Guia Laboratorio Microbiologia Semestre 2008B

UNAC – FIARN Laboratorio Microbiología General
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y DE
RECURSOS NATURALES
GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

GENERAL
CARLOS TOME RAMOS

Biólogo con mención en Microbiología y Parasitología
CALLAO-2018-PERÚ
Blgo. Carlos Tome Ramos 1

REGLAMENTO DEL TRABAJO EN EL LABORATORIO DEL ÁREA DE

MICROBIOLOGÍA
1. La asistencia a las prácticas de Laboratorio es de carácter obligatorio.

2. El alumno debe presentarse al laboratorio a la hora programada, y tendrá 10 minutos de
tolerancia para su ingreso.
3. En caso de inasistencia, el alumno no podrá recuperar la práctica y no tendrá derecho a
presentar el informe correspondiente.
4. Si la inasistencia al laboratorio es justificada, el alumno tendrá una alternativa de recuperar la
práctica perdida en otro grupo horario durante la semana correspondiente. Este derecho se
aceptara solo una vez en el desarrollo del semestre académico.
5. Si la inasistencia es igual o mayor al 20% del número total de prácticas del laboratorio
programadas en el Syllabus, el alumno no será evaluado.
6. El alumno debe tener conocimiento del marco teórico, sobre el tema que corresponde
realizar, según su Syllabus.
7. El ingreso al laboratorio debe realizarse con guardapolvo puesto y los materiales que les
corresponden llevar, según la guía de práctica a desarrollar.
8. Si el alumno no cumple con llevar los materiales y/o muestras solicitadas por el profesor, la
práctica se considerará como realizada.
9. Para un aprendizaje coordinado, las prácticas de Laboratorio se realizan por subgrupos,
mínimo integradas por 4 a 5 alumnos.
10. La mesa de trabajo debe estar limpia y libre de materiales u objetos que no corresponden a
la práctica.
11. Sobre la mesa de trabajo solo debe estar los materiales correspondientes a la práctica y el
alumno debe portar su cuaderno de apuntes, lápiz, lapicero y colores.
12. Cada subgrupo, a través de su delegado (a), debe solicitar al auxiliar del laboratorio, los
materiales que dispone el laboratorio, para efectuar los experiencias programadas.
13. Los trabajos experimentales deben desarrollarse con la participación coordinada de todos los
integrantes del subgrupo.
14. El alumno no debe ingerir bebidas o alimentos durante su permanencia en el ambiente del
laboratorio.
15. Si un alumno deteriora o rompe algún material debe reponerlo a la brevedad posible.
16. Si el alumno (s) no repone el material que adeuda, el profesor tendrá que reportar dicha
deuda al jefe del laboratorio y, el alumno está en la obligación de reponer el material de
laboratorio antes de finalizar el semestre académico.
17. Una vez finalizado los trabajos experimentales, cada subgrupo, debe devolver los materiales
limpios, al auxiliar del laboratorio, para el guardado en su lugar correspondiente; y además
están en la obligación de dejar limpio su mesa de trabajo.
18. Antes de abandonar el ambiente del laboratorio, el alumno debe lavarse bien las manos con
abundante agua y jabón (jabón carbólico).
19. A la salida del laboratorio, el alumno procederá a quitarse el guardapolvo y guardarlo, para
luego recién poder realizar otras actividades.

20. Los informes de la práctica realizada deben ser presentados a la semana siguiente
manteniendo el siguiente formato: Carátula, Introducción, Materiales y Métodos, Resultados,
Discusión y Conclusiones, y Bibliografía.
21. En el informe puede adicionarse la solución de un cuestionario sobre un grupo de preguntas,
relacionados al tema, elaborado por el profesor.

INTRODUCCIÓN
El estudio general de los microorganismos requiere de técnicas que permitan su visualización,

aislamiento, identificación y demostración de ciertas actividades específicas que puedan realizar
estos organismos en la naturaleza. La presente Guía de Prácticas de Laboratorio de Microbiología
General tiene como finalidad que el alumno de Ingeniería Ambiental y de Recursos Naturales
aprenda de las técnicas básicas de estudio sobre los microorganismos en nuestro laboratorio y,
además que permita que el alumno tenga cierta autonomía para realizar los trabajos
experimentales que corresponde en cada sesión.
Las primeras prácticas están relacionadas a las técnicas de observación microscópica de los
microorganismos, la segunda parte relacionada al cultivo y caracterización macroscópica de
colonias microbianas, la tercera parte correspondiente a las técnicas que demuestran la actividad
de ciertos agentes antibacterianos y por último el estudio de los hongos. Estos trabajos prácticos
de laboratorio son complementarios a los temas que se desarrollan en las clases de teoría.
A través de este trabajo, espero contribuir en el aprendizaje de la asignatura de Microbiología

General y por ende en la formación profesional del Ingeniero Ambiental y de Recursos Naturales.

PRÁCTICA N° 1
MATERIALES Y EQUIPOS BÁSICOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
Objetivos
 Identificación de los materiales y equipos del laboratorio de microbiología

 Reconocimiento de la finalidad del uso de cada material y equipo.
 Adquirir destreza en la preparación de los materiales con fines de procedimientos
microbiológicos como el cultivo.
Los procedimientos de análisis o experimentación microbiológica requiere de la capacitación del

investigador en la manipulación y operación adecuada de materiales y equipos utilizados con el
fin de aislar, cultivar e identificar microorganismos.
Procedimiento
Representar los materiales, instrumentos y equipos de laboratorio de uso más frecuente en

microbiología
Matraz (erlenmeyer) y balón
Recipiente volumétrico, utilizado en la preparación y/o almacenamientos

de soluciones, reactivos y colorantes. Es frecuente su utilización en la
preparación, esterilización y almacenamiento de medios de cultivo
líquidos o sólidos.
Vaso de precipitado o beaker
Recipiente volumétrico de forma cilíndrica, utilizado en las

preparaciones de soluciones, reactivos y colorantes. Se adapta para
realizar mezclas utilizando dispositivos electromecánicos o manuales,
pudiendo ser en caliente o frío.
Probeta
Recipiente volumétrico de forma cilíndrica con graduación estandarizada

y utilizada en la medición de volúmenes de líquidos como el agua para la
preparación de soluciones, reactivos, colorantes y medios de cultivo.

Pipeta
Tubo cilíndrico con graduación estandarizada, utilizada en la medición

de volúmenes de líquidos con alta precisión. Las capacidades más
utilizadas corresponden a las pipetas de 1 ml, 5 ml y 10 ml.
Tubo de ensayo o de prueba
Tubo cilíndrico, obturado en uno de sus extremos, utilizado según sus

dimensiones para realizar pruebas bioquímicas de identificación
bacteriana (13 x 100 mm), cultivos especiales como la determinación de
NMP (16 x 150 mm)
Gradilla
Soporte metálico inoxidable o de otro material resistente, provisto de una

rejilla para la colocación de los tubos de ensayo.
Placa de Petri
Recipiente de vidrio o plástico (polipropileno), que consta de dos platos

circulares que encajan una actuando como base y la otra como tapa.
Adecuado para el cultivo de microorganismos ya que proporciona
suficiente área para su crecimiento y aislamiento.
Embudo aforado
Recipiente que consta de una plataforma circular con orificios en la base,

unido a un embudo colector, utilizado conjuntamente con filtros o
membranas de filtración para realizar filtraciones o esterilización de
líquidos por filtración y al vacio.
Matraz Kitasato
Componente del equipo de filtración que trabaja con el embudo aforado.

Es en sí un matraz convencional provisto de una tubuladura a nivel del
cuello, el cual se conecta al equipo de generación de vacío, para la
esterilización al frio.

Mechero de Bunsen y mecheros en general
Son utilizados para condicionar un espacio aséptico en la mesa de trabajo

y en el aire circundante a la llama, con la finalidad de realizar el trabajo
con material biológico y/o cultivo de microorganismos bajo condiciones
adecuadas de esterilidad.
Asa de siembra o de Kolle
Material constituido por un mango que sostiene una aguja de platino o

nicron, utilizado para realizar las inoculaciones, repiques y siembra de
los microorganismos en los medios de cultivo líquidos o sólidos.
Jarra de anaerobiosis
Recipiente cilíndrico con tapa de cierre hermético, utilizado para la

incubación y crecimiento de microorganismos microaerofílicos o
anaeróbicos.
Microscopio compuesto
Equipo de laboratorio esencial para la observación de células y

estructuras celulares con incremento de las dimensiones de las imágenes
en un rango de 40 a 1 000 veces el tamaño real del objeto en
observación.
Contador de colonias
Equipo provisto de una luna de aumento y una plataforma con

cuadrículas e iluminada, utilizado para el recuento de las colonias de los
microorganismos que desarrollan sobre los medios de cultivo sólidos.
Estufa
Equipo que contiene una cámara de calentamiento con flujo de aire seco
caliente, utilizado para la desecación de material biológico y para la
esterilización al seco (150 a 180 °C) de materiales de vidrio o metálicos.
Autoclave
Equipo que contiene una cámara de calentamiento por acumulación de

vapor de agua, con el consecuente incremento de la presión interna hasta
15 lb y de la temperatura hasta 121 °C. Utilizado para la esterilización de
medios de cultivo.

Incubadora
Equipo provisto de un termostato que regula la temperatura de una

cámara de crecimiento o incubación de microorganismos según la
necesidad del cultivo.
Centrífuga
Equipo provisto de un rotor que experimenta movimiento giratorio y

expone a los tubos y muestras que contienen a una fuerza centrífuga con
el fin de separar los componentes de una suspensión, basado en las
diferencias de su masa o peso.
Cámara aséptica (Flujo laminar)
Recinto aislado y con condiciones estériles generados artificialmente con

la finalidad de crear un espacio libre de microorganismos para evitar la
contaminación de los cultivos puros. Utiliza flujo y un sistema de
filtración de aire.
pH metro
Equipo utilizado para realizar los ajustes y mediciones del pH de las

soluciones y/o medios de cultivos destinados para el cultivo de
microorganismos. Para la preparación de soluciones amortiguadoras,
buffer o tampón.
Portaobjetos y cubreobjetos
Láminas de vidrio que se utilizan para la preparación de montajes de muestras de células o tejidos
y la preparación de los frotis microbianos.
Para que se utilizan las pipetas Pasteur
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Para que se utilizan las pizzetas
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Para que se utiliza el baño de agua (baño maría)
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Para que se utiliza la espátula de Drigalsky
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Otros procedimientos
 Preparar tapones de algodón para tubos de ensayo, matraces o balones.

 Colocar tapones de algodón en la base de las pipetas.
 Envolver pipetas y placas de Petri con papel Kraft para su esterilización.
 Colocar capuchones de papel Kraft en la boca taponada de matraces o balones.

PRÁCTICA N° 2
OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS EN FRESCO Y COLORACIÓN SIMPLE
OBJETIVOS
 Adquirir destreza en la preparación de muestras para la observación de estructuras

celulares vivas.
 Adquirir destreza en la preparación de muestras coloreadas para la observación al
microscopio.
Una de las ventajas de la observación al microscopio a través de preparados en fresco, es la

posibilidad de observar las estructuras celulares en su condición nativa e incluso vivas. La
coloración de células por lo general conlleva a su muerte y en alguna forma distorsiona la forma
y tamaño real de las células; sin embargo a pesar de esta desventaja, algunos microorganismos
como las bacterias sólo pueden ser claramente visibles en el microscopio óptico, si anteladamente
han sido coloreadas.
PROCEDIMIENTO
1. Preparaciones en fresco y fijación con un mordiente
a. Observación de microorganismos en agua estancada y/o fermento
 En una lámina portaobjetos colocar una gota de la muestra

 Colocar una laminilla cubre objetos y observar con objetivo de 10X y 40X
 Dibujar los microorganismos que observa (Observación 1)
 Añadir una gota de lugol en la preparación, observar con objetivo de 10 y 40X y
dibujar el nuevo aspecto de los microorganismos (Observación 2).
Observación 1 Observación 2

b. Observación de levaduras
 Colocar en una lámina portaobjetos una gota de un fermento (chicha) o de una

suspensión acuosa de levaduras.
 Colocar una laminilla cubre objetos y observar con objetivo de 10X y 40X
 Dibujar las levaduras (Observación 3)
 Añadir una gota de lugol en la preparación, observar con objetivo de 10X y 40X y
dibujar el nuevo aspecto de las levaduras (Observación 4).
2. Coloración simple
Observación de levaduras y bacterias coloreadas
 En una lámina portaobjetos, con la ayuda de una asa de siembra extender una gota de
fermento o suspensión de levaduras y dejar secar en el ambiente.
 En otra lámina realizar el extendido de una gota de yogurt y dejar secar en el
ambiente.
 Luego, realizar la fijación de las muestras, pasando por la llama del mechero el lado
que no contiene la muestra (3 veces).
 Cubrir las muestras con azul de metileno al 0,1 % durante un minuto. Luego de este
tiempo, descartar el exceso del colorante y lavar con un chorro de agua.
 Dejar secar y observar las coloraciones con el objetivo de inmersión.
 Dibujar la forma de las levaduras (Observación 5) y bacterias (Observación 6).

Completar la siguiente información:
1. Indique dos diferencias concretas de la observación en fresco y después de ser fijadas.
a.
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b.
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2. En las células microbianas, después de la fijación con lugol, que estructuras celulares se
hacen visibles.
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3. El lugol sobre que tipo de sustancias celulares se fija.
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4. Según la forma que presentan las bacterias, que nombres reciben
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5. Cuando un método de coloración es considerado simple
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Investigación:
1. Porque se recomienda colorantes básicos para la tinción de células bacterianas.

2. Señale los colorantes básicos más utilizados en la coloración de bacterias.

PRACTICA N° 3
COLORACIÓN DIEFERENCIAL O COMPUESTA: TÉCNICA DE GRAM
OBJETIVOS
 Adquirir destreza en la coloración de células bacterianas mediante la técnica de Gram.

 Reconocer las características diferenciales entre células Gram positivas y Gram negativas.
Los métodos de coloración compuesta son utilizados con la finalidad de establecer respuestas
diferenciales entre grupos microbianos con el fin de aproximarse a su identificación o
reconocimiento. Dos técnicas de coloración compuesta o diferencial son las más comunes: La
técnica de Gram y la coloración alcohol ácido resistente o técnica de Ziehl Neelsen.
La respuesta diferencial de las bacterias frente a la técnica de Gram se fundamenta en la

composición de su pared celular; así tenemos que en las Gram positivas la cantidad de mureina o
peptidoglucano es considerablemente mayor que en las Gram negativas y además contienen
ácidos teicoicos. Es posible que la mureina sea responsable del comportamiento de estas bacterias
frente a esta técnica de coloración. Las bacterias Gram negativas tienen una delgada capa de
mureina y más bien contienen una capa de lipopolisacáridos.
En la coloración alcohol ácido resistente se usa como principio diferencial el alto contenido de
lípidos en la pared celular de las micobacterias, especialmente el de la cera D.
PROCEDIMIENTO
1. Técnica de Gram
a. Frotis o extendido
La muestra (sarro dental, hisopado faríngeo, agua residual, yogurt, etc) se coloca en el
centro de una lámina porta objetos y con un asa de Kolle se extiende en la superficie
media.
b. Fijación
Consiste en calentar el envés de la lámina portaobjetos en la llama del mechero, con la

finalidad de que las células se adhieran a la superficie de la lámina.
c. Coloración primaria
Se cubre el frotis con el colorante primario cristal violeta o violeta de genciana durante
un minuto, tiempo luego del cual se lava el exceso con un chorro de agua destilada.

d. Mordiente
El frotis se cubre con una solución de lugol (solución de yodo y yoduro de potasio)
durante un minuto, tiempo luego del cual se lava el exceso.
e. Decoloración
Se realiza cubriendo el frotis con alcohol cetona por un periodo de tiempo aproximado de
10 segundos. Luego se lava con agua destilada.
f. Coloración secundaria o de contraste
Se hace cubriendo el frotis con safranina durante un minuto, tiempo después del que se
lava con agua destilada.
g. Observación al microscopio
Antes de la observación, la lámina debe secar completamente al medio ambiente y la

observación se hace con el objetivo de inmersión usando el aceite de cedro o de inmersión
(Observación 1, 2).
Completar la siguiente información:
1. Porque el colorante primario es retenido en las bacterias Gram positivas después de la

decoloración con alcohol cetona.
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2. Que función cumple el lugol en el proceso de la técnica de Gram.
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3. Que relación existe entre la composición de la pared celular de las bacterias Gram negativas
y la decoloración con alcohol cetona.
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Cuestionario e investigación:
1. Representar la estructura de la pared celular de bacterias Gram positivas y Gram negativas.

2. Investigue sobre la composición y estructura de la pared celular de las micobacterias.
3. Que características o propiedades de Mycobacterium tuberculosis hacen que el tratamiento de
la enfermedad esté basado en:
 La utilización de una mezcla de antibióticos
 Largo periodo de quimioterapia (6 meses)

PRACTICA N°. 4
COLORACIONES ESPECIALES
INTRODUCCIÓN:
Las observaciones más detalladas de las estructuras de los microorganismos, tales como las
Endosporas, cápsulas, flagelos y corpúsculos meta cromáticos, requieren de métodos especiales
en la utilización de tintes básicos.
COLORACIÓN DE ENDOSPORAS.- Las endosporas se observan fácilmente al microscopio

de luz, como cuerpos fuertemente refráctiles y como son muy impermeables a los colorantes,
requieren de un procedimiento especial. Los colorantes sencillos no penetran la pared de la
espora y por ello la célula con su endospora contiene un cuerpo oval ó esférico incoloro cuando
se coloca brevemente con cristal violeta o azul de metileno. Las endosporas pueden ser teñidas
por un procedimiento enérgico en el que se permite que los colorantes fuertes se pongan en
contacto con las células durante cierto tiempo, o se facilita la coloración por aplicación del calor.
COLORACIÓN DE CAPSULAS.- Las cápsulas son estructuras de ciertas especies bacterianas

que se forman a partir de la pared celular. Dada su naturaleza química (de preferencia complejos
carbohidratos extracelulares) ofrecen consistencia gelatinosa, por lo que tampoco son fáciles de
teñir.
COLORACIÓN DE CORPÚSCULOS METACROMATICOS.- Muchas bacterias acumulan

en su protoplasma grandes reservas de fosfato inorgánico insoluble en agua en forma de gránulos
de poli fosfatos. Con colorante de azul de Toluidina u otros tintes azules, se tornan de color
violáceo o ligeramente rojo violáceo; de ahí el nombre de metacromasis (cambio de color) y los
gránulos que se tiñen de esta manera, se denominan gránulos meta cromáticos. Este gránulo de
poli fosfato también se le denomina VOLUTINA.
OBJETIVOS:
 Ensayo de las técnicas de coloración para endosporas, cápsulas y corpúsculos meta

cromáticos.
 Evidenciar las diferentes estructuras microbianas mediante coloraciones específicas.
PROCEDIMIENTO:
1. Coloración de endosporas: Metodo de Wirtz-Conklin
 A partir de un cultivo de Bacillus, extender la muestra con el asa de siembra, sobre la lámina
portaobjetos.
 Fijar la muestra el calor y cubrir con Verde de Malaquita. Esperar que caliente hasta la
aparición de vapores por 5 minutos.

 Lavar con agua corriente.

 Contrastar con Safranina o con Fucsina básica por 1 minuto.
 Secar y observar con el lente de inmersión.
Resultados: Se deberá observar a las esporas de color verde y al resto del cuerpo bacteriano de
color rojo. Se determinará la posición de la espora dentro de la célula bacteriana, puede ser
terminal, sub terminal o central, dependiendo de la especie.
Observación
1. ¿A qué se debe la resistencia térmica de la endospora?

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2. ¿Qué importancia tienen las endosporas?

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3. ¿Explicar cómo pueden ser destruidas las endosporas?

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2. Coloración de capsulas: Metodo de Hiss
 La muestra de saliva o esputo de persona resfriada, proceder a extender igual que para la
coloración de bacterias ácido-resistentes, y fijar a la llama.
 Colorear con Fucsina básica o con Safranina, con suaves calentamientos hasta la salida de
vapores blancos durante 1 minuto.
 Lavar con solución de Sulfato de Cobre al 20% a chorro continuo.

 Secar y observar al microscopio.
3. Coloración de cápsulas: Método de la tinta china
 Sin fijar el frotis, se cubre con fucsina diluida durante dos minutos.
 Lavar con agua destilada y secar al aire.
 Se colocan en un extremo del porta objeto dos gotas de nigrosina o de tinta china y se hace
una extensión por el método de los dos portaobjetos. Se deja secar y se observa al
microscopio con objetivo de inmersión.
Resultados: En el primer caso se observarán diplococos con una cápsula de color azul suave y
las células acompañantes de color violeta o rosado (dependiendo del colorante utilizado).Y en la
segunda técnica, el fondo aparecerá negro, las bacterias teñidas de rojo y la cápsula como un halo
blanco que las envuelve
Observación
1.- ¿En que consiste una tinción positiva?

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2.- ¿En que consiste una tinción negativa?

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3.- ¿Todas las bacterias tienen la capacidad de formar cápsulas?

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c. Coloración de corpúsculos meta cromáticos
 Extender la muestra de saliva con sarro dentario sobre la lámina portaobjetos y fijar la
muestra al calor.
 Colorear con Azul de Metileno por 5 minutos.
 Secar y observar.
Resultados: Se observarán a los bacilos largos y ligeramente gruesos de color azul claro.
Observación
Indique la importancia de las inclusiones citoplasmáticas microbianas.

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CUESTIONARIO:
1. Haga la estructura de una endospora

2. Indique los géneros bacterianos más importantes que producen endosporas.
3. ¿Qué diferencia existe entre una endospora bacteriana y las esporas de otros organismos?
4. Indique las funciones de las cápsulas en la naturaleza.
5. Mencionar otros métodos de coloración de esporas.
6. Mencionar las principales características de los géneros Bacillus y Clostridium

PRÁCTICA N° 5
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
Objetivos
 Conocer la importancia y necesidad de la esterilización en los procedimientos

microbiológicos.
 Conocer los principios en que se basan la esterilización por transferencia de calor.
 Adquirir destreza en la utilización del autoclave y estufa.
La esterilización es un procedimiento frecuentemente empleado en microbiología por la

necesidad de contar con aislamientos o cepas puras de microorganismos para realizar los estudios
de comportamiento bioquímico y su respectiva identificación taxonómica: Así mismo en los
trabajos de numeración microbiana mediante cultivos in vitro es preciso utilizar medios de
cultivo o sustratos estériles y si se propagan células o estructuras de resistencia de
microorganismos con potencial patogénico es necesario eliminarlos (matarlos) mediante su
esterilización.
Los procedimientos de esterilización se basan en principios físicos y químicos; lo más utilizado

es la transferencia de calor ya sea con vapor de agua o aire caliente.
Procedimiento
1. Esterilización con vapor de agua caliente
El equipo que se utiliza para esta forma de esterilización se llama autoclave. Consta de doble
pared de acero inoxidable que encierra una cámara de aire que actúa como aislante. En la cámara
interna se calienta agua hasta hervir y producir vapor de agua que satura la cámara elevando la
presión y temperatura hasta niveles que destruyen o matan incluso esporas de bacterias y hongos
que son muy resistentes a la ebullición y desecación. En este equipo es posible esterilizar
materiales metálicos, de vidrio, de fibra de celulosa o nitrocelulosa, de poli estireno resistente a la
esterilización y medios de cultivo o soluciones acuosas. También se pueden esterilizara tejidos o
fluidos contaminados con microorganismos patógenos.
Que función cumple la espita

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Que combinación de temperatura, presión y tiempo son recomendables para la esterilización de

materiales y soluciones de pequeño volumen.
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Represente el autoclave indicando con claridad la espita, el manómetro, el termómetro, los

bulones la válvula de seguridad, el conducto de desfogue.
Que modificación del protocolo usual de este método aplicaría para esterilizar un medio o
sustrato que tiene alta diversidad y densidad de microorganismos (suelo) productores de
estructuras de resistencia como esporas.
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Porque no se esterilizan antibióticos y vitaminas a través del uso del autoclave.

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Que elemento o agente físico realiza la transferencia de calor en el autoclave.

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2. Esterilización con aire caliente
El equipo utilizado para esta forma de esterilización es la estufa u horno que consta de un sistema
de resistencias que calienta el aire y lo impulsa mediante un ventilador a la cámara interna donde
se encuentran los materiales para esterilizar.
Al igual que el autoclave consta de doble pared de acero inoxidable que forma una cámara
externa de aire que actúa como aislante. En este equipo pueden esterilizarse materiales metálicos
y de vidrio. La esterilización de materiales de fibras de celulosa o nitrocelulosa se limitan a
temperaturas inferiores a 150 °C y soluciones o medios de cultivo no pueden ser esterilizados a
través de la estufa.
Haga un esquema de la posible estructura de una estufa indicando la ubicación de las resistencias
que calientan el aire y de la dirección de flujo del aire caliente.
Que combinaciones de temperatura, presión y tiempo fueron indicados como recomendables para
lograra la esterilización de materiales.
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Marque con una X cual de los siguientes materiales pueden ser esterilizados con seguridad
mediante la estufa.
Tubos de ensayo ( ) Escarpelo ( )

Pinzas quirúrgicas ( ) Hisopos ( )

Paños de gasa ( ) Placas de Petri( )
Que elemento o agente físico realiza la transferencia de calor en la estufa.

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Preguntas de investigación
1. Que método de esterilización se recomienda o usa para una solución de antibióticos,

vitaminas o cofactores enzimáticos
2. Explique el mecanismo molecular a través del cual se logra la esterilización con rayos
ultravioleta
3. Describa la utilización de tres agentes químicos mediante los cuales se esteriliza
4. Establezca diferencias entre desinfección y esterilización

PRÁCTICA N° 6
MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVOS
 Reconocer las características de los principales medios de cultivo usados en el estudio de

microorganismos de importancia ambiental.
 Aprender la metodología de utilización de los medios de cultivo para el aislamiento y
cultivo de microorganismos de importancia ambiental.
El cultivo in vitro de los microorganismos requiere necesariamente del uso de un sustrato y un

ambiente artificial ajustado a las condiciones mínimas de crecimiento; con este fin se han
desarrollado diferentes medios de cultivo que proveen como mínimo de una fuente de carbono,
nitrógeno, factores especiales de crecimiento (vitaminas y cofactores enzimáticos), sustancias
para la regulación de pH y sustancias para la regulación de la presión osmótica. Por otro lado
para lograr el adecuado crecimiento de los microorganismos se ejerce control sobre la
temperatura a través de la incubadora y sobre el potencial de oxido reducción mediante la
provisión de oxígeno molecular.
Clasificación de medios de cultivo
Existen varias formas de clasificar los medios de cultivo. Una forma muy básica de clasificarlos
es identificándolos como medios de cultivo sólidos y líquidos de acuerdo a su consistencia, como
simples o compuestos de acuerdo a su composición. La clasificación que utilizaremos en la
presente práctica es por la composición y función del medio de cultivo:
1. Medios nutritivos
Se caracterizan porque proveen los elementos mínimos necesarios para el crecimiento de

microorganismos de diferentes grupos taxonómicos y no tienen elementos inhibitorios.
Ejemplos Agar o caldo nutritivo, Agar Plate Count y Agar Métodos Estándar donde
pueden crecer bacterias y hongos.
2. Medios enriquecidos
Son los que además de los elementos mínimos necesarios poseen sustancias que mejoran
la calidad nutricional del medio de cultivo y es utilizado para el crecimiento de
microorganismos exigentes. Ejemplos Caldo infusión cerebro corazón y Agar sangre
(tiene como base un medio nutritivo al que se le agrega sangre desfibrinada en un 5 %)
donde pueden crecer cepas de Streptococcus, Staphylococcus, Campylobacter jejuni,
Helicobacter pylori.

3. Medios selectivos
Son los que poseen elementos o sustancias que ejercen una condición de selectividad, es
decir inhiben el crecimiento de un determinado grupo taxonómico microbiano y
favoreciendo de este modo el crecimiento de otro gripo taxonómico. Ejemplo el Agar
EMB (Eosin Methylene Blue) y Agar MacConkey para el crecimiento selectivo de entero
bacterias (coliformes) e inhibición de cocos Gram positivos. Agar Manitol Salado para el
crecimiento selectivo de cocos Gram positivos como Staphylococcus y Estreptococos y la
inhibición de coliformes. Agar Sabouraud para el crecimiento selectivo de mohos y
levaduras y la inhibición de bacterias.
4. Medios diferenciales
Se caracterizan porque en su composición contienen sustancias o elementos que permiten

medir la capacidad metabólica de los microorganismos, es por ello que a través de estos
medios de cultivo se determina el comportamiento o perfil bioquímico de bacterias y
levaduras. Los medios diferenciales utilizados para la caracterización o identificación de
coliformes son los más conocidos y utilizados en la práctica microbiológica. Ejemplo
Agar Triple Azúcar Hierro (TSI) para determinar la capacidad de uso fermentativo u
oxidativo de la glucosa, sacarosa y lactosa, Agar Lisina Hierro (LIA) para determinar la
capacidad de uso desaminante o descarboxilante de la lisina y la producción de sulfuro de
hidrógeno, Agar Citrato de Simmons para determinar la utilización del citrato como única
fuente de carbono.
PROCEDIMIENTO
Cultivo en medio nutritivo
Indicar en cada elemento o sustancia que compone el Agar Plate Count si se constituye en fuente
de carbono (C), fuente de nitrógeno (N), fuente de cofactores enzimáticos y/o vitaminas (Vit) y
que condición o factor de crecimiento permite regular: pH, presión osmótica (). Observe el
ejemplo descrito para el Agar Nutritivo.
Agar Nutritivo estándar I Elemento o factor de crecimiento Cant.

C N Vit pH  g/L
Peptona X X 15.0
Extracto de levadura X X 3.0
Cloruro de sodio X 6.0
D – Glucosa X 1.0
Agar (polímero usado para la 12.0
gelificación)
pH = 7.5  .2 a 25 °C
Autoclavar a 121 °C durante 15
minutos

Agar Plate Count Elemento o factor de crecimiento Cant.

(Casein – peptone Dextrose Yeast C N Vit pH  g/L
Agar)
Peptona de caseina 5.0
Extracto de levadura 2.5
D – Glucosa 1.0
gelificación)
pH = 7.5  .2 a 25 °C
Modo de esterilización:
Destapar y exponer al contacto con el aire una placa de Petri conteniendo Agar Plate Count
durante dos minutos con el fin de que esporas o células vegetativas de hongos y bacterias se
adhieran sobre el medio de cultivo y generan colonias luego de su incubación a 30 °C durante 48
horas.
Cultivo en medio enriquecido
Indicar en cada elemento o sustancia que compone el Agar Sangre (con medio base sangre) si se
constituye en fuente de carbono (C), fuente de nitrógeno (N), fuente de cofactores enzimáticos
y/o vitaminas (Vit) y que condición o factor de crecimiento permite regular: pH, presión osmótica
().
Agar Sangre Elemento o factor de crecimiento Cant.

(composición de medio base sangre) C N Vit pH  g/L
Extracto de carne 10.0
Peptonas 10.0
Cloruro de sodio 5.0
gelificación)
Sangre desfibrinada 50 ml
pH = 6.8  .2 a 25 °C

Cultivo en medio selectivo
Completar el cuadro para el Agar EMB según corresponda. En la columna con ( I ) anotar (Inh)
si la actividad del componente es inhibir el crecimiento de modo selectivo o (Ind) si la función es
actuar como indicador de la ocurrencia de una reacción.
Agar EMB Elemento o factor de crecimiento Cant.

Eosin Methylene – blue Lactose C N Vit pH  I g/L
Sucrose Agar
Peptona 10.0
K2HPO4 2.0
Lactosa 5.0
Sacarosa 5.0
Eosina Y 0.4
Azul de metileno 0.07
Agar (polímero para la gelificación) 13.5
pH = 7.5  .2 a 25 °C
Completar el cuadro para el Agar MacConkey según corresponda. En la columna con ( I )

anotar (Inh) si la actividad del componente es inhibir el crecimiento de modo selectivo o (Ind) si
la función es actuar como indicador de la ocurrencia de una reacción.
Agar EMB Elemento o factor de crecimiento Cant.

Eosin Methylene – blue Lactose C N Vit pH  I g/L
Sucrose Agar
Peptona de caseina 17.0
Peptona de carne 3.0
Lactosa 10.0
Sales biliares 1.5
Rojo neutro 0.03
Cristal violeta 0.001
pH = 7.5  .2 a 25 °C
Completar el cuadro para el Agar Manitol Salado según corresponda. En la columna con ( I )
anotar (Inh) si la actividad del componente es inhibir el crecimiento de modo selectivo o (Ind) si
la función es actuar como indicador de la ocurrencia de una reacción.

Agar Manitol Salado Elemento o factor de crecimiento Cant.

Mannitol Salt Phenol – red Agar C N Vit pH  I g/L
Peptona 10.0
Manitol 10.0
Rojo de fenol 0.025
pH = 7.5  .2 a 25 °C
Completar el cuadro para el Agar Saboraud 2 % de glucosa según corresponda
Agar Sabouraud Elemento o factor de crecimiento Cant.

Sabouraud – 2 % Dextrosa Agar C N Vit pH  g/L
Peptona 10.0
Glucosa o maltosa 20.0
gelificación)
Opcional (cloranfenicol 50 mg/L)
pH = 6.8  .2 a 25 °C
 En el Agar EMB sembrar mediante el asa de Kolle una muestra de agua servida o agua de
uso recreacional. Incubar a 37 °C por 24 – 48 horas.
 En el Agar Manitol Salado sembrar mediante el asa de Kolle una suspensión de agua de
queso triturado en una proporción de 10 % (10 g queso - 90 ml de agua destilada estéril).
Incubar a 37 °C por 24 – 48 horas.
 En el Agar Sabouraud sembrar mediante el asa de Kolle agua de lavado de fruta (lavar
una muestra de uvas en agua destilada estéril). Incubar a 30 °C por 24 – 48 horas.
Medios diferenciales
Completar el cuadro para el Agar TSI según corresponda. En la columna con (I) anotar (Inh) si la
actividad del componente es inhibir el crecimiento de modo selectivo o (Ind) si la función es

Agar TSI Elemento o factor de crecimiento Cant.

Triple Sugar Iron Agar C N Vit pH  I g/L
Peptona de caseína 15.0
Lactosa 10.0
Sacarosa 10.0
Glucosa 1.0
Citrato férrico (III) amónico 0.5
Tiosulfato de sodio 0.5
Rojo de fenol 0.024
pH = 7.5  .2 a 25 °C
Completar el cuadro para el Agar LIA según corresponda. En la columna con (I) anotar (Inh) si
la actividad del componente es inhibir el crecimiento de modo selectivo o (Ind) si la función es
Agar LIA Elemento o factor de crecimiento Cant.

Lisien Iron Agar C N Vit pH  I g/L
L- Lisina 10.0
Tiosulfato de sodio 0.04
Citrato férrico (III) amónico 0.5
Púrpura de bromocresol 0.02
gelificación)
pH = 7.5  .2 a 25 °C

PRACTICA N° 7
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
INTRODUCCIÓN
En la Naturaleza, los microorganismos viven casi siempre en mezclas. Por tanto, es necesario,
antes de estudiar las características de un microorganismo en particular, que éste sea aislado en
un cultivo puro. El procedimiento general para lograr el aislamiento de un microorganismo en un
cultivo puro, consiste en usar un medio de cultivo y condiciones de incubación que estimulen el
crecimiento y que inhiban el crecimiento de otros organismos acompañantes. La esencia para
tener éxito en el cultivo de microorganismos es tratar de practicar una técnica aséptica. Esta
técnica requiere la preparación de un medio de cultivo estéril y la manipulación de los cultivo en
condiciones que eviten la contaminación con sustancias extrañas.
Los métodos de siembra varían de acuerdo al dispositivo de siembra y a la forma de distribuir el

inóculo y pueden ser: Aislamiento por estriado, Por diseminación y Por Difusión.
OBJETIVOS
 Aislamiento de bacterias aerobias en placas Petri por los métodos de estriado y

diseminación.
 Manejar los procedimientos de la recolección, el procesamiento de las muestras y los
métodos de aislamiento.
PROCEDIMIENTO
Antes de realizar la siembra, se debe plaquear los medios de cultivo, preparados durante el
desarrollo de las prácticas anteriores. El procedimiento se realizará en asepsia, para evitar la
contaminación.
 Primero, se calentarán los medios de cultivo y esperar a que se vuelvan al estado líquido,
en el Baño María a 90° C.
 Se tomará cada placa Petri estéril y delante del mechero se le adicionará un volumen de
15 ml del medio de cultivo enfriado a 55° C.
 Se sellará la placa y se esperará a que solidifique el medio para proceder a invertir la placa
e incubar.
Aislamiento por el método de estriado
 Quemar el asa de siembra al rojo, y destapar el frasco en el cual se encuentra la muestra

con el dedo meñique y margen cubital de la mano derecha.
 Cargar el asa en aro con el inóculo del cultivo. Flamear previamente la boca del tubo
antes y después de extraída la muestra.
 Tomar con la mano izquierda la placa Petri con agar, el dedo índice actúa como bisagra y
levantar con el pulgar, la tapa de la placa. Realizar todo ello, a la altura del mechero.

 Descargar el inóculo en un punto de la capa superficial de la placa Petri, y con el asa

misma, describir las ESTRIAS hasta el margen opuesto de la placa, cuidando de no
romper el medio.
 En el caso del estriado por planos, repetir las anteriores operaciones, hasta la descarga del
inóculo. Describir las estrías en el primer plano, hacer un cuarto de giro a la placa y
describir las estrías en el segundo plano, y así hasta completar tantos planos como sea
necesario sembrar.
 Dejar caer suavemente la tapa de la placa con el control de los dedos pulgar e índice.
 Rotular los datos sobre el dorso de la placa Petri, escribiendo: Nombre del grupo, tipo de
siembra y fecha.
 Incubar a 37° C durante 24 a 48 horas, colocando las placas en la estufa en posición
invertida.
Aislamiento por el método de diseminación
 Tomar el inóculo de la muestra, con la pipeta Pasteur, Flamear previamente la boca del
tubo antes y después de extraída la muestra.
 Depositar una gota del inóculo sobre la superficie del medio. Cerrar la placa a la llama del
mechero y devolver el sobrante de la muestra al tubo de cultivo.
 Calentar al mechero la espátula de Drigalsky y esterilizar. Destapar con la mano izquierda
lo necesario para introducir la espátula.
 Diseminar la gota del cultivo con la espátula, por la superficie del medio. Desechar la
espátula.
 Rotular los datos sobre el dorso de la placa Petri, escribiendo: Nombre del grupo, tipo de
siembra y fecha.
 Incubar a 37° C durante 24 a 48 horas, colocando las placas en la estufa en posición
invertida.
RESULTADOS
Hacer esquemas de cada uno de los métodos de aislamiento, y describir cuidadosamente, sobre lo
realizado en práctica. Los alumnos deberán estar alertas por revisar sus aislamientos, sobre todo
por si se produjera contaminación en alguna placa, ésta deberá ser descartada de inmediato.
CUESTIONARIO
 Explique las recomendaciones generales que se debe tener en cuenta para realizar un
adecuado aislamiento de microorganismos.
 ¿Cuáles son las muestras problemas que pueden tomarse y cuáles son las normas
específicas para colectarlas?
 ¿Cuál es la finalidad del aislamiento de microorganismos?
 ¿Qué es un CLON?
 Explique los métodos para el aislamiento y cultivo de bacterias anaerobias.
 ¿Si desea realizar recuento de células bacterianas, qué método de siembra emplearía? ¿Por
qué?

PRACTICA Nº 8
MORFOLOGÍA DE COLONIAS
INTRODUCCIÓN
Las colonias son masas microbianas definidas separadas entre sí. Cada colonia, no viene a ser
sino el resultado de la multiplicación logarítmica de una célula depositada en un punto del medio
sólido, que en condiciones óptimas de crecimiento forma su progenie con sus características
distintivas de especies o grupos bacterianos.
La morfología de las colonias puede depender de varios factores: naturaleza del medio para el
vigor del crecimiento, temperatura y tiempo de incubación, modo de división celular y tipo de
movimiento post-fisión; en consecuencia, una variedad de bacteria tiende a formar
constantemente el mismo tipo general de colonia cuando crece sobre el mismo medio y bajo
iguales condiciones. De esta manera, por sus caracteres ayuda grandemente a la identificación.
Los principales caracteres tomados en cuenta para la descripción de una colonia son: forma,
tamaño, borde, elevación, textura de la superficie, consistencia, grado de adherencia al medio,
cromo génesis.
Forma : Circular, alargada, irregular, filamentosa, rizoide, fusiforme

Tamaño : Puntiformes, pequeños, medianos, grande, extendido en
Velo, invadiendo toda la superficie del medio.
Borde : Entero, dentado, lobulado, rizoide.
Elevación : Plana, convexo, acuminada, umbilical.
Textura : Superficie lisa, superficie rugosa. etc.
Consistencia : Mucoide, seco, viscosa, friable.
Transparencia : Transparente, traslúcida, opaca.
Cromogénesis : Blanco, amarillo, gris, verde, rojo, crema, etc.
OBJETIVO:
 Reconocer los diversos parámetros que se toman en cuenta para describir una colonia
bacteriana.
 Relacionar la morfología colonial con la capacidad tintorial.
PROCEDIMIENTO:
 Seleccionar 5 colonias bacterianas y marcarlos.

 Con los cuidados indicados por el profesor, proceder a la descripción de cada colonia,
considerando los principales caracteres descritos anteriormente.
 Realizar la coloración Gram de cada colonia descrita y observar al microscopio.

RESULTADOS
Determinar la descripción de las colonias con la morfología celular y Gram. Así por ejemplo:
a. Colonias tipo rocío, cocos en cadena, GRAM POSITIVOS

b. Colonias circulares ( 3 mm.), borde entero, cremosas, convexas, opacos, cocos en racimo,
GRAM POSITIVOS
c. Colonias irregulares (3 a 4 mm.), aplanadas, blancas y opacas, bacilos rectangulares largos en
cadena, GRAM POSITIVO.
d. Colonia circular, lisa, borde entero, transparente, convexa, bacilos pequeños, GRAM
NEGATIVOS.
EJERCICIO
De las colonias seleccionadas, haga la descripción en el siguiente cuadro, según las características
indicadas:
Característica Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3 Colonia 4 Colonia 5

Forma
Tamaño
Borde
Elevación
Textura
Consistencia
Transparencia
Cromogénesis
Gram
CUESTIONARIO:
 ¿En qué consiste el movimiento post-fisión? Explique los tipos.

 ¿Qué importancia tiene la producción de pigmentos microbianos en la naturaleza?

PARTE III
DEMOSTRACIÓN DE LA INFLUENCIA DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS SOBRE

EL CRECIMIENTO MICROBIANO

PRACTICA N°. 9
ACCION DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS
I. INTRODUCCIÓN:
En la actualidad disponemos de varios agentes físicos y químicos para destruir a

las células bacterianas o por lo menos para evitar su multiplicación. La utilización
correcta de éstos agentes nos permite controlar a los microorganismos, y en ello radica la
importancia de conocer las técnicas para demostrar su efecto y estandarizar su aplicación.
En esta práctica revisaremos la metodología para demostrar la influencia de ciertos
agentes físicos y químicos más importantes utilizados para controlar las poblaciones de
microorganismos matando y/o evitando la multiplicación de las células.
II. OBJETIVOS:
a. Determinar la zona térmica letal de una bacteria

b. Demostrar el efecto de la presión osmótica sobre el crecimiento
microbiano.
c. Demostrar el poder germicida de la luz UV sobre una célula bacteriana
d. Demostrar la acción de un colorante sobre el crecimiento de los
microorganismos.
III. EQUIPOS Y MATERIALES:
1. Baño María, Incubadora, autoclave, estufa esterilizadora, cámara con luz UV.
2. Cultivo en caldo de una bacteria, Agar nutricio, Sacarosa o Cl Na, Cristal violeta.
3. Tubos estériles, Placas Petri estériles.
4. Mechero, alcohol, algodón, asa de siembra.
IV. PROCEDIMIENTO:
1. ACCION DE LOS AGENTES FÍSICOS:
1.11 Determinación de la zona térmica letal.

- Distribuir el cultivo de bacteria en caldo en 4 tubos estériles, 1ml. a cada uno.
- Colocar en baño maría a 50ºC, 70ºC, 100ºC durante 10 minutos cada tubo
respectivamente.
- Colocar el último tubo al autoclave a 121 ºC durante 10 minutos.
- Transcurrido los 10 minutos, enfriarlo bruscamente en agua fría.
- Una vez enfriado, tomar 1ml. y proceder a sembrar por el método de
difusión en un medio común.
- Rotular datos e incubar a 37° C por 24 a 48 horas.

1.2 Acción de la Presión Osmótica.

- En las placas con agar nutricio (medio común) y con una concentración del
5%, 10%, 20% y 40% de Cl Na o 30%, 40%, 50% de Sacarosa, sembrar una cepa
bacteriana.
- Para el control, sembrar en una placa con agar nutricio (medio común).
- Incubar a 37° C por 24 a 48 horas.
1.3 Acción de la Luz Ultravioleta

 Inocular 4 placas de petri, conteniendo un medio común, con la cepa en estudio
 Exponer a la luz ultravioleta tres de las cuatro placas, en las siguientes condiciones:
Dos placas destapadas durante 10 minutos
Dos placas tapadas durante 10 minutos
 Incubar a 37ºC en la oscuridad durante 24-48 horas. Observar el crecimiento de los
microorganismos.
2. ACCION DE LOS AGENTES QUÍMICOS:
2.11 Acción de los Colorantes:

- En una placa con Agar nutricio y 1% de cristal violeta (o un medio con
colorante como el agar McConkey, EMB, etc), colocar una impresión del dedo de
la mano previamente introducido en las fosas nasales.
- De la misma forma dejar la impresión del dedo de la mano en otra placa con
agar nutricio sin el colorante (control).
- Incubar a 37° C, 24 a 48 hora.
V. RESULTADOS:
EXPERIMENTO RESULTADO OBSERVACIONES

50ºC
TEMPERATURA 70ºC
DE MUERTE 100ºC
121ºC
Control
PRESION ___%
OSMOTICA ___%
___%
___%
Control
LUZ Destapado
ULTRAVIOLETA
Tapado
Control

c/colorante
COLORANTE
s/colorante
VI. CUESTIONARIO:
1) ¿Qué importancia tiene determinar la zona térmica letal?

2) ¿Qué factores influyen en la desinfección?
3) Explique las condiciones que pueden variar la zona térmica letal.
4) Explique como se determina el poder destructor de los desinfectantes. ¿Qué es el
coeficiente fenol?

PARTE IV
ESTUDIO DE LOS HONGOS

PRACTICA N°. 10
METODOS DE ESTUDIO DE LOS HONGOS
I. INTRODUCCIÓN:
Los hongos son organismos no fotosintéticos que proliferan como una masa de
filamentos ramificados, entrelazados (hifas) conocido como micelio. Las formas
miceliales se llaman mohos, y los que no forman micelio y son unicelulares levaduras.
El estudio de los Hongos se realiza a nivel macroscópico y microscópico.
El estudio macroscópico se realiza a partir del cultivo puro, describiéndose al
detalle sus características más importantes: Aspecto, Superficie, Color, Difusión del
pigmento en el medio y velocidad de crecimiento.
En el estudio microscópico se realiza; un examen directo con Azul de Lactofenol
y/o utilizando al método de la cinta adhesiva; y la técnica de microcultivo para estudiar
las estructuras de reproducción de los hongos.
II. OBJETIVOS:
1. Realizar preparaciones en fresco y en cinta adhesiva de distintas especies de mohos.

2. Observar la morfología de los hongos y distinguir entre hifas septadas y no septadas y entre
distintos tipos de esporas y las estructuras que las originan.
3. Observar las levaduras en gemación
4. Cultivo y descripción de las colonias de hongos.
5. Microcultivo e identificación de género de mohos
III. MATERIALES:
1. Agar Sabouraud glucosado en placas Petri o el Agar OGYE.

2. Muestra de pan con moho, Levadura de panificación.
3. Placas Petri con varilla en U, láminas porta objetos y laminillas estériles.
4. Asa de siembra en ángulos recto, pinzas, bisturí, pipeta Pasteur.
5. Trozos de algodón estéril humedecidos en agua destilada, cinta adhesiva.
IV. PROCEDIMIENTO:
EXAMENT DIRECTO:
1.1 Montaje en Azul de Lacto fenol.-

1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado
grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa.
Realizar la misma operación en otro portaobjetos que se usará para lavar la muestra.

2. Tomar el material a observar en una mínima cantidad con agujas finas o lancetas
procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno de
los portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el exceso de
conidias que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver lo que
realmente interesa, los conidióforos.
3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que será ya el
definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas tapizadas en su
interior por los conidióforos), se aplastarán éstos ligeramente sobre la gota o se
seccionarán con un bisturí.
4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quede
amontonado.
5. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que se
formen burbujas entre los dos vidrios.
1.2 Técnica de la Cinta Adhesiva.-

1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado grande
para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa.
2. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente de 2 a 4 cm.
3. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la fruta o el pan enmohecidos o
el borde de una colonia de hongo de un cultivo. En la zona central de una colonia
puede haber una excesiva concentración de esporas.
4. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos.
5. Eliminar el colorante sobrante con un papel de filtro.

Aumento Total ____________ Aumento Total ____________
1. Determina si las hifas son septadas o no.
2. Forma, tamaño y disposición de las esporas.
3. Tipo de estructuras formadoras de esporas que se observan.
AISLAMIENTO DE MOHOS.
 De una muestra de moho de pan o de una fruta, con la ayuda del asa de siembra
coger un micelio y sembrar en puntura sobre la superficie de un agar para cultivo
de hongos.
 Incubar a 25 ºC por 72 horas a 7 días.
TÉCNICAS DE MICROCULTIVOS:
Microcultivo en Lámina.-
 Siembra:
 Con el bisturí cortar un trozo de ASG de 0.5 x 0.5 cm. y depositarlo
sobre una lámina porta objeto.
 Con el asa de siembra en ángulo recto recoger una pequeña porción del
cultivo de hongos y depositarlo en el centro de uno de los lados del

trozo de agar. Repetir el mismo procedimiento con los tres lados

restantes.
 Cubrir con una laminilla y colocarlo en una placa Petri.
 Depositar un trozo de algodón estéril húmedo dentro de la placa Petri.
 Incubar al medio ambiente por 3 a 7 días.
 Montaje:
 Con ayuda de una pinza, levantar la laminilla y depositarla sobre una
lámina porta objeto donde previamente se ha colocado una gota del
colorante (azul de lactofenol), quitar el exceso de colorante con papel
filtro (o papel higiénico) y sellar la lámina con esmalte de uñas.
 Eliminar cuidadosamente el trozo de agar de la lámina portaobjeto con
ayuda de un bisturí, o asa de siembra; depositar una gota de azul de
lactofenol sobre la lámina portaobjeto, cubrir con la laminilla, eliminar
el exceso de colorante y sellar con esmalte de uñas.
 Observar al microscopio los preparados realizados.

 Reconocer las estructuras, identificarlos y esquematizarlos.
Aumento Total ____________ Aumento Total ____________
V. CUESTIONARIO:
1) Indique y explique las estructuras de reproducción de los Hongos.

2) ¿Qué diferencias hay entre una célula bacteriana y un Hongo?
3) Importancia de los Hongos en la naturaleza.

BIBLIOGRAFÍA
1. BOB FREEMAN, 1989, “Microbiología de Barraus”, 22 Edición. Ed. Interamericana

S.A. México 1180 pags.
2. GERARD TORTORA, BERDELL FUNKE y CHRISTIAN L., 1993 “Introducción a
la microbiología”, Ed. Acribia S.A. Zaragoza España, 792 pags.
3. GERMAN VERGARAY, 1991 “Guía de trabajos prácticos”. UNMSM, facultad de
Ciencias biológicas, Departamento académico de Microbiología y parasitología Lima
Perú.
4. GUTIERRES MORENO, MERINO RAFAEL y TALLEDO RIVERA;1995;
“Prácticas de Laboratorio en Microbiología”; C. U.-UNMSM; Lima-Perú.
5. MADIGAN MICHAEL, MARTINKO, JHON, PARKER, JACK, 1997 “Biología de
los microorganismos”; octava edición; Ed. PRENTICE HAIL IBERIA, Madrid
España; 1064 págs.
Paginas Web:
 Aislamiento y cultivo de Microorganismos-Esterilización:

http://orbita.starmedia.com/sohail/micro1.htm
 Curso de Microbiología General de Enrique Iáñez:
http://www.ugr.es/eianez/Microbiología/04-Micro.html
 Ensayos Microbiológicos: htt://www.joseacortes.com/microbiologìa/index.htm
 Frotis Bacteriano por tinción simple: : http://www.joseacortes.com/pràcticas/tincion
simple.htm
 Laboratorio de Microbiología General I: http://eros,pquim.unam.mx/Departamento de
Biología/Pagina actual/Profesores/Lab-microI 06/cuestionarios.htm.
 Tinciòn de Esporas: htt://www.joseacortes.com/pràcticas/tincion esporas..htm.
 Tinciòn Gram: htt://www.joseacortes.com/pràcticas/tincion gram.htm.
 http://www.fing.edu.uy/iq/bio/Practico7_2006.pdf
 http://inspeccion-uvmi3.iespana.es/inde6983.htm
 http://www.doschivos.com/trabajos/biologia/45.htm
 http://www.unal.edu.co/medicina/Documentos/Microbiologia/IDENTIFICACION
%20BACTERIANA%20II%202005%20ago%2030.pdf

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UNAC – FIARN Laboratorio Microbiología General

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

CARLOS TOME RAMOS

Blgo. Carlos Tome Ramos 1

REGLAMENTO DEL TRABAJO EN EL LABORATORIO DEL ÁREA DE

1. La asistencia a las prácticas de Laboratorio es de carácter obligatorio.

Blgo. Carlos Tome Ramos 2

Blgo. Carlos Tome Ramos 3

El estudio general de los microorganismos requiere de técnicas que permitan su visualización,

A través de este trabajo, espero contribuir en el aprendizaje de la asignatura de Microbiología

Blgo. Carlos Tome Ramos 4

MATERIALES Y EQUIPOS BÁSICOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

 Identificación de los materiales y equipos del laboratorio de microbiología

Los procedimientos de análisis o experimentación microbiológica requiere de la capacitación del

Representar los materiales, instrumentos y equipos de laboratorio de uso más frecuente en

Matraz (erlenmeyer) y balón

Recipiente volumétrico, utilizado en la preparación y/o almacenamientos

Vaso de precipitado o beaker

Recipiente volumétrico de forma cilíndrica, utilizado en las

Recipiente volumétrico de forma cilíndrica con graduación estandarizada

Blgo. Carlos Tome Ramos 5

Tubo cilíndrico con graduación estandarizada, utilizada en la medición

Tubo de ensayo o de prueba

Tubo cilíndrico, obturado en uno de sus extremos, utilizado según sus

Soporte metálico inoxidable o de otro material resistente, provisto de una

Recipiente de vidrio o plástico (polipropileno), que consta de dos platos

Recipiente que consta de una plataforma circular con orificios en la base,

Componente del equipo de filtración que trabaja con el embudo aforado.

Blgo. Carlos Tome Ramos 6

Mechero de Bunsen y mecheros en general

Son utilizados para condicionar un espacio aséptico en la mesa de trabajo

Asa de siembra o de Kolle

Material constituido por un mango que sostiene una aguja de platino o

Recipiente cilíndrico con tapa de cierre hermético, utilizado para la

Equipo de laboratorio esencial para la observación de células y

Equipo provisto de una luna de aumento y una plataforma con

Equipo que contiene una cámara de calentamiento por acumulación de

Blgo. Carlos Tome Ramos 7

Equipo provisto de un termostato que regula la temperatura de una

Equipo provisto de un rotor que experimenta movimiento giratorio y

Cámara aséptica (Flujo laminar)

Recinto aislado y con condiciones estériles generados artificialmente con

Equipo utilizado para realizar los ajustes y mediciones del pH de las

Para que se utilizan las pipetas Pasteur

Para que se utilizan las pizzetas

Blgo. Carlos Tome Ramos 8

Para que se utiliza el baño de agua (baño maría)

Para que se utiliza la espátula de Drigalsky

 Preparar tapones de algodón para tubos de ensayo, matraces o balones.

Blgo. Carlos Tome Ramos 9

OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS EN FRESCO Y COLORACIÓN SIMPLE

 Adquirir destreza en la preparación de muestras para la observación de estructuras

Una de las ventajas de la observación al microscopio a través de preparados en fresco, es la

1. Preparaciones en fresco y fijación con un mordiente

a. Observación de microorganismos en agua estancada y/o fermento

 En una lámina portaobjetos colocar una gota de la muestra

Blgo. Carlos Tome Ramos 10

 Colocar en una lámina portaobjetos una gota de un fermento (chicha) o de una

Observación de levaduras y bacterias coloreadas

Blgo. Carlos Tome Ramos 11

Completar la siguiente información:

1. Indique dos diferencias concretas de la observación en fresco y después de ser fijadas.

_ __