulares de la mayoría de hongos,
además de la producción de sideróforos e inducción de resistencia en las plantas, propiedades
asociadas a su capacidad para controlar fitopatógenos como Verticillium spp., Alternaria
brassicicola, Botrytis cinerea, Fusarium avenaceum, F. culmorum F. oxysporum, Pythium
debaryanum, Phomopsis sclerotioides, Rhizoctonia solani y Sclerotinia sclerotiorum
(Doumbou et al., 2002; Franco, 2008).

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Fusarium moniliforme, sin. F. verticillioides (Sacc.) Nirenberg Tel. Gibberella fujikuroi

(Sawada) Wollenweber es el parásito mayoritario de gramíneas, particularmente en las
regiones tropicales y subtropicales. Causa quemado de las plántulas, pudrición del tallo y
frutos y se puede aislar de semillas (García & Martínez, 2010) de raíz y tallos infectados
(Figueroa et al., 2010). Otros hongos causantes de pudrición de tallos son F. subglutinans,
F. heterosporum, F. equiseti, F. reticulatum, F. graminearum, F. poae, F. sporotrichioides y
F. proliferatum. F. verticillioides coloniza el maíz durante todo el ciclo vegetativo de las
plantas, incluyendo raíz, tallo, mazorca y semillas; sin embargo, la infección es asintomática y
el hongo puede ser trasmitido por semillas a las plántulas, pudiendo o no desarrollar una
infección sistémica. Este hongo aparece como una coloración salmón pálido en el pedicelo o
casquete de la punta de los granos y eventualmente los granos infectados muestran un
crecimiento de moho pulverulento de color rosáceo, compuesto por un gran número de
conidias. F. verticillioides penetra cerca de la corona de la planta o través de los nudos. Las
plantas afectadas toman color café y los tejidos se reblandecen en la parte inferior del tallo,
conforme avanza la enfermedad, el patógeno se distribuye en el tejido medular y solo quedan
en el tallo las fibras de los vasos que conducen el agua (Mendoza et al., 2006).

Las bacterias del género Streptomyces pueden sobrevivir como esporas, por lo que se
consideran apropiadas para la formulación de productos viables y estables de uso en la
agricultura. En este contexto, deben ser investigadas en tres etapas: aislamiento y
caracterización de cepas potencialmente PGPR; ensayos de efectividad sobre el crecimiento
vegetal en invernadero y en campo y establecimiento de técnicas para la reproducción masiva
que permitan su introducción en la práctica agrícola.

2. Objetivos
2.1 Aislar Fusarium verticillioides de tallos o mazorcas de maíz.
2.2 Aislar actinomicetos de suelo rizosférico de maíz.
2.3 Identificar el género Streptomyces.
2.4 Determinar antagonismo de Streptomyces frente a F. verticillioides.

3. Metodología
3.1 Aislamiento e identificación de F. verticillioides
En campos comerciales de maíz donde se observen síntomas de pudrición de tallo y de
la mazorca (Figura 1), colectar cinco tallos y aleatoriamente cinco mazorcas recién
cosechadas en el campo. Para el aislamiento de hongos (Ríos & Zúñiga, 2012), lavar los tallos
con agua de caño para eliminar el suelo adherido. Después, en asepsia cortar en fragmentos de
aproximadamente 1 cm, depositarlos en un vaso de precipitación, adicionar 40 mL de
hipoclorito de sodio comercial 10 % (v/v) y homogenizar el contenido con movimientos
rotatorios durante 2 minutos. A continuación, eliminar el sobrenadante y enjaguar con 50 mL
de agua destilada esterilizada. Por su parte, seleccionar 50 granos de maíz aleatoriamente
(García & Martínez, 2010) desinfectarlos superficialmente con hipoclorito de sodio comercial
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al 1 % (v/v) durante 1 minuto (Figura 2) y enjuagarlos dos veces consecutivas con 50 mL

agua destilada esterilizada (1 minuto por enjuague).

Finalizada la desinfección, secar los fragmentos de tejido vegetal y semillas de maíz

sobre papel filtro esterilizado y luego depositarlos en número de seis, dispuestos radialmente
sobre placas de Petri con agar papa dextrosa (PDA) más cloranfenicol (Figura 3). Después de
la incubación a 30 ºC, hasta por 7 días, fragmentos de los micelios desarrollados (Figuras 4,5),
se cultivarán en viales con PDA, se incubarán a 30 ºC, por 4 días y constituirán los cultivos
puros de hongos, que serán guardados en refrigeración. Realizar la identificación de los
hongos fitopatógenos (Figuras 6, 7 8,9) según las claves de Barnett y Hunter (1998).

3.2 Aislamiento de actinomicetos

Para el aislamiento de actinomicetos (Franco, 2008), tomar 10 g de una muestra de
suelo rizosférico previamente homogenizada, adicionar 90 mL de agua peptonada al
0,1 % p/v y agitar durante 20 minutos, para obtener una suspensión del suelo o dilución 10-1,
con la que se realizará una dilución adicional, 10-2 . De esta última dilución tomar una alícuota
y sembrar por agotamiento y estría en agar avena, incubar a 30 ºC, hasta por 5 días y
seleccionar las colonias típicas de actinomicetos, teniendo en cuenta la textura, coloración del
micelio aéreo y de sustrato, forma y tamaño de las colonias y la producción de pigmentos. A
continuación, agrupar las colonias según sus características y seleccionar una representativa
de cada grupo, para su posterior siembra en viales con agar avena durante 72 horas,
constituyendo los aislados de actinomicetos nativos, que se guardarán en refrigeración a 8 ºC.

3.3 Identificación del género Streptomyces

Para la identificación de Streptomyces spp. realizar la caracterización morfológica de los
actinomicetos nativos. En la caracterización morfológica macroscópica (Franco, 2008),
observar las colonias desarrolladas en agar avena durante 5 días y reconocer la textura,
coloración del micelio aéreo y de sustrato, producción de pigmentos difusibles en el medio de
cultivo y olor característico a suelo húmedo.
Para la caracterización morfológica microscópica (Gómez & Yarlaqué, 2013), sembrar
las colonias de actinomicetos en agar avena y al mismo tiempo introducir en el medio de
cultivo cuatro cubreobjetos esterilizados, dispuestos con una inclinación de 45º respecto a la
superficie del agar (Figura 10). Incubar a 30 ºC, durante 5 días y después retirar los
cubreobjetos y colocarlos sobre una lámina portaobjetos con cristal violeta, para la
identificación del género Streptomyces por la morfología de sus esporóforos: no espiralados,
con espirales primitivos y con espirales abiertos o cerrados. Para su mantenimiento, cultivar
Streptomyces spp. en viales con agar avena, durante 72 horas y luego llevar a refrigeración
(8 ºC), realizándose subcultivos cada 30 días (Franco, 2008).

3.4 Prueba de antagonismo

Para la prueba de antagonismo utilizar la técnica de enfrentamiento en “cultivo dual”
(Fernández & Vega, 2001). Sembrar cada bacteria masivamente en el extremo de una placa de
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Petri con PDA, ocupando aproximadamente un cuarto del área total e incubar a 30 ºC, por 72
horas. A continuación, depositar un fragmento del hongo fitopatógeno en el extremo de la
placa opuesto al de la bacteria e incubar a 30 ºC, hasta que el patógeno detenga su crecimiento
(Figura 11). Después de 5 días medir el radio de la colonia del hongo fitopatógeno y comparar
con una placa testigo para determinar si el crecimiento fúngico es afectado por Streptomyces
spp. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición del crecimiento respecto al
testigo. La prueba de antagonismo también se puede realizar con hongos causantes de
chupadera fungosa: Fusarium spp. y Rhizoctonia solani, aislados de Lycopersicon
esculentum MilL. “tomate” con chupadera fungosa (Figuras 12 a 22) o pudrición radicular.

Figura 1. Tallo y mazorca de Zea mays L. con síntomas de pudrición por Fusarium
verticillioides.

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Figura 2. Desinfección de granos de Zea mays L. con hipoclorito de sodio.

Figura 3. Siembra de granos de Zea mays L. en agar papa dextrosa más cloranfenicol.

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Figura 4. Colonias de hongos filamentosos desarrollados en agar papa dextrosa más

cloranfenicol.

Figura 5. Observación macroscópica de la colonia de Fusarium verticillioides.

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Figura 6. Observación microscópica (400x) de microconidias de Fusarium

verticillioides.

Figura 7. Observación microscópica de macroconidia de Fusarium verticillioides.

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Figura 8. Observación microscópica de hinchamiento de la hifa de Fusarium

verticillioides.

Figura 9. Cultivo de Fusarium verticillioides aislado de granos de Zea mays L.

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Figura 10. Actinomicetos cultivados en agar avena para la caracterización

microscópica de las células.

a b

Figura 11. Antagonismo de Streptomyces sp. y F. verticillioides (a) y control (b).

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Figura 12. Lycopersicon esculentum Mill. con síntomas de chupadera fungosa.

Figura 13. Siembra de fragmentos de tejido vegetal en agar papa dextrosa más
cloranfenicol.

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Figura 14. Hongos filamentosos desarrollados en agar papa dextrosa.

Figura 15. Observación microscópica (400x) de conidias de Fusarium sp.

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Figura 16. Observación microscópica (400x) de hifas de Rhizoctonia solani.

Figura 17. Micelio de Fusarium sp. desarrollado en agar papa dextrosa.

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Figura 18. Micelio de Rhizoctonia solani desarrollado en agar papa dextrosa.

Figura 19. Crecimiento de Bacillus sp. y Fusarium sp. en agar papa dextrosa.

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Figura 20. Fragmento de Rhizoctonia solani en el extremo opuesto a Fusarium sp.

Figura 21. Inhibición del crecimiento de Fusarium sp. y Rhizoctonia solani por
Bacillus sp.

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Figura 22. Ausencia de inhibición del crecimiento de Fusarium sp. y Rhizoctonia

solani por Bacillus sp.

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Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Perú.
4. Anexo
Agar avena
En 600 mL de agua destilada remojar 60 g de avena durante 24 horas. Después, hervir
durante 30 minutos, filtrar, decantar y colectar el sobrenadante. Pesar 15 g de agar agar y
disolver en 400 mL de agua destilada, en baño maría. Mezclar el agar agar disuelto con el
sobrenadante de avena, completar con agua destilada a 1000 mL, calentar por 5 minutos y
esterilizar en autoclave.

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