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La mayoría de los núcleos atómicos poseen espín, la cual es una propiedad de las partículas
que componen a los átomos (2). Al momento de introducir átomos con espín nuclear a un campo
magnético externo, el núcleo se comporta como un pequeño imán y tiende a orientarse,
preferentemente, a favor del campo magnético. Si se aplica energía que obligue a los núcleos a
invertir el sentido de su orientación con respecto al campo magnético, se dice que el sistema está en
resonancia. A este fenómeno de excitación de los espínes nucleares se le
conoce como resonancia magnética nuclear. Esta energía aplicada, ∆E, corresponde a radiación
electromagnética de la región de las radiofrecuencias, la cual se rige por la relación:
∆E = h γ Bο / 2π (1)
El desplazamiento químico de núcleos como los mencionados anteriormente varía en cientos o miles de
Hz; por tanto, todos los núcleos de un elemento en específico se observan en una región relativamente
pequeña. Por regla general, núcleos equivalentes tienen desplazamientos químicos iguales; núcleos no
equivalentes poseen desplazamientos químicos distintos. Aunque no debe sorprendernos que en
moléculas complejas puedan existir núcleos completamente distintos que absorban energía en la misma
posición.
CH
1 H
H3C O
CH
NH2 y COOH
6 5 4 3 2 ppm
Figura 2. Espectro de RMN de protón en una dimensión de la alanina. Las señales de los
metilos muestran el acoplamiento con el protón del metino, por tanto se observa como un
doblete; el cual, a su vez muestra el acoplamiento con los tres protones del metilo,
observándose un cuarteto. Los protones del COOH y NH2 se encuentran en el mismo
desplazamiento químico sin acoplamiento escalar.
Cuando se obtiene un espectro de RMN de una proteína, las señales se ensanchan debido al movimiento
lento de estas moléculas en el medio acuoso. Mientras más rápido sea el movimiento molecular en el
disolvente, las señales son más finas. Este ensanchamiento de las señales junto con el traslape entre ellas
provocan que los espectros monodimensionales de una proteína sean imposibles de interpretar. Para
lograr la interpretación de los espectros de RMN es requisito indispensable la obtención de espectros
multidimensionales. Este conocimiento nos permite determinar el número y tipo de protones que se
encuentran a dos o a tres enlaces de distancia. La representación gráfica de un espectro
monodimensional es una representación en dos dimensiones, como se muestra en la Figura 2.
b)
a)
Figura 5. Estructuras secundarias regulares comúnmente encontradas en las proteínas. a)
Hélices α. b) Hojas β.
Con los datos de la RMN (8) es posible determinar tanto la estructura secundaria como la
terciaria. Sin embargo, es un requisito fundamental contar con la estructura primaria con antelación
para facilitar el análisis de los espectros de RMN. Es factible determinar la estructura cuaternaria,
pero es una tarea muy compleja. Para estos casos sólo se mencionará que es requisito indispensable
que la proteína se enriquezca isotópicamente con el átomo de hidrógeno
2
pesado (el deuterio o H), además de con 13C y 15N.
Para la determinación de la estructura de una proteína se requiere asignar la totalidad de
las señales de los espectros en dos dimensiones COSY. En esta forma se determina qué señales
corresponden a un aminoácido en particular. Cuando el traslape en regiones específicas es grande,
el experimento TOCSY facilita las asignaciones. Conociendo qué tipo de aminoácido
corresponde a que grupo de señales y con la ayuda del experimento NOESY se asigna cada uno de los
aminoácidos en la secuencia de la proteína, ver Figura 6. A través del experimento NOESY es posible
estimar las distancias de los protones que se encuentran a menos de 5 Ångstroms de distancia.
Proteína Pura
Estructura tridimensional
Proteínas