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Revista Colombiana de Entomología 32(2): 125-130 (2006) Inhibidores de α -amilasas de la broca del café 125

Inhibidores de α -amilasas de la broca del café Hypothenemus


hampei en diferentes especies vegetales

α-Amylase inhibitors of the coffee berry borer Hypothenemus hampei in different plant species

BEATRIZ ELENA PADILLA H.1, JOSÉ RICARDO ACUÑA Z.2, CLAUDIA S. VELÁSQUEZ3,
JOSÉ DAVID RUBIO G.4

Resumen. La antibiosis es uno de los mecanismos de resistencia de las plantas al ataque de insectos,
en el cual están involucradas proteínas de defensa como los inhibidores de α-amilasas. Estas se en-
cuentran principalmente en especies vegetales como gramíneas y leguminosas. En Phaseolus vulgaris
L. var. Radical se ha registrado un inhibidor de α-amilasas de la broca del café Hypothenemus hampei,
con más de 80% de inhibición, el cuál también inhibe las α-amilasas de mamíferos. Es necesaria la
búsqueda de nuevos inhibidores de α-amilasas en otras especies vegetales que tengan un efecto
similar al de fríjol y con especificidad a las α-amilasas de insectos. Se obtuvieron extractos proteicos
de las semillas de ocho especies vegetales de las familias Gramineae y Leguminosae. Con estos
extractos y un inhibidor de α-amilasas comercial de trigo (Triticum aestivum L.), se realizaron pruebas
de actividad inhibitoria contra las α-amilasas de la broca, evaluadas con espectrofotometría utilizan-
do el método de Bernfeld y mediante zimogramas de inhibición enzimática. Las especies que mostra-
ron más de 50% de inhibición de las α-amilasas de broca, fueron: maíz (Zea mays L.), Brachiaria
decumbens Stapf y el inhibidor comercial de trigo, corroborando su actividad mediante los zimogramas
de inhibición. Con los extractos de brachiaria y de maíz no se encontró inhibición de las α-amilasas
de mamíferos, mientras que con el inhibidor comercial de trigo si se presentó más de 50% de inhibi-
ción. Adicionalmente se evaluó el efecto de los extractos de maíz y brachiaria sobre diferentes estados
de la broca en dietas artificiales, encontrándose mortalidades de 40% y 95% de larvas respectivamen-
te. Estas dos especies son promisorias para la identificación de los genes que codifican estas proteínas
y para desarrollar una base genética de resistencia contra la broca del café.
Palabras clave: Antibiosis. Proteínas de defensa de las plantas.
Abstract. Antibiosis is one of the mechanisms of plant resistance to insect attack in which plant
defense proteins, like α-amylase inhibitors, are involved. These inhibitors are found mainly in the
seeds of leguminous and graminaceous plant species. In Phaseolus vulgaris L. var. Radical, an α-
amylase inhibitor of the coffee berry borer Hypothenemus hampei Ferrari has been reported, with up to
80% inhibition, which also inhibits α-amylase of mammals. It is necessary to search for new α-amylase
inhibitors in other plant species that have an effect similar to beans and with specificity to insect a-
amylases. Protein extracts were obtained from the seeds of eight plant species from the families
Gramineae and Leguminosae. With these extracts and a commercial α-amylase inhibitor from wheat
(Triticum aestivum L.), tests were conducted on the inhibitory activity in the coffee berry borer evaluated
with spectrophotometry using the Bernfeld method and zymograms of enzymatic inhibition. The
species that showed more than 50% inhibition of α-amylases in the coffee berry borer were maize (Zea
mays L.), Brachiaria decumbens Stapf and the commercial inhibitor from wheat, their activity
corroborated with the inhibition zymograms. While No inhibition of mammal α-amylases were found
for Brachiaria or maize, while the commercial inhibitor from wheat α-amylases showed more than
50% inhibition. In addition, the effect of Brachiaria and maize extracts were evaluated on different
stages of the coffee berry borer in artificial diets, resulting in larval mortalities of 40 and 95%,
respectively. Therefore, these two species are promising for the identification of a promissory source
of genes coding that code for such these inhibitory proteins and to develop a genetic base that could
conferfor resistance to the coffee berry borer.
Key words: Antibiosis. Plant defense proteins.

Introducción nidae: Scolytinae) es actualmente la pla- integrado de la broca (MIB) se ha inclui-


ga más importante para el cultivo del café do el control cultural, biológico y quí-
La broca del café, Hypothenemus (Coffea arabica L.) en Colombia. Dentro mico. El análisis de la estructura de costos
hampei Ferrari (Coleoptera: Curculio- de las estrategias diseñadas para el manejo de producción en café muestra que este

1 Investigador Asociado. Bacterióloga Especialista en Biología Molecular y Biotecnología. Centro Nacional de Investigaciones del Café, Cenicafé. Chinchiná,
Caldas, Colombia.
2 Investigador Científico III. Mejoramiento Genético y Biotecnología. Centro Nacional de Investigaciones del Café, Cenicafé. Chinchiná, Caldas, Colombia.
3 Auxiliar de Investigación.
4 Investigador Asociado. Ingeniero Agrónomo. Centro Nacional de Investigaciones del Café, Cenicafé. Chinchiná, Caldas, Colombia.
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control puede representar 7,1% del total, de fríjol, para poder ser activo, es necesa- sión en semillas de tabaco transgénico,
es decir, aproximadamente $ 300.000 rio que en la semilla ocurran cambios por ser una especie de rápido desarrollo
(US$145) por ha/año (Duque 2001). In- postraduccionales como la glicosilación vegetativo (Acuña 2004, com. per.).
corporar una variedad resistente al insec- y proteólisis, y crear así un sitio de unión
to dentro del MIP haría este manejo más a la enzima blanco. Chrispeels (1997) Teniendo en cuenta que estos inhibidores
eficiente y reduciría sus costos, pero no registra que cuando los genes de proteí- de fríjol también son activos para las α-
se han encontrado aún fuentes de resis- nas de semilla son expresados en plantas amilasas humanas, se hace necesaria la
tencia genética en el género Coffea. Por heterólogas, los productos de la trangé- búsqueda de otros inhibidores de amila-
medio de transgénesis es posible obtener nesis son correctamente procesados y sas que sean específicos para las amilasas
tal variedad, con una amplia base genéti- transportados hasta las vacuolas especia- de insectos. Las especies de leguminosas
ca, la cual tenga incluidos genes que lizadas para lo formación de un inhibidor y gramíneas son las principales fuentes
codifiquen proteínas con efecto de anti- de amilasas activo. de estas proteínas de defensa. Se han eva-
biosis contra la broca. luado extractos semipuros de semillas de
Algunos inhibidores de α-amilasas Brachiaria decumbens Stapf, Canavalia
Los mecanismos de defensa al ataque de inhiben la actividad tanto en insectos ensiformis L., Vicia faba L., Erythrina
insectos basados en proteínas son mane- como en mamíferos, otros inhiben sola- rubrinervia Kunth, Adenanthera pavo-
jados por la ingeniería genética para la mente las α-amilasas de insectos como nica L., Acacia melanoxylum L. y
transformación de plantas con resisten- los aislados de trigo, maíz y Amaranthus
Trifolium hybridum L., adicionados a die-
cia a insectos (Gatehouse et al. 1992). spp., entre otros (Franco et al. 2002;
tas artificiales, encontrándose efectos ad-
Las principales proteínas empleadas Gatehouse 1999). También hay especifi-
versos en el ciclo de vida de la broca
como fuente de resistencia a insectos son cidad en el género del insecto, ya que la
(González 1999). Por tanto, se seleccio-
los inhibidores de enzimas digestivas, formación del complejo inhibidor más
como los inhibidores de α-amilasas y amilasa tiene un pH óptimo de 5.5 y por naron estas especies y algunas por regis-
proteasas, además de las lectinas, que blo- esta razón inhibe amilasas en el medio tros en la literatura, como T. aestivum y Z.
quean glicoproteínas en el intestino del ácido del intestino de insectos del orden mays, para la búsqueda de especies vege-
insecto. Los tres grupos ocasionan dis- Coleoptera pero no en el alcalino del or- tales que contengan inhibidores de las
minución en la absorción de nutrientes, den Lepidoptera (Chrispeels 1997). α-amilasas de la broca y así ser seleccio-
retardo en el desarrollo del insecto y su nadas para la posterior identificación de
Los genes de inhibidores de α-amilasas los genes que codifican estas proteínas y
muerte (Gatehuose 1999).
de fríjol (αAI) han sido identificados y desarrollar una base genética de resisten-
Enzimas digestivas como las α-amilasas clonados con el propósito de obtener cia contra la broca.
constituyen una familia de endo-amila- plantas transgénicas. Se han obtenido
sas, que catalizan la hidrólisis de almi- plantas de arveja (Pisum sativum L.) vía Materiales y Métodos
dón, componente importante de diversas Agrobacterium tumefaciens (Smith &
semillas que son alimento de varios in- Town) que expresan αAI, acumulándose Material Vegetal. Se utilizaron semillas
sectos. El grano de café, fuente de ali- de forma estable en sus semillas, a nive- de V. faba, B. decumbens, C. ensiformes,
mento para larvas y adultos de la broca les de 0,8 -1% de expresión. Estudios en T. hybridum, A. melanoxylum, A. pavo-
del café, H. hampei, contiene 10% de al- campo y bioensayos con semilla de arve- nica, E. rubrinervia y Z. mays, además
midón en su composición bioquímica ja transgénica ocasionaron 100% de mor- un inhibidor comercial purificado de T.
total (Siveltz 1977). talidad de larvas de Bruchus pisorum L. aestivum (Sigma I-1520).
(Coleoptera: Bruchidae) (Chrispeels Extracción de los inhibidores de α-ami-
Los inhibidores de α-amilasas se encuen-
1997; Schroeder et al. 1995). lasas. Las semillas molidas se homo-
tran en semillas de leguminosas y gra-
míneas (Richardson 1991) y se han Igualmente, se han obtenido plantas genizaron a 4°C con 5 volúmenes de
purificado de semillas de trigo (Triticum transgénicas de tabaco que expresan αAI, NaCl 100 mM por 3horas en agitación
aestivum L.), fríjol (Phaseolus vulgaris afectando insectos del orden Coleoptera constante. Posteriormente el extracto se
L.), maíz (Zea mays L.) y Amaranthus sp., (Tenebrio molitor L. y Callosobruchus centrifugó a 10.000 rpm durante 30 mi-
en busca de sus propiedades insecticidas maculatus F.) (Altabella y Chrispeels nutos y los sobrenadantes se dializaron
contra coleópteros (Schimoler-O’Rourke 1990). También, plantas de tabaco trans- contra agua durante tres noches (tres cam-
et al. 2001; Franco et al. 2000; Valencia formadas con un inhibidor bifuncional bios de agua al día). Los extractos
et al. 2000; Minney et al. 1990 citado de α amilasas y proteasas de maíz, adqui- dializados se centrifugaron a 10.000 rpm
por Gatehouse 1999; Ishimoto y Kitamura rieron protección contra los insectos del a 4°C y finalmente se liofilizaron. Los
1989, citado por Chrispeels 1997; Cha- orden Coleoptera (Tribolium castaneum extractos liofilizados se utilizaron pos-
golla-López et al. 1994). Herbst y Rhyzopertha dominica Fa- teriormente como fuente de inhibidores
bricius) (Franco et al. 2000; Sarneer- de α-amilasas.
Los inhibidores de α-amilasas son glico-
Masoud et al. 1994 citado por Dilawari y
proteínas de bajo peso molecular que se
Dhaliwal 1996). Extracción de las α -amilasas de H.
acumulan en vacuolas especializadas en
hampei. Se pesaron 2 gramos de insectos
la fase media de desarrollo de la semilla. Valencia et al. (2000) encontraron me-
Al ser proteínas de semillas, son excelen- diante ensayos espectrofotométricos y y se homogenizaron a 4°C con 5 volúme-
tes candidatos para ser expresadas hete- zimogramas de inhibición, que inhibi- nes de NaCl 10 mM y CaCl2 20 mM. Pos-
rólogamente en tejidos homólogos como dores de α-amilasas de frijol (P. vulgaris y teriormente el extracto se centrifugó a
la semilla del café, donde ocurre el desa- Phaseolus coccineus L.) bloquean la ac- 10.000 rpm durante 30 minutos a 4°C. El
rrollo biológico de la broca. Esto es tividad de las α-amilasas de la broca del sobrenadante se congeló a –20°C para
particularmente importante porque café. Estos genes actualmente están sien- ser usado posteriormente como fuente de
inhibidores de α-amilasas, como el αAI do clonados y se está evaluando su expre- enzima.
Inhibidores de α -amilasas de la broca del café 127

Identificación de los extractos con separaron en geles de poliacrilamida na- de proteína total. Se observa que entre
inhibidores de α amilasas. Para deter- tivos (Gradiente 10–15%. Phast-Gel, 24 y 48 µg se alcanza 50% de inhibición
minar cuáles de los extractos semipuros Amersham-Pharmacia). Cada gel se incu- de las α-amilasas de la broca. El porcen-
de las semillas en estudio mostraron acti- bó en una solución de almidón a 1,5% taje de inhibición se ajusta mejor a un
vidad inhibitoria, se cuantificó la produc- por 30 minutos a 4°C, y luego con 10 ml comportamiento cuadrático (Fig. 1) com-
ción de maltosa en la digestión del del extracto semipuro de las α-amilasas parado con un comportamiento lineal (y
almidón con la metodología propuesta de la broca, disuelto en buffer citrato de = 0.4708x + 25.243. R2 = 0.8872).
por Bernfeld (ácido 3,5 dinitrisalicílico) sodio 50 mM pH 5.0, por 30 minutos a
En la figura 2 se observa el porcentaje de
(Bernfeld 1955). 30°C. El gel con almidón se reveló con
inhibición de las α-amilasas de la broca
KI/I2 hasta obtener bandas azules oscu-
Previo a la identificación de los extrac- con diferentes cantidades de extracto
ras, que indicaron la presencia del
tos semipuros con inhibidores de α- semipuro de B. decumbens, 2.86, 5.66,
inhibidor. Como control se utilizó fríjol
amilasas, se cuantificó la proteína total 11.32 y 42.45 µg de proteína total. Con
(P. vulgaris, var. Radical) como fuente
por ml de cada extracto, disuelto en bu- la menor cantidad de extracto evaluado
de inhibidores de las α-amilasas de la
ffer citrato pH 5.0, por el método de se alcanza más de 50% de inhibición. El
broca del café (Valencia et al. 2000).
Bradford (Bradford 1976). porcentaje de inhibición se ajusta mejor
Evaluación de antibiosis contra la bro- a un comportamiento cuadrático (Fig. 2)
Para la identificación se realizaron tres
ca en dietas artificiales. Para observar el que lineal (y = 0.3624x + 60.123. R 2
repeticiones por especie vegetal. Se eva-
efecto de antibiosis se evaluaron los ex- 0,7494).
luaron cuatro cantidades de los extrac-
tractos de las especies vegetales que
tos 10, 20, 40 y 80 µl. Del inhibidor Para el ensayo de inhibición con el
comercial de trigo se evaluó 1 µl. A todos mostraron efecto de inhibición de las α- inhibidor comercial purificado trigo se
los tubos de prueba se les adicionaron amilasas de la broca, adicionándolos a
100 µl del extracto semipuro de las α- dietas merídicas (Portilla et al. 2000). Se d\
amilasas de la broca, se incubaron duran- evaluaron 400 mg de los extractos
semipuros liofilizados de B. decumbens ^\
te una hora a 37°C y se adicionaron 250

zYopY{l|n}ntn~l
µl del sustrato almidón a 0,125%. y Z. mays disueltos en 10 ml de agua des- e\
tilada estéril, a los cuales previamente se f\
Para determinar la producción de maltosa les había determinado su concentración XYZY[\]\\^_`YaYb]`cde_YaYbb]efd
se hicieron dos lecturas, al tiempo cero y c\
de proteína total. Posteriormente estos 10 g`YZY\]hd`f
a la hora de iniciadas, tomando 100 µl de ml se homogenizaron con 20 ml de dieta i\
la reacción más 100 µl del reactivo de y se sirvieron en 10 pozos de una caja `\
Bernfeld. Se detuvieron las reacciones multipozos con 2 ml de la mezcla en cada
calentándolas en agua hirviendo durante b\
pozo. La dieta se secó hasta obtener una
10 minutos, se adicionó 1 ml de agua y se \ bf i\ cf e\ ^f h\ b\f
humedad de 50% y se inoculó con 20
realizó la lectura en el espectrofotómetro huevos de broca por pozo. Para los con- jklmnokoYopqYr_msktmuYjsvouYwvxy
a λ de 490 nm. Además se tuvo un control troles de cada uno de los extractos se Figura 1. Porcentaje de inhibición de las ∝-
de la actividad de la enzima proveniente adicionó el mismo volumen de la dieta amilasas de la broca con diferentes cantida-
del insecto, sin el extracto proteico. mezclada con 10 ml de agua destilada des de extracto semipuro de Zea mays (12,
Adicionalmente se hicieron ensayos con 24, 48 y 96 µg de proteína). Medido como la
estéril y se tuvieron las mismas repeti- producción de maltosa utilizando el método
amilasa comercial, Pankreoflat® (amilasa
ciones y la misma cantidad de huevos de Bernfeld (1955). Cada punto es el prome-
pancreática de porcino) como fuente de
inoculados.
α-amilasas de mamíferos. dio de tres medidas y las barras representan el
error standard.
La variable de respuesta fue el porcenta- Se hicieron tres lecturas, una a los cuatro
je de inhibición. Para cada especie se días, para determinar el porcentaje de
buscó la expresión lineal o cuadrática que eclosión, a los 12 y a los 24 días para df
describiera el comportamiento del por- determinar el porcentaje de mortalidad d\
centaje de inhibición en función de la de estados de brocas ocasionados por ^f
zYopY{l|n}ntn~l

concentración, y se determinó la concen- efecto de los extractos evaluados. ^\


tración mínima que inhibió 50% de la ef
amilasa de la broca. Para la obtención de Resultados e\ XYZY[\]\`hf_`YaYb]^ebe_YaYf`]d^f
los genes de inhibidores de amilasa, se Los extractos de las especies vegetales ff g`YZY\]hfd`
seleccionaron las especies que mostraron que mostraron inhibición de las α- f\
50% o más de inhibición de la actividad cf
amilasas de la broca del café con las con-
de la amilasa en estudio. c\
diciones evaluadas fueron B. decumbens,
\ bf i\ cf
Con los extractos que mostraron activi- Z. mays y el inhibidor comercial de trigo
jklmnokoYopqYr_msktmuYjsvouYwvxy
dad inhibitoria en el ensayo espectro- (T. aestivum). Con las otras especies eva-
fotométrico, se hicieron zimogramas de luadas en las mismas condiciones no se Figura 2. Porcentaje de inhibición de las ∝-
inhibición enzimática, con el fin de encontró inhibición de las α-amilasas de amilasas de la broca con diferentes cantidades
implementar la decisión de las especies la broca. de extracto semipuro de Brachiaria decumbens
(2.83, 5.66, 11.32 y 42.45 µg de proteína)
seleccionadas para la búsqueda de los En la figura 1 se observa el porcentaje de medido como la producción de maltosa utili-
genes de inhibidores de α-amilasas, como inhibición de las α-amilasas de la broca zando el método de Bernfeld (1955). Cada
posibles fuentes de resistencia a la broca. con diferentes cantidades de extracto punto es el promedio de tres medidas y las
Las proteínas del respectivo extracto se semipuro de Z. mays, 12, 24, 48 y 96 µg barras representan el error standard.
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evaluó 1 µl del producto (740 unidades


-1
mg ) disuelto en 1 ml de buffer citrato
pH 5.0 y se hicieron tres lecturas. Dando
un porcentaje de inhibición de las α-
amilasas de la broca de 80,33 ± 1,19%.
En la evaluación del efecto inhibitorio
de los extractos semipuros de Z. mays, B.
decumbens y el inhibidor comercial de
trigo contra las α-amilasas de mamíferos
(amilasas pancreáticas de porcino,
Pankreoflat®), se encontró inhibición
con trigo de un 58,13 ± 3,12%. Con las
otras dos especies evaluadas no se en-
contró efecto de inhibición. Por tanto las
especies de Z. mays y B. decumbens son
fuentes promisorias para la búsqueda de
genes de inhibidores de α-amilasas espe- A B
cialmente contra α-amilasas de insectos.
Figuras 3. Zimogramas de inhibición de ∝-amilasas de broca. A) gel incubado con la amilasa
Zimogramas de inhibición enzimática pancreática comercial (Pankreoflat®). B) gel incubado con la amilasa de la broca. Carril 1.
inhibidor comercial de trigo, carril 2. Extracto purificado de frijol, carril 3. Extracto semipuro
En la figura 3 se presentan los zimo-
de brachiaria, carril 4, extracto semipuro de maíz.
gramas de inhibición enzimática de las
amilasas de la broca y de las α-amilasas
pancreáticas de porcino (Pankreoflat®).
En el gel incubado con la solución de castaneum y R. dominica. B. decumbens registró el porcentaje de eclosión de lar-
las α-amilasas pancreáticas de porcino también fue específica a las α-amilasas de vas, el cual fue de 84,3 ± 4,9%, compara-
(Fig. 3A), se observa dos bandas bien la broca. Por lo anterior, estas dos espe- do con el control (tratamiento sin la
definidas, correspondientes al inhibidor cies son candidatas para la búsqueda de adición de extracto semipuro de la espe-
purificado de fríjol (carril 2) y al los genes que codifican los inhibidores cie vegetal en estudio), de 89,5 ± 6,2%.
inhibidor comercial de trigo (carril 1). de α-amilasas y hacer parte de la base Con las larvas que eclosionaron se hicie-
En este gel no se observan bandas de genética para resistencia a la broca del ron las siguientes dos lecturas, a los 12 y
inhibición con los extractos de Z. mays café. 24 días después de la inoculación de la
y B. decumbens (carriles 3 y 4), corrobo- dieta. La variable respuesta fue el por-
rando los resultados espectrofoto- Evaluación de antibiosis contra la centaje de mortalidad de estados de bro-
métricos, en los cuales tampoco se broca en dietas artificiales ca por el efecto del tratamiento. Se
encontró inhibición con estas dos espe- En la figura 4, se observa el efecto del obtuvo 40,4 ± 10,6% de mortalidad a los
cies. En el gel incubado con las α- extracto semipuro de B. decumbens, con- 12 días con el tratamiento, comparado
amilasas de la broca (Fig. 3B), se tra la broca del café. Previamente se había con 4,5 ± 4,9% en el control. A los 24
presenta una coloración más oscura, po- determinado que los 400 mg del extracto días, 95,1 ± 5,6% de mortalidad, compa-
siblemente porque tienen menor activi- semipuro adicionado a la dieta contenían rado con 9,3 ± 4,2% en el control. Consi-
dad que las amilasas comerciales. Sin 2,83 mg de proteína total. El efecto ad- derando estos resultados y la evidencia
embargo, se aprecia un barrido muy verso contra la broca se determinó median- bioquímica de inhibición de las α-
fuerte correspondiente al inhibidor co- te tres evaluaciones. A los cuatro días, se amilasas de la broca del café con este
mercial de trigo (carril 1). Espectrofo-
tométricamente éste inhibió 80% de las
amilasas de la broca y 58% de las 120.0
amilasas de mamífero, resultados encon-
% m ortalidad
trados también en los geles. En la figura 100.0
% eclosión
3B también se observan bandas de inhi-
bición con el extracto puro de P. vulgaris
80.0
(carril 2), el extracto semipuro de Z. mays C ontrol
(carril 4) y con el extracto semipuro de Tratam iento
B. decumbens se observa un barrido muy 60.0 % m ortalidad
tenue y no se observan bandas definidas
de inhibición (carril 3). 40.0
El extracto semipuro de Z. mays sólo
inhibió las α-amilasas de la broca, tanto 20.0
en los zimogramas como en los ensayos
espectrofotométricos. Esta actividad es- 0.0
pecífica de inhibición de las α-amilasas 4 días 12 días 24 días
de insectos, fue registrada por Franco et Figura 4. Efecto de antibiosis contra la broca del café de 400 mg de extracto semipuro de
al. (2002) y por Schimoler et al. (2001) Brachiaria decumbens evaluado en la dieta artificial Cenibroca. Las barras representan el error
para insectos del orden Coleoptera, T. standard de diez repeticiones.
Inhibidores de α -amilasas de la broca del café 129

extracto (resultados mostrados previa- del extracto para alcanzar 50% de inhibi- Otra propiedad importante es la especifi-
mente), se reafirmó la decisión de selec- ción de las α-amilasas de la broca. cidad de inhibición a las amilasas de los
cionar la especie B. decumbens, como insectos, la cual se identificó con los dos
fuente de búsqueda de genes con efectos Discusión extractos vegetales seleccionados de B.
deletéreos contra la broca, para ser Las plantas han adquirido evolutivamente decumbens y el de Z. mays. Con estos
incluidos en futuras variedades con cierto grado de resistencia a insectos pla- dos extractos se encontró inhibición de
resistencia a esta plaga mediante el me- ga mediante la producción de compues- las α-amilasas de la broca de café y no
joramiento genético no convencional. tos de defensa, que pueden ser de hubo inhibición de las α-amilasas pan-
En la figura 5 se observa el efecto de naturaleza peptidica o no peptidica. Los creáticas de mamífero, confirmando así
antibiosis contra la broca del café utili- inhibidores de α-amilasas son proteínas los registros en la literatura del inhibidor
zando el extracto semipuro de Z. mays, de defensa contra insectos ampliamente de Z. mays (Franco et al. 2002). El
con una concentración total de proteína estudiadas para el control de diversas pla- inhibidor de B. decumbens es un nuevo
de 12 mg en los 400 mg de extracto adi- gas en diferentes cultivos importantes en registro en la literatura como posible fuen-
cionado a la dieta. A los cuatro días el el mundo (Franco et al. 2002). De las ocho te de inhibidores de α-amilasas, además
porcentaje de eclosión encontrando fue especies vegetales evaluadas en la presen- de mostrar especificidad para la broca del
94,7± 4,2%, comparado con el observa- te investigación, se encontraron dos can- café fue el extracto que se necesitó en
do en el control que fue 94 ± 3,1%. Res- didatos potenciales como fuente de genes menor concentración para obtener más
pecto al porcentaje de eclosión de larvas, que confieran resistencia a la broca, como de 50% de inhibición.
se obtuvo 8,3 ± 3,4% de mortalidad a los son el inhibidor de B. decumbens y el de En los zimogramas de inhibición de las α-
12 días con el tratamiento, comparado Z. mays. amilasas de la broca con el extracto de B.
con 2,4 ± 2,7% en el control y 40 ± 6,6% Para introducir genes de inhibidores decumbens, a diferencia de maíz, no se
de mortalidad a los 24 días, comparado enzimáticos en una variedad resistente a observó una banda de inhibición bien
con 5,5 ± 3,6 en el control. una plaga por medio de transgénesis, es- definida, por tanto es importante hacer un
En los ensayos con dietas se observó que tos deben tener algunas propiedades análisis de proteómica para esta especie y
con el extracto de B. decumbens se logra como son: Inhibir sustancialmente las corroborar que el efecto adverso contra la
una evidente mortalidad de larvas, 95%, enzimas de los insectos utilizando bajas broca demostrada tanto en los ensayos
confirmando los ensayos bioquímicos de concentraciones del inhibidor, como fue biológicos y bioquímicos son de tipo
inhibición de α-amilasas, en los cuales el caso de los dos extractos de inhibidores peptídico, característica importante para
con la menor cantidad de extracto seleccionados en la presente investiga- que sean candidatos en el desarrollo de
evaluado se alcanzó más de 50% de ción. Comparando los dos extractos se- una futura variedad de café con resisten-
inhibición. Con el extracto de maíz se leccionados, utilizando el extracto de B. cia a la broca por medio de transgénesis.
encontró una menor mortalidad en las eva- decumbes se necesita menor concentra- En los ensayos biológicos utilizando ex-
luaciones en dietas hasta 40%, igualmen- ción de proteína en el extracto para al- tractos de proteína semipura de maíz y
te confirmando los ensayos bioquímicos, canzar el 50% de inhibición de las brachiaria en dietas merídicas para la bro-
en los cuales se necesitó mayor cantidad α-amilasas de la broca. ca, se presentaron mortalidades entre el
40 y el 95%. Debe determinarse si la mor-
talidad del insecto es ocasionada por los
120,0
120.0 inhibidores enzimáticos presentes en los
extractos, los cuales se identificaron por
% eclosi ón medio de ensayos bioquímicos. Se reco-
Control
% eclosión
100,0 mienda entonces realizar pruebas con los
100.0 Control
inhibidores de α-amilasas puros. Debido
Tratamiento
Tratamiento
a los altos costos del proceso de purifica-
80,0 ción de la proteína y de la obtención de la
80.0
cantidad necesaria para realizar los ensa-
yos biológicos, la metodología utilizada
en esta investigación, evaluando extrac-
60,0
60.0 tos semipuros, es valida para la selección
% mortali dad
mortalidad
de especies como fuentes genéticas de re-
sistencia vegetal a insectos.
40,0
40.0 Por tanto, en éste trabajo se dan las herra-
mientas bioquímicas y biológicas para
la selección de especies vegetales que
20,0 % mortali dad
% mortalidad
20.0 contengan compuestos proteicos respon-
sables de antibiosis contra la broca del
café. Las especies vegetales que produz-
0,0 can estos efectos son candidatas poten-
0.0
ciales para la búsqueda de los genes que
44 días
días 1212días
dias 2424días
días codifican estas proteínas, con el propósi-
Figura 5. Efecto de antibiosis contra la broca del café de 400 mg de extracto semipuro de Zea to de incluirlos dentro de un plan de
mays evaluado en la dieta artificial Cenibroca. Las barras representan el error standard de diez mejoramiento para obtener una variedad
repeticiones. de café resistente a la broca.
130 Revista Colombiana de Entomología Beatriz Elena Padilla H. & Cols.

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