25 de Mayo de 2018

Interpretación del espectro de absorción de clorofila.

Alejandra Villa Calderón

Laboratorio de Física Contemporánea II, Facultad de Ciencias​, ​Universidad Nacional Autónoma de México.

Resumen​- ​Mediante el uso de un espectrofotómetro UV-Visible se midió la transmitancia de pigmentos

fotosintéticos en una disolución haciendo un barrido desde 410 nm a 692 nm. Dichos pigmentos fueron
extraídos en base a un procedimiento químico usando etanol al 80% y hojas de espinaca. Y se calculó la
absorbancia para obtener el espectro de absorción. Logrando distinguir los tres principales pigmentos
implicados en el proceso de fotosíntesis y una zona de emisión en longitudes de onda entre el verde y
amarillo ( 520-562 nm).

Palabras clave:​ pigmento, clorofila, fotosíntesis, cromóforos, teoría orbital molecular.

I. INTRODUCCIÓN

La luz visible representa una pequeña parte del amplio rango de radiación continua llamado espectro
electromagnético. En este espectro toda la radiación viaja como ondas. La franja del espectro
electromagnético con longitud de onda entre 380 y 760 nm (nanómetros) se llama espectro visible, ya que
los humanos pueden verlo. El espectro visible incluye todos los colores del arco iris; el violeta tiene la
longitud de onda más corta, y el rojo la más larga. La luz está compuesta de pequeñas partículas, o
paquetes de energía, llamados fotones. La energía de un fotón es inversamente proporcional a su longitud
de onda.

Cuando una molécula absorbe un fotón de energía luminosa, uno de sus electrones queda energizado, lo
que significa que el electrón se transfiere de un orbital atómico de baja energía a otro orbital de alta
energía más alejado del núcleo atómico. Entonces, la molécula puede seguir una de las dos vías que se
muestran en la figura 1.

En la fotosíntesis, los electrones excitados son capturados

por moléculas aceptoras.
En la fotosíntesis, la energía solar se convierte en energía
química mediante organismos fotosintéticos. En la
fotosíntesis los pigmentos absorben sólo longitudes de onda
específicas de la luz visible, y reflejan otras, esto se conoce
como espectro de absorción .

Los pigmentos fotosintéticos son moléculas que contienen

cromóforos como clorofilas, xantofilas, carotenoides, entre
otros. Los pigmentos más importantes en la fotosíntesis son:
clorofila a, clorofila b y 𝜷-carotenos.

Figura 1. ​Vias de desexitación.

1
25 de Mayo de 2018

La clorofila (figura 2) es el pigmento verde común a todas las células fotosintéticas, está formada por
cuatro anillos pirrólicos cuya función es absorber luz, debido al sistema de dobles enlaces conjugados que
lo conforman, estos pigmentos pueden absorber luz visible, la cola de fitol; mantiene la clorofila integrada
a la membrana fotosintética. Existen tipos diferentes de clorofila.

Por otro lado, otra de las propiedades menos conocidas de la Clorofila es su comportamiento frente a la
Luz Ultravioleta. Frente a ella, la Clorofila sufre un proceso de fluorescencia que hace que aparezca ante
nuestros ojos de color rojo.

Cuando un haz de radiación monocromática de una

determinada longitud de onda atraviesa una capa de
disolución conteniendo una especie absorbente, la
potencia (energía por unidad de tiempo y unidad de
área) del haz incidente I​0 se atenúa, disminuyendo
hasta I (Figura 3).
Se define la transmitancia T, como la fracción de
radiación incidente que consigue atravesar la
muestra. Varía de 0 a 1 y puede expresarse también
como porcentaje:
I I
T = I0 ; T = I0 × 100
Figura 2. ​Estructura de la molécula de clorofila.

Un parámetro de mayor utilidad práctica, es la absorbancia, A, definida como:

A =− log(T ) ; A =− log (T /100)

La absorbancia está relacionada con la concentración de la sustancia, c, por la ley de Lambert-Beer, que
se resume con la ecuación:

A =αlc

donde c se expresa en mol/L, l es la longitud del camino óptico (anchura de la celda que contiene la
disolución de la sustancia) y se expresa en cm, y α es la absortividad molar, propiedad característica de
cada sustancia correspondiente a la cantidad de radiación que absorbe a una longitud de onda determinada
por unidad de concentración, siendo sus unidades L mol​-1​cm​-1

Figura 3.​ Atenuación de la intensidad de una luz incidente

al atravesar un medio absorbente.

2
25 de Mayo de 2018

II. DESARROLLO EXPERIMENTAL

Se inició con el proceso de extracción de los pigmentos fotosintéticos de las diferentes especies de plantas
seleccionadas (ver tabla 1), primero se cortaron las hojas muy finamente con un cuchillo y se pesaron
dentro del tubo de ensayo donde se preparó la solución, se agregaron 10 ml de etanol al 80% y se cubrió
el tubo para poner a baño maría la solución, se tuvo 20 min a una temperatura de 80°C usando un soporte
universal para sostener los tubos de ensayo y evitar que tocaran de forma directa el fondo del vaso de
precipitado en que se colocaron para el baño maría (el contacto directo con el calor de la parrilla puede
llegar a inducir degradación de la materia prima, ya que se consume el solvente y no hay líquido que
proteja las hojas).

Una vez obtenida la solución con el pigmento, filtramos para eliminar la presencia de partículas, después
colocamos las soluciones bajo luz ultravioleta para observar la fluorescencia que presentan los pigmentos
fotosintéticos como la clorofila y asegurarnos que efectivamente lo que obtuvimos es clorofila o algún
otro pigmento implicado en el proceso de fotosíntesis de las plantas.

Posteriormente agregamos más etanol al 80% (10 ml) para diluir la solución y evitar que el pigmento
altamente concentrado provoque una saturación al momento de medir transmitancia. Una vez diluido,
usamos el espectrofotómetro para medir la transmitancia a partir de 410 nm a 692 nm con pasos de 2 nm,
calibrando con etanol como la muestra blanco a cada cambio de longitud de onda.

En la figura 4 se muestran imágenes que ilustran el proceso experimental redactado.

Tabla 1. ​En esta tabla se enlistan las distintas plantas y la

masa usada de cada una, así como el volumen de solvente.

Figura 4. ​En esta imagen se ilustra el proceso

de extracción de los pigmentos y el
espectrofotómetro usado para las mediciones.
(A)Se cortó y pesó la cantidad deseada de
hojas. (B)Se disolvió con etanol al 80% y se
cubrió con papel aluminio. (C)Se llevaron las
soluciones a baño maría por 20 min a 80°C.
(D)Un poco de extracto de pigmentos de la
espinaca y la celda usada para contener la
solución dentro del espectrofotómetro. (E)
Espectrofotómetro UV-Visible Spectronic 21D.

3
25 de Mayo de 2018

III. ANÁLISIS Y RESULTADOS

Una vez terminada nuestra extracción, colocamos la disolución bajo una lámpara de luz UV, porque como
ya se mencionó; la clorofila absorbe la radiación energética procedente de la luz ultravioleta y pasa a un
estado excitado liberando el exceso de energía en forma de un fotón en la zona roja del espectro. Así que
observar su fluorescencia es un buen método para visualizar si lo que extrajimos, realmente contiene
clorofila. En la figura 5, se puede apreciar la fluorescencia de la extracción obtenida de tres plantas
distintas.

Figura 5. ​Imágenes obtenidas la fluorescencia generada por la presencia

de clorofila.

En las imágenes de la figura 5, se aprecia claramente el tono rojo característico el cual esperábamos
observar por la presencia de clorofilas en nuestra disolución.

Se realizaron medidas de la transmitancia de la disolución de espinaca para analizar el analito,

comenzando a medir desde 410 a 692 nm, con pasos de 2 nm.

Una vez obtenidos los datos se calculó la absorbancia y se analizaron los datos usando Origin 2017.
Se gráfico absorbancia contra longitud de onda y se obtuvo la primer derivada de la función para obtener
los puntos críticos.

En la gráfica 1, podemos observar ciertos picos de máxima absorción los cuales se registran en la tabla 2,
buscando asociarlos a alguno de los tres pigmentos más importantes en el proceso de fotosíntesis. Se
observa una zona de mínima absorción, a la que llamamos zona de emisión, y se encuentra en el rango de
520-562 nm dichos valores corresponden a longitudes de onda del verde-amarillo del espectro visible.

En la gráfica 2, algunos de los máximos encontrados se pueden asociar a la absorción característica de

clorofila a, clorofila b y carotenoides. Sin embargo son más los pigmento presentes en las plantas en
particular en el proceso de fotosíntesis que permiten captar la luz visible, son muchos, y dichos puntos

4
25 de Mayo de 2018

pueden estar asociados a otros pigmentos. En el caso de los puntos de inflexión tenemos probables picos
convulsionados los cuales pueden estar también asociados a la presencia de otros pigmentos, de los cuales
desconocemos su absorción máxima.

Gráfica 1. ​Espectro de absorción obtenido

de la extracción de la espinaca.

Gráfica 2. ​Puntos críticos de la función

asociada al espectro de absorción,
obtenidos al calcular la primera
derivada.

Tabla 2. Máximos observados en el espectro de absorción, asociados a uno de

los tres pigmentos más importantes en la fotosíntesis.

5
25 de Mayo de 2018

De acuerdo con la ley de Lambert - Beer, la intensidad está asociada a la concentración de las partículas o
grupos funcionales implicados en la absorción de la molécula, solo después de la zona de emisión es
apreciable una mayor concentración de clorofila a, ya que la intensidad para la absorción de la clorofila b
es muy baja a comparación de la a.

La única diferencia entre la clorofila a y b es el radical que presentan, por lo que puedo sugerir que el
grupo funcional metil (en clorofila a) y el grupo funcional aldehído (en clorofila b) son los cromóforos
responsables de la absorción de la luz para esas longitudes de onda en particular que presentan de acuerdo
el espectro obtenido.

VI. CONCLUSIONES

● Se logró sintetizar de forma correcta pigmentos de clorofila al observar una clara fluorescencia en
rojo al estimular las moléculas con luz UV.
● Se lograron distinguir los tres principales pigmentos implicados en el proceso de fotosíntesis.
● La espinaca presenta una zona de emisión en longitudes de onda entre el verde y amarillo
(520-562 nm).

REFERENCIAS

1) http://lucyzo.blogspot.mx/2017/10/fotosintesis.html
2) Lucas Hernández Hernández​,​ Claudio González Pérez​, ​Introducción al análisis instrumental, Ed.
Ariel, 2002​.
3) Harold Eric Avery​,​ D. J. Shaw​, ​Cálculos básicos en química física​, Reverte, 1987.
4) G. E. W. Wolstenholme, David W. FitzSimons, Chlorophyll Organization and Energy Transfer in
Photosynthesis, John Wiley & Sons, Sep 16, 2009.
5) Ralph C. Dougherty​, ​Teoría de las perturbaciones de los orbitales moleculares (PMO) en química
orgánica, Reverte, 1980​.