Diversidad de levaduras durante la extracción y

fermentación del vino de palma de Camerún.

Intro.

· La producción de vino de
palma se ha realizado por el
método secular de la
inoculación casual y la
fermentación incontrolada.
Por lo tanto, las variaciones
habituales en la calidad y la
estabilidad del producto no
son inesperadas.
· Es una bebida alcohólica que se
produce y se consume en cantidades
muy grandes en África Occidental, y se
conoce a lo largo de las principales
partes de África bajo varios nombres,
como 'mimbo' en Camerún, 'nsafufuo'
en Ghana, En Nigeria “Jespersen”.

· Así, en varios países africanos y más

allá, la savia de la palmera es
aprovechada y se deja experimentar
fermentación espontánea, lo que
promueve la proliferación de especies
de levadura para la conversión del
sustrato en una bebida alcohólica que
contiene importantes componentes
nutricionales, incluyendo
aminoácidos , proteínas, vitaminas y
azúcares.
LEVADURAS. BAL

AAB
Experimentación.
Se obtuvieron muestras frescas de vino de palma
durante los primeros cinco días de
aprovechamiento de la palma aceitera (E.
guineensis) en las plantaciones de Odza (Camerún,
África Central), durante el verano (diciembre-
enero) de 2006-2007.

Las muestras de savia se recogieron a intervalos de

24 horas durante la fermentación natural, desde el
tiempo cero hasta el quinto día (A, B, C, D, E y F).

Se tomaron aproximadamente 50 ml de muestras

de savia de palma, , se colocaron asépticamente en
bolsas de plástico estériles y se transfirieron para
análisis en el laboratorio del Departamento de
SAIFET, Sección de Microbiología Alimentaria,
Industrial y Ambiental de la Universidad
Politécnica de Marche, Italia, en cajas de hielo
Se llevaron a cabo procedimientos estándar para diluciones
en serie y examen microbiológico por duplicado, las
muestras se hicieron 1:10 de muestra en agua estéril.

3 Metodos de aislamiento utilizados

Para levaduras: agar nutritivo WL.

Para LAB: agar MRS (Oxoid) suplementado con

cicloheximida 0,005%, para suprimir el crecimiento de
levadura.

Para AAB: agar GEY compuesto de 2% de D-glucosa, 5% de

etanol, 1% de extracto de levadura y 2% de CaCO3
suplementado con cicloheximida 0,005% para suprimir el
crecimiento de la levadura.
Levaduras.
Se extrajo el ADN. Los cultivos de levadura
pura se pre-cultivaron en agar YPD a 25ºC
durante 3 días.

Los tubos se sometieron a vórtice 3 veces

durante 1 minuto cada uno en el ajuste más
alto. Las mezclas fueron entonces hervidas
durante 10 min y transferidas a hielo durante 3
min.

Para cada muestra, se a~nadieron 20 ml de

Tris-HCl 1 M, pH 8,0, 15 ml de EDTA 0,5 M, pH
8,0, 50 ml de SDS al 10% y 200 ml de acetato de
potasio 5 M.

Las muestras se incubaron a continuación

durante 30 min en hielo, y finalmente se
centrifugaron a 18.000 g durante 10 min.
 Los ácidos nucleicos precipitados se recogieron después de una incubación de 5 min,
y el sedimento se lavó en 500 ml de etanol al 70% enfriado con hielo, y se centrifugó
a 18.000 g durante 5 min.

El ADN obtenido se secó durante la noche y se resuspendió en 100 ml de tampón TE

0,1 M, pH 8,0, y la plantilla de ADN se incubó a continuación a 45ºC durante 15
minutos.

Después de esta incubación, las muestras se almacenaron a 20ºC y se analizaron en 2

semanas.

El ADN amplificado se digirió sin purificación adicional, utilizando tres

endonucleasas de restricción: CfoI, HaeIII y HinfI

Los productos amplificados (ITS-PCR) y sus fragmentos de restricción se separaron

en un aparato de electroforesis horizontal en geles de agarosa al 1,5% y 2,5% (p / v),
respectivamente, en 0,5 TBE buffer.

Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV os

tama~nos de los fragmentos se estimaron mediante comparaciones con un marcador
de patrones de ADN, y los patrones de restricción se compararon con estudios
publicados previamente.
Análisis químicos.
Se determinaron los azúcares
reductores, el contenido en
alcohol y la acidez volátil de
las muestras de vino de
palma, siguiendo los métodos
oficiales para los vinos de la
Comunidad Europea (2000).
Las medidas de pH se
realizaron directamente,
usando un medidor de pH.
 Resultados.

*Se realizaron caracterizaciones intraespecíficas de aislados pertenecientes a

S. cerevisiae utilizando los cebadores d1 y d2, ademas de genes que codifican
proteínas de la pared celular para su análisis.
* Evolución
de las
poblaciones
de
levaduras y
bacterias en
el vino de
palma
después de
la
extracción
de la palma
cortada: A) -
Levaduras;
B), bacterias
del ácido
láctico y
bacterias
del ácido
acético.
*Amplificación ITS-PCR y análisis de restricción HhaI, HaeIII y HinfI del ADNr 5.8S de las cepas
de levadura aisladas de la muestra A. L, escala de marcadores de peso molecular de 100 pb (Escala de
ADN de O'BrangeRule 100 pb).
Carriles 2-5, Saccharomyces cerevisiae
Carriles 6-9, Saccharomycodes ludwigii
Carriles 10-13, Saccharomycodes ludwigii
Carriles 14-17, Zygosaccharomyces bailii
Carriles 18-21, Saccharomycodes ludwigii
 Todas las muestras de vino se
analizaron por PCR-DGGE,
incluyendo un perfil de escalera de
los fragmentos del gen rRNA 26S
para comparar los perfiles de
muestra con algunas especies
seleccionadas de referencia. Para
confirmar la identidad de las
bandas de DGGE, y también
cuando las bandas no coincidían con
ninguno de los amplicones de
levadura de referencia, las bandas se
escindieron de los geles y se
secuenciaron .
indican un total de 15 biotipos diferentes de
todas las diferentes muestras recogidas
durante el proceso de extracción. Se
obtuvieron siete patrones diferentes
utilizando los cebadores...la reducción de las
especies de levadura durante el proceso de
extracción que favoreció a S. cerevisiae, la
caracterización molecular en el nivel de
cepa mostró una amplia diversidad
intraspecífica. De hecho, se encontraron
diferentes biotipos en las muestras recogidas
durante todas las fases del vino de palma,
incluso después de la estabilización de las
condiciones químicas y de las especies de
levadura. En esta fermentación natural,
llevada a cabo de forma semicontinua,
existe en realidad una fermentación multi-
arranque con cepas de S. cerevisiae.
 Conclusiones.

Los resultados del presente estudio confirman

inicialmente la amplia presencia de levaduras,
LAB y AAB durante el proceso de vino de
palma, por lo que se seleccionó
progresivamente las levaduras a favor de S.
cerevisiae, que permaneció la única especie
después de tres días Determinada utilizando
métodos tanto dependientes de la cultura como
independientes de la cultura. Los métodos
independientes del cultivo permitieron la
detección de especies adicionales, destacando
la presencia en las primeras muestras de H.
uvarum, C. parapsilopsis, C. fermentati y P.
fermentans, que no se detectaron utilizando
métodos basados en la cultura. La
caracterización molecular intraespecífica de las
cepas de S. cerevisiae aisladas de las muestras
recogidas durante la extracción del vino de
palma reveló un amplio espectro de perfiles de
patrón, lo que indica que se produce una
fermentación multi-arranque en este proceso
de fermentación natural, semi-continuo
particular.