PROTOCOLO DE VALIDACIÓN SR-M 1220

DETERMINACIÓN DE HIDROXIPROLINA
EN CARNE DE RES VERSIÓN 01
MÉTODO COLORIMÉTRICO.
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OBJETIVO: Construir un protocolo de validación para la determinación de hidroxiprolina

en carne de res por el método oficial AOAC 990.26.

1. TITULO. Validación del método AOAC 990.26 para la

determinación de hidroxiprolina en carne de res.

2. AUTOR/FECHA/ Sandra Patricia Restrepo Manotas/Abril de

INSTITUCIÓN. 2018/FOOD LAB.

3. INTRODUCCIÓN. Previa hidrólisis en medio ácido de las proteínas y

oxidación de la hidroxiprolina. El derivado formado
con el 4-dimetilaminobenzaldehído se valora
colorimétricamente.

4. OBJETIVO GENERAL Y Objetivo general:

ESPECIFICOS.  Validar el Método Oficial AOAC 990.26 para la
determinación de hidroxiprolina en carne de
res.

Objetivos específicos:
 Elaborar un protocolo de validación.
 Realizar una búsqueda bibliográfica del
método a validar.
 Elegir el personal adecuado para la
realización de la fase experimental.
 Establecer un cronograma de actividades para
la ejecución de la validación del método.
 Documentar los resultados de la validación.
 Realzar el informe de la validación.

5. PROBLEMA. El método para la determinación de hidroxiprolina no

(PROPÓSITO) se encuentra validado en el laboratorio, por lo cual se
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pueden presentar desviaciones que afecten los

resultados.

6. JUSTIFICACIÓN. Se desea desarrollar la validación del método AOAC

990.26 dado que es de vital importancia, debido a que
en la actualidad el laboratorio cuenta con este análisis
dentro de su portafolio de servicios, y con el tiempo el
número de pruebas solicitadas por nuestros clientes
se están viendo en aumento, en el último año, el
análisis de hidroxiprolina en carne de res se ha
realizado con mayor frecuencia dentro del laboratorio.

La hidroxiprolina se determina cuantitativamente

7. MARCO TEORICO. como medida del colágeno en la carne de res
(Colágeno en el tejido conectivo contiene 12,5 % de
hidroxiprolina [Cuando el factor nitrógeno de proteína
es 6,25]). La muestra se hidroliza con 𝐻2𝑆𝑂4 a 105
°C, se filtra y diluye. La hidroxiprolina oxida el
Cloramina-T a pirrol. El color rojo-púrpura que se
desarrolla después de la adición de 4
dimetilaminobenzaldehido se mide a 560 nm.

8. GLOSARIO.  Hidroxiprolina: Es uno de los tres aminoácidos

predominantes que constituyen colágeno. No
es volátil, sólo se absorbe débilmente en la
región ultravioleta visible y no posee
fluorescencia nativa.
 Colágeno: El colágeno, una glicoproteína, es el
principal componente estructural de los tejidos
conectivos (55-95% del contenido de materia
seca).
 Validación de un método analítico: Consiste en
asegurar que cada medida futura en el análisis
de rutina será lo suficientemente cercana al
valor verdadero desconocido para el contenido
del analito en la muestra.
 Analito: Sustancia (química, física o biológica)
buscada o determinada en una muestra, que
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debe ser recuperada, detectada o cuantificada

por el método.
 Pirrol: Es un anillo aromático de cinco
miembros, donde el heteroátomo es el
nitrógeno. Este compuesto, al igual que sus
derivados, presenta olores débiles, similares a
los de la anilina; es insoluble en agua, pero
soluble en alcohol, éter y ácidos diluidos.
 Blanco: Se realiza sobre una muestra de
composición igual al problema, pero que no
contiene el constituyente a medir, todos los
tratamientos que se le realizan a la muestra, se
le realizan también idénticamente al blanco.

9. HIPÓTESIS. El método para la determinación de hidroxiprolina

empleado en el laboratorio entrega resultados
confiables y es aplicable a la carne de res.

10. MATERIALES Y TIPO DE INVESTIGACIÓN

MÉTODOS. Investigación cuantitativa

MUESTRA
Carne de res

MÉTODO
AOAC 990.26: Determinación de hidroxiprolina en
carne de res

EQUIPOS Y MATERIALES

 Cortador mecánico de carne. Con aberturas

de placa de 2 y 3 mm.
 Procesador de alimentos. Para operar a 1500-
3000 rpm.
 Erlenmeyer de 100 ml, cuello ancho.
 Vidrio reloj de 5 a 6 cm de diámetro.
 Horno de secado. 105 ± 1 °C.
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 Papel de filtro. Lavado con ácido, 12.5 cm de

diámetro. Velocidad de flujo700 ml / min.
 Tubos de ensayo de 10 ml. Use tubos
idénticos para cada serie de análisis.
 Baño de agua. Con temperatura controlada a
60 ± 0.5 °C.
 Espectrofotómetro. Para medir A a 558 ± 2
nm. Con celdas de vidrio de10 mm de longitud
de camino óptico. Colorímetro fotoeléctrico
con filtro de interferencia puede ser utilizado.

REACTIVOS

Use reactivos de grado analítico. El agua debe ser

destilada o equivalente pureza.
 Ácido sulfúrico 7N.
 Solución de tampón.-pH 6.0.
 Cloramina T
 4-dimetilaminobenzaldehído
 Ácido perclórico (60% peso / peso).
 2-propanol. Prepare la solución el día de uso.
 Estándar de hidroxiprolina.
 Azúcar
 Colágeno
 Agua.

DISEÑO DE EXPERIMENTOS

Se realiza un diseño de experimentos completamente

aleatorizado, para posteriormente realizar un análisis
de tabla ANOVA y así determinar si hay o no
diferencia significativa en la exactitud del método.

ESTÁNDAR A USAR
L-Hidroxiprolina de concentración 1mg/mL, marca
Merck.

PARÁMETROS A VALIDAR
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 Especificidad: El método usado tiene como

referencia la AOAC 990.26
 Criterio de aceptación: Desviación estándar
< 3% y 92-100% de recuperación

 Exactitud: Se determina el contenido de

hidroxiprolina en el estándar de L-
Hidroxiprolina.

 Criterio de aceptación: 92-100% de

recuperación.

 Precisión: Se realiza la preparación de tres

muestras con diferentes concentraciones de
hidroxiprolina (Colágeno, con contenido de
hidroxiprolina) y tres muestras de azúcar (Sin
contenido de hidroxiprolina), para
posteriormente analizarlas. Lo cual se presenta
en la siguiente tabla:

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

Colágeno 0 75 100
Azúcar 100 25 0

 Criterio de aceptación: Desviación estándar

< 3%

 Linealidad: Se realizará una curva de

calibración, en la cual se conoce la
concentración del estándar, se determina su
absorbancia, para posteriormente graficar
absorbancia vs concentración, y así comprobar
la linealidad.
Se trabaja con un blanco, el cual está
compuesto por los reactivos usados en la
muestra.
El montaje de los análisis se realiza por
triplicado.
 Criterio de aceptación: Desviación estándar
< 3%
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Se trabaja con un blanco, el cual está compuesto

por los reactivos usados en la muestra.
El montaje de los análisis se realiza por triplicado.

 Tratamiento estadístico:
Los resultados obtenidos se llevan a un
software estadístico Statgraphics Centurion
XVI, para así realizar un análisis de tabla
ANOVA.

11. RESULTADOS Se espera que los resultados obtenidos cumplan los

ESPERADOS criterios de aceptación, para de esta manera
comprobar que la hipótesis propuesta es verdadera,
demostrando que la determinación de hidroxiprolina
en carne de res realizada en el laboratorio FOOD
LAB arroja resultados veraces.

12. CRONOGRAMA/
RECURSOS.

Recursos: Para llevar a cabo la validación del método

se debe disponer de $15’000’000, los cuales son
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necesarios para la adquisición de materiales y

reactivos, así como también el salario de los analistas,
el responsable de la validación, y todos los posibles
gastos que se generen durante la validación.

13. BIBLIOGRAFÍA.  Validación de métodos y determinación de la

incertidumbre de la medición: “Aspectos
generales sobre la validación de métodos.”
Instituto de salud pública de Chile; 2010
 AOAC (2000). Official method 990.26,
Hydroxyproline in Meat and Meat Products,
Official Methods of Analysis (17th ed.).
Gaithersburg, MD: Association of Official
Analytical Chemists
 Instituto de salud pública. Validación de
métodos y determinación de la incertidumbre
de la medición: “Aspectos generales sobre la
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analíticos. Ministerio de Ambiente, Vivienda y
Desarrollo Territorial - República de Colombia
2006;1–12. Consultado el 23 abril 2018.
Disponible en:
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 Kindt E, Guene K, Rekhter MD, Humphries J,
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 Glenn H. Brown EMS. Química cuantitativa.

Edición en. Barcelona-Buenos aires-México:
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 PANREAC QUIMICA, S.A. ANALITICOS EN
ALIMENTARIA METODOS OFICIALES DE
ANALISIS, Carne y productos cárnicos,
Editado por: PANREAC QUIMICA, S.A. 042 -
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abril de 2018. Disponible en:
http://www.usc.es/caa/MetAnalisisStgo1/carne
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