Determinación de la capacidad inhibitoria del antisuero de Loxosceles laeta (araña

violinista) obtenido de cobayos

Resumen

Abstract

Introducción

Las arañas del género Loxosceles, llamadas también arañas pardas, se encuentran
distribuidas en Sudamérica, América Central, Norteamérica, Europa, África, Oriente Medio
y Asia (Gremski et al., 2014); en Perú las especies más comunes son Loxosceles laeta, y L.
rufipes, que son responsables de serios casos accidentales por mordedura de araña (Dias-
Lopes, 2010).

La especie L. laeta, también llamada araña violinista por su diseño de cefalotórax similar al
de un violín invertido, al morder a un ser humano, este desarrollo un cuadro clínico
demoninado loxocelismo con dos variaciones clínicas; la primera denominada loxocelismo
cutáneo, es el más común con un 83% de los casos reportados, asociado a necrosis cutánea
y gravitational spreanding; el segundo denominado loxocelismo sistémico, incluye fallo
renal, disminución de la coagulación intravascular, hemolisis y en la mayoría de los casos
causa la muerte; esto es debido a que el veneno de Loxosceles es una compleja mezcla de
proteínas y péptidos con una masa molecular entre 3 a 40 kDa, en años resientes se han
realizado investigaciones para determinar las diferentes proteínas y péptidos que conforman
las toxina de esta araña. (Chaim et al., 2011; Trevisan-Silva et al., 2010).

Materiales y Métodos

Diseño Metodológico

El diseño metodológico usado fue el transaccional descriptivo por Maxwell (2013), para
investigar la incidencia y valores que las variables expresan dentro de un enfoque
cuantitativo, permitiendo medir las propiedades de las variables y proporcionar su
descripción. En la investigación la variable cuantitativa fue la capacidad inhibitoria del
antisuero de cobayo frente al veneno de L. laeta. El trabajo de investigación tuvo dos fases;
la primera consistió en la identificación y recolección de especímenes de L. laeta para su
posterior extracción de veneno y determinar la dosis máxima no letal para la inmunización
de cobayos; la segunda fue la inmunización de cobayos con veneno de L. laeta para la
obtención del antisuero y verificar su capacidad inhibitoria mediante pruebas de inhibición
radial en agar noble e inhibición de la hemaglutinación, en el Laboratorio de Inmunología
de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional “Pedro Ruiz Gallo”.

Selección y mantenimiento de especímenes

La captura de los especímenes de L. laeta se realizó en los alrededores de la ciudad

universitaria de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo en Lambayeque, Perú; los
ejemplares fueron delicadamente inmovilizados con pinzas anatómicas de 30 cm y asilados
en frascos de vidrio de 50 mL con su tapa superior horadada para permitir airear la “jaula”;
posteriormente se realizó la identificación de la especie de acuerdo a lo mencionado por
Maguiña-Vargas et al (2017), solo se conservaron aquellos especímenes de color pardo o
café oscuro, con abundante pilosidad, cefalotórax con forma de violín invertido, con un
tamaño entre 10 a 15 mm y las patas con una longitud entre 40 a 45 mm. Es importante
mencionar que se realizó una repoblación con arañas jóvenes para no alterar
sustancialmente el equilibrio poblacional en el área; al finalizar la recolección de los
especímenes, se les alimento a todos por única vez y se les mantuvo en ayunas por 30 días
únicamente con agua a una temperatura de 22°C para estimular la producción de veneno.

Extracción de veneno

La obtención de veneno se realizó a través del extracción de glándulas venenosas, retirando

los quelíceros de un total de 300 arañas, previa muerte por congelación a una temperatura
de -25°C; luego se sumergieron unos segundos en buffer fosfato salino (PBS) 0.1 M, pH
7.4 a 4°C y se retiró los quelíceros; cada quelícero con su glándula de veneno se depositó
en tubo con buffer PBS (25 pares de glándulas por 100 uL de PBS), siendo homogenizados
e inmediatamente centrifugados a 10 000 rpm por 15 min; el sobrenadante se denominó
extracto de veneno y se congeló a -25°C hasta su utilización (Myamoto et al., 2016;
Romero et al., 2000)

Ensayo de Letalidad e Inmunización

Para determinar la dosis letal media (DL50) se empleó el método de Spearman & Karber, un
método aproximado no paramétrico propuesto por la OMS, se emplearon cobayos machos
adultos de peso similar, además de haber sido sometido a cuarentena por 30 días con una
alimentación y condiciones ambientales controladas; la vía de inoculación fue
intraperitoneal, con un tiempo de observación de 10, 30 y 60 minutos, y a 24 y 48 horas.

Purificación del antisuero de cobayo

Los anticuerpos Ig G fueron aislados por salting out método descrito y adaptado por Li et
al (2017); se separó el suero de cobayo, se diluyo 10 mL de suero con dos volúmenes de
PBS pH 7.4 y se ajustó el pH a 5 con ácido acético al 60%. Se añadió ácido caprílico (64
uL/mL de dilución) por goteo; se dejó en agitación durante dos horas a temperatura
ambiente hasta que adquirió consistencia pastosa, se filtró y se llevó a pH 7 con Tris 1M.
Para eliminar las proteínas contaminantes sensibles al congelamiento, las muestras fueron
colocadas a -10 °C por 12 horas y descongeladas a temperatura ambiente; luego se
centrifugó a 10000 rpm por 15 minutos. El sobrenadante fue sometido a fraccionamiento
con sulfato de amonio (0.231 g/mL de solución), nuevamente se centrifugó y el pellet
obtenido fue resuspendido en 10 mL de PBS pH 7.4; fue dializado y almacenado en
refrigeración a -4°C hasta su uso.

Determinación de actividad inhibitoria del antisuero por hemaglutinación

Para determinar la actividad inhibitoria del antisuero de cobayo por hemaglutinación

indirecta, se empleó sensibilización de glóbulos rojos con ácido tánico al 0.1%. Primero se
lavó glóbulos rojos al 2.8%, para esto se extrajo 5 mL de sangre de cobayo con un tubo
anticoagulante con citrato, se dejó reposar por 24 horas, se eliminó el sobrenadante, se
agregó 3 mL de PBS, se centrifugó a 3500 rpm por 15 minutos, se eliminó el sobrenadante
y se resuspendió los glóbulos rojos en 5 mL de PBS, este proceso se repitió dos veces; al
pellet de glóbulos rojos se agregó 5 mL de solución salina fisiológica estéril, por último se
tomó una alícuota 2.8 mL de los glóbulos lavados y se diluyo en 100 mL de solución salina
estéril. La tanización de glóbulos rojos, se realizó tomando una alícuota de 5 mL de los
glóbulos rojos lavados y se adicionó 5 mL de ácido tánico al 0.1%, se dejó reposar por 15
minutos a 37°C, se centrifugó a 3500 rpm por 5 minutos y se resuspendio los glóbulos rojos
en 5 mL de PBS, este proceso se repitió 2 veces, para después resuspender el pellet de
glóbulos rojos en 5 mL de solución salina fisiológica estéril. Para la sensibilización de
glóbulos rojos con el extracto de veneno, en un tubo de ensayo se agregó una alícuota de 1
mL de los glóbulos rojos tanizados y 1 mL del extracto de veneno, se dejó reposar por 10
minutos a 37°C y luego se refrigero a -4°C hasta su uso.

La hemaglutinación indirecta se realizó en una placa de microtitulación, en los pocillos de

la fila A se agregó 75 uL de PBS y 50 uL de la misma solución en los pocillos B, C, D, E,
F, G, H. Al pocillo de la fila A se agregó 25 uL del antisuero y se realizó diluciones
sucesivas tomando 50 uL de cada pocillo, se agregó 50 uL de la solución de glóbulos rojos
sensibilizados con el extracto de veneno de L. laeta y se realizó la lectura en 24 horas.

Determinación de la actividad inhibitoria del antisuero por inmunodifusión radial

Para determinar la actividad inhibitoria del antisuero de cobayo por difusión radial, se
empleó agar Noble al 2%, se vertió aproximadamente una capa de 2 cm de espesor en una
placa de Petri a 45°C y se agregó un 1 mL del antisuero; luego se realizaron orificios de 2
mm y se agregó 10 uL del veneno de L. laeta en concentraciones de 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 y
10-5 (Fuentealba et al., 2014; Tscheschlok et al., 2017).

Resultado y discusión

El análisis de datos obtenidos de la Tabla 1, demostró la posible dosis letal media del
veneno de L. laeta, a través de la inoculación intraperitoneal de dosis escalonadas en
cobayos machos adultos. Resultados que guardan relación con las investigaciones
realizadas por…….

La capacidad inhibitoria del suero purificado de cobayo, inmunizado con veneno de L.

laeta, se determinó mediante inmunodifusión radial en agar Noble al 2% que mostro halos
de inhibición de ………con una concentración de veneno de ……..; asi mismos estos
resultados se compararon mediante la prueba de hemaglutinación indirecta con glóbulos
rojos sensibilizados con ácido tánico al 0.1% que demostró una capacidad inhibitoria del
veneno de L. laeta a una concentración de …….
Conclusión

Bibliografía

Maguiña Vargas, C., Figueroa Vásquez, V., & Pulcha Ugarte, R. (2017). Actualización
sobre manejo de araneismo en Perú. Revista Medica Herediana, 28(3), 200-207.

Romero, F., Altier, E., Quiñehua, C., & Cayuqueo, A. (2000). Actividad contráctil del
músculo papilar cardiaco y conducto deferente de rata inducida por veneno de la araña
Latrodectus mactans de Chile. Gayana (Concepción), 64(2), 161-170.

Myamoto, D. T., Pidde-Queiroz, G., Pedroso, A., Goncalves-de-Andrade, R. M., van den
Berg, C. W., & Tambourgi, D. V. (2016). Characterization of the gene encoding component
C3 of the complement system from the spider Loxosceles laeta venom glands: Phylogenetic
implications. Immunobiology, 221(9), 953-963.

Fuentealba, N., Sguazza, G., Scrochi, M., Bravi, M., Zanuzzi, C., Corva, S., & Galosi, C.
(2014). Production of equine herpesvirus 1 recombinant glycoprotein D and development
of an agar gel immunodiffusion test for serological diagnosis. Journal of virological
methods, 202, 15-18.

Tscheschlok, L., Venner, M., & Howard, J. (2017). Comparison of IgG concentrations by
radial immunodiffusion, electrophoretic gamma globulin concentrations and total globulins
in neonatal foals. Equine veterinary journal, 49(2), 149-154.

Li, F., Li, Q., Wu, S., & Tan, Z. (2017). Salting-out extraction of allicin from garlic (Allium
sativum L.) based on ethanol/ammonium sulfate in laboratory and pilot scale. Food
chemistry, 217, 91-97.