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Resonancia magnética nuclear

La mayoría de los núcleos atómicos poseen espín, la cual es una propiedad de las partículas
que componen a los átomos (2). Al momento de introducir átomos con espín nuclear a un campo
magnético externo, el núcleo se comporta como un pequeño imán y tiende a orientarse,
preferentemente, a favor del campo magnético. Si se aplica energía que obligue a los núcleos a
invertir el sentido de su orientación con respecto al campo magnético, se dice que el sistema está en
resonancia. A este fenómeno de excitación de los espínes nucleares se le
conoce como resonancia magnética nuclear. Esta energía aplicada, ∆E, corresponde a radiación
electromagnética de la región de las radiofrecuencias, la cual se rige por la relación:

∆E = h γ Bο / 2π (1)

donde h es la constante de Planck, γ es la constante giromagnética dependiente de cada núcleo y Bo es


el campo magnético aplicado. La γ es independiente del campo magnético externo aplicado, la cual puede
ser calculada a partir de la ecuación 1 empleando los datos de la Tabla 1. Con esta relación es posible
intercambiar los términos de energía requerida para la excitación, ∆E, campo magnético aplicado, Bo, y
frecuencia de la energía aplicada, ν, ya que se conserva la relación de Einstein dado por ∆E = hν,
siempre y cuando se defina el núcleo con el cual se está trabajando.
Núcleos activos en RMN comúnmente usados en el estudio de proteínas.
Frecuencia de
observación Abundancia Región normal
Núcleo Espín nuclear (MHz) a 14.1 Natural (%) (ppm)
Teslas
1H ½ 600.0 99.99 10 : 0
13C ½ 150.86 1.1 220 : 0
5Ν -½ 60.82 0.37 130 : 0
19F ½ 564.52 100.0 0 : -250
31P ½ 242.86 100.0 100 : -100

En la Figura 1 se muestra un equipo de RMN con Bo de 11.75 Teslas, el cual es el mínimo


requerido para determinar estructuras de proteínas. Si bien, se espera que todos los 1H absorban a esta
frecuencia, existen pequeñas variaciones (del orden de las centenas o millares de Hz) en las posiciones
exactas de excitación para cada núcleo de la misma especie química.

El desplazamiento químico de núcleos como los mencionados anteriormente varía en cientos o miles de
Hz; por tanto, todos los núcleos de un elemento en específico se observan en una región relativamente
pequeña. Por regla general, núcleos equivalentes tienen desplazamientos químicos iguales; núcleos no
equivalentes poseen desplazamientos químicos distintos. Aunque no debe sorprendernos que en
moléculas complejas puedan existir núcleos completamente distintos que absorban energía en la misma
posición.

Consideremos una molécula sencilla, la alanina, cuya estructura se muestra en la Figura


2. En ella se observa que existen tres grupos de señales: una con desplazamiento químico en 5.77
ppm, la cual corresponde al protón del ácido y del NH2; la señal en 4.15 ppm corresponde al protón
α del CH; y la señal que corresponde al metilo que se encuentra en 1.55 ppm. Si la molécula es muy
pequeña, la determinación del desplazamiento químico puede ser suficiente para la determinación
estructural de la molécula. A medida que se incrementa el número de núcleos, la sobreposición de
señales aumenta; por ejemplo, en una proteína de 60 aminoácidos se tiene en promedio 500 núcleos
de 1H, de los cuales cada tipo de ellos darían una señal de RMN, provocando que varias señales se
traslapen e impidan una interpretación rápida de los espectros.
H2N OH CH3
C

CH
1 H
H3C O

CH
NH2 y COOH

6 5 4 3 2 ppm
Figura 2. Espectro de RMN de protón en una dimensión de la alanina. Las señales de los
metilos muestran el acoplamiento con el protón del metino, por tanto se observa como un
doblete; el cual, a su vez muestra el acoplamiento con los tres protones del metilo,
observándose un cuarteto. Los protones del COOH y NH2 se encuentran en el mismo
desplazamiento químico sin acoplamiento escalar.

Cuando se obtiene un espectro de RMN de una proteína, las señales se ensanchan debido al movimiento
lento de estas moléculas en el medio acuoso. Mientras más rápido sea el movimiento molecular en el
disolvente, las señales son más finas. Este ensanchamiento de las señales junto con el traslape entre ellas
provocan que los espectros monodimensionales de una proteína sean imposibles de interpretar. Para
lograr la interpretación de los espectros de RMN es requisito indispensable la obtención de espectros
multidimensionales. Este conocimiento nos permite determinar el número y tipo de protones que se
encuentran a dos o a tres enlaces de distancia. La representación gráfica de un espectro
monodimensional es una representación en dos dimensiones, como se muestra en la Figura 2.

Estructura de proteínas (7)

Las proteínas son polímeros cuyas bases monoméricas son α-aminoácidos.


Principalmente, se han encontrado 20 estructuras de estos α-aminoácidos. Existen cuatro niveles
estructurales en las proteínas. La primera es la secuencia de los aminoácidos en la proteína; a la
fecha es prácticamente imposible determinar la estructura tridimensional de una proteína contando
sólo con la secuencia. El segundo nivel estructural se estabiliza por los puentes de hidrógeno que
forman los grupos carbonilo con los grupos amino; generando arreglos locales de la cadena principal
llamado hebras β o hélices α ,ver Figura 5. El agrupamiento de conformaciones secundarias debidas
a atracciones electrostáticas o fuerzas de van der Walls definen a la estructura terciaria. Y por último,
la agrupación de varias proteínas para constituir un agregado molecular que realice las funciones
naturales, se le conoce como estructura cuaternaria.

b)
a)
Figura 5. Estructuras secundarias regulares comúnmente encontradas en las proteínas. a)
Hélices α. b) Hojas β.

Con los datos de la RMN (8) es posible determinar tanto la estructura secundaria como la
terciaria. Sin embargo, es un requisito fundamental contar con la estructura primaria con antelación
para facilitar el análisis de los espectros de RMN. Es factible determinar la estructura cuaternaria,
pero es una tarea muy compleja. Para estos casos sólo se mencionará que es requisito indispensable
que la proteína se enriquezca isotópicamente con el átomo de hidrógeno
2
pesado (el deuterio o H), además de con 13C y 15N.
Para la determinación de la estructura de una proteína se requiere asignar la totalidad de
las señales de los espectros en dos dimensiones COSY. En esta forma se determina qué señales
corresponden a un aminoácido en particular. Cuando el traslape en regiones específicas es grande,
el experimento TOCSY facilita las asignaciones. Conociendo qué tipo de aminoácido
corresponde a que grupo de señales y con la ayuda del experimento NOESY se asigna cada uno de los
aminoácidos en la secuencia de la proteína, ver Figura 6. A través del experimento NOESY es posible
estimar las distancias de los protones que se encuentran a menos de 5 Ångstroms de distancia.

Proteína Pura

Espectros: Espectro: Secuencia Primaria


COSY y TOCSY NOESY Puentes disulfuro

Asignación de los sistemas de espín

Asignación secuencial de los sistemas


de espín.

Correlaciones de larga distancia


(1H – 1H) < 5 Å
Refinamiento

Cálculo de las estructuras

Estructura tridimensional
Proteínas

Figura 6. Sinopsis del procedimiento para la determinación de estructura de proteínas