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Kurs Ia: Fingerprint

Einleitung:
Die eigene genomische DNA wurde aus Mundschleimhautzellen isoliert, um anhand dieser
Rückschlüsse auf die Allele im genetischen Marker D1S80 zu ziehen. D1S80 befindet sich auf
dem kurzen Arm von Chromosom 1 und besitzt eine Sequenz von 16 Basenpaaren, die sich
wiederholt. Die Bezeichnung für diese Wiederholungssequenz ist „Variable Number of
Tandem Repeats“.

Material und Methode:


Vgl. Skript S. 15-19
Abweichende Durchführung: Aus nicht mehr nachvollziehbaren Gründen war Am zweiten
Versuchstag nur noch sehr wenig von meiner DNA-Lösung vorhanden. Daher ergab sich in der PCR
keine Bande.

Ergebnisse:

Abb. 1: Ergebnis der Gel-Elektrophorese. Die eigene Probe (Probe 7) führte wegen zu geringer DNA-
Menge zu keinen Banden.

In den Proben 1-3 +5+6 sind jeweils zwei Banden zu erkennen, bei Probe 4 nur eine.
Tabelle 1: Relative Laufstreckenlängen der jeweiligen Fragmentgrößen und der dekadische
Logarithmus der Fragmentgrößen der untersuchten DNA.

Fragmentgröße [in Bp] Laufstrecke [in cm] Log der Fragmentgröße


1000 0 3
900 0,2 2,95
800 0,4 2,90
700 0,6 2,85
600 0,8 2,78
500 1,1 2,70
400 1,4 2,60
300 1,8 2,48

Tabelle 2:

Probe Laufstrecke [in cm] Fragmentgröße Zygoterie


1 0,7/1,1 650/500 Heterozygot
2 0,8/1,1 600/500 Heterozygot
3 1,0/1,2 533/466 Heterozygot
4 1,5 375 Homozygot
5 0,7/1,0 650 Homozygot
6 0,9/1,3 566/433 Heterozygot
7 0 0 -

Ohne Berücksichtigung von Probe 7 ergibt sich hinsichtlich Zygoterie folgendes Ergebnis:
83,2% der Proben waren heterozygot und 16,7% homozygot.
Arbeitsblatt 1:

1) Führen Sie für alle 6 Personen eine DNA Typisierung anhand des folgenden
Beispielgels durch und berechnen Sie die Wahrscheinlichkeiten (in Prozent) für das
Auftreten der verschiedenen Allelkombinationen (mit Hilfe der Tabelle 1).

Vaterschaftstest A:

M: 24; 33 => P(24;33) = 0,379*0,006 = 0,227%

V: 22; 26 => P(22;26) = 0,252%

K: 22; 24 => P(22;24) = 2,38%

Vaterschaftstest B:

M: 18; 21 => P(18;21) = 0,585%

V: 21; 28 => P(21;28) = 0,235%

K: 18; 23 => P(18;23) = 0,292%

2) Kann im Beispiel A (siehe oben) das Kind vom Putativvater stammen? Wenn ja,
mit welcher Wahrscheinlichkeit (Rechnung Bayes Theorem)?
Ja, das Kind kann vom Putivvater stammen. Die Wahrscheinlichkeit dafür berechnet sich wie
folgt:
P = P(V)*P(K22/V)/(P(V)*P(K22/V) + P(-V)*P(K22/-V))
P(V): W.keit, daß der Putivvater der biolog.Vater ist (a priori) = 0,5
P(K22/V): W.keit, daß das Kind Allel 22 hat unter der Nebenbedingung, daß der Putivvater
sein Vater ist = W.keit dafür, daß der Putivvater Allel22 an K weitergegeben hat = 0,5.
P(K22/-V): W.keit dafür, daß K Allel 22 hat ohne daß der Putivvater sein Vater ist =
Häufigkeit des Allels in der Allgemeinbevölkerung.
P = 0,5*0,5/(0,5*0,5 + 0,063*0,5) = 0,888
Der Putivvater ist hier mit fast 90% Wahrscheinlichkeit der biologische Vater.

3) Kann im Beispiel 1B (siehe oben) das Kind vom Putativvater stammen? Wenn ja,
mit welcher Wahrscheinlichkeit (Rechnung Bayes Theorem)?
Auch hier kann das Kind vom Putivvater (P) stammen, allerdings mit einer viel niedrigeren
Wahrscheinlichkeit, da kein gemeinsames Allel vorliegt.
Die Wahrscheinlichkeit kann mit den vorliegenden Informationen nicht angegeben werden.
Es wäre z.B. eine Neumutation beim Kind möglich, ein Fehler bei der Analyse oder eine
vertauschte Probe. 100% ausgeschlossen werden kann eine Vaterschaft durch den Test
nicht.

4) Zurzeit sind 25 verschiedene Allele von D1S80 bekannt. Wie viele verschiedene
Klassen von Homozygoten gibt es demzufolge? Und wie viele verschiedene Klassen
von Heterozygoten? Wie viele verschiedene Genotypen sind also insgesamt
möglich?
Homozygote: 25
Heterozygote: 25*24 = 600
Genotypen: Homozygote + Heterozygote = 625

5) Die Grössen der PCR Produkte einer Familie sind 542 und 654 bp bei der Mutter
und 446 und 542 bp beim Vater. Wie würden alle möglichen DNA Fingerprints ihrer
gemeinsamen Kinder aussehen?
V: 542; 654
M: 446; 542
K:
 542; 446
 542; 542
 654; 446
 655; 542

6) Die Wahrscheinlichkeit, dass eine 40-jährige, symptomfreie Frau Brustkrebs hat,


beträgt 1%. Die Wahrscheinlichkeit, dass diese Krankheit mit einer Mammografie
erkannt wird, wenn sie vorliegt, beträgt 80%. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine
Mammografie fälschlicherweise auf Brustkrebs hinweist, obwohl die Krankheit gar
nicht vorliegt, beträgt 10%. Wie groß ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine 40-jährige,
symptomfreie Frau tatsächlich Brustkrebs hat, wenn sie einen positiven
Mammografiebefund erhalten hat?
P = (W.keit, daß F Brustkrebs UND Mammo positiv)/(W.keit, daß Mammo positiv)
P(Brustkrebs + Mammo positiv) = 1%*80%
P(kein Brustkrebs + Mammo positiv) = 99%*10%
=> P = 1%*80%/(1%*80% + 99%10%) = 0,075
Kurs Ib: Chromosomen
Einleitung:
Mittels Schrottschuss-Verfahren wurde die im Versuch 1a isolierte genomische DNA in
E.Coli-Zellen integriert und vervielfältigt. Zunächst wurde die DNA hierfür durch das Enzym
EcoRI, eine Restriktionsendonuklease, in unterschiedlich lange Fragmente geschnitten und
von einer sogenannten DNA-Ligase in ein Plasmid eingebunden. Anschließend wird ein
E.coli-Stamm diesem Plasmid ausgesetzt. Die E-Coli-Kultur wird dann auf einer Agarplatte
kultiviert und auf Antibiotikaresistenz und Fluoreszenz getestet.

Material und Methode:


Vgl. Skript S. 30-36

Ergebnisse:

Abb. 2: Mit DNA versetzter gewachsene E.coli-Kolonien. A) unter UV-Licht. B) Unter Tageslicht.

Auswertung:
Man erkennt, daß nicht überall auf der Platte Kolonien wachsen konnten und das unter den
gewachsenen Kolonien auch einige nicht fluoreszieren. Die E.Coli-Zellen bei denen
erfolgreich ein Plasmid integriert wurde, können auf antibiotikahaltigem Nährboden
wachsen. Da sie via Plasmid eine Antibiotika-Resistenz erhalten haben. Bakterien, die kein
Plasmid aufgenommen haben, werden durch das Antibiotikum abgetötet und können nicht
wachsen. Unter den resistenten kann man wiederum Kolonien unterscheiden, die ein
Plasmid mit Fremd-DNA besitzen und solche mit Plasmid ohne Fremd-DNA. Kolonien, die ein
Plasmid mit Fremd-DNA besitzen können nicht mehr fluoreszieren, weil kein funktionales
GFP-Protein mehr gebildet werden kann.
Berechnung der Klonierungseffizienz:
Gesamtanzahl der Kolonien auf der Antibiotikahaltige Agarplatte: 416
Davon fluoreszierend: 295
=> Nichtfluoreszierende = 416 – 295 = 121

Klonierungseffizienz: = = 4840
, ! "#
Kurs 3a: Plaskart

Einleitung:
Die im Versuchsteil 2a in E.Coli integrierten Plasmide wurden isoliert und mittels einer Gel-
Elektrophorese analysiert. Anhand der Bandenmuster können Rückschlüsse auf das
vorhanden sein von Inserts (Fremd-DNA) geschlossen werde.

Material und Methode:


Vgl. Skript, S. 43-46.

Ergebnisse:

Abb. 1: Auftrennung der E.coli-Plasmide in der Gel-Elektrophorese. Die eigenen Proben sind Banden
2+3.

Tabelle 1: Abhängigkeit der Laufstrecke von der Fragmentgröße

Laufstrecke Größe Laufstrecke Größe Laufstrecke Größe


[in cm] [kb] [in cm] [kb] [in cm] [in cm]
1kb-Größenstandard Stamm 7 Stamm 7
Ansatz A Ansatz B
3,5 10 - - - -
4,0 8 4,1 7,33 - -
4,3 6 - - - -
4,4 5 - 5 3,77 5,25
4,6 4 - - - -
4,9 3,5 4,8 3,67 - -
5,2 3 5,2 3,00 4,59 3
5,5 2,5 - - 4,87 2,5
5,8 2 - - - -
6,4 1,5 - - - -
7,1 1 - - 6,74 1
8,3 0,75 - - - -
9,1 0,5 - - - -
10,2 0,25 - - - -

Auswertung:
In der Gel-Elektrophorese (Abb. 1) ist zu erkennen, dass Kulturen mit und ohne Insert (Fremd-
DNA) im Plasmid vorkommen. Bei der Kultur mit Insert können die beiden Restriktionsenzyme
EcoRI und BamHI herauszuschneiden und so erkennbar machen. Die Insert-Bande sind
deutlich kleiner als die anderen Banden und können somit eine längere Strecke durch das Gel
zurücklegen.
Arbeitsblatt 2:
1) DNA verschiedener Individuen wurde mit EcoRI gespalten und elektrophoretisch
aufgetrennt. Durch Southern Blotting mit einer markierten humanen Gen-Sonde
wurden die folgenden Muster erzielt:

a) Wie können Sie die hier auftretenden Muster erklären? Erstellen Sie eine Karte
der Allele!
Es liegen vier verschiedene Allele vor:
1,9 kb und 3,1 kb müssen zu einem Gen gehören: Ind2 ist nämlich offenbar homozygot für ein
Gen aus nur einem Stück (5 kb). Ind5 hat dieses Allel und noch die beiden 1,9kb und 3,1 kb die
folglich einem zweiten Allel entsprechen müssen.
Entsprechendes ergibt sich für die Stücke 1,9 kb und 2,1 kb durch Vergleich von Ind4 und Ind9.

Ind1-4 sind homozygot für ein bestimmtes Allel. Ind5-10 sind hingegen heterozygot für die
nämlichen Gene und können z.B. durch Kreuzungen zwischen Ind1-4 (oder anderen)
hervorgegangen sein. Mögichkeiten:
Ind5: Ind2+1 (aber auch z.B. 8+7 usw.)
Ind6: Ind3+1
Ind7: Ind4+1
Ind8: Ind2+3
Ind9: Ind2+4
Ind10: Ind3+4

b) Wenn die Individuen 1 und 6 gemeinsame Kinder hätten, welche Banden würden
Sie dann bei den Nachkommen erwarten?
Zwei Möglichkeiten:
- 1,9 + 3,1 + 4,0
- 1,9 + 3,1

2) Wieviele EcoRI Restriktionsschnittstellen (erkennt GAATTC) erwarten Sie


a) im menschlichen Genom? (3 x 109)
EcoRI erkennt die Sequenz GAATTC, wo es zwischen G und A schneidet. Geht man davon
aus, daß es hochspezifisch für diese Frequenz ist und nimmt man an, daß in den Genomen
die 4 zur Verfügung stehenden Basen zufallsverteilt sind, ist die Wahrscheinlichkeit P für die
zufällige Bildung der Zielfrequenz P = 1/46. Der Erwartungswert E an Schnittstellen beträgt
also:
E = Genomlänge (in Anzahl der Basen)/46
=> für das Menschliche Genom ergibt sich: E = 3 x 109/46 = 732.422 Scnittstellen
b) im Genom von Drosophila? (1,8 x 108): E = 1,8 x 108/46 = 43.945
c) im Genom von E. coli? (4,2 x 106): E = 4,2 x 106/46 = 1025
d) im Genom eines HIV Virus? (9,7 x 103): E = 9,7 x 103/46 = 2