Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE

Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura

Ingeniería en Biotecnología
Laboratorio de Enzimología
Práctica No 1
Autores:
 Castillo Fabricio
 Jessica Villafuerte
 Tamia Villacrés,
 Luis Leiva
NRC: 4324

I. Tema:
Identificación cualitativa de la actividad enzimática de la catalasa del hígado de res (Bos
taurus) y peroxidasa del tomatillo (Physalis philadelphica)

II. Objetivos

General
Identificar cualitativamente la actividad enzimática de la catalasa del hígado de res y
peroxidasa del tomatillo.

Específicos
1. Obtener un extracto enzimático de hígado de res y tomatillo, respectivamente.
2. Observar la actividad enzimática de la catalasa presente en el hígado de res (Bos
taurus) mediante la reacción de coloración.
3. Demostrar la actividad de la enzima peroxidasa presente en tomatillo (Physalis
philadelphica) mediante la reacción de coloración.

III. Introducción

Tampón fosfato
Es una disolución reguladora intracelular con un pk’=7.2, conformada por el sistema
K2HPO4 (base débil) y KH2PO4 (ácido conjugado) (Tejón, y otros, 2006). Importante
para mantener el pH en los fluidos intra y extracelulares debido a que este factor influye en la
actividad biológica de las proteínas, enzimas, hormonas, la distribución de iones a través de
membranas, etc (Túñez, Galván, & Fernández, s.f.).

En el caso de la extracción de enzimas intracelulares se recomienda mantener el pH

entre 6 y 7, un rango cercano al pH natural de tejido del hígado, el cual puede ser
ajustado adicionando un reactante ácido o alcalino dependiendo del pH inicial (Hans &
Wauwatousa, 1961).

Catalasa
En los mamíferos esta enzima se encuentra en todo tipo de células, siendo su actividad
mayor en el hígado, riñón y eritrocitos (Universidad del Zulia, s.f.). Particularmente en
los peroxisomas donde cumple la función de detoxificación o antioxidante al
 descomponer el peróxido de hidrogeno, presentando una actividad enzimática de tipo
oxido-reductasa (Cancho, García, Molano, Morejo, & Alfonso, 2012). Su masa
molecular es de 225.000 kDa, contiene cuatro grupos hemo por molécula y su contenido
de hierro es 0.9% (Universidad del Zulia, s.f.).

Para su extracción se requiere que el tejido muestra, esté congelado para evitar la
autolisis y rápida descomposición del tejido, que causa que las enzimas se inactiven
(Currea & Martínez, 2014) (Hans & Wauwatousa, 1961). Su actividad enzimática
regularmente se produce bajo el rango de pH fisiológico, sin embargo, se ha demostrado
que su actividad es estable en un amplio rango de pH entre 5 y 10.5 y a temperaturas de
10 a 30°C (Cheng, y otros, 2014).

Peroxidasa

Las peroxidasas, constituyen un grupo de glicoproteínas muy extendido en la escala

filogenética, cataliza reacciones bisustrato de carácter redox de diferentes sustratos
fenólicos y sustancias orgánicas e inorgánicas (Guarachi Condori, Paz Garcia, Terrazas
Siles , & Giménez Turba, 2008). Las peroxidasas vegetales, frecuentemente se las
conoce como: peroxidasas clase III, son enzimas monoméricas que intervienen en una
amplia gama de procesos fisiológicos, tales como: la lignificación, la suberización, el
metabolismo de las auxinas, el ensamblado de las proteínas de la pared celular, la
tolerancia a sales, el estrés hídrico y la defensa contra el ataque de patógenos (Matus
Trujillo, Díaz Solares, & Samaniego , 2017).

La variación de la enzima depende del crecimiento en los que se encuentra la célula;

existe una relación inversa entre la peroxidasa y el crecimiento celular (Guarachi
Condori, Paz Garcia, Terrazas Siles , & Giménez Turba, 2008). Las peroxidasas
participan en el balance de especies activas de oxígeno (Mazorra & Nuñez, 2003).

IV. Metodología
 Materiales y equipos
Se usó 2 tubos de ensayo, un mortero, tres pipetas, gradilla, pipetas Pasteur,
una balanza electrónica, una centrífuga, hígado de res, tomatillos.
 Reactivos
Se empleó una solución de fosfato 0.1M pH 7.0, una solución de peróxido de
hidrogeno al 3%, guayacol al 0.5% y agua destilada.

 Identificación de cualitativa de catalasa.

En la identificación de la enzima, se homogenizó 15g de hígado de res fresco

con 35mL de una solución de buffer de fosfato 0,1M a pH 7.0 por al menos 2
min. Se centrifugó por 5min a la mezcla y se recuperó el sobrenadante. Para el
ensayo se realizó: en un tubo se extrajo 3mL del sobrenadante y adicionó 2mL
de solución de peróxido de hidrógeno al 3%. Para tener un control se tomó 3mL
 de buffer fosfato 0,1M a pH 7.0 en un tubo de ensayo y se adicionó 2mL de
solución de peróxido de hidrógeno al 3%. Y se identificó la presencia de la
catalasa.

 Identificación cualitativa de peroxidasa.

En la identificación enzimática se homogenizó 25g de tomatillo fresco con 25mL
de una solución buffer de fosfato 0.1M pH 7.0 durante 2min. Se centrifugó por
5min la mezcla y se recuperó el sobrenadante. Para el ensayo se toma en un tubo
de ensayo 4mL del sobrenadante, adicionamos 1mL de solución de guayacol al
0.5% y finalmente 1mL de peróxido de hidrógeno al 3%. En otro tubo de ensayo
se coloca 4mL de buffer fosfato 0.1M pH 7.0 como control y se realiza el mismo
procedimiento que con el sobrenadante.

V. Cálculos
Ecuación de Henderson-Hasselbalch
𝑲𝟐 𝑯𝑷𝑶𝟒 𝐊𝐇𝟐 𝑷𝑶𝟒
PM=174,17 g/mol PM=136,08 g/mol

[∆− ][𝑏𝑎𝑠𝑒]
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + 𝑙𝑜𝑔
[∆𝐻][á𝑐𝑖𝑑𝑜]
−
[∆ ] + [∆𝐻] = 0.1𝑀

[∆− ] = 0.361[∆𝐻]

0.361[∆𝐻] + [∆𝐻] = 0.1𝑀

0.1𝑀 6.131𝑥10−2 𝑚𝑜𝑙
[∆𝐻] = =
1.631 𝐿

3.869𝑥10−2 𝑚𝑜𝑙
[∆− ] = 0.361[∆𝐻] =
𝐿
𝑔
KH2 𝑃𝑂4 → [∆𝐻] = 𝑚 = 𝑃𝑀 ∗ 𝑛 = 136.08 ∗ 6.131𝑥10−2 = 8.59
𝐿
𝑔
𝐾2 𝐻𝑃𝑂4 → [∆− ] = 𝑚 = 𝑃𝑀 ∗ 𝑛 = 174.17 ∗ 3.860𝑥10−2 = 6.72
𝐿

𝐊𝐇𝟐 𝑷𝑶𝟒
8.59g 1000mL
X=2.148g 250mL

𝑲𝟐 𝑯𝑷𝑶𝟒
6.74g 1000mL
Y=1.685g 250mL
VI. Resultados

Tabla 1.- resultados cualitativos de la presencia de enzimas peroxidasa y cata lasa

PEROXIDASA
Blanco Acción de peroxidasa Observaciones

Se obtiene una reaccion positiva a la presencia de

peroxidasa, debido al cambio de coloracion, a un
color marron ladrillo.

Solución de buffer, Solución de buffer,

guayacol, peróxido de
hidrogeno.
guayacol, peroxidasa y
peróxido de hidrogeno
CATALASA
Se puede observar en la reacción la presencia de
burbujas al colocar el peróxido de hidrógeno con
lo cual vemos una reacción positiva de la catalasa,
por su reacción efervescente, en contraste con el
otro tubo de blanco.
Otro tipo de característica que se apreció fue la
presencia de calor de la reacción lo cual indica
que estamos ante la presencia de una reacción
exotérmica.

Solución de buffer,
Solución de buffer, y
extracto de hígado y
peróxido de hidrógeno
peróxido de hidrógeno
VII. Discusión

 La catalasa y la peroxidasa (células eucariotas) se encuentran en vesículas denominadas

peroxisomas, en el citoplasma celular, por lo tanto, el extracto enzimático se obtuvo a
partir del sobrenadante que resultó de la centrifugación del homogenado de cada
muestra (Cancho, García, Molano, Morejo, & Alfonso, 2012) (Universidad de Vigo,
2018). A razón de ser un estudio cualitativo el tampón fosfato (pH 7.0) cumplió la
función de solvente y regulador de pH; en consecuencia, no se purificó el extracto con
otros solventes (Hans & Wauwatousa, 1961).
 Las peroxidasas son enzimas que se encuentran en células vegetales, en el citoplasma
y es una enzima que cataliza la oxidación de compuestos dadores de oxígeno, por medio
del peróxido de hidrogeno, Castro (2006) indica que el principal substrato oxidable más
usado es el guayacol, usado en el extracto enzimático proveniente del rábano para
detectar la peroxidasa debido a que la enzima oxida el reactivo orignando la coloración
rojo ladrillo coincidiendo con los resultados obtenidos del extracto enzimático de
tomatillo (Physalis philadelphica), indicando positivo a la presencia de peroxidasa en
esta especie.
 La catalasa es una enzima antioxidante presente en la mayoría de los organismos
aerobios. Cataliza la dismutación del peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno.
La mayoría de estas enzimas son homotetrámeros con un grupo hemo en cada
subunidad. Se ha determinado la estructura cristalográfica de nueve catalasas. Algunas
catalasas tienen subunidades pequeñas (masa molecular ≈ 60 kDa) y otras grandes (masa
molecular > 80 kDa). Entre estos dos tipos de catalasas existen diferencias estructurales
importantes. Las catalasas pequeñas son menos resistentes a la desnaturalización, unen
NADPH, tienen hemo b y se inhiben e inactivan por sustrato. En cambio, las catalasas
grandes tienen un dominio extra en el C-terminal que es semejante a la flavodoxina, son
muy resistentes a la desnaturalización, tienen hemo d, presentan enlaces covalentes
inusuales cercanos al sitio activo y son resistentes a concentraciones molares de H2O2.
Aquí revisamos los aspectos estructurales de las catalasas y sus posibles implicaciones
funcionales. (Días, 2003)

VIII. Conclusiones
1. Se obtuvo un extracto enzimático no purificado (catalasa) de la muestra de hígado
de res y otro extracto no purificado (peroxidasa) de la muestra de tomatillo, mediante
el uso de tampón fosfato, para reproducir las condiciones de pH biológicas
normales.
2. Se observó una reacción exotérmica al colocar el peróxido en la muestra que
contenía solución de buffer y extracto de catalasa, en comparación con el reactivo
blanco. También apreciamos la reacción inmediata al apreciar la efervescencia de la
muestra lo que comprueba la presencia de la enzima catalasa en la muestra de hígado
(Bos taurus)

3. Se demostró la presencia de la enzima peroxidasa en muestras vegetales de tomatillo

(Physalis philadelphica), mediante un cambio de coloración del reactivo de
guayacol a color marrón ladrillo que demuestra la oxidación de sustrato.
IX. Bibliografía

Cancho, L., García, C., Molano, N., Morejo, J., & Alfonso, F. (2012). Acción y reconocimiento de la
catalasa. Revista IES San Pedro de Alcántara, 3-5.

Cheng, Q., Cheng, M., Wang, Y., Yao, M., Chen, Y., Gao, Y., & Ding, W. (2014). A simple method of
catalase purification for the undergraduate experimental course. Molecular Medicine
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Currea, C., & Martínez, S. (2014). La enzima caatlasa y su acción en tejidos animales y vegetales.
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http://www.uacj.mx/ICB/redcib/Documents/REB_DOC/2003/06/2003-2_LA%20ESTRUC_.pdf

Guarachi Condori, M., Paz Garcia, M., Terrazas Siles , E., & Giménez Turba, A. (2008). ÓRGANO
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http://www.revistasbolivianas.org.bo/pdf/rbfb/v16n1/v16n1a08.pdf

Hans, E., & Wauwatousa, W. (1961). Method of extracting catalase from liver. MIlwaukee: United
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Mazorra, L. M., & Nuñez, M. (2003). INFLUENCIA DE ANÁLOGOS DE BRASINOESTEROIDESEN LA

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